Name: Przygotowanie wielofunkcyjnych mikrokapsułek na bazie jedwabiu wypełnionych plazmidami DNA kodującymi aptamery RNA i ryboprzełączniki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Poznaj metodę tworzenia biokompatybilnych mikrokapsułek z jedwabiu fibroinowego wypełnionych plazmidami DNA kodującymi aptamery RNA i ryboprzełączniki. Technika ta umożliwia badanie aktywacji genów in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez grant LRIR 16RH3003J z Biura Badań Naukowych Sił Powietrznych, a także program Synthetic Biology for Military Environments Applied Research for the Advancement of S&T Priorities (ARAP) Biura Podsekretarza Obrony Stanów Zjednoczonych ds. Badań i Inżynierii.
Sekwencja wektora plazmidowego dla ThyRS (pSALv-RS-GFPa1, 3.4 kb) została hojnie dostarczona przez Dr. J. Gallivana. Kokony jedwabników z Bombyx mori zostały hojnie podarowane przez dr D.L. Kaplana z Tufts University, MA.

<ol><li>Slomovic, S., Pardee, K., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+biology+devices+for+in+vitro+and+in+vivo+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Synthetic biology devices for in vitro and in vivo diagnostics.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (47), 14429-14435 (2015).</li>
<li>Harbaugh, S. V., Goodson, M. S., Dillon, K., Zabarnick, S., Kelley-Loughnane, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Riboswitch-based+reversible+dual-color+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Riboswitch-based reversible dual-color sensor.</a> ACS Synthetic Biology. 6 (5), 766-781 (2017).</li>
<li>König, H., Frank, D., Heil, R., Coenen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+genomics+and+synthetic+biology+applications+between+hopes+and+concerns%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Genomics%22%5BJournal%5D)">Synthetic genomics and synthetic biology applications between hopes and concerns.</a> Current Genomics. 14 (1), 11-24 (2013).</li>
<li>Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+gene+expression%3A+An+expanded+repertoire+of+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Cell-free gene expression: An expanded repertoire of applications.</a> Nature Reviews Genetics. 21, 151-170 (2020).</li>
<li>Chushak, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+synthetic+riboswitch+in+cell-free+protein+expression+systems%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">Characterization of synthetic riboswitch in cell-free protein expression systems.</a> RNA Biology. , 1-12 (2021).</li>
<li>Cole, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+interlaboratory+cell-free+protein+synthesis+variability%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantification of interlaboratory cell-free protein synthesis variability.</a> ACS Synthetic Biology. 8 (9), 2080-2091 (2019).</li>
<li>Thavarajah, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Point-of-use+detection+of+environmental+fluoride+via+a+cell-free+riboswitch-based+biosensor%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Point-of-use detection of environmental fluoride via a cell-free riboswitch-based biosensor.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (1), 10-18 (2020).</li>
<li>Grӓwe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+paper-based%2C+cell-free+biosensor+system+for+the+detection+of+heavy+metals+and+date+rape+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A paper-based, cell-free biosensor system for the detection of heavy metals and date rape drugs.</a> PLoS One. 14 (3), 0210940(2019).</li>
<li>Lin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Portable+environment-signal+detection+biosensors+with+cell-free+synthetic+biosystems%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Advances%22%5BJournal%5D)">Portable environment-signal detection biosensors with cell-free synthetic biosystems.</a> RSC Advances. 10 (64), 39261-39265 (2020).</li>
<li>Caschera, F., Lee, J. W., Ho, K. K. Y., Liu, A. P., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+compartmentalized+protein+synthesis+inside+double+emulsion+templated+liposomes+with+in+vitro+synthesized+and+assembled+ribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">Cell-free compartmentalized protein synthesis inside double emulsion templated liposomes with in vitro synthesized and assembled ribosomes.</a> Chemical Communications. 52 (31), 5467-5469 (2016).</li>
<li>Niederholtmeyer, H., Chaggan, C., Devaraj, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Communication+and+quorum+sensing+in+non-living+mimics+of+eukaryotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Communication and quorum sensing in non-living mimics of eukaryotic cells.</a> Nature Communications. 9, 5027(2018).</li>
<li>Timin, A. S., Gould, D. J., Sukkhorukov, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-layer+microcapsules%3A+Fresh+insights+and+new+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Delivery%22%5BJournal%5D)">Multi-layer microcapsules: Fresh insights and new applications.</a> Expert Opinion on Drug Delivery. 14 (5), 583-587 (2017).</li>
<li>Bomati, E. K., Haley, J. E., Noel, J. P., Deheyn, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+and+structural+comparison+between+bright+and+dim+green+fluorescent+proteins+in+Amphioxus%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Spectral and structural comparison between bright and dim green fluorescent proteins in Amphioxus.</a> Scientific Reports. 4, 5469(2014).</li>
<li>Frey, B. Amplification of Genomic DNA by PCR. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFrey%2C+B+%22Molecular+Diagnosis+of+Infectious+Diseases.+Methods+in+Molecular+Medicine%22">Molecular Diagnosis of Infectious Diseases. Methods in Molecular Medicine</a>. Reischl, U. 13, Humana Press. Totowa, NJ. 143-156 (1998).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> Journal of Visualized Experiments. (62), e3923(2012).</li>
<li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+regeneration+and+reuse+of+silica+columns+from+PCR+purification+and+gel+extraction+kits%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Rapid regeneration and reuse of silica columns from PCR purification and gel extraction kits.</a> Scientific Reports. 8, 12870(2018).</li>
<li>Kostylev, M., Otwell, A. E., Richardson, R. E., Suzuki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+should+be+simple%3A+Escherichia+coli+DH5%CE%B1-mediated+assembly+of+multiple+DNA+fragments+with+short+end+homologies%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cloning should be simple: Escherichia coli DH5α-mediated assembly of multiple DNA fragments with short end homologies.</a> PLoS One. 10 (9), 0137466(2015).</li>
<li>Rockwood, D. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Materials+fabrication+from+Bombyx+mori+silk+fibroin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Materials fabrication from Bombyx mori silk fibroin.</a> Nature Protocols. 6 (10), 1612-1631 (2011).</li>
<li>Drachuk, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silk+macromolecules+with+amino+acid-Poly%28Ethylene+Glycol%29+grafts+for+controlling+layer-by-layer+encapsulation+and+aggregation+of+recombinant+bacterial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Silk macromolecules with amino acid-Poly(Ethylene Glycol) grafts for controlling layer-by-layer encapsulation and aggregation of recombinant bacterial cells.</a> ACS Nano. 9 (2), 1219-1235 (2015).</li>
<li>Antipov, A. A., Sukhorukov, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyelectrolyte+multilayer+capsules+as+vehicles+with+tunable+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Colloid+and+Interface+Science%22%5BJournal%5D)">Polyelectrolyte multilayer capsules as vehicles with tunable permeability.</a> Advances in Colloid and Interface Science. 111 (1-2), 49-61 (2004).</li>
<li>Drachuk, I., Harbaugh, S., Chávez, J. L., Kelley-Loughnane, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+activity+of+DNA-encoded+sensing+elements+through+confinement+in+silk+microcapsules%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Materials+%26+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Improving the activity of DNA-encoded sensing elements through confinement in silk microcapsules.</a> ACS Applied Materials & Interfaces. 12 (43), 48329-48339 (2020).</li>
<li>Melnikov, S., Ben-Shem, A., Garreau de Loubresse, N., Jenner, L., Yusupova, G., Yusupov, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+the+inhibition+of+the+eukaryotic+ribosome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural basis for the inhibition of the eukaryotic ribosome.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 19 (6), 560-567 (2012).</li>
<li>Zhao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+of+layer-by-layer+assembly%3A+A+tribute+to+ACS+Nano+associate+editor+Helmuth+M%C3%B6hwald%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">The future of layer-by-layer assembly: A tribute to ACS Nano associate editor Helmuth Möhwald.</a> ACS Nano. 13 (6), 6151-6169 (2019).</li>
<li>Main, K. H. S., Provan, J. I., Haynes, P. J., Wells, G., Hartley, J. A., Pyne, A. L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscopy-A+tool+for+structural+and+translational+DNA+research%5BTitle%5D)+AND+%22APL+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscopy-A tool for structural and translational DNA research.</a> APL Bioengineering. 5, 031504(2021).</li>
<li>Riera, R., Feiner-Gracia, N., Fornaguera, C., Cascante, A., Borrós, S., Albertazzi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+the+DNA+complexation+state+of+pBAE+polyplexes+in+cells+with+super+resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Tracking the DNA complexation state of pBAE polyplexes in cells with super resolution microscopy.</a> Nanoscale. 11 (38), 17869-17877 (2019).</li>
<li>Bilokapic, S., Strauss, M., Halic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+of+nucleosome+core+particle+interactions+in+trans%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM of nucleosome core particle interactions in trans.</a> Scientific Reports. 8, 7046(2018).</li>
<li>Pritchard, E. M., Dennis, P. B., Omenetto, F., Naik, R. R., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+and+chemical+aspects+of+stabilization+of+compounds+in+silk%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">Physical and chemical aspects of stabilization of compounds in silk.</a> Biopolymers. 97 (6), 479-498 (2012).</li>
<li>Fritz, B. R., Jamil, O. K., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implications+of+macromolecular+crowding+and+reducing+conditions+for+in+vitro+ribosome+construction%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Implications of macromolecular crowding and reducing conditions for in vitro ribosome construction.</a> Nucleic Acids Research. 43 (9), 4774-4784 (2015).</li>
<li>Ge, X., Luo, D., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+protein+expression+under+macromolecular+crowding+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cell-free protein expression under macromolecular crowding conditions.</a> PLoS One. 6 (12), 28707(2011).</li>
<li>Cawte, A. D., Unrau, P. J., Rueda, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+imaging+of+single+RNA+molecules+with+fluorogenic+mango+II+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Live cell imaging of single RNA molecules with fluorogenic mango II arrays.</a> Nature Communications. 11, 1283(2020).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+RNA+dynamics+in+live+cells+with+bright+and+stable+fluorescent+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Visualizing RNA dynamics in live cells with bright and stable fluorescent RNAs.</a> Nature Biotechnology. 37 (11), 1287-1293 (2019).</li>
</ol>

Poglądy i opinie przedstawione w niniejszym dokumencie są poglądami autorów i niekoniecznie reprezentują poglądy Departamentu Obrony lub jego Komponentów

Zgodnie z tym protokołem można przygotować selektywnie przepuszczalne mikrokapsułki hydrożelowe z różnymi typami czujników kodowanych DNA. Jedną z charakterystycznych cech podejścia LbL jest możliwość dostosowania złożoności mikrokapsułek podczas składania od dołu do góry, które zwykle rozpoczyna się od adsorpcji gatunków molekularnych na matrycach ofiarnych. Poprzez staranne dostosowanie stężeń początkowych składników, warunków pH i liczby warstw, można przygotować mikrokapsułki o różnych parametrach obciążenia DNA, fun...

Dziedzina biologii syntetycznej oferuje unikalne możliwości rozwijania zdolności wykrywania poprzez wykorzystanie naturalnych mechanizmów wyewoluowanych przez mikroorganizmy do monitorowania ich środowiska i potencjalnych zagrożeń. Co ważne, te mechanizmy wykrywania są zwykle powiązane z reakcją, która chroni te mikroorganizmy przed szkodliwym narażeniem, regulując ekspresję genów w celu złagodzenia negatywnych skutków lub zapobieżenia spożyciu materiałów toksycznych. Podjęto znaczne wysiłki w celu zmodyfikowania tych mikroorganizmów w celu stworzenia czujników całokomórkowych wykorzystujących te naturalne reakcje, ale przekierowujących je w celu rozpoznawania nowych celów i/lub wytwarzania mierzalnego sygnału, który można zmierzyć w celu ilościowego określenia (zwykle fluorescencji)1,2. Obecnie obawy związane ze stosowaniem mikroorganizmów modyfikowanych genetycznie (GMO), zwłaszcza podczas ich uwalniania do środowiska lub ciała ludzkiego, z powodu wycieku całych komórek lub części ich materiału genetycznego, nawet jeśli są zamknięte w matrycy polimerowej, sugerują, że potrzebne są alternatywne sposoby wykorzystania tych podejść do wykrywania3.
Skutecznym podejściem do wykorzystania korzyści płynących z wykrywania opartego na mikroorganizmach bez obaw o wdrożenie GMO jest użycie systemów transkrypcji/translacji in vitro (IVTT). Z praktycznego punktu widzenia, systemy IVTT składają się z mieszaniny zawierającej większość składników komórek w stanie aktywnym, która została "wyekstrahowana" z komórek za pomocą różnych środków, w tym sonikacji, bicia perełkami lub innych4. Produktem końcowym tego procesu jest biochemiczna mieszanina reakcyjna, już zoptymalizowana pod kątem transkrypcji i translacji, która może być wykorzystana do testowania różnych czujników w formacie "otwartego naczynia", bez ograniczeń związanych z użyciem całych komórek (dyfuzja błonowa, wydajność transformacji, toksyczność komórek itp.). Co ważne, różne komponenty czujnika mogą być dodawane ilościowo, a ich działanie badane za pomocą różnych technik optycznych i spektrometrycznych, jak pokazaliśmy5. Zauważono, że wydajność systemów IVTT może być niespójna; Jednak ostatnie badania wykazały podejścia mające na celu standaryzację ich przygotowania i charakteryzacji, co jest bardzo pomocne podczas badania ich wydajności w projektowaniu czujników<klasa SUP="xref">6. Ostatnio zademonstrowano wiele przykładów systemów IVTT wykorzystujących do tworzenia testów opartych na papierze poprzez liofilizację ich składników w matrycach papierowych, w tym wykrywanie jonów metali ciężkich, leków, elementów czujników kworum i innych7,8,9. Ekscytującym obszarem zastosowań czujników opartych na IVTT jest ich zastosowanie w aplikacjach czujnikowych w różnych typach środowisk, w tym w glebie, wodzie i ludzkim ciele. Aby wdrożyć te systemy IVTT w tych trudnych środowiskach, należy wdrożyć podejście hermetyzacji, które ograniczy komponenty IVTT i ochroni je przed degradacją.
Najczęstsze metody enkapsulacji dla systemów IVTT obejmują użycie kapsułek lipidowych, miceli, polimeromów i innych ściśle zamkniętych mikropojemników10,11,12. Jedną z wad tego podejścia jest konieczność włączenia pasywnych lub aktywnych mechanizmów transportu materiałów do i z kontenerów, aby umożliwić komunikację ze środowiskiem zewnętrznym i zapewnić możliwości wykrywania. Aby przezwyciężyć niektóre z tych problemów, w niniejszym badaniu opisano metodę, która zapewnia proste, ale skuteczne podejście do hermetyzacji materiałów kodujących dla różnych projektów czujników, które mają być wyrażone w systemach IVTT. Podejście to opiera się na zastosowaniu osadzania biopolimeru warstwa po warstwie (LbL) w obecności interesujących plazmidów w celu stworzenia pustych mikrokapsułek o wysokiej porowatości, co pozwala chronionemu materiałowi genetycznemu na interakcję z różnymi składnikami wybranego IVTT. Badanie wykazało, że kapsułkowane plazmidy mogą kierować transkrypcją i translacją, gdy są aktywowane w tej matrycy polimerowej, jak pokazano w odpowiedzi kodowanego plazmidem aptameru i ryboprzełącznika na odpowiadające im cele. Dodatkowo ta powłoka LbL chroni plazmidy przez wiele miesięcy bez żadnych specjalnych warunków przechowywania.

<table><tbody><tr><td>(Z)-4-(3,5-difluoro-4-hydroksybenzylideno)-2-metylo-1-(2,2,2-trifluoroetylo)-1H-imidazol-5(4 H)-on (DFHBI-1T)</td><td>Lucerna</td><td>DFHBI-1T</td><td></td></tr><tr><td>5x T4 Lufor ligazy DNA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>46300-018</td><td></td></tr><tr><td>6x Niebieski żel Ładowanie Barwnik</td><td>New England BioLabs</td><td>B7021S</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowe, czarne okrągłe</td><td>Corning</td><td>3601</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td>BioReagent, do biologii molekularnej, sól</td></tr><tr><td>sodowa ampicyliny</td> o niskiej EEO Proszek lub kryształy <td>Sigma-Aldrich</td><td>A0166</td>, <td>BioReagent, odpowiedni do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Enzymy restrykcyjne BlpI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0585S Corning Jednorazowy</td><td></td></tr><tr><td>filtr/systemy przechowywania</td><td>próżniowego FisherScientific</td><td>09-761-1</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472301</td><td>ACS, &ge; 99.9%</td></tr><tr><td>Plazmid DNA, pET28c-F30-2x Brokuły (5.4 kb), BrocApt.</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #66788</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do znakowania przeciwciał DyLightTM550 (Invitrogen)</td>System ekstraktu <td>ThermoFisher Scientific</td><td>84530</td><td></td></tr><tr><td>E. coli S30 do okrągłego DNA</td><td>Stożkowe</td> probówki wirówkowe Promega <td>L1020</td><td></td></tr><tr><td>Falcon, 15 ml</td><td>FisherScientific</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>Stożkowe probówki wirówkowe Falcon, 50 ml</td><td></td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek Fisherbrand, 1,5 ml</td><td>FisherScientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Kwas fluorowodorowy, odczynnik HF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>695068</td><td>ACS, 48%</td></tr> <tr><td>siarczan kanamycyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60615</td><td>mieszanina Kanamycyny A (główny składnik) oraz enzymów restrykcyjnych Kanamycyny B i C</td></tr><tr><td>KpnI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0142S</td><td></td></tr><tr><td>Płytka agarowa LB uzupełniona 100 &mikro; g/ml ampicyliny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5667</td><td>wstępnie wylane płytki agarowe z 100 &mikro; g/ml ampicylina</td></tr><tr><td>LB płytka agarowa uzupełniona 50 &mikro; g / ml kanamycyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L0543</td><td>wstępnie wylane płytki agarowe z 50 &mikro; g/ml bulion kanamycyny</td></tr><tr><td>LB (klasa Lennoxa)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>Bromek litu, LiBr</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>213225</td><td>ReagentPlus, &ge; 99%</td></tr> <tr><td>Maksymalna wydajność DH5-&alpha; kompetentny szczep E. coli</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18258012</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>MilliporeSigma</td><td>322415</td><td>bezwodny, 99,8%</td></tr> <tr><td>MilliQ-water</td><td>EMD MilliPore</td><td></td><td>Milli-Q Referencyjny system oczyszczania wody</td></tr><tr><td>MinElute PCR Zestaw do oczyszczania</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek N-(3-dimetyloaminopropylo)-N&prime;-etylokarbodimidu, EDC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1769</td><td></td></tr><tr><td>PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanem)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010023</td><td>1x PBS, pH 7,4</td></tr><tr><td>Phusion Polimeraza DNA o wysokiej wierności</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>Polietylenomenimina, rozgałęziona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>408727</td><td>średnia Mw ~ 25 000</td></tr><tr><td>Zestaw do syntezy białek in vitro PURExpress New</td><td>England BioLabs</td><td>E6800S</td><td></td></tr><tr><td>QIAEX II Zestaw do ekstrakcji żelu</td><td>Qiagen</td><td>20021</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>&nbsp; 27104</td><td></td></tr><tr><td>Drabina DNA z 2 kłódami (0,1-10,0 kb)</td><td>New England BioLabs</td><td>N0469S</td><td></td></tr><tr><td>SiO? Mikrosfery krzemionkowe, 4,0 i mikro; m</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>24331-15</td><td>10% roztwór wodny</td></tr><tr><td>Kasety dializacyjne Slide-A-Lyzer G2, 3,5 tys. MWCO, 15 ml</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>87724</td><td></td></tr><tr><td>Węglan sodu, Na?CO?</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>222321</td><td>odczynnik ACS, bezwodny, &ge; 99,5%, proszek</td></tr><tr><td>Spectrum Spectra/Por Float-A-Lyzer G2 Urządzenia do dializy</td><td>FisherScientific</td><td>08-607-008</td><td>Spectrum G235058</td></tr><tr><td>SYBR Bezpieczne barwienie żelowe DNA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Ligaza DNA T4 (5 U/&mikro; L)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EL0011</td><td></td></tr><tr><td>Theophylline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1633</td><td>bezwodny, &ge; 99%, proszek</td></tr><tr><td>Bufor Tris Acetate-EDTA (bufor TAE)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6025</td><td>Zawiera 40 mM Tris-octan i 1 mM EDTA, pH 8,3.</td></tr><tr><td>UltraPure Woda destylowana bez DNaz/RNaz</td><td>FisherScientific</td><td>10-977-023</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw ZymoPURE II Plasmid MaxiPrep</td><td>ZymoResearch</td><td>D4202</td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie wielofunkcyjnych mikrokapsułek na bazie jedwabiu wypełnionych plazmidami dna kodującymi aptamery rna i ryboprzełączniki

Preparation of Multifunctional Silk-Based Microcapsules Loaded with DNA Plasmids Encoding RNA Aptamers and Riboswitches

Wprowadzamy protokół do przygotowania mikrokapsułek fibroiny jedwabnej z DNA za pomocą metody składania warstwa po warstwie (LbL) na protektorowych rdzeniach sferycznych. Po adsorpcji warstwy podstawowej i plazmidów DNA, tworzenie wytrzymałych mikrokapsułek było ułatwione poprzez indukcję β-arkuszy w strukturze drugorzędowej jedwabiu podczas ostrego odwodnienia pojedynczej warstwy jedwabiu. W związku z tym nawarstwianie zaszło poprzez wielokrotne wiązania wodorowe i oddziaływania hydrofobowe. Po adsorpcji wielowarstwowych powłok, struktury rdzeń-powłoka mogą być dalej funkcjonalizowane za pomocą nanocząstek złota (AuNPs) i/lub przeciwciał (IgG) do wykorzystania do teledetekcji i/lub celowanego dostarczania. Dostosowanie kilku kluczowych parametrów podczas sekwencyjnego osadzania kluczowych makrocząsteczek na rdzeniach krzemionkowych, takich jak obecność startera polimerowego, stężenie DNA i białka jedwabiu, a także liczba zaadsorbowanych warstw, zaowocowało biokompatybilnymi, obciążonymi DNA mikrokapsułkami o zmiennej przepuszczalności i ładunkach DNA. Po rozpuszczeniu rdzeni krzemionkowych, protokół wykazał tworzenie się pustych i wytrzymałych mikrokapsułek z plazmidami DNA unieruchomionymi na wewnętrznej powierzchni błony kapsułki. Stworzenie selektywnie przepuszczalnej, biokompatybilnej błony między plazmidami DNA a środowiskiem zewnętrznym pozwoliło zachować DNA podczas długotrwałego przechowywania i odegrało ważną rolę w poprawie odpowiedzi wyjściowej plazmidów ograniczonych przestrzennie. Aktywność matryc DNA i ich dostępność badano podczas reakcji transkrypcji i translacji in vitro (systemy bezkomórkowe). Plazmidy DNA kodujące aptamery i ryboprzełączniki zapalające RNA zostały z powodzeniem aktywowane za pomocą odpowiednich analitów, co uwidoczniono podczas lokalizacji znakowanych fluorescencyjnie transkryptów RNA lub białka GFPa1 w błonach otoczki.

W niniejszym badaniu przeanalizowano funkcjonalność matryc DNA kodujących różne konstrukcje sensorów (dwa typy elementów transkrypcji/translacji regulowanych przez RNA) po enkapsulacji w kapsułkach z białka jedwabiu. Mikrokapsułki przygotowano za pomocą szablonowego montażu warstwa po warstwie (LbL) kluczowych komponentów: warstwy podstawowej, plazmidów DNA kodujących konstrukcje sensorów oraz biopolimeru fibroiny jedwabiu (Rysunek 2). Osadzanie makrocząsteczek w sposób warstwowy pozwala na ...

Protokół opisuje tworzenie wytrzymałych i biokompatybilnych mikrokapsułek z DNA jako multipleksowane biosensory in vitro zdolne do śledzenia kilku ligandów.

Przygotowanie wielofunkcyjnych mikrokapsułek na bazie jedwabiu wypełnionych plazmidami DNA kodującymi aptamery RNA i ryboprzełączniki

We introduce a protocol for the preparation of DNA-laden silk fibroin microcapsules via the Layer-by-Layer (LbL) assembly method on sacrificial spherical ...

Znaczenie tego protokołu polega na tym, że zapewnia on środki do utrzymania funkcjonalności czujników kodowanych w DNA poprzez unieruchomienie matryc plazmidu DNA w półprzepuszczalnych biokompatybilnych mikrokapsułkach. Proponowana technika immobilizacji DNA jest wszechstronna. Pozwala to na wytwarzanie wielofunkcyjnych biosensorów o różnych mechanizmach aktywacji in vitro.Przewidujemy, że te mikrokapsułki, w połączeniu z odpowiednimi elementami czujnikowymi, mogą być wykorzystywane do badania różnych procesów biologicznych, w tym uwalniania cząsteczek sygnałowych w różnych środowiskach, takich jak biofilmy i narządy. Technika ta może dostarczyć informacji na temat systemów biologicznych w mikroskali, w szczególności tego, jak unieruchomienie DNA i stłoczenie molekularne mogą wpływać na kinetykę i mechanizm aktywacji genów. Zacznij od osadzenia pierwszej warstwy polietylenoiminy na mikrocząstkach krzemionki protektorowej lub SiO2, dodając jeden mililitr roztworu polietylenoiminy do 300 mikrolitrów mikrocząstek w dwumililitrowej probówce do mikrowirówki.Mieszać mieszaninę w mieszalniku ThermoMixer z prędkością 800 obrotów na minutę w warunkach otoczenia. Zebrać mikrocząstki przez odwirowanie w stężeniu 0,2 g przez jedną minutę w temperaturze pokojowej i ostrożnie usunąć supernatant. Po 15 minutach przemyć mikrocząstki czterokrotnie jednym mililitrem wody dejonizowanej wolnej od DNaz i RNaz przez odwirowanie 0,2 g przez jedną minutę w temperaturze pokojowej, odrzucając supernatant po każdym wirowaniu.Następnie dostosuj stężenie plazmidów DNA od 50 do 200 nanogramów na mikrolitr za pomocą wody destylowanej wolnej od DNaz i RNaz i użyj jednego mililitra przygotowanych roztworów do osadzenia DNA na mikrocząstkach zagruntowanych polietylenopinaminą. Delikatnie mieszaj mieszaninę mikrocząstek w mieszalniku ThermoMixer w temperaturze czterech stopni Celsjusza i 800 obr./min przez 15 minut, a następnie zbieraj mikrocząstki przez odwirowywanie w temperaturze 0,2 g przez jedną minutę. Oznacz probówki dla plazmidów DNA kodujących ryboprzełącznik teofiliny, sprzężony z GFPa1 jako ThyRS-GFPa1 i plazmidy DNA kodujące aptamer brokułów jako BrocApt.Ostrożnie usunąć supernatant i przemyć mikrocząstki czterokrotnie jednym mililitrem wody destylowanej wolnej od DNaz i RNaz, jak wykazano wcześniej, odrzucając supernatant po każdym wirowaniu. Aby zdeponować warstwę fibroiny jedwabiu, dodaj jeden mililitr odtworzonego wodnego roztworu fibroiny jedwabiu do mikrocząstek wchłoniętych przez DNA i delikatnie mieszaj mieszaninę w mieszalniku ThermoMixer z prędkością 750 obr./min przez 15 minut w temperaturze 10 stopni Celsjusza. Zbierz mikrocząstki przez odwirowanie, a następnie umyj je raz jednym mililitrem wody destylowanej wolnej od DNaz i RNaz, jak wyjaśniono wcześniej.Powtórzyć wirowanie i odrzucić supernatant. Dodaj 0,5 mililitra wody destylowanej DNazy i RNazy i wymieszaj mikrocząstki przez wirowanie. Następnie potraktuj mikrocząsteczki 0,5 mililitra 100% metanolu w temperaturze 10 stopni Celsjusza przez pięć minut na ThermoMixerze.Po zebraniu mikrocząstek przez odwirowanie, potraktuj cząstki 100% metanolem na ThermoMixerze z prędkością 750 obrotów na minutę przez 10 minut w temperaturze 10 stopni Celsjusza w celu utworzenia arkusza beta. Odwirować mieszaninę o masie 0,2 g przez jedną minutę w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby zebrać mikrocząstki, a następnie dwukrotnie przepłukać cząstki jednym mililitrem wody destylowanej wolnej od DNaz i RNaz, jak wykazano wcześniej. Rozpuść rdzenie SiO2 mikrocząstek, dodając 8% roztwór kwasu fluorowodorowego do mikrocząstek otoczki rdzenia.Roztwory rozpuszczonych cząstek należy przenieść do urządzeń do dializy i dializować je w zlewce z wodą dejonizowaną. Następnie za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra należy zebrać zawiesinę mikrokapsułek jedwabiu z urządzeń do dializy do nowych dwumililitrowych probówek do mikrowirówek. Przenieś 100 mikrolitrów próbki mikrokapsułki do pojedynczego dołka szklanych szkiełek z ośmiodołkowymi komorami i pozwól kapsułkom osiadać przez 20 do 30 minut przed obrazowaniem za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego lub CLSM.Odpipetować 100 mikrolitrów zawiesiny kapsułek do każdej studzienki szklanego szkiełka podstawowego. Do każdej studzienki dodaj kolejno 300 mikrolitrów roztworu fluoroforu o różnej masie cząsteczkowej od najniższej do najwyższej. Wymieszać mieszaninę, pipetując w górę i w dół, i pozostawić mieszaninę do inkubacji przez godzinę w temperaturze pokojowej, aż dyfuzja roztworów fluoroforów osiągnie równowagę.Później przenieś szkiełko do CLSM, aby zobrazować każdy odwiert za pomocą 100-krotnego obiektywu zanurzeniowego w oleju przy długości fali wzbudzenia 488 nanometrów. Zidentyfikuj obszar zainteresowania, dostosowując płaszczyznę ogniskowej i skup się na kapsułkach, które pojawiają się w postaci okręgów o największej średnicy. Przeprowadzić reakcję transkrypcji/translacji in vitro, sekwencyjnie dodając składniki bezkomórkowe do próbki mikrokapsułek i inkubując probówkę w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez cztery godziny.Sprawdź fluorescencję na czytniku płytek przy użyciu długości fali wzbudzenia 488 nanometrów i emisji dla filtra GFP/FITC przy około 510 nanometrach. Na koniec zobrazuj mikrokapsułki jedwabiu w systemie CLSM za pomocą laserów o długości 488 i 561 nanometrów. W ramach badań wyprodukowano wytrzymałe mikrokapsułki z fibroiny jedwabnej o jednorodnym rozmiarze około 4,5 mikrometra i grubości skorupy około 500 nanometrów.Przepuszczalność pustych w środku jedwabnych otoczek kapsułek fibroinowych analizowano, stosując metodę odcięcia masy cząsteczkowej. Wzrost stężenia warstwy podstawowej polietylenoiniminy prowadzi do zwiększenia stabilności koloidalnej mikrokapsułek o bardziej przepuszczalnych otoczkach, natomiast wyeliminowanie warstwy podstawowej powoduje agregację kapsułek z mniej przepuszczalnymi membranami otoczki. Kinetyka ekspresji GFPa1 podczas aktywacji ThyRS ujawniła wyższą aktywację genu GFPa1 z plazmidów DNA załadowanych do mikrokapsułek jedwabiu niż w kontrolnym DNA niekapsułkowanym.W analizie reprezentatywnej wyświetlane są obrazy CLSM kapsułek fibroiny jedwabiu załadowanych 32 kopiami DNA na kapsułkę przed i po inkubacji w systemie transkrypcji in vitro, translacji. Profile intensywności przekroju poprzecznego kapsułek fibroinowych z jedwabiu wykazały ekspresję GFPa1. Kinetykę transkrypcji 20 warstwowych mikrokapsułek jedwabiu załadowanych 30 kopiami DNA na kapsułkę porównano z kontrolnym niekapsułkowanym DNA.Wyższy sygnał wyjściowy z mikrokapsułek jedwabiu niż z niekapsułkowanych próbek DNA o równoważnych stężeniach potwierdził skuteczność mikrokapsułek jedwabnych. Zgodnie z tym protokołem, kilka technik mikroskopii o wysokiej rozdzielczości może być zastosowanych do obrazowania splątania DNA w stanie unieruchomionym i odsprzężonym procesie aktywacji genów in vitro. Technika ta może być zastosowana do odpowiedzi na dynamikę na poziomie molekularnym w minimalnej liczbie sztucznych komórek.W szczególności, w połączeniu z odpowiednimi elementami genów, mikrokapsułki mogą być wykorzystywane do badania komunikacji międzykomórkowej.

preparation-multifunctional-silk-based-microcapsules-loaded-with-dna

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Szybka mechaniczna deformacja komórek pojawiła się jako obiecująca, bezwektorowa metoda wewnątrzkomórkowego dostarczania makrocząsteczek i nanomateriałów. Protokół ten zawiera szczegółowe instrukcje dotyczące korzystania z systemu w szerokim zakresie zastosowań.

Ściskanie komórek jako solidna, mikroprzepływowa platforma dostarczania wewnątrzkomórkowego

Dostarczanie pozostaje głównym wyzwaniem dla terapeutycznej implementacji małego interferującego RNA (siRNA). Protokół ten polega na wykorzystaniu wielofunkcyjnej i biokompatybilnej platformy dostarczania siRNA, składającej się z porowatych mikrocząstek krzemu szczepionych argininą i polietyleniną.

Porowate mikrocząsteczki krzemu do dostarczania terapii siRNA

Prezentujemy nowatorską metodę, która wykorzystuje fotoczułe kopolimery blokowe do bardziej efektywnej czasoprzestrzennej kontroli wyciszania genów bez wykrywalnych efektów poza celem. Ponadto zmiany w ekspresji genów można przewidzieć za pomocą prostych testów uwalniania siRNA i prostego modelowania kinetycznego.

Przewidywanie wyciszania genów poprzez czasoprzestrzenną kontrolę uwalniania siRNA z reagujących na światło nanonośników polimerowych

Tutaj opisujemy protokół generowania kationowych nanoliposomów, który opiera się na metodzie suchego filmu i może być wykorzystany do bezpiecznego i efektywnego dostarczania transkrybowanego in vitro informacyjnego RNA.

Wytwarzanie kationowych nanoliposomów w celu efektywnego dostarczania transkrybowanego in vitro informacyjnego RNA

Ta praca przedstawia przygotowanie biokompatybilnych kopolimerów blokowych (mBG) funkcjonalizowanych metioniną metodą odwracalnego transferu łańcucha addycyjno-fragmentacyjnego (RAFT). Zbadano również zdolność do kompleksowania plazmidowego DNA otrzymanych mBG oraz skuteczność ich transfekcji. Metoda RAFT jest bardzo korzystna w przypadku polimeryzacji monomerów zawierających specjalne grupy funkcyjne.

Biokompatybilne kopolimery blokowe funkcjonalizowane metioniną do celowanego dostarczania plazmidowego DNA

Tutaj przedstawiono protokół ochrony nanostruktur DNA origami w pożywkach zubożonych w Mg i bogatych w nukleazy przy użyciu naturalnych kationowych powłok polisacharydowych chitozanu i syntetycznych liniowych powłok polietylenoiminy (LPEI).

Powłoka polikationowa inspirowana terapią genową w celu ochrony nanostruktur DNA origami

Demonstrujemy syntezę fuzogennych porowatych nanocząsteczek krzemu do skutecznego dostarczania oligonukleotydów in vitro i in vivo. Porowate nanocząstki krzemu są ładowane siRNA w celu utworzenia rdzenia, który jest pokryty fuzogenicznymi lipidami poprzez wytłaczanie w celu utworzenia powłoki. Uwzględniono ugrupowanie celowe, funkcjonalizację i charakterystykę cząstek.

Synteza, funkcjonalizacja i charakterystyka fuzogennych porowatych nanocząstek krzemu do dostarczania oligonukleotydów

Opisujemy inżynierię nowatorskiej polimerazy T7 RNA na uwięzi DNA do regulacji reakcji transkrypcji in vitro. Omawiamy etapy syntezy i charakterystyki białek, walidujemy regulację transkrypcji typu proof-of-concept i omawiamy jej zastosowania w obliczeniach molekularnych, diagnostyce i przetwarzaniu informacji molekularnych.

Polimeraza RNA na uwięzi DNA do programowalnej transkrypcji in vitro i obliczeń molekularnych

Tutaj przedstawiono prosty protokół produkcji nanocząsteczek mRNA opartych na polimerach poli(beta aminoestrowych), który można łatwo dostosować poprzez zmianę kapsułkowanego mRNA. Opisano również przebieg syntezy polimerów, nanocząstek oraz ich niezbędną charakterystykę in vitro. Dodano również dowód słuszności koncepcji dotyczący szczepień.

Synteza i charakterystyka nanocząstek poli(beta-aminoestrów) obciążonych mRNA do celów szczepień

Przedstawiamy protokół przygotowania syntetycznych kondensatów biomolekularnych składających się z amfifilowych nanogwiazd DNA, zaczynając od ich składowych oligonukleotydów DNA. Kondensaty są wytwarzane z pojedynczego składnika nanogwiazdy lub dwóch składników i są modyfikowane w celu podtrzymania transkrypcji RNA in vitro z osadzonej matrycy DNA.

Syntetyczne kondensaty i architektury podobne do komórek z amfifilowych nanostruktur DNA

Prezentowany tutaj jest protokół dostarczania nanocząsteczek chitozan/dsRNA larwom jedwabników Bombyx mori w celu wywołania wyciszenia genów poprzez spożycie.

Interferencja RNA larw w jedwabniku Bombyx mori poprzez dostarczanie nanocząstek chitozanu/dsRNA

Poznaj metodę tworzenia biokompatybilnych mikrokapsułek z jedwabiu fibroinowego wypełnionych plazmidami DNA kodującymi aptamery RNA i ryboprzełączniki. Technika ta umożliwia badanie aktywacji genów in vitro.

Przygotowanie wielofunkcyjnych mikrokapsułek na bazie jedwabiu wypełnionych plazmidami DNA kodującymi aptamery RNA i ryboprzełączniki (Wideo) | JoVE Journal

Przygotowanie wielofunkcyjnych mikrokapsułek na bazie jedwabiu wypełnionych plazmidami DNA kodującymi aptamery RNA i ryboprzełączniki

Przeglądaj więcej filmów