Bezpośrednia stochastyczna mikroskopia rekonstrukcji optycznej pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w trzech wymiarach

Protokół ten wykorzystuje mikroskopię superrozdzielczą, w szczególności bezpośrednią stochastyczną mikroskopię rekonstrukcji optycznej, znaną również jako dSTORM, w celu ominięcia limitu dyfrakcji i wizualizacji EV z nanometrową precyzją w trzech wymiarach. Jedną z godnych uwagi zalet dSTORM jest jego zdolność do bezpośredniej wizualizacji cząstek poniżej poziomu dyfrakcji światła bez uszkadzania etapów, które zmieniają biochemiczną naturę pojazdu elektrycznego. Wiele ewolucyjnie odrębnych wirusów wykorzystuje sygnalizację EV, dlatego dSTORM może być stosowany do charakteryzowania EV pod kątem biomarkerów choroby i postępu, a także do wizualizacji pojedynczych cząstek wirusa, takich jak SARS-CoV2. Zacznij od umieszczenia oczyszczonych z powinowactwa, pęcherzyków zewnątrzkomórkowych lub EV na ośmiodołkowych płytkach ze szklanym dnem, mikroszkiełkami o łącznej objętości 200 mikrolitrów i pozwól im przylegać do powierzchni przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Nie usuwając istniejącego roztworu z płytki ośmiodołkowej, należy przymocować EV do płytek, dodając 200 mikrolitrów 4% paraformaldehydu w 1X PBS do roztworu zawierającego EV w każdym dołku i pozostawić płytki do inkubacji przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie usuń paraformaldehyd i nadmiar roztworu za pomocą mikropipety, aby nie przeszkadzać EVs. Umyj EV 1X PBS, aby usunąć nadmiar paraformaldehydu.

Wykonaj procedurę prania trzy razy. Usuń nadmiar 1X PBS. Przygotować 250 mikrolitrów roztworu buforowego dSTORM Bcube na próbkę, tworząc roztwór pięciomilimolowej dioksygenazy protokatechowej rozcieńczonej w buforze obrazowania zgodnie z protokołem producenta.

Dodaj 250 mikrolitrów przygotowanego buforu do każdej studzienki zgodnie z protokołem producenta i inkubuj płytki przez 20 minut w temperaturze pokojowej przed obrazowaniem w celu usunięcia cząsteczek utleniających. Pojazdy elektryczne można natychmiast zwizualizować lub przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez tydzień. Aby przygotować kulki wymagane do kalibracji mikroskopu superrozdzielczego, rozcieńczyć mikrosfery 100-nanometrowe do stężenia 0,5% w wodzie klasy biologii molekularnej i pipetować 200 mikrolitrów do każdej studzienki szklanej, mikroszkiełkowej, ośmiodołkowej płytki.

Pozwól koralikom osiąść w studzienkach przez godzinę w temperaturze pokojowej. Nie usuwając istniejącego roztworu, dodać 200 mikrolitrów 4% paraformaldehydu w PBS do każdego dołka do roztworu kulki kalibracyjnej i pozostawić do inkubacji przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie usuń paraformaldehyd za pomocą mikropipety, aby nie naruszyć kulek, i umyj koraliki trzykrotnie za pomocą 1X PBS.

Przygotować bufor zgodnie z opisem w manuskrypcie. Usuń 1X PBS i dodaj 250 mikrolitrów przygotowanego buforu do każdej studzienki. Pozostaw bufor na 20 minut przed wizualizacją.

Użyj przycisku Podłącz mikroskop, aby połączyć się z mikroskopem 3D przed umieszczeniem czegokolwiek na stoliku. Dodaj 100X oleju do celu i umieść środek studni na wierzchu obiektywu. W ustawieniu Acquire włącz lasery wzbudzające 473 i 640 nm i kliknij View.

Bez aktywacji soczewki 3D wyświetl koraliki pod ustawieniem nasycenia fotonów, klikając liczbę fotonów w opcjach wyświetlania obrazu. Ustaw początkową moc lasera na 8,4 miliwata dla lasera 473 nm i 11,6 miliwata dla lasera 640 n. Zmniejsz ostrość lasera do około minus 300 nanometrów lub płaszczyzny ogniskowej kulek kalibracyjnych, aby uzyskać wyraźną rozdzielczość poszczególnych kulek.

Po ustawieniu ostrości na płaszczyźnie Z dostosuj poziomy mocy lasera, aby uwzględnić zmiany w każdym polu widzenia. W obszarze Funkcje przyrządu wykonaj kalibrację mapowania 3D i kalibrację mapowania kanałów, aby uzyskać błędy na osiach X, Y i Z. Ustaw maksymalną liczbę pól widzenia na 20, docelową liczbę punktów na 4 000, maksymalną odległość między kanałami na 5,0 pikseli, a promień wykluczenia między kanałami na 10,0 pikseli podczas kalibracji odwzorowania kanałów.

Upewnij się, że kalibracja zapewnia pokrycie punktowe większe niż 90% i dobrą jakość mapowania. Zapisz podane dane kalibracyjne do przyszłych akwizycji obrazów. Dodaj 100-krotny olej na obiektyw i umieść przygotowane EV na mikroskopie.

Bez aktywacji soczewki 3D włącz laser wzbudzający 640 nanometrów i początkowo podnieś go do od 1,2 do 12,5 miliwata, w zależności od intensywności sygnału w polu widzenia, aby wzbudzić czerwoną membranę, interkalację, barwione barwnikiem EV. W opcjach wyświetlania obrazu przełącz metodę wyświetlania z nasycenia fotonów na percentyle, aby lepiej zobrazować EV. Dostosuj moc lasera, aby zminimalizować szumy, jednocześnie maksymalizując sygnał i utrzymując wszystkie inne parametry.

Dostosuj ostrość płaszczyzny Z, klikając ikonę w górę lub w dół na osi Z. Ustaw czas naświetlania na 20 milisekund, przechwytywanie klatki na 10 000 klatek, a początkową moc lasera na od 1,2 do 12,5 miliwata, w zależności od intensywności sygnału i pola widzenia. Aktywuj soczewkę 3D za pomocą ikony i rozpocznij akwizycję, klikając przycisk Pobierz.

W trakcie procesu akwizycji obrazu zwiększaj moc lasera o trzy przyrosty po 10 co 1000 klatek lub wystarczająco, aby utrzymać wysoki stosunek sygnału do szumu. Nie reguluj płaszczyzny Z podczas akwizycji. Po pobraniu obrazu przełącz się do okna Analizuj viewing.

Wykonaj korekcję dryfu na niefiltrowanym obrazie, a następnie aktywuj filtry. Dostosuj liczbę fotonów, precyzję lokalizacji, sigma i indeks ramki, jak wspomniano w manuskrypcie. Nałóż narzędzie widoku w płaszczyźnie X, Y, Z wzdłuż osi X poszczególnych EV z pola widzenia i wyeksportuj poszczególne pliki csv ze zdarzeniami fotoprzełączania.

Przecinaj poszczególne EV na osiach X, Y w polu widzenia X na Y za pomocą narzędzia Histogram liniowy, które przypina zdarzenia fotoprzełączania do ustawionych grup odległości. Rób zdjęcia pojedynczych pojazdów elektrycznych i zapisuj je jako pliki tif. Twórz filmy 3D poszczególnych pojazdów elektrycznych za pomocą narzędzia do wizualizacji 3D i koloruj zgodnie z położeniem wzdłuż osi Z.

Po kalibracji mikroskopu, która wykazała średni błąd 16 nanometrów na osi X, Y i 38 nanometrów na osi Z, oczyszczone EV u20s zostały pomyślnie zwizualizowane z rozdzielczością do 20 nanometrów na osi X, Y i 50 nanometrów wzdłuż osi Z. Poszczególne pojazdy elektryczne wizualizowane za pomocą dSTORM w fotometrach 3D przełączały się w ciągu 10 000 klatek ekspozycji wraz ze wzrostem mocy lasera i były łatwo widoczne na uzyskanym obrazie. Korekcja obrazu po akwizycji w płaszczyźnie Z, liczba fotonów, sigma i precyzja lokalizacji zrekonstruowanego obrazu zaowocowały wyraźną rozdzielczością EV w 3D.

EV przełączał się tylko przez pierwsze 7 000 klatek, co widać na legendzie w prawym górnym rogu. Histogram potwierdza, że większość zdarzeń fotoprzełączania miała miejsce w promieniu 100 nanometrów, co potwierdza, że wizualizowany EV jest egzosomem i że izolacja EV o małej średnicy zakończyła się sukcesem. Analiza rozkładu wielkości przeprowadzona na innych indywidualnie śledzonych EV za pomocą narzędzia Histogram liniowy i narzędzia Widok w płaszczyźnie X, Y, Z potwierdziła, że większość zdarzeń fotoprzełączania miała miejsce w promieniu 100 nanometrów od środka.

Błąd wzdłuż osi Z został zwiększony, co dało wydłużony końcowy obraz EV wzdłuż osi osiowej. Zdarzenia fotoprzełączania nie były skorelowane z rozmiarem EV, co pokazuje, że charakterystyka oparta na dSTORM może być stosowana w przypadku małych EV, takich jak egzosomy i małe, otoczkowe wirusy o średnicy mniejszej niż 100 nanometrów. Podczas wykonywania dSTORM należy pamiętać o ustawieniu początkowej mocy lasera na bardzo niskim poziomie i powolnym jej zwiększaniu przez cały czas akwizycji obrazu, aby zapobiec fotowybielaniu.

Od czasu opracowania projektu dSTORM naukowcy mogli lepiej zrozumieć morfologię struktur subkomórkowych, które wcześniej były niemożliwe do wizualizacji ze względu na granicę dyfrakcji typowej mikroskopii świetlnej.