Name: Bezpośrednia stochastyczna mikroskopia rekonstrukcji optycznej pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w trzech wymiarach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-26T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Poznaj mikroskopię dSTORM do wizualizacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z nanometrową precyzją w trzech wymiarach. Ta metoda umożliwia badanie struktury EV i ich roli w chorobach wirusowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Oxford Nanoimaging za konstruktywne opinie i wskazówki. Prace te zostały sfinansowane przez 5UM1CA121947-10 do R.P.M. i 1R01DA040394 do D.P.D.

1 Rozmnażanie i utrzymanie linii komórkowych
<ol>
	<li>Pozyskaj ludzkie komórki kostniakomięsaka (U2OS) i umieść je w pożywce wzrostowej uzupełnionej 10% wolną od egzosomów płodową surowicą bydlęcą i 1x roztworem penicyliny/streptomycyny. 
	UWAGA: Wolna od egzosomów płodowa surowica bydlęca została wygenerowana zgodnie z protokołem przedstawionym w McNamara i in. al.26.</li>
	<li>Utrzymuj komórki U2OS w inkubatorze pokrytym miedzią w temperaturze 37 °C w 5% CO2 i komórkach pasażowych w kolbach T17526,27. Komórki muszą być utrzymywane w środkowej logarytmicznej fazie wzrostu, aby zapobiec powstawaniu subpopulacji lub gromadzeniu się resztek apoptotycznych w fazie stacjonarnej.</li>
</ol>
2 Izolacja i oczyszczanie egzosomów
<ol>
	<li>Wyhoduj linie komórkowe U2OS do pełnej konfluencji w 10 oddzielnych kolbach T175 z 50 ml pożywki na kolbę. Usunąć supernatant komórek i kolejno przepuścić go przez aparat filtracji próżniowej 0,45 μm i 0,22 μm.</li>
	<li>Poddaj supernatant filtracji z przepływem krzyżowym (znanej również jako filtracja o przepływie stycznym) w systemie filtracji wyposażonym we wkład z pustych włókien o mocy 750 kDa w celu usunięcia mniejszych białek lub metabolitów28.
	<ol>
		<li>Przepuścić supernatant przez operatora filtracji o przepływie stycznym przy stałym ciśnieniu 30 psi, utrzymując ciśnienie retencji <20 psi, aby wytworzyć ciśnienie Δ 10 lub więcej psi. Umieść mieszadło magnetyczne w zbiorniku retentatu i ustaw na 150 obr./min26.</li>
		<li>Utrzymuj szybkość podawania na poziomie 40 ml/min lub wyższym. Zebrać permeat w zbiorniku i wyrzucić go.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Stężyć supernatant do 30 ml, a następnie zrównoważyć z czterema objętościami 1x PBS. Zebrać przefiltrowany i zrównoważony roztwór o przepływie krzyżowym w stożkowej probówce o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Wytrącić EV w temperaturze 4 °C przez noc w końcowym stężeniu 40 mg/ml glikolu polietylenowego o masie cząsteczkowej 8 000 Da. Odwirować EV przy 1 200 x g w 4 °C przez 1 godzinę i ponownie zawiesić w 500 μl 1x PBS.</li>
	<li>Inkubować EVs z 50 μg/ml fotoprzełączalnego barwnika interkalacyjnego z czerwoną membraną i 50 μg/ml RNazy A w 1x PBS w 4 °C przez 1 godzinę.</li>
	<li>Usunąć nadmiar barwnika przez kolumnę w systemie oczyszczania białek podłączonym do kolektora frakcji. Zidentyfikuj frakcje EV za pomocą absorbancji UV i połącz je w probówce do mikrowirówki26.</li>
	<li>Affinity-select total 200 μL EV za pomocą kulek magnetycznych anty-CD81 zrównoważonych w 1x PBS.
	<ol>
		<li>Rozcieńczyć 100 μl kulek magnetycznych anty-CD81 w 1x PBS do całkowitej objętości 1 ml i pozostawić do związania w temperaturze 4 °C przez 2 godziny w probówce mikrowirówkowej o pojemności 2 ml z ciągłym kołysaniem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umyj koraliki anty-CD81 i EV trzy razy za pomocą 1x PBS. Elutę CD81+ EV z roztworu za pomocą 100 mM glicyny o pH 2,0 przez 30 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Odpipetować oczyszczony CD81+ EV do równej objętości 100 mM Tris-HCl o pH 7,5 w 1x PBS. 
	UWAGA: Podwielokrotność oczyszczonego roztworu CD81+ EV może być zarezerwowana do analizy śledzenia nanocząstek lub mikroskopii elektronowej w celu potwierdzenia czystości roztworu i obecności EVs26.</li>
</ol>
3 Utrwalenie i przygotowanie
<ol>
	<li>Umieścić oczyszczone pod względem powinowactwa EV na 8-dołkowych płytkach ze szklanym dnem μ o łącznej objętości 200 μl (można rozcieńczyć próbkę EV w 100 mM Tris-HCl przy pH 7,5 w 1x PBS) i pozostawić do przylegania do powierzchni przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Nie usuwając istniejącego roztworu z płytki 8-dołkowej, przymocuj EV do płytek, dodając 200 μl 4% paraformaldehydu w 1x PBS do roztworu zawierającego EV w każdym dołku i pozostaw do inkubacji przez 30 minut w temperaturze pokojowej21.</li>
	<li>Ostrożnie usuń paraformaldehyd i nadmiar roztworu za pomocą mikropipety, aby nie przeszkadzać EVs. Umyj EV 1x PBS, aby usunąć nadmiar paraformaldehydu. Wykonaj procedurę prania trzy razy. Usuń nadmiar 1x PBS.</li>
	<li>Przygotować 250 μl sześciennego roztworu buforowego dSTORM B na próbkę, tworząc roztwór 5 mM dioksygenazy protokatechunowej (część A) rozcieńczonej w buforze obrazowania (część B) zgodnie z protokołem producenta. 
	UWAGA: Stężenie enzymu w buforze może zostać podwojone do 10 mM, jeśli wystąpi fotowybielanie.
	<ol>
		<li>Dodaj 250 μl przygotowanego buforu do każdej studzienki zgodnie z protokołem producenta przez 20 minut w temperaturze pokojowej przed obrazowaniem w celu usunięcia cząsteczek utleniających. 
		UWAGA: EV można następnie natychmiast wyświetlić lub przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do tygodnia. Zamień bufor po przechowywaniu przed każdą wizualizacją.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4 Bezpośrednia kalibracja mikroskopii rekonstrukcji optycznej
<ol>
	<li>Przygotować kulki wymagane do kalibracji mikroskopu o wysokiej rozdzielczości, rozcieńczając mikrosfery o długości fali 100 nm do stężenia 0,5% w wodzie klasy biologii molekularnej i pipetując 200 μl do każdej studzienki 8-dołkowej płytki ze szklanym dnem μ.
	<ol>
		<li>Pozwól koralikom osiąść w studzienkach przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Nie usuwając istniejącego roztworu, dodać 200 μl 4% paraformaldehydu w PBS do każdego dołka do roztworu kulki kalibracyjnej i pozostawić do inkubacji przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Ostrożnie usuń paraformaldehyd za pomocą mikropipety, aby nie naruszyć kulek i umyj koraliki trzykrotnie 1x PBS. Przygotuj bufor zgodnie z krokiem 3.4.</li>
	<li>Usunąć 1x PBS i dodać 250 μl przygotowanego buforu do każdej studzienki. Pozostaw bufor na 20 minut przed wizualizacją.</li>
	<li>Przed umieszczeniem czegokolwiek na scenie podłącz do mikroskopu 3D za pomocą przycisku Podłącz mikroskop. Dodaj 100x oleju do celu i umieść środek studni na wierzchu obiektywu. W ustawieniach Acquire włącz lasery wzbudzające 473 i 640 nm i kliknij View.
	<ol>
		<li>Bez włączonej soczewki 3D view koraliki pod ustawieniem nasycenia fotonów, klikając opcję Photon Counts (Liczba fotonów) w opcjach wyświetlania obrazu. Ustaw początkową moc lasera na 8,4 mW dla lasera 473 nm i na 11,6 mW dla lasera 640 nm.</li>
		<li>Zmniejsz ostrość lasera do około -300 nm lub płaszczyzny ogniskowej kulek kalibracyjnych, aby uzyskać wyraźną rozdzielczość poszczególnych kulek. Po ustawieniu ostrości na płaszczyźnie Z dostosuj poziomy mocy lasera, aby uwzględnić zmiany w każdym polu widzenia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W ramach funkcji przyrządu zakończ kalibrację mapowania 3D i kalibrację mapowania kanałów, aby uzyskać błędy na osiach X, Y i Z. Ustaw maksymalną liczbę pól widzenia na 20, docelową liczbę punktów na 4 000, maksymalną odległość między kanałami na 5,0 pikseli, a promień wykluczenia między kanałami na 10,0 pikseli podczas kalibracji mapowania kanałów.</li>
	<li>Upewnij się, że kalibracja zapewnia pokrycie punktowe na poziomie >90% i dobrą jakość mapowania. Zapisz podane dane kalibracyjne do przyszłych akwizycji obrazów.</li>
</ol>
5 Wizualizacja EV w trzech wymiarach
<ol>
	<li>Dodaj 100x olej na obiektyw i umieść przygotowane EV w mikroskopie. Bez aktywowanej soczewki 3D włącz laser wzbudzający 640 nm i początkowo podnieś go do wartości od 1,2 mW do 12,5 mW, w zależności od intensywności sygnału i pola widzenia, aby wzbudzić czerwoną membranę interkalacyjną barwione barwnikiem EV.
	<ol>
		<li>W opcjach wyświetlania obrazu przełącz metodę wyświetlania z nasycenia fotonów na percentyle, aby lepiej zobrazować EV. Dostosuj moc lasera, aby zminimalizować szumy, jednocześnie maksymalizując sygnał. Zachowaj wszystkie inne parametry.</li>
		<li>Dostosuj ostrość płaszczyzny Z, klikając ikonę w górę lub w dół na osi Z. 
		UWAGA: Płaszczyzna Z powinna być zogniskowana w zakresie od -200 do -350 nm, ale będzie się różnić w zależności od pola view.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustaw czas ekspozycji na 20 ms, przechwytywanie klatki na 10 000 klatek, a początkową moc lasera na zakres od 1,2 mW do 12,5 mW lub moc lasera określoną w kroku 5.1, w zależności od intensywności sygnału i pola view.
	<ol>
		<li>Aktywuj soczewkę 3D za pomocą ikony i rozpocznij akwizycję, klikając przycisk Pobierz.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podczas akwizycji obrazu zwiększaj moc lasera o 3 przyrosty po 10 co 1000 klatek lub wystarczająco, aby utrzymać wysoki stosunek sygnału do szumu. Nie reguluj płaszczyzny Z podczas akwizycji. 
	UWAGA: Moc lasera można zwiększyć do maksymalnie 90 mW.</li>
</ol>
6 Modyfikacja po przejęciu i śledzenie EV
<ol>
	<li>Po pobraniu obrazu przełącz się do okna Analizuj viewing. Wykonaj korekcję dryfu na niefiltrowanym obrazie, a następnie aktywuj filtry. Dostosuj liczbę fotonów, precyzję lokalizacji, sigma i indeks ramki zgodnie z Tabelą 1.</li>
	<li>Nałóż narzędzie widoku płaszczyzny XYZ wzdłuż osi X poszczególnych EV z pola widzenia i wyeksportuj . Pliki CSV ze zdarzeniami fotoprzełączania.</li>
	<li>Przetnij poszczególne EV na osi XY w polu widzenia X na Y za pomocą narzędzia do histogramu liniowego, które dzieli zdarzenia fotoprzełączania na określone grupy odległości.</li>
	<li>Rób zdjęcia pojedynczych pojazdów elektrycznych i zapisuj je jako pliki .tiff.</li>
	<li>Twórz filmy 3D poszczególnych pojazdów elektrycznych za pomocą narzędzia do wizualizacji 3D i koloruj zgodnie z położeniem wzdłuż osi Z.</li>
</ol>

M.G.C. nie ma żadnych konfliktów interesów, o których mógłby się oświadczyć. R.P.M i D.P.D. otrzymują wsparcie materialne od Oxford Nanoimaging (ONI) Inc. i Cytiva Inc. (dawniej GE Healthcare). R.P.M. i D.P.D. deklarują konkurencyjne interesy w zakresie ewentualnej komercjalizacji niektórych z prezentowanych informacji. Są one zarządzane przez Uniwersytet Północnej Karoliny. Źródła finansowania nie były zaangażowane w interpretację ani pisanie tego manuskryptu.

EV stały się popularnym obszarem badań ze względu na ich ważną rolę w wielu procesach wewnątrzkomórkowych i sygnalizacji międzykomórkowej 1,30. Ich wizualizacja okazuje się jednak trudna, ponieważ ich niewielkie rozmiary mieszczą się poniżej granicy dyfrakcji mikroskopii świetlnej. Bezpośrednia stochastyczna mikroskopia rekonstrukcji optycznej (dSTORM) jest bezpośrednią metodą wizualizacji, która omija granicę dyfrakcji poprzez uchwycenie zdarzeń fotoprzełączania...

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) to pęcherzyki związane z błoną, uwalniane przez wszystkie typy komórek. Zawierają lipidy, białka, metabolity i kwasy nukleinowe i przenoszą te materiały lokalnie między komórkami i dystalnie między tkankami i narządami. Istnieją trzy podstawowe podtypy EV: ciała apoptotyczne, mikropęcherzyki i egzosomy1,2. Tutaj skupiamy się na naszej dyskusji na egzosomach i związanych z nimi białkach.
Egzosomy to wydzielane pęcherzyki pochodzące z wewnętrznego pączkowania wczesnych endosomów do ciała wielopęcherzykowego (MVB). MVB następnie łączy się z błoną plazmatyczną, uwalniając egzosomy do przestrzeni zewnątrzkomórkowej, aby przemieszczać się do innych komórek3,4. Egzosomy występują w spektrum rozmiarów od 40 do 150 nm i są wzbogacone w endosomalne białka transbłonowe znane jako tetrasantyny (CD9, CD63, CD81), endosomalny kompleks sortujący związany z błoną wymagany do transportu (ESCRT) oraz białka związane z tratwą lipidową1,2, 5,6,7.
Charakteryzowanie składu biochemicznego egzosomów stało się popularną dziedziną dla badaczy, aby lepiej zrozumieć ich funkcjonalną naturę. Istnieje wiele metod wizualizacji i charakterystyki egzosomów, w tym cytometria przepływowa w nanoskali, analiza śledzenia nanocząstek (NTA), skaningowa i transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM), powierzchniowy rezonans plazmonów, rezystancyjne wykrywanie impulsów i tradycyjna mikroskopia świetlna, z których każda zawiera wewnętrzne zalety i wady8,9. TEM i cryo-EM mogą osiągać rozdzielczość nanometryczną, ale często wymagają etapów odwadniania i zamrażania i pękania, co powoduje kurczenie się lub lizę EVs10,11. NTA opiera się na rozpraszaniu światła, co pozwala na scharakteryzowanie setek EV jednocześnie, ale jest pośrednim pomiarem wielkości cząstek i nie może łatwo odróżnić EV, wirusów i agregatów białkowych12,13,14,15,16. Cytometria przepływowa w nanoskali wykorzystuje rozpraszanie światła ze ścieżki wzbudzenia, które można następnie przełożyć na pomiary wielkości, ale jest to nowa technologia i nie ma zgody co do tego, jakie rozmiary cząstek mieszczą się w liniowym zakresie wykrywania dla różnych instrumentów12,17,18.
Tradycyjna mikroskopia świetlna z użyciem białek fluorescencyjnych lub barwników była jedną z najczęściej stosowanych technik wizualizacji subkomórkowych kompartmentów, kompleksów białkowych i maszynerii sygnalizacyjnej w komórce. Chociaż technika ta okazuje się przydatna w wizualizacji lokalizacji kompleksów, granica dyfrakcyjna tradycyjnej mikroskopii świetlnej (około 250-400 nm) uniemożliwia wyraźną rozdzielczość białek lub struktur w typowym zakresie wielkości egzosomu (40-150 nm)12,19,20.
Mikroskopia superrozdzielcza, a konkretnie bezpośrednia stochastyczna mikroskopia rekonstrukcji optycznej (dSTORM), odróżnia się od konwencjonalnej mikroskopii świetlnej tym, że wykorzystuje właściwości fotoprzełączalne określonych fluoroforów i wykrywa te mrugające zdarzenia do rekonstrukcji obrazów z dokładnością do nanometrów21. Zdarzenia fotoprzełączania są zbierane za pomocą kamery wykrywającej o dużej liczbie klatek na sekundę w ciągu dziesiątek tysięcy indywidualnych ekspozycji, a funkcja rozproszenia punktowego służy do mapowania z dużą pewnością dokładnej lokalizacji fotoprzełączania fluoroforu19,20,22. Dzięki temu dSTORM może ominąć limit dyfrakcji mikroskopii świetlnej. Kilka grup zgłosiło użycie technik super-rozdzielczości do wizualizacji i śledzenia egzosomów i związanych z nimi białek22,23,24,25. Ostateczna rozdzielczość zależy od właściwości biofizycznych fluoroforu, ale często waha się od +/- 10-100 nm wzdłuż osi XY, co pozwala na rozdzielczość pojedynczej cząsteczki.
Zdolność do rozpoznawania pojedynczych fluoroforów w tej skali na osi XY zrewolucjonizowała mikroskopię. Jednak niewiele jest danych na temat trójwymiarowego (3D) dSTORM egzosomu. W związku z tym staraliśmy się ustalić standardową procedurę operacyjną (SOP) do wizualizacji i charakterystyki oczyszczonych EV opartych na dSTORM, w tym egzosomów z nanometrową precyzją w 3D.

<table><tbody><tr><td>15 &mikro;-Slide 8-dołkowe płytki</td><td>Ibidi</td><td>80827</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>1X Penicylina Roztwór streptomycyny</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>50 ml rurka stożkowa</td><td>Thermo Fisher</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>500 ml 0,22 &micro; m Aparatura do filtracji próżniowej</td><td>Genesee</td><td>25-227</td><td></td></tr><tr><td>750 kDa wkład odcinający z kanalikowym włóknem</td><td>Cytiva</td><td>29-0142-95</td><td></td></tr><tr><td>AKTA Flux S</td><td>Cytiva</td><td>29-0384-37</td><td></td></tr><tr><td>AKTA Start</td><td>Cytiva</td><td>29022094-ECOMINSSW</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki magnetyczne Anti-CD81</td><td>Thermo Fisher</td><td>10616D</td><td></td></tr><tr><td>B-sześcienny bufor</td><td>ONI</td><td>&nbsp; </td><td></td>BCA0017</tr><tr><td>CellMask Red</td><td>Thermo Fisher</td><td>C10046</td><td></td></tr><tr><td>Dubelco's Modified Eagle Medium</td><td>Thermo Fisher</td><td>10566016</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>VWR</td><td>97068-085</td><td></td></tr><tr><td>Frac 30 Kolektor</td><td>frakcji Cytiva</td><td>29022094-ECOMINSSW</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna pH=2,0</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP381-5</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap CaptoCore 700 Kolumna</td><td>Cytiva</td><td>17548151</td><td></td></tr><tr><td>Biologia molekularna Klasa Woda</td><td>Corning</td><td>9820003</td><td></td></tr><tr><td>Nanoimager</td><td>Oxford Nanoimaging</td><td>Niestandardowa</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehhyde</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Glikol polietylenowy</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP233-1</td><td></td></tr><tr><td>RNaza A</td><td>Promega</td><td>A797C</td><td></td></tr><tr><td>T175 Kolby</td><td>Genesee</td><td>25-211</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosfery Tetraspek</td><td>Invitrogen</td><td>T7279</td><td></td></tr><tr><td>Tris- HCl pH=7,5</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP153-1</td><td></td></tr><tr><td>Unicorn V</td><td>Cytiva</td><td>29022094-ECOMINSSW</td><td></td></tr></tbody></table>

bezpośrednia stochastyczna mikroskopia rekonstrukcji optycznej pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w trzech wymiarach

Direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy of Extracellular Vesicles in Three Dimensions

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) są uwalniane przez wszystkie typy komórek i odgrywają ważną rolę w sygnalizacji komórkowej i homeostazie. Wizualizacja EV często wymaga metod pośrednich ze względu na ich małą średnicę (40-250 nm), która jest poniżej limitu dyfrakcji typowej mikroskopii świetlnej. Opracowaliśmy wizualizację EV opartą na mikroskopii superrozdzielczości, aby ominąć limit dyfrakcji zarówno w dwóch, jak i trzech wymiarach. Korzystając z tego podejścia, możemy określić trójwymiarowy kształt EV z rozdzielczością +/- 20 nm na osi XY i rozdzielczością +/- 50 nm wzdłuż osi Z. Podsumowując, proponujemy, aby mikroskopia superrozdzielcza była rozważana jako metoda charakterystyki EV, w tym egzosomów, a także wirusów otoczkowych.

Celem niniejszego badania była ocena skuteczności mikroskopii superrozdzielczej w obrazowaniu pojedynczych EV z rozdzielczością nanometryczną w trzech wymiarach (3-D). Aby przeanalizować kształt i rozmiar pojedynczych EV, zastosowano barwnik fotoprzewłączalny; EV inkubowano z dalekoczerwonym barwnikiem wbudowującym się w błony, a nadmiar barwnika usunięto metodą chromatografii29. Następnie EV uchwycone za pomocą przeciwciał anty-CD81 i zabarwione na czerwono obrazowano za pomocą mikroskopu superro...

Bezpośrednia stochastyczna mikroskopia rekonstrukcji optycznej (dSTORM) służy do ominięcia typowego limitu dyfrakcji mikroskopii świetlnej i do oglądania egzosomów w skali nanometrów. Może być stosowany zarówno w dwóch, jak i trzech wymiarach do charakteryzowania egzosomów.

Bezpośrednia stochastyczna mikroskopia rekonstrukcji optycznej pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w trzech wymiarach

Extracellular vesicles (EVs) are released by all cell types and play an important role in cell signaling and homeostasis. The visualization of EVs often ...

Protokół ten wykorzystuje mikroskopię superrozdzielczą, w szczególności bezpośrednią stochastyczną mikroskopię rekonstrukcji optycznej, znaną również jako dSTORM, w celu ominięcia limitu dyfrakcji i wizualizacji EV z nanometrową precyzją w trzech wymiarach. Jedną z godnych uwagi zalet dSTORM jest jego zdolność do bezpośredniej wizualizacji cząstek poniżej poziomu dyfrakcji światła bez uszkadzania etapów, które zmieniają biochemiczną naturę pojazdu elektrycznego. Wiele ewolucyjnie odrębnych wirusów wykorzystuje sygnalizację EV, dlatego dSTORM może być stosowany do charakteryzowania EV pod kątem biomarkerów choroby i postępu, a także do wizualizacji pojedynczych cząstek wirusa, takich jak SARS-CoV2. Zacznij od umieszczenia oczyszczonych z powinowactwa, pęcherzyków zewnątrzkomórkowych lub EV na ośmiodołkowych płytkach ze szklanym dnem, mikroszkiełkami o łącznej objętości 200 mikrolitrów i pozwól im przylegać do powierzchni przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Nie usuwając istniejącego roztworu z płytki ośmiodołkowej, należy przymocować EV do płytek, dodając 200 mikrolitrów 4% paraformaldehydu w 1X PBS do roztworu zawierającego EV w każdym dołku i pozostawić płytki do inkubacji przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie usuń paraformaldehyd i nadmiar roztworu za pomocą mikropipety, aby nie przeszkadzać EVs. Umyj EV 1X PBS, aby usunąć nadmiar paraformaldehydu.Wykonaj procedurę prania trzy razy. Usuń nadmiar 1X PBS. Przygotować 250 mikrolitrów roztworu buforowego dSTORM Bcube na próbkę, tworząc roztwór pięciomilimolowej dioksygenazy protokatechowej rozcieńczonej w buforze obrazowania zgodnie z protokołem producenta.Dodaj 250 mikrolitrów przygotowanego buforu do każdej studzienki zgodnie z protokołem producenta i inkubuj płytki przez 20 minut w temperaturze pokojowej przed obrazowaniem w celu usunięcia cząsteczek utleniających. Pojazdy elektryczne można natychmiast zwizualizować lub przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez tydzień. Aby przygotować kulki wymagane do kalibracji mikroskopu superrozdzielczego, rozcieńczyć mikrosfery 100-nanometrowe do stężenia 0,5% w wodzie klasy biologii molekularnej i pipetować 200 mikrolitrów do każdej studzienki szklanej, mikroszkiełkowej, ośmiodołkowej płytki.Pozwól koralikom osiąść w studzienkach przez godzinę w temperaturze pokojowej. Nie usuwając istniejącego roztworu, dodać 200 mikrolitrów 4% paraformaldehydu w PBS do każdego dołka do roztworu kulki kalibracyjnej i pozostawić do inkubacji przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie usuń paraformaldehyd za pomocą mikropipety, aby nie naruszyć kulek, i umyj koraliki trzykrotnie za pomocą 1X PBS.Przygotować bufor zgodnie z opisem w manuskrypcie. Usuń 1X PBS i dodaj 250 mikrolitrów przygotowanego buforu do każdej studzienki. Pozostaw bufor na 20 minut przed wizualizacją.Użyj przycisku Podłącz mikroskop, aby połączyć się z mikroskopem 3D przed umieszczeniem czegokolwiek na stoliku. Dodaj 100X oleju do celu i umieść środek studni na wierzchu obiektywu. W ustawieniu Acquire włącz lasery wzbudzające 473 i 640 nm i kliknij View.Bez aktywacji soczewki 3D wyświetl koraliki pod ustawieniem nasycenia fotonów, klikając liczbę fotonów w opcjach wyświetlania obrazu. Ustaw początkową moc lasera na 8,4 miliwata dla lasera 473 nm i 11,6 miliwata dla lasera 640 n. Zmniejsz ostrość lasera do około minus 300 nanometrów lub płaszczyzny ogniskowej kulek kalibracyjnych, aby uzyskać wyraźną rozdzielczość poszczególnych kulek.Po ustawieniu ostrości na płaszczyźnie Z dostosuj poziomy mocy lasera, aby uwzględnić zmiany w każdym polu widzenia. W obszarze Funkcje przyrządu wykonaj kalibrację mapowania 3D i kalibrację mapowania kanałów, aby uzyskać błędy na osiach X, Y i Z. Ustaw maksymalną liczbę pól widzenia na 20, docelową liczbę punktów na 4 000, maksymalną odległość między kanałami na 5,0 pikseli, a promień wykluczenia między kanałami na 10,0 pikseli podczas kalibracji odwzorowania kanałów.Upewnij się, że kalibracja zapewnia pokrycie punktowe większe niż 90% i dobrą jakość mapowania. Zapisz podane dane kalibracyjne do przyszłych akwizycji obrazów. Dodaj 100-krotny olej na obiektyw i umieść przygotowane EV na mikroskopie.Bez aktywacji soczewki 3D włącz laser wzbudzający 640 nanometrów i początkowo podnieś go do od 1,2 do 12,5 miliwata, w zależności od intensywności sygnału w polu widzenia, aby wzbudzić czerwoną membranę, interkalację, barwione barwnikiem EV. W opcjach wyświetlania obrazu przełącz metodę wyświetlania z nasycenia fotonów na percentyle, aby lepiej zobrazować EV. Dostosuj moc lasera, aby zminimalizować szumy, jednocześnie maksymalizując sygnał i utrzymując wszystkie inne parametry.Dostosuj ostrość płaszczyzny Z, klikając ikonę w górę lub w dół na osi Z. Ustaw czas naświetlania na 20 milisekund, przechwytywanie klatki na 10 000 klatek, a początkową moc lasera na od 1,2 do 12,5 miliwata, w zależności od intensywności sygnału i pola widzenia. Aktywuj soczewkę 3D za pomocą ikony i rozpocznij akwizycję, klikając przycisk Pobierz.W trakcie procesu akwizycji obrazu zwiększaj moc lasera o trzy przyrosty po 10 co 1000 klatek lub wystarczająco, aby utrzymać wysoki stosunek sygnału do szumu. Nie reguluj płaszczyzny Z podczas akwizycji. Po pobraniu obrazu przełącz się do okna Analizuj viewing.Wykonaj korekcję dryfu na niefiltrowanym obrazie, a następnie aktywuj filtry. Dostosuj liczbę fotonów, precyzję lokalizacji, sigma i indeks ramki, jak wspomniano w manuskrypcie. Nałóż narzędzie widoku w płaszczyźnie X, Y, Z wzdłuż osi X poszczególnych EV z pola widzenia i wyeksportuj poszczególne pliki csv ze zdarzeniami fotoprzełączania.Przecinaj poszczególne EV na osiach X, Y w polu widzenia X na Y za pomocą narzędzia Histogram liniowy, które przypina zdarzenia fotoprzełączania do ustawionych grup odległości. Rób zdjęcia pojedynczych pojazdów elektrycznych i zapisuj je jako pliki tif. Twórz filmy 3D poszczególnych pojazdów elektrycznych za pomocą narzędzia do wizualizacji 3D i koloruj zgodnie z położeniem wzdłuż osi Z.Po kalibracji mikroskopu, która wykazała średni błąd 16 nanometrów na osi X, Y i 38 nanometrów na osi Z, oczyszczone EV u20s zostały pomyślnie zwizualizowane z rozdzielczością do 20 nanometrów na osi X, Y i 50 nanometrów wzdłuż osi Z. Poszczególne pojazdy elektryczne wizualizowane za pomocą dSTORM w fotometrach 3D przełączały się w ciągu 10 000 klatek ekspozycji wraz ze wzrostem mocy lasera i były łatwo widoczne na uzyskanym obrazie. Korekcja obrazu po akwizycji w płaszczyźnie Z, liczba fotonów, sigma i precyzja lokalizacji zrekonstruowanego obrazu zaowocowały wyraźną rozdzielczością EV w 3D.EV przełączał się tylko przez pierwsze 7 000 klatek, co widać na legendzie w prawym górnym rogu. Histogram potwierdza, że większość zdarzeń fotoprzełączania miała miejsce w promieniu 100 nanometrów, co potwierdza, że wizualizowany EV jest egzosomem i że izolacja EV o małej średnicy zakończyła się sukcesem. Analiza rozkładu wielkości przeprowadzona na innych indywidualnie śledzonych EV za pomocą narzędzia Histogram liniowy i narzędzia Widok w płaszczyźnie X, Y, Z potwierdziła, że większość zdarzeń fotoprzełączania miała miejsce w promieniu 100 nanometrów od środka.Błąd wzdłuż osi Z został zwiększony, co dało wydłużony końcowy obraz EV wzdłuż osi osiowej. Zdarzenia fotoprzełączania nie były skorelowane z rozmiarem EV, co pokazuje, że charakterystyka oparta na dSTORM może być stosowana w przypadku małych EV, takich jak egzosomy i małe, otoczkowe wirusy o średnicy mniejszej niż 100 nanometrów. Podczas wykonywania dSTORM należy pamiętać o ustawieniu początkowej mocy lasera na bardzo niskim poziomie i powolnym jej zwiększaniu przez cały czas akwizycji obrazu, aby zapobiec fotowybielaniu.Od czasu opracowania projektu dSTORM naukowcy mogli lepiej zrozumieć morfologię struktur subkomórkowych, które wcześniej były niemożliwe do wizualizacji ze względu na granicę dyfrakcji typowej mikroskopii świetlnej.

direct-stochastic-optical-reconstruction-microscopy-extracellular

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejszy artykuł opisuje standardową metodę uzyskiwania trójwymiarowej (3D) rekonstrukcji makrocząsteczek biologicznych przy użyciu mikroskopii elektronowej (EM) z barwieniem negatywowym. W tym protokole wyjaśniamy, jak uzyskać strukturę 3D kompleksu egzosomu Saccharomyces cerevisiae w średniej rozdzielczości, stosując metodę rekonstrukcji z losowym nachyleniem stożkowym (RCT).

Rekonstrukcja kompleksu egzosomu metodą kriotomografii elektronowej pojedynczych cząsteczek z wykorzystaniem metody losowych przechyłów stożkowych

W tym filmie demonstrujemy test do wizualizacji i ilościowego określenia poboru komórkowego przez pęcherzyki zewnątrzkomórkowe lub EV. Test ten wykorzystuje obrazowanie fluorescencyjne 3D za pomocą mikroskopu konfokalnego i pozwala na odróżnienie zinternalizowanych EV od tych przyklejonych do powierzchni komórki.

Test wychwytu pęcherzyków zewnątrzkomórkowych: metoda wizualizacji i ilościowego określania wychwytu komórkowego pęcherzyków zewnątrzkomórkowych przy użyciu techniki obrazowania fluorescencyjnego 3D

Czterowymiarowe (4D) obrazowanie jest wykorzystywane do badania zachowania i interakcji między dwoma typami endosomów w zakończonych nerwach żywych kręgowców.  Ruch tych małych struktur jest scharakteryzowany w trzech wymiarach, co pozwala na potwierdzenie zdarzeń takich jak fuzja endosomów i egzocytoza.

Wizualizacja dynamiki endosomów w żywych zakończeniach nerwowych za pomocą czterowymiarowego obrazowania fluorescencyjnego

W tym protokole wideo śledzimy - z dużą prędkością i w trzech wymiarach - fluorescencyjnie znakowane lizosomy w żywych komórkach, używając metody śledzenia orbitalnego w zmodyfikowanym mikroskopie dwufotonowym.

Śledzenie orbitalne 3D w zmodyfikowanym mikroskopie dwufotonowym: zastosowanie do śledzenia pęcherzyków wewnątrzkomórkowych

Ogólnym celem tej metodologii jest zapewnienie optymalnych warunków eksperymentalnych od przygotowania próbki do akwizycji i rekonstrukcji obrazu, aby umożliwić wykonanie dwukolorowych obrazów 2D dSTORM mikrotubul i pośrednich włókien w stałych komórkach...

Obrazowanie pośrednich włókien i mikrotubul za pomocą 2-wymiarowej bezpośredniej stochastycznej mikroskopii rekonstrukcji optycznej

Ten protokół wyjaśnia, jak przygotować i zamontować próbki bakterii do trójwymiarowego obrazowania na żywo oraz jak zrekonstruować trójwymiarowy kształt E. coli na podstawie tych obrazów.

Trójwymiarowe obrazowanie komórek bakteryjnych w celu dokładnego odwzorowania komórek i precyzyjnej lokalizacji białek

Mikroskopia optyczna oparta na chipach jest nowatorskim podejściem do mikroskopii fluorescencyjnej i oferuje korzyści w zakresie efektywności kosztowej i przepustowości. W tym miejscu przedstawiono protokoły przygotowania i obrazowania chipów dla mikroskopii TIRF i mikroskopii superrozdzielczej opartej na lokalizacji.

Wysokoprzepustowa mikroskopia fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia i bezpośredniej stochastycznej rekonstrukcji optycznej z wykorzystaniem chipa fotonicznego

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) przyczyniają się do biologii komórkowej i komunikacji międzykomórkowej. Istnieje potrzeba przeprowadzenia praktycznych testów w celu wizualizacji i ilościowego określenia wychwytu EV przez komórki. Obecny protokół proponuje test wychwytu EV poprzez wykorzystanie trójwymiarowego obrazowania fluorescencyjnego za pomocą mikroskopii konfokalnej, po izolacji EV za pomocą urządzenia mikroprzepływowego opartego na nanofiltracji.

Test wychwytu pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą analizy obrazowania pod mikroskopem konfokalnym

Ten artykuł przedstawia prostą metodę szybkiego wytwarzania gigantycznych pęcherzyków jednowarstwowych z zamkniętymi białkami cytoszkieletu. Metoda ta okazuje się przydatna do oddolnego odtwarzania struktur cytoszkieletu w zamknięciu i interakcjach cytoszkielet-błona.

Szybka enkapsulacja odtworzonego cytoszkieletu w gigantycznych pęcherzykach jednowarstwowych

Błona podstawna jest niezbędna do morfogenezy tkanek i narządów podczas rozwoju. Aby lepiej zrozumieć mechanizmy prowadzące do prawidłowego umiejscowienia tej struktury, w przedstawionym protokole opisano metody wizualizacji i charakterystyki wewnątrzkomórkowego transportu i wydzielania białek błony podstawnej w komórkach nabłonka za pomocą mikroskopii konfokalnej i superrozdzielczej.

Obrazowanie konfokalne i superrozdzielcze spolaryzowanego transportu wewnątrzkomórkowego i wydzielania białek błony podstawnej podczas oogenezy Drosophila

Ten protokół opisuje szczegółowo, jak zbudować jednoobiektywowy, światło-arkuszowy mikroskop fluorescencyjny i jego zastosowanie do wizualizacji sieci cytoszkieletów.

Zaprojektowanie i zbudowanie konfigurowalnego, jednoobiektywowego, arkuszowego mikroskopu fluorescencyjnego do wizualizacji sieci cytoszkieletów

Poznaj mikroskopię dSTORM do wizualizacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z nanometrową precyzją w trzech wymiarach. Ta metoda umożliwia badanie struktury EV i ich roli w chorobach wirusowych.

Bezpośrednia stochastyczna mikroskopia rekonstrukcji optycznej pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w trzech wymiarach

Przeglądaj więcej filmów