Bezwzględna ocena ilościowa pirofosforanów inozytolu za pomocą elektroforezy kapilarnej Spektrometria mas z jonizacją elektrorozpylania
13 sierpnia 2021
Opisano procedurę elektroforezy kapilarnej, spektrometrii mas z jonizacją elektrorozpylania do bezwzględnego oznaczania ilościowego pirofosforanów inozytolu z ekstraktów komórkowych ssaków.
Zapewnia to wysokiej jakości wyniki metabolizmu fosforanu inozytolu we wszystkich badanych przez nas do tej pory organizmach. Dostarczy również informacji na temat nowego szlaku biosyntezy komórkowej, którego obecnie jesteśmy świadomi. Analiza metabolizmu fosforanu inozytolu przez CE-ESI-MS jest szybsza, bardzo czuła i może dostarczyć informacji o strukturze zespołów fosforanu inozytolu.
Aby rozpocząć, skonfiguruj spektrometrię mas z elektrorozpylaniem i jonizacją do elektroforezy kapilarnej lub system CE-ESI-MS składający się z komercyjnego systemu CE i potrójnego kwadrupolowego tandemowego spektrometru masowego, wyposażonego w źródło ESI Agilent Jet Stream. Następnie podłącz rozdzielacz przepływu w osłonie 1:100 i wylot pompy izokratycznej chromatografii cieczowej i upewnij się, że fiolka wlotowa systemu CE znajduje się na tej samej wysokości co końcówka opryskiwacza analizatora masy. Następnie wykorzystaj wersję MassHunter Workstation lub podobne oprogramowanie MS, aby kontrolować cały system oraz akwizycję i analizę danych.
Po przygotowaniu buforu do pracy CE i płynu osłonowego, zainstaluj płyn osłonowy, przedmuchując go z prędkością pięciu mililitrów na minutę przez pięć minut. Następnie ustaw natężenie przepływu na jeden mililitr na minutę, a ciśnienie pompy na 180 barów. Upewnij się, że rurka z recyklingu łączy się z powrotem z butelką z płynem w osłonie, aby ponownie użyć rozpuszczalnika.
Następnie, za pomocą przecinarki do kolumn kapilarnych z obrotowym ostrzem diamentowym, należy prawidłowo przyciąć oba końce kapilary CE-MS z okienkiem wykrywającym promieniowanie UV. Następnie usuń od dwóch do trzech centymetrów powłoki poliimidowej na obu końcach zapalniczką i oczyść powierzchnię kapilary izopropanolem. Aby zainstalować kapilarę, dopasuj kapilarnę do kasety CE-MS.
Następnie kliknij przycisk Zmień kasetę i zainstaluj kasetę w urządzeniu CE. Aby aktywować kapilarę, najpierw przepłucz kapilarę jednym molowym wodorotlenkiem sodu, następnie wodą przez 10 minut, a następnie buforem CE przez 15 minut. Następnie włóż kapilę do opryskiwacza CE-MS.
Za pomocą szkła powiększającego i regulacyjnej w opryskiwaczu precyzyjnie wyreguluj wylot kapilary, upewniając się, że koniec kapilary wystaje około 0,1 milimetra z końcówki opryskiwacza. Sprawdź stabilność opryskiwacza ESI w trybie pełnego skanowania. Fluktuacja elektroferogramów jonów całkowitych powinna mieścić się w granicach 5%Następnie wykonaj próbę z wzorcami fosforanu inozytolu.
Po przygotowaniu mieszaniny wzorców wewnętrznych wymieszać 10 mikrolitrów próbki z 0,5 mikrolitra mieszaniny wzorców wewnętrznych i fiolką z próbką CE. Korzystając z systemu uzupełniania zapasów, kliknij przycisk Zmień butelkę. Przygotowane 250 mililitrów buforu do biegania CE umieścić w butelce z elektrolitem.
Następnie kliknij na Clean Tubes, trzymając igłę uzupełniającą w fiolce z wodą. Ustaw parametry ESI i MS. Następnie zoptymalizuj parametry źródła za pomocą optymalizatora źródła z mieszaniną wzorców polifosforanu inozytolu i wielu ustawień monitorowania reakcji za pomocą MassHunter Optimizer ze wszystkimi standardami.
Następnie wykonaj bieg dla ekstraktów fosforanowych inozytolu i sprawdź wyniki. Ustaw sekwencję, gdy jest więcej próbek. Po pomiarze pozwól MS przejść w tryb czuwania i nie wyłączaj pompy do chromatografii cieczowej.
Wymień opryskiwacz CE-ESI-MS na opryskiwacz LC-ESI-MS, gdy nie ma dopływu płynu do osłony. W celu analizy danych otwórz oprogramowanie do analizy ilościowej i utwórz partię dla wszystkich próbek. Następnie utwórz nową metodę na podstawie uzyskanych danych z monitorowania wielu reakcji i ustaw fosforany inozytolu węgla-13 jako wzorce wewnętrzne.
Następnie sprawdź związek do monitorowania wielu reakcji, czas retencji, normy wewnętrzne, konfigurację stężenia i kwalifikatora. Przekaż walidację i zakończenie, aby zastosować metodę do bieżącej partii. Zapisz metodę.
Następnie sprawdź, czy każdy pik w partii jest prawidłowo zintegrowany. W przeciwnym razie ręcznie zintegruj szczyt. Wyeksportuj wyniki do arkusza kalkulacyjnego i określ ilościowo pirofosforany inozytolu, porównując odpowiedź piku anolitu z odpowiednią odpowiedzią pikową wzorców wewnętrznych znakowanych stabilnym izotopem o znanych stężeniach.
Na koniec, przy zmierzonym stężeniu w fosforanie inozytolu, roztworze ekstraktu i jego objętości, oblicz ilości bezwzględne i dalej znormalizuj ilość przez liczbę komórek lub zawartość białka. Oblicz stężenie komórkowe na podstawie liczby komórek i średniej objętości komórek HCT116. Przedstawiono tutaj wyekstrahowane elektroferogramy jonowe wzorców pirofosforanu inozytolu w stężeniu dwóch mikromoli.
Wprowadza się metabolizm pirofosforanów inozytolu u ssaków z ich uproszczoną strukturą. Seria komórek HCT116 CE-ESI-MS z University College London lub UCL jest pokazana tutaj. CE-MS wykorzystano do ilościowego określenia zmienności poziomów IP8 między komórkami HCT116 z UCL a komórkami z NIH.
Ogniwa HCT116 z UCL zawierają siedmiokrotnie wyższy poziom IP8 niż te z NIH. Znacząca akumulacja 1,5-IP8 w ogniwach HCT116 UCL idzie w parze ze znacznym wzrostem 1-IP7. Analiza CE-ESI-MS komórek HCT116 traktowanych fluorkiem sodu z NIH wykazała podwyższenie 5-IP7, wraz ze zmniejszeniem IP6 i pojawieniem się 5-PPIP4.
Chociaż poziomy 1-IP7 zmniejszyły się do pewnego stopnia, nie jest on całkowicie nieobecny w komórkach traktowanych fluorkiem sodu, ale głównie poniżej granicy wykrywalności. Ważne jest, aby utworzyć stabilny gatunek CE-ESI-MS. Zalecamy sprawdzenie powtarzalności i czułości systemu przed pomiarami.
Technika ta pozwala na zapewnienie metabolizmu fosforanu inozytolu, implantów i tkanek, a także daje możliwość dokładnego zbadania biologicznie istotnego pirofosforanu inozytolu.
Przegląd
Ten artykuł opisuje procedurę kapilarowej elektroforezy z elektrorozpyłową ionizacyjną spektrometrią mas (CE-ESI-MS) do ilościowego oznaczania pirofosforanów inozytolu z ekstraktów komórek ssaków. Metoda znajduje zastosowanie ze względu na swoją szybkość, czułość i zdolność dostarczania informacji strukturalnych na temat zespołów fosforanów inozytolu.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Spektrometria mas
- Biochemia
- Biologia komórki
Tło
- Pirofosforany inozytolu odgrywają kluczową rolę w sygnalizacji komórkowej.
- Rozumienie ich metabolizmu może dostarczyć wglądu w różne procesy biologiczne.
- CE-ESI-MS oferuje szybką i czułą metodę analizy.
- Poprzednie metody brały w efektywności i szczegółach, które zapewnia CE-ESI-MS.
Cel badania
- Ustanowienie niezawodnej metody ilościowego oznaczania pirofosforanów inozytolu.
- Analiza metabolizmu fosforanów inozytolu w komórkach ssaków.
- Zbadanie różnic w poziomach pirofosforanów inozytolu w różnych liniach komórkowych.
Stosowane metody
- Konfiguracja systemu CE-ESI-MS z określonymi ustawieniami sprzętowymi.
- Przygotowanie bufora biegowego CE i cieczy osłaniającej.
- Płukanie i aktywacja kapilary dla optymalnej wydajności.
- Zbieranie i analiza danych za pomocą oprogramowania MassHunter.
Główne wyniki
- CE-ESI-MS z powodzeniem ilościowo oznaczało poziomy pirofosforanów inozytolu w komórkach HCT116.
- Zaobserwowano znaczne różnice w poziomach IP8 między komórkami HCT116 z różnych źródeł.
- Zaobserwowano zmiany w metabolizmie fosforanów inozytolu po leczeniu fluorkiem sodu.
- Metoda wykazała wysoką powtarzalność i czułość.
Wnioski
- CE-ESI-MS jest cennym narzędziem do badania metabolizmu fosforanów inozytolu.
- Technika ta może wzbogacić nasze zrozumienie biosyntetycznych ścieżek komórkowych.
- Przyszłymi zastosowaniami mogą być szersze badania nad fosforanami inozytolu w różnych kontekstach biologicznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Accurate quantitation of inositol pyrophosphates (PP-InsPs) enables mechanistic de-risking in target validation by providing quantitative readouts of phosphate homeostasis and cellular energy charge. This CE-ESI-MS method supports assay development for intracellular signaling pathways, offering baseline separation of regioisomers and absolute concentration data. The approach enhances predictive confidence in early discovery by enabling temporal monitoring of PP-InsPs under experimental conditions, informing go/no-go decisions in preclinical model selection.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses linking PP-InsPs to metabolic signaling and insulin sensitivity pathways.
- Operational Value: Provides high-throughput, sensitive quantification of low-abundance PP-InsPs without radioactive tracers, reducing assay complexity and cost.
- Predictive Value: Supports biological de-risking by delivering absolute cellular concentrations of PP-InsPs, including minor isomers, for target confidence assessment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers baseline separation of PP-InsP regioisomers, enabling specific detection of biologically relevant species in mammalian cells.
- Operational Value: Offers reproducible, quantitative outputs via stable isotope-labeled internal standards, ensuring assay standardization across runs.
- Scalability: Facilitates platform reuse for screening compound effects on inositol phosphate metabolism in disease-relevant systems.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase PP-InsP dynamics to preclinical validation by monitoring temporal changes in HCT116 cells under experimental conditions like sodium fluoride treatment.
- Mechanistic De-risking: Reveals alterations in IP7/IP8 levels and PPIP4 appearance, supporting pathway-specific biomarker alignment and risk-adjusted advancement decisions.
- Disease-Relevant System: Applicable to studying phosphate homeostasis and cellular energy charge in oncology and metabolic disease models.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical evaluation by supplying quantitative, structurally resolved PP-InsP data that inform mechanistic understanding and assay readiness.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying PP-InsPs as metabolic messengers surveying phosphate homeostasis and insulin sensitivity.
- Screening: Enables assay readiness through sensitive detection and baseline separation of PP-InsPs, allowing reliable compound evaluation in metabolic signaling assays.
- Analytics: Delivers quantitative dependent variable measurements (absolute concentrations, temporal changes) via MRM, enabling statistical comparison across conditions and cell lines.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by monitoring PP-InsP modulation in disease-relevant systems, supporting biomarker alignment and risk-adjusted decisions.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable CE-ESI-MS capability for longitudinal studies of inositol phosphate metabolism across multiple projects and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through absolute quantitation of PP-InsPs, reduction of mechanistic ambiguity in inositol phosphate signaling.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and sensitivity achieved via CE-ESI-MS with internal standard normalization and optimized source parameters.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions via quantitative PP-InsP readouts, capital efficiency by avoiding radioactive methods, and reduced late-stage biological risk through early pathway de-risking.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on PP-InsP modulation data, enabling informed advancement of compounds affecting phosphate homeostasis and energy signaling.
Implementation Considerations
- Requires expertise in capillary electrophoresis, mass spectrometry optimization, and metabolite quantification using stable isotope-labeled standards.
- Needs instrumentation including a commercial CE system, triple quadrupole MS with Agilent Jet Stream ESI source, and MassHunter software for data acquisition and analysis.
- Demands cross-team standardization of CE running buffer preparation, sheath liquid flow rates (1 mL/min), and capillary installation procedures to ensure ESI spray stability (<5% TIC fluctuation).
- Involves adaptation considerations for different sample types (cells, tissues) requiring normalization to cell counts or protein content and appropriate internal standard selection.
- Includes practical limitations such as the need for system repeatability and sensitivity checks before measurements, and potential interference from high-abundance inositol phosphates during method development.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:45
Setting Up the Capillary Electrophoresis Electrospray Ionization Mass Spectrometry (CE-ESI-MS) System
1:38
Preparation of Buffer, Capillary, and CE-MS System
3:28
Performing the CE-ESI-MS Runs
5:10
Data Analysis
6:50
Results: Quantitation of Inositol Pyrophosphates from Mammalian Cell Extracts by Capillary Electrophoresis Electrospray Ionization Mass Spectrometry
8:35
Conclusion
