Name: Adaptacja organoidów przewodu pokarmowego do zakażenia patogenami i sekwencjonowania pojedynczych komórek w warunkach 3. poziomu bezpieczeństwa biologicznego (BSL-3) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Poznaj metodę infekcji ludzkich organoidów jelitowych w warunkach BSL-3 i analizy scRNA-seq, aby badać interakcje patogen-gospodarz na poziomie pojedynczych komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Megan Stanifer i Steeve Boulant byli wspierani przez granty badawcze z Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG): (Numer projektu 240245660, 278001972, 415089553 i 272983813 Steeve Boulant i 416072091 dla Megan Stanifer), kraju związkowego Badenia-Wirtembergia oraz Bundesministerium für Bildung und Forschung BMBF 01KI20239B do MS i 01KI20198A oraz (NUM-COVID 19, Organo-Strat 01KX2021) do SB. Schematy zostały stworzone w BioRender.

<ol><li>Kretzschmar, K., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids%3A+Modeling+development+and+the+stem+cell+niche+in+a+dish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Organoids: Modeling development and the stem cell niche in a dish.</a> Developmental Cell. 38, 590-600 (2016).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li>
<li>Tekes, G., Ehmann, R., Boulant, S., Stanifer, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+feline+ileum-+and+colon-derived+organoids+and+their+potential+use+to+support+feline+coronavirus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Development of feline ileum- and colon-derived organoids and their potential use to support feline coronavirus infection.</a> Cells. 9, (2020).</li>
<li>Derricott, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+a+3D+intestinal+epithelium+model+for+livestock+species%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Developing a 3D intestinal epithelium model for livestock species.</a> Cell and Tissue Research. 375, 409-424 (2019).</li>
<li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+of+bat+and+human+intestinal+organoids+by+SARS-CoV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Infection of bat and human intestinal organoids by SARS-CoV-2.</a> Nature Medicine. 26, 1077-1083 (2020).</li>
<li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growing+self-organizing+mini-guts+from+a+single+intestinal+stem+cell%3A+mechanism+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications.</a> Science. 340, 1190-1194 (2013).</li>
<li>Spence, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+intestinal+tissue+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro.</a> Nature. 470, 105-109 (2011).</li>
<li>de Graaf, M., van Beek, J., Koopmans, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+norovirus+transmission+and+evolution+in+a+changing+world%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Human norovirus transmission and evolution in a changing world.</a> Nature Reviews Microbiology. 14, 421-433 (2016).</li>
<li>Leshem, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-world+effectiveness+of+pentavalent+rotavirus+vaccine+among+bedouin+and+jewish+children+in+southern+Israel%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases+%3A+An+Official+Publication+of+the+Infectious+Diseases+Society+Of+America%22%5BJournal%5D)">Real-world effectiveness of pentavalent rotavirus vaccine among bedouin and jewish children in southern Israel.</a> Clinical Infectious Diseases : An Official Publication of the Infectious Diseases Society Of America. 62, Suppl 2 155-160 (2016).</li>
<li>Karst, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+commensal+bacteria+on+infection+with+enteric+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The influence of commensal bacteria on infection with enteric viruses.</a> Nature Reviews Microbiology. 14, 197-204 (2016).</li>
<li>Ettayebi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+of+human+noroviruses+in+stem+cell-derived+human+enteroids%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids.</a> Science. 353, 1387-1393 (2016).</li>
<li>de Wit, E., van Doremalen, N., Falzarano, D., Munster, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS+and+MERS%3A+recent+insights+into+emerging+coronaviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">SARS and MERS: recent insights into emerging coronaviruses.</a> Nature Reviews Microbiology. 14, 523-534 (2016).</li>
<li>Scaldaferri, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+thrilling+journey+of+SARS-CoV-2+into+the+intestine%3A+From+pathogenesis+to+future+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammatory+Bowel+Diseases%22%5BJournal%5D)">The thrilling journey of SARS-CoV-2 into the intestine: From pathogenesis to future clinical implications.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 26, 1306-1314 (2020).</li>
<li>Kipkorir, V., Cheruiyot, I., Ngure, B., Misiani, M., Munguti, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+SARS-CoV-2+RNA+detection+in+anal%2Frectal+swabs+and+stool+specimens+in+COVID-19+patients+after+negative+conversion+in+nasopharyngeal+RT-PCR+test%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Virology%22%5BJournal%5D)">Prolonged SARS-CoV-2 RNA detection in anal/rectal swabs and stool specimens in COVID-19 patients after negative conversion in nasopharyngeal RT-PCR test.</a> Journal of Medical Virology. 92, 2328-2331 (2020).</li>
<li>Lamers, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+productively+infects+human+gut+enterocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 productively infects human gut enterocytes.</a> Science. 369, 50-54 (2020).</li>
<li>Stanifer, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+of+type+III+interferon+in+controlling+SARS-CoV-2+Infection+in+human+intestinal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Critical role of type III interferon in controlling SARS-CoV-2 Infection in human intestinal epithelial cells.</a> Cell Reports. 32, 107863(2020).</li>
<li>Triana, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomics+reveals+immune+response+of+intestinal+cell+types+to+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomics reveals immune response of intestinal cell types to viral infection.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Triana, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analyses+reveal+SARS-CoV-2+interference+with+intrinsic+immune+response+in+the+human+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Single-cell analyses reveal SARS-CoV-2 interference with intrinsic immune response in the human gut.</a> Molecular Systems Biology. 17, 10232(2021).</li>
<li>Tang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA-Seq+whole-transcriptome+analysis+of+a+single+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell.</a> Nature Methods. 6, 377-382 (2009).</li>
<li>Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+technologies+and+bioinformatics+pipelines%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+%26+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines.</a> Experimental & Molecular Medicine. 50, 1-14 (2018).</li>
<li>García-Rodríguez, I., Sridhar, A., Pajkrt, D., Wolthers, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Put+some+guts+into+it%3A+Intestinal+organoid+models+to+study+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Put some guts into it: Intestinal organoid models to study viral infection.</a> Viruses. 12, 1288(2020).</li>
<li>Stanifer, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+distribution+of+TLR3+leads+to+a+polarized+immune+response+in+human+intestinal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Asymmetric distribution of TLR3 leads to a polarized immune response in human intestinal epithelial cells.</a> Nature Microbiology. 5, 181-191 (2020).</li>
<li>Lees, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+intestinal+organoids+to+study+and+modify+epithelial+cell+protection+against+salmonella+and+other+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Using human induced pluripotent stem cell-derived intestinal organoids to study and modify epithelial cell protection against salmonella and other pathogens.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59478(2019).</li>
<li>Mahe, M. M., Sundaram, N., Watson, C. L., Shroyer, N. F., Helmrath, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+human+epithelial+enteroids+and+colonoids+from+whole+tissue+and+biopsy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (97), e52483(2015).</li>
<li>Fujii, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Intestinal+organoids+maintain+self-renewal+capacity+and+cellular+diversity+in+niche-inspired+culture+condition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Human Intestinal organoids maintain self-renewal capacity and cellular diversity in niche-inspired culture condition.</a> Cell Stem Cell. 23 (6), 787-793 (2018).</li>
<li>Bartfeld, S., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+as+model+for+infectious+diseases%3A+Culture+of+human+and+murine+stomach+organoids+and+microinjection+of+Helicobacter+Pylori%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Organoids as model for infectious diseases: Culture of human and murine stomach organoids and microinjection of Helicobacter Pylori.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53359(2015).</li>
<li>Hernandez, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-lambda+and+interleukin+22+act+synergistically+for+the+induction+of+interferon-stimulated+genes+and+control+of+rotavirus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Interferon-lambda and interleukin 22 act synergistically for the induction of interferon-stimulated genes and control of rotavirus infection.</a> Nature Immunology. 16, 698-707 (2015).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Patogeny jelitowe najczęściej rozpoczynają swój cykl życiowy poprzez zakażenie komórek nabłonka jelitowego od strony wierzchołkowej skierowanej w stronę światła jelita. Chociaż organoidy są dobrze uznawane za dobry model do odtwarzania złożoności komórkowej i organizacji nabłonka jelitowego, ich organizacja jako trójwymiarowych, zamkniętych struktur sprawia, że ich błona wierzchołkowa jest niedostępna dla patogenu. W protokole tym opisano metody infekowania organoidów jelitowych od strony wierzchołkowej, podstawno-bocznej lub obu patogenami BLS-3. Protokoły te można łatwo dostosować do badania dowolnego patogenu jelitowego w ramach hermetyzacji BSL-2 lub BLS-3 lub dowolnego innego modelu organoidowego, wykonując kilka krytycznych kroków, które przedstawiono poniżej. Opisana powyżej metoda służy do izolacji i przygotowania kropelek jednokomórkowych zgodnie z przepisami obowiązującymi w Niemczech. Jako zastrzeżenie, protokół ten nie opisuje środków postępowania z bezpieczeństwem biologicznym (standardowe procedury operacyjne), które należy podjąć podczas pracy w warunkach BSL-3. Ważne jest również, aby nalegać, aby pamiętać, że przepisy mogą się różnić w innych krajach i że należy skontaktować się z lokalnymi władzami, aby upewnić się, że wszystkie lokalne przepisy są przestrzegane.
Jednym z kluczowych etapów sadzenia organoidów w dwóch wymiarach dla infekcji wierzchołkowej jest kontrolowanie, czy komórki będą się podobnie różnicować w porównaniu z tymi, gdy są hodowane jako klasyczne organoidy trójwymiarowe. W zależności od patogenu jelitowego, tropizm może być ograniczony do bardzo rzadkich komórek lub do komórek, które muszą być wysoce zróżnicowane. W tym przypadku użycie dwuwymiarowego organoidu, który nie jest w pełni zróżnicowany, może prowadzić do błędnego wniosku, że ten patogen jelitowy nie może infekować organoidów jelitowych. Sugeruje się, jeśli to możliwe, przeprowadzanie infekcji przy użyciu trzech konfiguracji tego protokołu: organoid 2D tylko do infekcji wierzchołkowej (sekcja 2), pęknięte otwarte organoidy 3D do infekcji wierzchołkowej i podstawno-bocznej (sekcja 3) oraz pełne organoidy 3D tylko do infekcji podstawno-bocznej (sekcja 3). Takie podejście pomoże dostrzec drogę wejścia patogenu (wierzchołkowa lub podstawno-boczna), a także będzie kontrolować, czy osiągnięto podobny poziom zróżnicowania. Alternatywą dla infekcji wierzchołkowej 2D jest mikroiniekcja, która wykorzystuje organoid 3D, ale dostarcza patogen bezpośrednio do strony wierzchołkowej (szczegóły w Bartfeld i wsp.27 ). Ta metoda wymaga wykwalifikowanego wstrzykiwacza, aby upewnić się, że patogen jest prawidłowo umieszczony, a organoidy pozostają nienaruszone. Mikroiniekcja jest powszechnie stosowana w hermetyzacji BSL-2 i może nie być odpowiednia do hermetyzacji BSL-3.
Dodatkową ważną kwestią podczas przeprowadzania eksperymentów z infekcją w organoidach zasiewanych 2D jest ostateczna gęstość komórek. Jak wspomniano w kroku 2.3, 100-150 organoidów zostanie wysianych w jednym dołku na 48-dołkowej płytce lub w jednym dołku 8-dołkowego szkiełka komorowego ze szklanym dnem. W zależności od linii organoidów i osoby zajmującej się organoidami, rozmiar tych organoidów może się znacznie różnić. Może to skutkować bardzo różną gęstością komórek w 48-dołkowej płytce lub 8-dołkowym szkiełku ze szklanym dnem. W zależności od wirusa jelitowego, niektóre wirusy preferują rzadsze komórki, podczas gdy inne będą również w stanie infekować zbiegające się komórki. Molekularne pochodzenie takich różnic w zakaźności dla różnych zbiegów komórek nie jest jasne; W związku z tym przed przeprowadzeniem dalszej charakterystyki należy przeprowadzić eksperymenty pilotażowe mające na celu znalezienie najlepszej gęstości komórek dla wybranego patogenu jelitowego.
Często sortowanie FACS przeprowadza się przed wykonaniem emulsji kropelkowej z jednej komórki. Ten krok jest często używany do oddzielania martwych komórek od żywych i pojedynczych komórek od dubletów. Podczas pracy z patogenami BSL-3 wymaga to wyposażenia obiektu w odpowiedni sorter FACS, co nie zdarza się często. Co więcej, nie wszystkie komórki w organoidzie mają ten sam rozmiar i często trudno jest odróżnić dublet od większej komórki, co powoduje ryzyko negatywnej selekcji przeciwko określonemu typowi komórki. Wciąż toczy się również dyskusja w tej dziedzinie, czy czas potrzebny na sortowanie między 5 000-10 000 dla każdej próbki może skutkować znaczącą modyfikacją profilu transkryptu poszczególnych komórek. Chociaż opisano metody utrwalania komórek zgodne z sekwencjonowaniem pojedynczych komórek (np. metanol i RNAassist), zaobserwowano, że prowadzi to do obniżenia jakości sekwencjonowania18. Wreszcie, podejrzewa się, że sortowanie komórek za pomocą markerów śmierci komórki może również prowadzić do stronniczości. Biorąc pod uwagę kierunkową proliferację i różnicowanie komórek przez oś krypta-kosmki, najbardziej zróżnicowane komórki, które zostaną zrzucone i uwolnione, znajdują się na końcu kosmków. Komórki te są często dodatnie dla różnych markerów szlaków śmierci komórkowej (np. apoptozy, nekrozy i nekroptozy); Jednak patrząc na zakażenie rotawirusem jelita myszy, czubek kosmków jest najbardziej zainfekowanym obszarem28. Tak więc odfiltrowanie komórek, które mogą wyglądać na pozytywne pod kątem markerów śmierci, skutkowałoby negatywną selekcją zainfekowanych komórek, które mogą reprezentować infekcję fizjologiczną. Obecnie nie ma dobrego rozwiązania do sortowania i utrwalania organoidów przed sekwencjonowaniem pojedynczych komórek. Zaleca się stosowanie żywych, nieposortowanych komórek, ponieważ potrzebne są dalsze badania w celu znalezienia odpowiednich alternatywnych protokołów.
Sekwencjonowanie pojedynczych komórek zrewolucjonizowało sposób oceny odpowiedzi komórkowych. Technika ta pozwala na identyfikację odpowiedzi specyficznych dla linii komórkowej zarówno w warunkach podstawowych, jak i w przypadku infekcji patogennych. Ta metoda otworzyła drzwi w wielu dziedzinach, które wcześniej były ograniczone przez odczyty masowe. Chociaż ta metoda jest bardzo potężna, ma swoje ograniczenia. Kluczowym ograniczeniem jest obszerna analiza bioinformatyczna, która jest wymagana po sekwencjonowaniu. Jest to szczególnie ważne podczas analizy tkanek i przypisywania typów komórek, w przypadku których obecnie nie ma adnotacji. Posiadanie wykwalifikowanego bioinformatyka jest wymagane do wspierania wszystkich badań nad pojedynczymi komórkami.
Protokół ten opisuje, jak wysiewać i obchodzić się z ludzkimi organoidami jelitowymi, infekować je patogenami jelitowymi i wykonywać sekwencję scRNAseq. Adaptacja tego podejścia do innych narządów jest obecnie możliwa, ponieważ dla większości narządów opracowano systemy modeli organoidów. Organoidy płuc i wątroby są podobnie zorganizowane w porównaniu z organoidami jelitowymi i jako takie, stosując analogiczne podejście, można je przetransponować do tych organoidów. Krytyczna kontrola będzie polegała na sprawdzeniu, czy po wyhodowaniu w dwóch wymiarach lub pęknięciu, organoidy te osiągają podobne zróżnicowanie, jak ich odpowiedniki organoidowe 3D. Specyficzne cechy i geny, które definiują zróżnicowany status, są specyficzne dla każdego modelu narządu. Inne modele organoidów, takie jak organoidy nerkowe i naczyniowe, duże gęste struktury, będą wymagały dodatkowych metod seryjnej dysocjacji tych struktur na pojedyncze komórki.

Badanie tropizmu specyficznego dla typu komórki i specyficznej dla typu komórki odpowiedzi immunologicznej na ludzkie wirusy jelitowe było historycznie trudne ze względu na brak pierwotnych modeli komórkowych człowieka. To ograniczenie zostało częściowo wyeliminowane wraz z rozwojem organoidów1. W przypadku przewodu pokarmowego opracowano modele organoidów żołądka i jelit dla ludzi i kilku innych gatunków (np. myszy, bydła, kotów, nietoperzy)2,3,4,5,6. Organoidy jelitowe odtwarzają architekturę strukturalną ludzkiego nabłonka jelitowego i zawierają struktury kryptowe i kosmkowe, funkcjonalne linie jelitowe, a nawet zostały wykorzystane do identyfikacji nieznanych wcześniej linii komórkowych. Do hodowli organoidów jelitowych można zastosować dwa różne podejścia. Po pierwsze, jelitowe komórki macierzyste zawierające krypty są izolowane z resekcji tkanek lub biopsji i hodowane w określonych warunkach hodowli (np. Wnt3A, R-spondin, Noggin i EGF) w celu namnażania, a następnie różnicowania komórek macierzystych do większości linii komórek jelitowych (np. enterocytów, komórek Panetha, komórek kubkowych, komórek enteroendokrynnych)7. Metoda ta pozwala na wyizolowanie organoidów ze wszystkich odcinków przewodu pokarmowego (np. żołądka, dwunastnicy, jelita czczego, jelita krętego i jelita grubego). Druga metoda opiera się na indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych lub embrionalnych komórkach macierzystych, które są następnie różnicowane w procesie stopniowym w komórki nabłonka jelitowego8. Te indukowane organoidy oparte na komórkach macierzystych są często opisywane jako mające bardziej embrionalny charakter w porównaniu z organoidami pochodzącymi od pacjentów. Chociaż wszystkie te modele organoidów miały kluczowe znaczenie dla rozwikłania wskazówek rozwojowych potrzebnych do uformowania przewodu pokarmowego, ich zastosowanie w badaniach nad chorobami zakaźnymi jest wciąż w powijakach.
Wirus jelitowy to szerokie pojęcie obejmujące wszystkie wirusy, które infekują przez przewód pokarmowy, takie jak pikornawirusy (np. EV-71), reowirusy (np. rotawirus) i kaliciwirusy (np. norowirus)9. Wirusy jelitowe inicjują swój zakaźny cykl życiowy poprzez spożycie skażonej żywności i wody, co naraża ludzi w krajach rozwijających się na wysokie ryzyko z powodu odprowadzania nieprzetworzonych odpadów do środowiska i braku opieki medycznej po wystąpieniu infekcji10. W zależności od rodzaju patogenu infekcja może prowadzić do zapalenia żołądka i jelit, wymiotów i/lub wodnistej biegunki z powodu nieszczelności błony śluzowej jelit. Ludzkie norowirusy są bardzo rozpowszechnionym i wysoce zakaźnym patogenem jelitowym, który prowadzi do ponad 600 milionów infekcji i 15 milionów hospitalizacji na całym świecie11. Organoidy odegrały kluczową rolę w badaniach nad norowirusami, ponieważ wspomagają infekcję i replikację ludzkiego norowirusa, który wcześniej nie mógł być hodowany w standardowych modelach hodowli komórkowych12.
W ciągu ostatnich dwóch dekad koronawirusy stały się kluczowymi patogenami dla ludzi13. Rodzina ta obejmuje wysoce zjadliwe MERS, SARS-CoV-1 i SARS-CoV-2, które wymagają ścisłego poziomu bezpieczeństwa podczas prowadzenia badań nad tymi wirusami. Co ciekawe, podczas gdy wszystkie trzy z tych patogenów są w większości rozpoznawane ze względu na wywołane objawy ze strony układu oddechowego i niepokój, obecnie jest oczywiste, że wirusy te infekują nie tylko drogi oddechowe, ale także inne narządy. Ważną patologią indukowaną u pacjentów zakażonych SARS-CoV-2 oprócz niewydolności oddechowej jest obecność objawów żołądkowo-jelitowych14. U części pacjentów zakażonych SARS-CoV-2 występują takie objawy, od bardzo łagodnej do ciężkiej biegunki. Dodatkowo genomy SARS-CoV-2 można wykryć w biopsjach kału i przewodu pokarmowego zakażonych pacjentów15. Co ważne, występowanie objawów żołądkowo-jelitowych nie ogranicza się tylko do SARS-CoV-2, ponieważ obserwowano je również u pacjentów zakażonych MERS i SARS-CoV-1. Aby zrozumieć, w jaki sposób SARS-CoV-2 wywołuje zaburzenia żołądkowo-jelitowe i precyzyjnie zidentyfikować tropizm SARS-CoV-2 w przewodzie pokarmowym, ludzkim organoidem jelitowym były kluczowe narzędzie i są obecnie wykorzystywane do odkrywania specyficznych dla typu komórek odpowiedzi na ten patogen16,17.
Profilowanie transkrypcyjne populacji komórek (masowe sekwencjonowanie RNA) było standardową praktyką przy ocenie infekcji patogenami zarówno unieśmiertelnionych linii komórkowych, jak i organoidów. Podczas gdy pozwala nam to określić globalne zmiany w odpowiedzi na patogeny (np. regulacja w górę cytokin), masowy RNAseq nie pozwala nam określić, dlaczego określone komórki w populacji są bardziej podatne na infekcję niż inne. Sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki (scRNAseq) stało się potężnym narzędziem do odkrywania programów transkrypcyjnych specyficznych dla linii komórkowej i może być używane do określania, w jaki sposób programy te wspierają lub tłumią infekcję wirusową18,19. Pierwszy opis scRNAseq został opublikowany w 2009 roku i został wykorzystany do oceny profili transkrypcyjnych różnych komórek znalezionych w mysim blastomerze20. Technologie te zostały obecnie rozszerzone i mogą być wdrażane za pośrednictwem kilku różnych platform. Wczesne wersje tej technologii wykorzystywały aktywowany fluorescencją sorter komórek (FACS) do oddzielania pojedynczych komórek do sekwencjonowania, które często ograniczało się do 96- lub 384-dołkowych płytek, dając w ten sposób 300 pojedynczych komórek do analizy na próbkę21. Metody te zostały obecnie udoskonalone przez platformy sekwencjonowania pojedynczych komórek, które wykorzystują urządzenie mikroprzepływowe do hermetyzacji pojedynczych komórek w pojedyncze kropelki z kodem kreskowym zawierającym kulki. Technologia ta pozwala na pobranie do 10 000 komórek w każdym warunku próbki.
Połączenie technologii organoidów z scRNAseq pozwala nam badać, jak patogeny jelitowe wpływają na przewód pokarmowy w sposób specyficzny dla typu komórki. Należy jednak wziąć pod uwagę kilka kwestii technicznych i związanych z bezpieczeństwem biologicznym. Przede wszystkim klasyczne metody hodowli organoidów (organoidy trójwymiarowe (3D), osadzone w macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM)) eksponują podstawno-boczną stronę komórek nabłonka na zewnątrz organoidu. Ponieważ patogeny jelitowe inicjują infekcję poprzez spożycie skażonej żywności/wody, infekcja najczęściej rozpoczyna się od wierzchołkowej strony komórek, która nie jest dostępna w tych organoidach jelitowych 3D. W związku z tym organoidy muszą być przygotowane tak, aby strona wierzchołkowa była dostępna dla infekcji patogenem albo poprzez wysiew 2D, bezpośrednio odsłaniając wierzchołkową stronę komórek, albo poprzez mikroiniekcję22,23. Po drugie, aby przeprowadzić sekwencję scRNAseq zakażonych próbek biologicznych, ważne jest, aby wziąć pod uwagę ich zakaźny charakter. Chociaż zaproponowano metody naprawy komórek i inaktywacji patogenów przed izolacją pojedynczej komórki w celu późniejszego sekwencjonowania RNAseq, metody te często prowadzą do spadku jakości sekwencjonowania18. Poniższy protokół opisuje kilka podejść do infekowania organoidów jelitowych wirusami jelitowymi, biorąc pod uwagę stronę infekcji (infekcja wierzchołkowa vs. podstawno-boczna) (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1). Dodatkowo, protokół będzie zawierał przepływ pracy w celu dysocjacji i izolacji pojedynczych komórek z organoidów zakażonych wysoce zjadliwymi wirusami dla scRNAseq. Protokół podkreśli kluczowe kroki, które należy wdrożyć podczas pracy w warunkach hermetyczności na poziomie bezpieczeństwa biologicznego 3 (BSL-3), aby uniknąć generowania aerozoli i potencjalnego skażenia.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; Rekombinowana mysia noggin</td><td>Peprotech</td><td>Cat#250-38</td><td></td></tr><tr><td>[Leu15]-Gastrin I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# G9145</td><td></td></tr><tr><td>0,05% Trypsin-EDTA</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>Cat#25300054</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowa płytka niepoddana hodowli komórkowej</td><td>Corning</td><td>Cat#3738</td><td></td></tr><tr><td>8-dołkowa szklana zjeżdżalnia z dolną komorą</td><td>Wózek iBIDI</td><td>#80827</td><td></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Tocris</td><td>Cat#2939</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Thermo Fischer Scientific Cat</td><td># 12634010</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Thermo Fischer Scientific Cat</td><td>#17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Kontroler chromu i Następny GEM Accessory Kit</td><td>10X Genomics</td><td>Cat#1000202</td><td>Stosowany do przygotowania roztworu jednokomórkowego i przygotowania Gel beads-in-emulsion (GEM)</td></tr><tr><td>Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit</td><td>10X Genomics</td><td>Cat #1000127</td><td>Stosowany do przygotowania roztworu jednokomórkowego i przygotowania Żel perełkowy w emulsji (GEM)</td></tr><tr><td>Chrom Next GEM Single Cell 3&prime; Zestaw v3.1</td><td>10X Genomics</td><td>Cat#1000268</td><td>Służy do przygotowania roztworu jednokomórkowego i przygotowania żelu perełek w emulsji (GEM)</td></tr><tr><td>Kolagenu z ludzkiego łożyska</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat#C5533-5MG</td><td></td></tr><tr><td>CYP34A forward</td><td>Eurofins</td><td>GATGGCTCTCATCCCAGACTT</td><td>Startery używane do sprawdzania różnicowania</td></tr><tr><td>CYP3A4 odwrócony</td><td>Eurofins</td><td>AGTCCATGTGAATGGGTTCC</td><td>Startery używane do sprawdzania zróżnicowania</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>Cat#11320074</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Car#E9884</td><td></td></tr><tr><td>Fast Read 102 szkiełki liczące</td><td>Biosigma</td><td>Cat# BVS100</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica Bovein Serum (FBS)</td><td>Koziorożec</td><td>Kot#FBS-12A</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>Cat# 35050061</td><td></td></tr><tr><td>Ogniwa HEPES</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>Cat3 15630080</td><td></td></tr><tr><td>L-WRN</td><td>ATCC</td><td>CRL-3276</td><td>Ta linia komórkowa służy do wytwarzania kondycjonowanych pożywek zawierających Wnt 3A, R-Spondynę i Noggin. Protokół produkcji kondycjonowanych pożywek można znaleźć na stronie producenta.</td></tr><tr><td>MatriGel. GFR, LDEV free</td><td>Corning</td><td>Cat#354230</td><td></td></tr><tr><td>MUC-2 forward</td><td>Eurofins</td><td>TGTAGGCATCCTCTTCTCA</td><td>Startery używane do sprawdzania różnicowania</td></tr><tr><td>MUC-2 reverse</td><td>Eurofins</td><td>GACACCATCTACCTCACCCG</td><td>Startery używane do sprawdzania różnicowania</td></tr><tr><td>N-acetylo-cysteina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Cat# A9165</td><td></td></tr><tr><td>OLMF4 forward</td><td>Eurofins</td><td>ACCTTTCCCGTGGACAGAGT</td><td>Startery używane do sprawdzania różnicowania</td></tr><tr><td>OLMF4 reverse</td><td>Eurofins</td><td>TGGACATATTCCCTCACTTTGGA</td><td>Startery używane do sprawdzania różnicowania</td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>Cat#15140122</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki FGF basic</td><td>Peprotech</td><td>Cat#100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki IGF-1</td><td></td><td>BioLegend Cat#590904</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana mysz EGF</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>Cat# PMG8043</td><td></td></tr><tr><td>SI forward</td><td>Eurofins</td><td>AATCCTTTTGGCATCCAGATT</td><td>Startery używane do sprawdzania różnicowania</td></tr><tr><td>SI reverse</td><td>Eurofins</td><td>GCAGCCAAGAATCCCAAT</td><td>Startery używane do sprawdzania różnicowania</td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>Cat#12605036</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Caymann Chemicals</td><td>Cat#10005583</td><td></td></tr></tbody></table>

adaptacja organoidów przewodu pokarmowego do zakażenia patogenami i sekwencjonowania pojedynczych komórek w warunkach 3. poziomu bezpieczeństwa biologicznego (bsl-3)

Adapting Gastrointestinal Organoids for Pathogen Infection and Single Cell Sequencing under Biosafety Level 3 (BSL-3) Conditions

Organoidy jelitowe człowieka stanowią najlepszy model komórkowy do badania infekcji patogenów przewodu pokarmowego. Organoidy te mogą pochodzić ze wszystkich odcinków przewodu pokarmowego (żołądek, jelito czcze, dwunastnica, jelito kręte, okrężnica, odbytnica) i po różnicowaniu zawierają większość typów komórek, które naturalnie występują w każdym pojedynczym odcinku. Na przykład organoidy jelitowe zawierają enterocyty wchłaniające składniki odżywcze, komórki wydzielnicze (Czara, Paneth i enteroendokrynne), komórki macierzyste, a także wszystkie produkty pośrednie różnicowania specyficzne dla linii (np. wczesne lub niedojrzałe typy komórek). Największą zaletą stosowania organoidów pochodzących z przewodu pokarmowego do badania chorób zakaźnych jest możliwość precyzyjnego określenia, który typ komórki jest celem patogenu jelitowego i ustalenia, czy różne odcinki przewodu pokarmowego i ich specyficzne typy komórek podobnie reagują na wyzwania związane z patogenami. W ciągu ostatnich lat modele przewodu pokarmowego, a także organoidy z innych tkanek, zostały wykorzystane do badania tropizmu wirusowego i mechanizmów patogenezy. Jednak wykorzystanie wszystkich zalet stosowania organoidów w przypadku wysoce zjadliwych wirusów stanowi wyzwanie techniczne i wymaga ścisłych względów bezpieczeństwa biologicznego. Dodatkowo, ponieważ organoidy są często hodowane w trzech wymiarach, podstawno-boczna strona komórek jest skierowana na zewnątrz organoidu, podczas gdy ich wierzchołkowa strona jest skierowana do wnętrza (światła) organoidów. Organizacja ta stanowi wyzwanie dla patogenów jelitowych, ponieważ wiele infekcji jelitowych rozpoczyna się od wierzchołkowej/luminalnej strony komórek po spożyciu. Poniższy manuskrypt zapewni kompleksowy protokół przygotowania organoidów jelitowych człowieka do zakażenia patogenami jelitowymi poprzez uwzględnienie strony infekcji (wierzchołkowej vs. podstawno-bocznej) w celu przeprowadzenia sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki w celu scharakteryzowania interakcji gospodarz/patogen specyficznych dla typu komórki. Metoda ta szczegółowo opisuje przygotowanie organoidów, jak również względy potrzebne do wykonania tej pracy w warunkach hermetyczności na poziomie bezpieczeństwa biologicznego 3 (BSL-3).

Przygotowanie organoidów do sekwencjonowania pojedynczych komórek 
Wyniki sekwencjonowania pojedynczych komórek są w dużym stopniu zależne od zastosowania komórek wysokiej jakości. Aby zapewnić wysoką jakość organoidów, należy je odpowiednio hodować i codziennie obserwować, aby określić moment, w którym będą gotowe do pasażowania (Rycina 2). Termin pasażowania organoidów zależy od dawcy; niektóre organoidy rosną szybciej i wymagają pasażowania co 5 dni, podczas gdy inne rosną wolniej i wymagają pasażowania co 10 dni. Średnio organoidy pasażuje się raz w tygodniu, gdy ich środki stają się ciemne (Rycina 2B). Jeśli organoidy urosną zbyt duże i w ich centrum nagromadzi się zbyt wiele martwych komórek, organoid obumrze.
Organoidy są utrzymywane w pożywce zawierającej wysoką ilość Wnt3A. Wspiera to niszę komórek macierzystych i sprzyja dalszemu wzrostowi oraz proliferacji organoidów. W tych warunkach wzrostu organoidy zawierają dużą liczbę komórek macierzystych i komórek tranzytowo wzmacniających oraz mniejszą liczbę zróżnicowanych populacji komórek, takich jak dojrzałe enterocyty, komórki kubkowe i komórki enteroendokrynne. Jednak aby naśladować złożoność komórkową występującą w ludzkim jelicie, istotne jest stymulowanie różnicowania komórek i zwiększenie produkcji tych typów komórek. Osiąga się to poprzez zmianę warunków pożywki, usunięcie Wnt3A oraz zmniejszenie ilości R-Spondin i Noggin (Tabela 1). Zazwyczaj różnicowanie komórkowe w kierunku enterocytów, komórek kubkowych i komórek enteroendokrynnych wymaga 4 dni przebywania w pożywce różnicującej (Rysunek 3). Uzyskanie prawidłowego różnicowania jest kluczowe, w przeciwnym razie ocena tropizmu patogenów oraz odpowiedzi specyficznych dla danego typu komórek będzie utrudniona.
Potwierdzenie inaktywacji patogenów BSL-3 
Pełną inaktywację należy potwierdzić przy użyciu wybranego patogenu i zwalidować, że usunięcie cDNA z laboratorium BSL-3 jest bezpieczne. W przypadku SARS-CoV-2 pełna inaktywacja wirusa została zwalidowana poprzez pobranie 100 μL SARS-CoV-2 i inkubację w termocyklerze przez 5 min w 85 °C. Następnie wirus został dodany do naiwnych komórek Vero, a infekcję wirusową porównano z wirusem niepoddanym obróbce termicznej za pomocą immunofluorescencji oraz testów płytkowych w odstępach 24 h, 48 h i 72 h po infekcji, aby upewnić się, że wszystkie cząsteczki nie są już zakaźne. Wyniki te przesłano do lokalnego organu regulacyjnego, a po uzyskaniu ich zgody przeprowadzono eksperyment jednokomórkowy oraz przetwarzanie cDNA.
Wyniki sekwencjonowania pojedynczych komórek 
Aby ocenić, w jaki sposób SARS-CoV-2 infekuje organoidy ludzkiego okrężnicy i jelita cienkiego, przeprowadzono sekwencjonowanie pojedynczych komórek. Organoidy przygotowano zgodnie z powyższym opisem i zainfekowano w formacie 2D, aby umożliwić apikalną infekcję przez SARS-CoV-2. Zainfekowane komórki zebrano 12 h i 24 h po infekcji, a następnie poddano je sekwencjonowaniu pojedynczych komórek według opisanego wcześniej schematu. Analiza danych z sekwencjonowania pojedynczych komórek pozwoliła ustalić, że tylko subpopulacja (niedojrzałe enterocyty 2) ludzkich komórek nabłonka jelitowego umożliwiała infekcję SARS-CoV-2 (Rysunek 4). Ponieważ nie wszystkie komórki w populacji zostały zainfekowane, przeanalizowano zarówno komórki zainfekowane, jak i niezinfekowane komórki sąsiednie (Rysunek 5). Wyniki te wykazały, że SARS-CoV-2 indukuje prozapalną kaskadę sygnałową w komórkach zainfekowanych, podczas gdy niezinfekowane komórki sąsiednie wykazywały odpowiedź immunologiczną zapśredniczoną przez interferony. Ponadto scRNA-Seq wykazał, że komórki zainfekowane były niezdolne do wykrywania interferonów z powodu wirusowej blokady tej ścieżki (Rysunek 5). Uzyskanie tych informacji nie było możliwe przy zastosowaniu sekwencjonowania bulk RNA.
<img alt="Schemat zakażenia komórkowego; metody 2D/3D, apikalne/bazolateralne, analiza wykresu t-SNE." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62857/62857fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schemat przedstawiający trzy różne metody przygotowania ludzkich organoidów jelitowych do zakażenia patogenami jelitowymi. Zakażenie apikalne można przeprowadzić poprzez wysiew organoidów jelitowych w 2D. Zakażenie apikalne i bazolateralne można przeprowadzić poprzez rozbicie organoidu 3D. Ostatecznie, zakażenie wyłącznie bazolateralne można przeprowadzić poprzez zakażenie nienaruszonych organoidów jelitowych 3D. Każda z tych metod może być wykorzystana do generowania próbek do sekwencjonowania pojedynczych komórek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62857/62857fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat hodowli komórkowej i obrazy mikroskopowe przedstawiające oś czasu: pasażowanie, wymiana pożywki; dni 1-7." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62857/62857fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Schemat utrzymania organoidów i reprezentatywne obrazy w polu jasnym. (A) Schemat utrzymania i pasażowania ludzkich organoidów jelitowych. (B). Reprezentatywne obrazy w polu jasnym z dni 1, 3, 5 i 7 po pasażowaniu. Do 7 dnia organoidy stają się duże i ciemne z powodu gromadzenia się martwych komórek i są gotowe do pasażowania. Pasek skali wskazuje 25 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62857/62857fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Porównanie ekspresji genów; wykresy kropkowe, komórki macierzyste, Panetha, kubkowe, enterocyty; w stosunku do HPRT1; analiza." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62857/62857fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Reprezentatywne wyniki qPCR ludzkich organoidów jelitowych 4 dni po przełączeniu na pożywkę różnicującą. Organoidy jelitowe utrzymywano w pożywce wzrostowej lub przełączono na pożywkę różnicującą na 4 dni. Wyizolowano RNA i przeprowadzono qPCR dla markerów komórek macierzystych (OLFM4), komórek Panetha (LYZ), komórek kubkowych (MUC2) oraz enterocytów (SI). N = 5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62857/62857fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Diagram UMAP ekspresji SARS-CoV-2 w komórkach okrężnicy i jelita krętego; wykresy słupkowe proporcji zainfekowanych komórek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62857/62857fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Identyfikacja populacji komórek zainfekowanych przez SARS-CoV-2. Organoidy pochodzące z ludzkiej okrężnicy i jelita krętego zostały zainfekowane SARS-CoV-2. Po 12 i 24 h od infekcji zebrano komórki i poddano je sekwencjonowaniu RNA pojedynczych komórek, aby zidentyfikować, które populacje komórek wspierają infekcję SARS-CoV-2. Stwierdzono, że infekcja wirusem zwiększała się w czasie i dotyczyła głównie niedojrzałych enterocytów 2. Rysunek ten został zmodyfikowany na podstawie pracy Triana et al.19. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62857/62857fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza ekspresji genów w jelicie grubym; wykresy A-C: log2 zmiany krotności względem wartości p; D-E: wykres kropkowy ekspresji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62857/62857fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Określenie wrodzonej odpowiedzi immunologicznej. Organoidy pochodzące z ludzkiego jelita grubego zostały zainfekowane wirusem SARS-CoV-2. Po 12 i 24 h od infekcji komórki zostały zebrane i poddane sekwencjonowaniu RNA z pojedynczych komórek w celu określenia wrodzonej odpowiedzi immunologicznej zarówno w komórkach zainfekowanych wirusem, jak i niezainfekowanych komórkach postronnych. Komórki zainfekowane SARS-CoV-2 wykazały silną odpowiedź prozapalną, podczas gdy niezainfekowane komórki postronne wykazały odpowiedź zależną od interferonu. Rycina zmodyfikowana na podstawie pracy Triana et al.19. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62857/62857fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td colspan="2">Pożywka wzrostowa</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Składnik</td>
			<td >Stężenie końcowe</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Ad DMEM/F12</td>
			<td >GlutaMAX (1X)</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >+GlutaMAX</td>
			<td >HEPES 1 mM</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >+HEPES</td>
			<td >Pen 10 U/mL</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >+P/S</td>
			<td >Strep 10 µg/mL</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >L-WRN</td>
			<td >50% objętościowo</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >B27</td>
			<td >01:50</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >N-acetylocysteina</td>
			<td >1 mM</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >EGF</td>
			<td >50 ng/mL</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >A83-01</td>
			<td >500 nM</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >IGF-1</td>
			<td >100 ng/mL</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >FGF basic</td>
			<td >50 ng/mL</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Gastryna</td>
			<td >10 mM</td>
		</tr >
		<tr >
			<td colspan="2">Pożywka różnicowania</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Składnik</td>
			<td >Stężenie końcowe</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Ad DMEM/F12</td>
			<td >GlutaMAX (1x)</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >+GlutaMAX</td>
			<td >HEPES 1 mM</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >+HEPES</td>
			<td >Pen 10 U/mL</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >+P/S</td>
			<td >Strep 10 µg/mL</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >B27</td>
			<td >01:50</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >N-acetylocysteina</td>
			<td >1 mM</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >R-spondyna</td>
			<td >5% objętościowo</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Noggin</td>
			<td >50 ng/mL</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >EGF</td>
			<td >50 ng/mL</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Gastryna</td>
			<td >10 mM</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >A83-01</td>
			<td >500 nM</td>
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 1: Skład pożywek do wzrostu i różnicowania.

Ten protokół opisuje, jak infekować ludzkie organoidy jelitowe od ich wierzchołkowej lub podstawno-bocznej strony, aby scharakteryzować interakcje gospodarz/patogen na poziomie pojedynczej komórki za pomocą technologii sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki (scRNAseq).

Adaptacja organoidów przewodu pokarmowego do zakażenia patogenami i sekwencjonowania pojedynczych komórek w warunkach 3. poziomu bezpieczeństwa biologicznego (BSL-3)

Human intestinal organoids constitute the best cellular model to study pathogen infections of the gastrointestinal tract. These organoids can be derived ...

Protokół ten pozwala nam zrozumieć, w jaki sposób poszczególne typy komórek obecne w nabłonku jelita ludzkiego reagują na infekcję wirusową. Przedstawiamy tutaj trzy niezależne sposoby wysiewu organoidów jelitowych człowieka, aby dowiedzieć się, w jaki sposób droga infekcji może wpływać na reakcję komórki. Podkreślamy, jak przygotować próbki do sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki, biorąc pod uwagę przepisy dotyczące bezpieczeństwa biologicznego, których należy przestrzegać podczas pracy z patogenami kategorii 3.Metodę tę można łatwo dostosować do innych patogenów i kultur organoidów. Najważniejszą kwestią jest upewnienie się, że modele organoidów są w pełni zróżnicowane w zależności od wybranej metody wysiewu i mogą wspierać infekcję wirusową. Przed zebraniem zakażonych organoidów należy usunąć jednokomórkowe kulki żelowe z minus 80 stopni Celsjusza i ogrzać je do temperatury pokojowej.Dodatkowo zrównoważyć odczynnik RT, środek redukujący B i enzym RT C do temperatury pokojowej i ponownie zawiesić oligo przełącznika matrycowego zgodnie z opisem w instrukcjach producenta. Następnie, aby zebrać organoidy 3D zakażone patogenem BSL-3, wyjmij płytkę do hodowli komórkowej z inkubatora i umieść ją w kapturze do hodowli komórkowej. Następnie za pomocą pipety P1000 usuń pożywkę różnicującą z każdej studzienki 24-dołkowej płytki, dodaj 500 mikrolitrów lodowatego PBS do każdego dołka i inkubuj w temperaturze pokojowej przez trzy minuty.Następnie, aby całkowicie rozbić roztwór macierzy zewnątrzkomórkowej, pipetuj w górę iw dół 10 razy, aby ponownie zawiesić PBS, macierz zewnątrzkomórkową i organoidy, a następnie przenieś zawieszone organoidy do 15-mililitrowej stożkowej probówki i umieść probówki na lodzie. Zbierz każdy stan infekcji w oddzielnych 15-mililitrowych stożkowych probówkach. Po zmianie rękawiczek wyczyść zewnętrzną część probówki i wyjmij probówkę z kaptura do hodowli komórkowych.Wirować próbki przez pięć minut. Przenieś probówkę z powrotem do kaptura do hodowli komórkowej i wyjmij PBS, unikając ponownego zawieszenia osadu organoidu z dna probówki. Następnie ponownie zawieś osad w jednym mililitrze enzymu dysocjacyjnego.następnie zmień rękawice, wyczyść probówkę i inkubuj próbki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Podczas inkubacji należy co 10 minut wkładać probówkę z powrotem do kaptura do hodowli komórkowej i ponownie zawiesić organoidy, pipetując w górę iw dół. Aby ustalić, czy organoidy są zdysocjowane na pojedyncze komórki, umieść 10 mikrolitrów zawiesiny organoidów w jednorazowym plastikowym szkiełku licznika komórek za pomocą pipety P10, a następnie uszczelnij port wejściowy próbki przezroczystą taśmą.Po zmianie rękawiczek wyczyść zewnętrzną część licznika komórek i za pomocą mikroskopu Brightfield upewnij się, że utworzyła się zawiesina pojedynczej komórki. Po potwierdzeniu zawiesiny pojedynczej komórki zatrzymaj trawienie, dodając jeden mililitr pożywki DMEM F12 zawierającej 10% FBS i pipetę w górę iw dół 10 razy. Następnie zmień rękawice, wyczyść probówkę i odwiruj próbkę.Po odwirowaniu ostrożnie usuń pożywkę zawierającą enzym dysocjacyjny, uważając, aby nie naruszyć osadu komórkowego na dnie. Następnie ponownie zawieś pojedyncze komórki w minimalnej objętości PBS zawierającej 0,1% BSA. Po przepuszczeniu zawiesiny komórek do probówki FACS przez filtr w celu usunięcia dużych grudek, umieść probówkę na lodzie.Następnie, aby określić liczbę komórek na mikrolitr, dodaj 10 mikrolitrów zawiesiny komórek do jednorazowej plastikowej komory do liczenia komórek. Następnie uszczelnij port wejściowy próbki przezroczystą taśmą przed wyjęciem próbki z kaptura hodowli komórkowej. Zmień rękawiczki, wyczyść komorę zliczania komórek, a następnie policz liczbę komórek za pomocą mikroskopu Brightfield.Następnie, w kapturze do hodowli komórkowych, przygotuj główną mieszankę odczynnika RT, oligo przełącznika matrycy, środka redukującego B i enzymu RT C w probówce o pojemności 1,5 mililitra zgodnie z instrukcjami producenta w zależności od liczby próbek w eksperymencie. Dla każdej próbki należy podsycić 33,4 mikrolitra mieszanki wzorcowej do probówki PCR, a następnie dodać komórki i wodę do mieszanki wzorcowej zgodnie z docelową liczbą komórek. Po zmianie rękawiczek przenieś pojedynczy kontroler komórkowy do kaptura hodowli komórkowej i przygotuj chip.Następnie dodaj jednokomórkowy chip do uchwytu na chipsy i wypełnij nieużywane tory 50% glicerolu. Dodaj mieszankę główną, kulki i olej do rozdzielania do pasów zawierających próbki zgodnie z instrukcjami producenta i przykryj chip uszczelką. Po załadowaniu układu do sterownika uruchom program.Po zakończeniu programu usuń chip i uszczelkę, a następnie za pomocą pipety wielokanałowej przenieś 100 mikrolitrów emulsji do czystych probówek PCR. Upewnij się, że każda emulsja ma jednolity biały kolor, co wskazuje, że wystąpiła cała emulsja. Po zmianie rękawiczek i oczyszczeniu probówek, przenieś probówki do PCR do maszyny do PCR i uruchom program.Pod koniec serii PCR większość wirusów otoczkowych zostanie dezaktywowana. Reprezentatywne obrazy Brightfield w pierwszym, trzecim, piątym i siódmym dniu po rozszczepieniu organoidów są pokazane tutaj. Średnio organoidy są dzielone raz w tygodniu, gdy środki stają się ciemne.Zmieniając warunki pożywki, usuwając Wnt-3a i redukując R-spondynę i nogginę, można naśladować złożoność komórkową znajdującą się w jelicie człowieka. Zwykle różnicowanie komórkowe w kierunku komórek Panetha, komórek kubkowych i enterocytów wymaga czterech dni pożywki różnicującej. Analiza danych sekwencjonowania pojedynczych komórek z organoidów pochodzących z ludzkiej okrężnicy i jelita krętego zakażonych SARS-CoV-2 wykazała, że tylko subpopulacja ludzkich komórek nabłonka jelitowego wspierała zakażenie SARS-CoV-2 po 12 i 24 godzinach.Analiza wrodzonych odpowiedzi immunologicznych w organoidach pochodzących z jelita grubego zakażonych SARS-CoV-2 wykazała, że SARS-CoV-2 indukował prozapalną kaskadę sygnałową w zakażonych komórkach, podczas gdy niezakażone komórki osób postronnych wykazywały odpowiedź immunologiczną za pośrednictwem interferonu. Ponadto sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki wykazało, że zakażone komórki nie były w stanie wykryć interferonów z powodu zablokowania szlaku za pośrednictwem wirusa. Organoidy muszą być dobrze zróżnicowane i zdrowe.Można to kontrolować, określając poziom markerów różnicowania komórek za pomocą qPCR przed zakażeniem. Jeśli komórki nie są dobrze zróżnicowane, nie będą wspierać infekcji wirusowej i doprowadzą do niepouczających wyników. Technika ta pozwala nam na zakażenie błony śluzowej zarówno od strony światła, jak i tkanki.Jest to bardzo ważne, ponieważ pozwala nam rozwikłać mechanizmy wykorzystywane przez powierzchnie błony śluzowej do tolerowania brudnego środowiska z jednej strony i sterylnego z drugiej.

adapting-gastrointestinal-organoids-for-pathogen-infection-single

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film demonstruje metodę tworzenia modelu infekcji organoidów żołądkowych poprzez mikrowstrzykiwanie patogenu żołądkowego Helicobacter pylori do światła organoidów. Model ten pomaga w badaniu zmian w komórkach żołądka wywołanych infekcją.

Ustalenie modelu infekcji poprzez mikroiniekcję organoidów żołądkowych z bakteriami chorobotwórczymi

Ten protokół wyjaśnia pierwotną hodowlę organoidów z dodatnim Lgr5 i późniejszą transdukcję retrowirusową. Umożliwia to indukowaną przez Cre nadekspresję lub knockdown dostarczonego transgenu i umożliwia prowadzenie badań funkcjonalnych w nowym systemie modeli organotypowych in vitro.

Protokół wideo infekcji retrowirusowej w pierwotnej hodowli organoidów jelitowych

Kultury pochodzące z komórek macierzystych kryją w sobie ogromny potencjał do modelowania chorób zakaźnych. W tym miejscu opisano hodowlę mysich i ludzkich organoidów żołądkowych pochodzących z dorosłych komórek macierzystych. Organoidy są mikrowstrzykiwane z patogenem żołądkowym Helicobacter pylori.

Organoidy jako model chorób zakaźnych: hodowla organoidów żołądka ludzkiego i mysiego oraz mikroiniekcja Helicobacter pylori

Organoidy jelitowe pochodzące z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) oferują ekscytujące możliwości modelowania chorób jelitowych in vitro. Wykazano różnicowanie hiPSC w organoidy jelitowe (iHO), stymulację tych iHO cytokinami oraz mikroiniekcję Salmonella Typhimurium do światła iHO, umożliwiając badanie inwazji nabłonka przez ten patogen.

Wykorzystanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych organoidów jelitowych pochodzących z komórek macierzystych do badania i modyfikowania ochrony komórek nabłonka przed salmonellą i innymi patogenami

Tutaj opisujemy technikę ilościowego określania integralności bariery organoidów jelita cienkiego. Fakt, że metoda opiera się na żywych organoidach, umożliwia sekwencyjne badanie różnych substancji modulujących integralność bariery lub ich kombinacji w sposób rozdzielczy w czasie.

Badanie rozpadu bariery jelitowej w żywych organoidach

Tutaj prezentujemy dwa protokoły, które pozwalają na modelowanie interakcji specyficznych dla wierzchołka jelita. Monowarstwy jelitowe pochodzące z organoidów i kultury interfejsu powietrze-ciecz (ALI) ułatwiają wytwarzanie dobrze zróżnicowanego nabłonka dostępnego zarówno od strony luminalnej, jak i podstawnej, podczas gdy organoidy jelitowe z odwróconą polaryzacją odsłaniają swoją wierzchołkową stronę i są podatne na testy o wysokiej przepustowości.

Metody hodowli do badania interakcji specyficznych dla wierzchołka przy użyciu modeli organoidów jelitowych

To badanie przedstawia protokół generowania monowarstw 2D jelit bydlęcych z organoidów, oferując lepszy dostęp do badania interakcji gospodarz-patogen. Obejmuje on metody oceny integralności i funkcjonalności błony, rozwijając modele in vitro, które naśladują fizjologię przewodu pokarmowego bydła. Podejście to obiecuje znaczące korzyści biomedyczne i rolnicze, w tym ulepszone strategie leczenia.

Postępy w technologii organoidów bydlęcych z wykorzystaniem jednowarstwowych interfejsów jelita cienkiego i grubego

To badanie przedstawia protokół generowania monowarstw 2D organoidów wieprzowych pochodzących z jelita cienkiego i grubego. Wzrost tych monowarstw charakteryzuje się rosnącymi wartościami TEER, co wskazuje na solidną integralność nabłonka. Dodatkowo, te monowarstwy wykazują fizjologiczne reakcje wydzielnicze w eksperymentach w komorze Ussing po zastosowaniu forskoliny.

Dwuwymiarowe organoidy jelitowe świń odzwierciedlające fizjologiczne właściwości rodzimego jelita

Tutaj opisujemy protokół generowania organoidów wierzchołkowych z jelit ze standardowych kultur organoidów osadzonych w matrycy. Przedstawiono również późniejsze włączenie EdU do aktywnie proliferujących komórek i półautomatyczną kwantyfikację komórek EdU-dodatnich.

Wytwarzanie wierzchołkowych organoidów jelitowych i ocena szybkości proliferacji organoidów za pomocą znakowania EdU

Badanie przedstawia metodę badania in vitro infekcji bakteryjnej z wykorzystaniem organoidów pochodzenia tkankowego z komórek macierzystych. Protokół opisuje, jak hodować i różnicować organoidy w dwóch wymiarach, zakażać je adherentno-inwazyjnymi Escherichia coli oraz oceniać kluczowe odczyty, w tym przełamanie bariery nabłonkowej, obrazowanie infekcji oraz odpowiedź RNA nabłonkowego.

Dwuwymiarowa hodowla organoidów na inwazynie lub wyciągu z błony podstawowej do badania interakcji gospodarz-bakteria

Poznaj metodę infekcji ludzkich organoidów jelitowych w warunkach BSL-3 i analizy scRNA-seq, aby badać interakcje patogen-gospodarz na poziomie pojedynczych komórek.

Adaptacja organoidów przewodu pokarmowego do zakażenia patogenami i sekwencjonowania pojedynczych komórek w warunkach 3. poziomu bezpieczeństwa biologicznego (BSL-3) (Wideo) | JoVE Journal

Adaptacja organoidów przewodu pokarmowego do zakażenia patogenami i sekwencjonowania pojedynczych komórek w warunkach 3. poziomu bezpieczeństwa biologicznego (BSL-3)

Przeglądaj więcej filmów