Przygotowanie wielofunkcyjnych mikrokapsułek na bazie jedwabiu wypełnionych plazmidami DNA kodującymi aptamery RNA i ryboprzełączniki

Znaczenie tego protokołu polega na tym, że zapewnia on środki do utrzymania funkcjonalności czujników kodowanych w DNA poprzez unieruchomienie matryc plazmidu DNA w półprzepuszczalnych biokompatybilnych mikrokapsułkach. Proponowana technika immobilizacji DNA jest wszechstronna. Pozwala to na wytwarzanie wielofunkcyjnych biosensorów o różnych mechanizmach aktywacji in vitro.

Przewidujemy, że te mikrokapsułki, w połączeniu z odpowiednimi elementami czujnikowymi, mogą być wykorzystywane do badania różnych procesów biologicznych, w tym uwalniania cząsteczek sygnałowych w różnych środowiskach, takich jak biofilmy i narządy. Technika ta może dostarczyć informacji na temat systemów biologicznych w mikroskali, w szczególności tego, jak unieruchomienie DNA i stłoczenie molekularne mogą wpływać na kinetykę i mechanizm aktywacji genów. Zacznij od osadzenia pierwszej warstwy polietylenoiminy na mikrocząstkach krzemionki protektorowej lub SiO2, dodając jeden mililitr roztworu polietylenoiminy do 300 mikrolitrów mikrocząstek w dwumililitrowej probówce do mikrowirówki.

Mieszać mieszaninę w mieszalniku ThermoMixer z prędkością 800 obrotów na minutę w warunkach otoczenia. Zebrać mikrocząstki przez odwirowanie w stężeniu 0,2 g przez jedną minutę w temperaturze pokojowej i ostrożnie usunąć supernatant. Po 15 minutach przemyć mikrocząstki czterokrotnie jednym mililitrem wody dejonizowanej wolnej od DNaz i RNaz przez odwirowanie 0,2 g przez jedną minutę w temperaturze pokojowej, odrzucając supernatant po każdym wirowaniu.

Następnie dostosuj stężenie plazmidów DNA od 50 do 200 nanogramów na mikrolitr za pomocą wody destylowanej wolnej od DNaz i RNaz i użyj jednego mililitra przygotowanych roztworów do osadzenia DNA na mikrocząstkach zagruntowanych polietylenopinaminą. Delikatnie mieszaj mieszaninę mikrocząstek w mieszalniku ThermoMixer w temperaturze czterech stopni Celsjusza i 800 obr./min przez 15 minut, a następnie zbieraj mikrocząstki przez odwirowywanie w temperaturze 0,2 g przez jedną minutę. Oznacz probówki dla plazmidów DNA kodujących ryboprzełącznik teofiliny, sprzężony z GFPa1 jako ThyRS-GFPa1 i plazmidy DNA kodujące aptamer brokułów jako BrocApt.

Ostrożnie usunąć supernatant i przemyć mikrocząstki czterokrotnie jednym mililitrem wody destylowanej wolnej od DNaz i RNaz, jak wykazano wcześniej, odrzucając supernatant po każdym wirowaniu. Aby zdeponować warstwę fibroiny jedwabiu, dodaj jeden mililitr odtworzonego wodnego roztworu fibroiny jedwabiu do mikrocząstek wchłoniętych przez DNA i delikatnie mieszaj mieszaninę w mieszalniku ThermoMixer z prędkością 750 obr./min przez 15 minut w temperaturze 10 stopni Celsjusza. Zbierz mikrocząstki przez odwirowanie, a następnie umyj je raz jednym mililitrem wody destylowanej wolnej od DNaz i RNaz, jak wyjaśniono wcześniej.

Powtórzyć wirowanie i odrzucić supernatant. Dodaj 0,5 mililitra wody destylowanej DNazy i RNazy i wymieszaj mikrocząstki przez wirowanie. Następnie potraktuj mikrocząsteczki 0,5 mililitra 100% metanolu w temperaturze 10 stopni Celsjusza przez pięć minut na ThermoMixerze.

Po zebraniu mikrocząstek przez odwirowanie, potraktuj cząstki 100% metanolem na ThermoMixerze z prędkością 750 obrotów na minutę przez 10 minut w temperaturze 10 stopni Celsjusza w celu utworzenia arkusza beta. Odwirować mieszaninę o masie 0,2 g przez jedną minutę w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby zebrać mikrocząstki, a następnie dwukrotnie przepłukać cząstki jednym mililitrem wody destylowanej wolnej od DNaz i RNaz, jak wykazano wcześniej. Rozpuść rdzenie SiO2 mikrocząstek, dodając 8% roztwór kwasu fluorowodorowego do mikrocząstek otoczki rdzenia.

Roztwory rozpuszczonych cząstek należy przenieść do urządzeń do dializy i dializować je w zlewce z wodą dejonizowaną. Następnie za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra należy zebrać zawiesinę mikrokapsułek jedwabiu z urządzeń do dializy do nowych dwumililitrowych probówek do mikrowirówek. Przenieś 100 mikrolitrów próbki mikrokapsułki do pojedynczego dołka szklanych szkiełek z ośmiodołkowymi komorami i pozwól kapsułkom osiadać przez 20 do 30 minut przed obrazowaniem za pomocą konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego lub CLSM.

Odpipetować 100 mikrolitrów zawiesiny kapsułek do każdej studzienki szklanego szkiełka podstawowego. Do każdej studzienki dodaj kolejno 300 mikrolitrów roztworu fluoroforu o różnej masie cząsteczkowej od najniższej do najwyższej. Wymieszać mieszaninę, pipetując w górę i w dół, i pozostawić mieszaninę do inkubacji przez godzinę w temperaturze pokojowej, aż dyfuzja roztworów fluoroforów osiągnie równowagę.

Później przenieś szkiełko do CLSM, aby zobrazować każdy odwiert za pomocą 100-krotnego obiektywu zanurzeniowego w oleju przy długości fali wzbudzenia 488 nanometrów. Zidentyfikuj obszar zainteresowania, dostosowując płaszczyznę ogniskowej i skup się na kapsułkach, które pojawiają się w postaci okręgów o największej średnicy. Przeprowadzić reakcję transkrypcji/translacji in vitro, sekwencyjnie dodając składniki bezkomórkowe do próbki mikrokapsułek i inkubując probówkę w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez cztery godziny.

Sprawdź fluorescencję na czytniku płytek przy użyciu długości fali wzbudzenia 488 nanometrów i emisji dla filtra GFP/FITC przy około 510 nanometrach. Na koniec zobrazuj mikrokapsułki jedwabiu w systemie CLSM za pomocą laserów o długości 488 i 561 nanometrów. W ramach badań wyprodukowano wytrzymałe mikrokapsułki z fibroiny jedwabnej o jednorodnym rozmiarze około 4,5 mikrometra i grubości skorupy około 500 nanometrów.

Przepuszczalność pustych w środku jedwabnych otoczek kapsułek fibroinowych analizowano, stosując metodę odcięcia masy cząsteczkowej. Wzrost stężenia warstwy podstawowej polietylenoiniminy prowadzi do zwiększenia stabilności koloidalnej mikrokapsułek o bardziej przepuszczalnych otoczkach, natomiast wyeliminowanie warstwy podstawowej powoduje agregację kapsułek z mniej przepuszczalnymi membranami otoczki. Kinetyka ekspresji GFPa1 podczas aktywacji ThyRS ujawniła wyższą aktywację genu GFPa1 z plazmidów DNA załadowanych do mikrokapsułek jedwabiu niż w kontrolnym DNA niekapsułkowanym.

W analizie reprezentatywnej wyświetlane są obrazy CLSM kapsułek fibroiny jedwabiu załadowanych 32 kopiami DNA na kapsułkę przed i po inkubacji w systemie transkrypcji in vitro, translacji. Profile intensywności przekroju poprzecznego kapsułek fibroinowych z jedwabiu wykazały ekspresję GFPa1. Kinetykę transkrypcji 20 warstwowych mikrokapsułek jedwabiu załadowanych 30 kopiami DNA na kapsułkę porównano z kontrolnym niekapsułkowanym DNA.

Wyższy sygnał wyjściowy z mikrokapsułek jedwabiu niż z niekapsułkowanych próbek DNA o równoważnych stężeniach potwierdził skuteczność mikrokapsułek jedwabnych. Zgodnie z tym protokołem, kilka technik mikroskopii o wysokiej rozdzielczości może być zastosowanych do obrazowania splątania DNA w stanie unieruchomionym i odsprzężonym procesie aktywacji genów in vitro. Technika ta może być zastosowana do odpowiedzi na dynamikę na poziomie molekularnym w minimalnej liczbie sztucznych komórek.

W szczególności, w połączeniu z odpowiednimi elementami genów, mikrokapsułki mogą być wykorzystywane do badania komunikacji międzykomórkowej.