Bezpośrednie pomiary siły mechaniki subkomórkowej w zamknięciu za pomocą pęsety optycznej

Protokół ten analizuje indywidualne właściwości mechaniczne jądra komórkowego, które sprawiają, że jest on mechanicznym miernikiem polaryzacji, różnicowania i migracji komórek. Główną zaletą tej techniki jest to, że może mierzyć właściwości mechaniczne i przykładać siły do przedziałów subkomórkowych bez zewnętrznych zaburzeń błony lub cytoszkieletu korowego. Protokół można łatwo dostosować do manipulowania koralikami wewnątrz innych komórek innego organizmu w celu zbadania mechaniki jądrowej w różnych liniach komórkowych lub modelach zwierzęcych.

Ustawienie czujnika siły bezpośredniej ma kluczowe znaczenie dla wychwytywania całego światła tworzącego i opuszczającego pułapki optyczne. Zapewni to dokładne pomiary momentu pędu światła w lepkosprężystym ośrodku komórki. Przygotowanie pojedynczej komórki należy rozpocząć od umieszczenia zarodków w stadium kulistym cztery godziny po zapłodnieniu w szklanym naczyniu zawierającym pożywkę E3 za pomocą plastikowej pipety Pasteura.

Następnie wybierz zarodki, które są dodatnie dla kulek i wyrażają białko fluorescencyjne w przypadku wstrzyknięcia mRNA. Za pomocą kleszczy ręcznie dokonaj dekurycji zarodków i przenieś około 10 do 15 zarodków bez kuracji do 1,5-mililitrowego pojemnika reakcyjnego za pomocą szklanej pipety Pasteura. Wyjmij pożywkę E3 z probówki i dodaj 500 mikrolitrów wstępnie podgrzanej, niezależnej od dwutlenku węgla pożywki do hodowli tkankowej.

Delikatnie potrząśnij probówką, unikając tworzenia się pęcherzyków i upewnij się, że zawartość probówki stanie się mętna, gdy komórki dysocjują bez dużych kawałków widocznych dla oka. Następnie odwirować probówkę o sile 200 razy G przez trzy minuty. Po odwirowaniu usunąć sklarowany osad i zebrać osad, aby przystąpić do barwienia komórek.

Aby oznaczyć jądro, ponownie zawieś komórki, dodając do probówki 500 mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu do barwienia barwnikiem DNA Hoechst. Inkubuj wybarwione komórki przez siedem minut w ciemności. Następnie odwirować komórki, jak opisano wcześniej, i ponownie zawiesić osad w 50 mikrolitrach DMEM dla próbek w zawiesinie lub 20 mikrolitrach DMEM dla komórek w zamknięciu.

W celu przygotowania pułapek optycznych lub komory OT do eksperymentów z komórkami w zawieszeniu, należy wyciąć kawałek dwustronnej taśmy klejącej z kwadratowym otworem o wymiarach około 10 milimetrów na 10 milimetrów pośrodku. Zdejmij jedną z warstw ochronnych taśmy i umieść odsłoniętą stronę taśmy na środku naczynia ze szklanym dnem o numerze 1,5 H. Delikatnie dociśnij taśmę, aby cała powierzchnia taśmy przylegała do szkła, unikając pęcherzyków powietrza i odklej pozostałą warstwę ochronną taśmy.

Inkubować powierzchnię ze 100 mikrolitrami Concanavalin A w ilości 0,5 miligrama na mililitr przez 30 minut. Następnie usuń kroplę Concanavalin A i spłucz powierzchnię DMEM. Dodać 30 mikrolitrów roztworu zawierającego komórki na powierzchnię jawy.

Następnie bardzo delikatnie zamknij komorę szklaną pokrywą o wymiarach 22 na 22 milimetry. W razie potrzeby użyj skalpela lub kleszczy. Następnie przystąp do uruchomienia pęsety optycznej, włączając laser ze znacznie dużą mocą na co najmniej 30 minut przed eksperymentem, aby zoptymalizować stabilność mocy wyjściowej.

Po zakończeniu włącz moduł elektroniczny optycznych jednostek mikromanipulacji i pomiaru siły. Przed ustawieniem czujnika siły optycznej umieść kroplę wody na obiektywie 60X 1.2 zanurzonym w wodzie i umieść komorę zawierającą ogniwa na stoliku. Skoncentruj się na dolnej powierzchni komory, w której zostaną umieszczone próbki komórek.

Po dodaniu kropli olejku immersyjnego na szkiełko nakrywkowe zakrywające próbkę, opuść soczewkę zbiorczą czujnika siły, aż zetknie się z kroplą oleju. Postępując zgodnie ze standardową procedurą ustawiania czujnika siły optycznej, spójrz na obraz płaszczyzny próbki na kamerze pomocniczej, która ma być użyta do ustawienia OT, a następnie opuść czujnik siły optycznej, aż jego ogranicznik pola pojawi się sprzężony z płaszczyzną próbki. Aby sprawdzić, czy nie ma pęcherzyków powietrza za pomocą soczewki Bertranda, obserwuj ścieżkę obrazowania przez kamerę pomocniczą.

Jeśli widoczne są jakiekolwiek zabrudzenia lub pęcherzyki powietrza, wyczyść soczewkę i komorę bezpyłową chusteczką do soczewek przed powtórzeniem procedury zgodnie z opisem, dodając więcej olejku immersyjnego. Za pomocą bocznych umieszczonych na uchwycie optycznego czujnika siły, wyśrodkuj ogranicznik pola w polu view. Aby uzyskać dokładność, otwórz ogranicznik pola prawie tak, aby zajmował pole widzenia widoczne na kamerze pomocniczej.

Po umieszczeniu próbki w mikroskopie i ustawieniu czujnika siły optycznej, użyj obracającej się płytki półfalowej, aby ustawić początkową moc pułapki na 200 miliwatów, jeśli sztywność badanego jądra lub struktury międzykomórkowej nie jest znana. Po zakończeniu użyj sterownika oprogramowania stolika mikroskopu, aby wyszukać komórkę z jednym lub dwoma koralikami za pomocą transmitowanej mikroskopii jasnego pola. W arkuszu numerycznym zapisz przemieszczenie i czas każdego kolejnego kroku trajektorii.

Alternatywnie należy załadować tabelę S1 z materiału uzupełniającego. W przypadku eksperymentu naprężeń/relaksacji zaprogramuj obciążenia trapezowe, które mają zostać przyłożone. W oprogramowaniu OT aktywuj pułapki optyczne.

Aby zalewkować mikrosferę, ustaw płaszczyzny obrazu nieco powyżej koralika za pomocą sterownika oprogramowania stolika mikroskopu. Kliknij na mikrokulkę polistyrenową w skalibrowanym oknie obrazowania kamery pomocniczej. Pomyślne uwięzienie koralika przez pułapkę optyczną znacznie zmniejszy ruch koralika.

Kliknij i przeciągnij koralik przez cytoplazmę i umieść go w odległości około dwóch mikronów od otoczki jądrowej. Upewnij się, że trajektoria jest ustawiona tak, aby wgłębienie ściegu było prostopadłe do błony jądrowej. Gdy konfiguracja będzie gotowa, przejdź do oprogramowania do obrazowania i kliknij przycisk akwizycji, aby rozpocząć akwizycję obrazu.

Otwórz okno wymuszonego odczytu w czasie rzeczywistym, kliknij dane i zapisz w oknie wymuszonego odczytu w czasie rzeczywistym, aby zapisać. Rozpocznij pomiar pozycji pułapki i siły. Zainicjuj poprzednio załadowaną trajektorię, klikając prawym przyciskiem myszy na ściegu i wybierając start trajektorii.

Poczekaj, aż trajektoria zostanie zakończona, a system się ustabilizuje, zanim zakończysz rejestrację danych pomiaru siły pułapki. Zatrzymaj akwizycję obrazu i wydrukuj wyniki w oprogramowaniu do przetwarzania końcowego. W analizie reprezentatywnej przedstawiono wyizolowaną komórkę macierzystą progenitora danio pręgowanego z pojedynczą mikrosferą w pobliżu jądra.

Monitorowano rozmieszczenie mikrosfery polistyrenu pięć godzin po wstrzyknięciu do wnętrza zarodka. Obraz w jasnym polu i fluorescencji pokazuje, że kulki są rozproszone w tkance zarodka. Maksymalna projekcja konfokalnego fluorescencyjnego stosu Z i maksymalna projekcja podstosu w tym samym obszarze potwierdza, że duża część głębokich komórek zawierała od jednego do dwóch koralików.

Po 24 godzinach od zapłodnienia koraliki zostały rozprowadzone po całym ciele zarodka. Uzyskano mikrofotografie Brightfield komórek zawiesinowych na zamkniętych komórkach z jednym lub dwoma wstrzykniętymi kulkami. Co więcej, wiele znaczników fluorescencyjnych ułatwiło badanie różnych aspektów komórek, takich jak błona międzyjądrowa, błona plazmatyczna, DNA i linia transgeniczna.

Reprezentatywne migawki opisywały jądra znakowane Hoechstem pięć sekund przed/w trakcie i pięć sekund po wgnieceniu optycznie uwięzioną mikrosferą. Badano profile intensywności wzdłuż segmentu wgłębienia dla trzech różnych ramek i trajektorii dystalnych i proksymalnych granic jądra podczas eksperymentu z wgłębieniami zawieszonych i ograniczonych komórek. Zmierzono uwięzioną trajektorię i siłę doświadczaną przez optycznie uwięzioną mikrosferę podczas powtarzającego się eksperymentu z wgłębieniami jądrowymi.

Mechanika jądra w komórkach w zawieszeniu i w zamknięciu potwierdziła, że uwięzienie spowodowało rozszerzenie rzutowanego obszaru i nieznaczną zmianę sztywności jądra. Jeśli kulki zostaną wstrzyknięte do zarodka w jednym stadium komórkowym, najprawdopodobniej równomiernie rozprowadzą się w późniejszych stadiach. Pamiętaj, że koralik musi być stabilnie uwięziony.

Jeśli koralik wydostanie się z pułapki optycznej, ponownie zdefiniuj trajektorię lub zwiększ moc lasera. Eksperymenty te można łatwo przeprowadzić na wielu mikrogranulkach wewnątrz jednej komórki i rozszerzyć o aktywne pomiary mikroreologiczne.