Adaptacja organoidów przewodu pokarmowego do zakażenia patogenami i sekwencjonowania pojedynczych komórek w warunkach 3. poziomu bezpieczeństwa biologicznego (BSL-3)

Protokół ten pozwala nam zrozumieć, w jaki sposób poszczególne typy komórek obecne w nabłonku jelita ludzkiego reagują na infekcję wirusową. Przedstawiamy tutaj trzy niezależne sposoby wysiewu organoidów jelitowych człowieka, aby dowiedzieć się, w jaki sposób droga infekcji może wpływać na reakcję komórki. Podkreślamy, jak przygotować próbki do sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki, biorąc pod uwagę przepisy dotyczące bezpieczeństwa biologicznego, których należy przestrzegać podczas pracy z patogenami kategorii 3.

Metodę tę można łatwo dostosować do innych patogenów i kultur organoidów. Najważniejszą kwestią jest upewnienie się, że modele organoidów są w pełni zróżnicowane w zależności od wybranej metody wysiewu i mogą wspierać infekcję wirusową. Przed zebraniem zakażonych organoidów należy usunąć jednokomórkowe kulki żelowe z minus 80 stopni Celsjusza i ogrzać je do temperatury pokojowej.

Dodatkowo zrównoważyć odczynnik RT, środek redukujący B i enzym RT C do temperatury pokojowej i ponownie zawiesić oligo przełącznika matrycowego zgodnie z opisem w instrukcjach producenta. Następnie, aby zebrać organoidy 3D zakażone patogenem BSL-3, wyjmij płytkę do hodowli komórkowej z inkubatora i umieść ją w kapturze do hodowli komórkowej. Następnie za pomocą pipety P1000 usuń pożywkę różnicującą z każdej studzienki 24-dołkowej płytki, dodaj 500 mikrolitrów lodowatego PBS do każdego dołka i inkubuj w temperaturze pokojowej przez trzy minuty.

Następnie, aby całkowicie rozbić roztwór macierzy zewnątrzkomórkowej, pipetuj w górę iw dół 10 razy, aby ponownie zawiesić PBS, macierz zewnątrzkomórkową i organoidy, a następnie przenieś zawieszone organoidy do 15-mililitrowej stożkowej probówki i umieść probówki na lodzie. Zbierz każdy stan infekcji w oddzielnych 15-mililitrowych stożkowych probówkach. Po zmianie rękawiczek wyczyść zewnętrzną część probówki i wyjmij probówkę z kaptura do hodowli komórkowych.

Wirować próbki przez pięć minut. Przenieś probówkę z powrotem do kaptura do hodowli komórkowej i wyjmij PBS, unikając ponownego zawieszenia osadu organoidu z dna probówki. Następnie ponownie zawieś osad w jednym mililitrze enzymu dysocjacyjnego.

następnie zmień rękawice, wyczyść probówkę i inkubuj próbki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Podczas inkubacji należy co 10 minut wkładać probówkę z powrotem do kaptura do hodowli komórkowej i ponownie zawiesić organoidy, pipetując w górę iw dół. Aby ustalić, czy organoidy są zdysocjowane na pojedyncze komórki, umieść 10 mikrolitrów zawiesiny organoidów w jednorazowym plastikowym szkiełku licznika komórek za pomocą pipety P10, a następnie uszczelnij port wejściowy próbki przezroczystą taśmą.

Po zmianie rękawiczek wyczyść zewnętrzną część licznika komórek i za pomocą mikroskopu Brightfield upewnij się, że utworzyła się zawiesina pojedynczej komórki. Po potwierdzeniu zawiesiny pojedynczej komórki zatrzymaj trawienie, dodając jeden mililitr pożywki DMEM F12 zawierającej 10% FBS i pipetę w górę iw dół 10 razy. Następnie zmień rękawice, wyczyść probówkę i odwiruj próbkę.

Po odwirowaniu ostrożnie usuń pożywkę zawierającą enzym dysocjacyjny, uważając, aby nie naruszyć osadu komórkowego na dnie. Następnie ponownie zawieś pojedyncze komórki w minimalnej objętości PBS zawierającej 0,1% BSA. Po przepuszczeniu zawiesiny komórek do probówki FACS przez filtr w celu usunięcia dużych grudek, umieść probówkę na lodzie.

Następnie, aby określić liczbę komórek na mikrolitr, dodaj 10 mikrolitrów zawiesiny komórek do jednorazowej plastikowej komory do liczenia komórek. Następnie uszczelnij port wejściowy próbki przezroczystą taśmą przed wyjęciem próbki z kaptura hodowli komórkowej. Zmień rękawiczki, wyczyść komorę zliczania komórek, a następnie policz liczbę komórek za pomocą mikroskopu Brightfield.

Następnie, w kapturze do hodowli komórkowych, przygotuj główną mieszankę odczynnika RT, oligo przełącznika matrycy, środka redukującego B i enzymu RT C w probówce o pojemności 1,5 mililitra zgodnie z instrukcjami producenta w zależności od liczby próbek w eksperymencie. Dla każdej próbki należy podsycić 33,4 mikrolitra mieszanki wzorcowej do probówki PCR, a następnie dodać komórki i wodę do mieszanki wzorcowej zgodnie z docelową liczbą komórek. Po zmianie rękawiczek przenieś pojedynczy kontroler komórkowy do kaptura hodowli komórkowej i przygotuj chip.

Następnie dodaj jednokomórkowy chip do uchwytu na chipsy i wypełnij nieużywane tory 50% glicerolu. Dodaj mieszankę główną, kulki i olej do rozdzielania do pasów zawierających próbki zgodnie z instrukcjami producenta i przykryj chip uszczelką. Po załadowaniu układu do sterownika uruchom program.

Po zakończeniu programu usuń chip i uszczelkę, a następnie za pomocą pipety wielokanałowej przenieś 100 mikrolitrów emulsji do czystych probówek PCR. Upewnij się, że każda emulsja ma jednolity biały kolor, co wskazuje, że wystąpiła cała emulsja. Po zmianie rękawiczek i oczyszczeniu probówek, przenieś probówki do PCR do maszyny do PCR i uruchom program.

Pod koniec serii PCR większość wirusów otoczkowych zostanie dezaktywowana. Reprezentatywne obrazy Brightfield w pierwszym, trzecim, piątym i siódmym dniu po rozszczepieniu organoidów są pokazane tutaj. Średnio organoidy są dzielone raz w tygodniu, gdy środki stają się ciemne.

Zmieniając warunki pożywki, usuwając Wnt-3a i redukując R-spondynę i nogginę, można naśladować złożoność komórkową znajdującą się w jelicie człowieka. Zwykle różnicowanie komórkowe w kierunku komórek Panetha, komórek kubkowych i enterocytów wymaga czterech dni pożywki różnicującej. Analiza danych sekwencjonowania pojedynczych komórek z organoidów pochodzących z ludzkiej okrężnicy i jelita krętego zakażonych SARS-CoV-2 wykazała, że tylko subpopulacja ludzkich komórek nabłonka jelitowego wspierała zakażenie SARS-CoV-2 po 12 i 24 godzinach.

Analiza wrodzonych odpowiedzi immunologicznych w organoidach pochodzących z jelita grubego zakażonych SARS-CoV-2 wykazała, że SARS-CoV-2 indukował prozapalną kaskadę sygnałową w zakażonych komórkach, podczas gdy niezakażone komórki osób postronnych wykazywały odpowiedź immunologiczną za pośrednictwem interferonu. Ponadto sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki wykazało, że zakażone komórki nie były w stanie wykryć interferonów z powodu zablokowania szlaku za pośrednictwem wirusa. Organoidy muszą być dobrze zróżnicowane i zdrowe.

Można to kontrolować, określając poziom markerów różnicowania komórek za pomocą qPCR przed zakażeniem. Jeśli komórki nie są dobrze zróżnicowane, nie będą wspierać infekcji wirusowej i doprowadzą do niepouczających wyników. Technika ta pozwala nam na zakażenie błony śluzowej zarówno od strony światła, jak i tkanki.

Jest to bardzo ważne, ponieważ pozwala nam rozwikłać mechanizmy wykorzystywane przez powierzchnie błony śluzowej do tolerowania brudnego środowiska z jednej strony i sterylnego z drugiej.