Name: Bezpośrednie pomiary siły mechaniki subkomórkowej w zamknięciu za pomocą pęsety optycznej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Poznaj metodę pomiaru mechanicznych właściwości jądra komórkowego w izolowanych komórkach embrionalnych Danio rerio za pomocą pułapki optycznej. Technika ta umożliwia bezpośredni pomiar siły bez zakłócania błony komórkowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

MK dziękuje za wsparcie finansowe od hiszpańskiego Ministerstwa Gospodarki i Konkurencyjności poprzez Plan Nacional (PGC2018-097882-A-I00), FEDER (EQC2018-005048-P), program Severo Ochoa dla Centrów Doskonałości w dziedzinie Badań i Rozwoju (CEX2019-000910-S; RYC-2016-21062), z Fundació Privada Cellex, Fundació Mir-Puig oraz z Generalitat de Catalunya za pośrednictwem CERCA i programu badawczego (2017 SGR 1012), oprócz finansowania za pośrednictwem ERC (MechanoSystems) i HFSP (CDA00023/2018). V.R. dziękuje za wsparcie ze strony hiszpańskiego Ministerstwa Nauki i Innowacji dla partnerstwa EMBL, Centro de Excelencia Severo Ochoa, MINECO's Plan Nacional (BFU2017-86296-P, PID2020-117011GB-I00) i Generalitat de Catalunya (CERCA). V.V. dziękuje za wsparcie ze strony programu doktoranckiego ICFOstepstone finansowanego przez program Unii Europejskiej w zakresie badań naukowych i innowacji Horyzont 2020 w ramach umowy o udzielenie dotacji "Maria Skłodowska-Curie" 665884. Dziękujemy Arnau Farré za krytyczną lekturę manuskryptu; Marii Marsal za pomoc w obrazowaniu i montowaniu zarodka 24 hpf oraz; Senda Jiménez-Delgado za wsparcie w mikronjekcjach danio pręgowanego.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym protokole opisujemy unikalną metodę badania właściwości mechanicznych jądra komórkowego wewnątrz żywych komórek. W przeciwieństwie do innych technik spektroskopii sił, nieinwazyjne pułapkowanie optyczne pozwoliło nam oddzielić udział błony komórkowej i cytoszkieletu od sztywności jądra komórki. Co ważne, mikromanipulacja optyczna jest kompatybilna z mikroskopią multimodalną, co pozwoli eksperymentatorowi badać różne procesy zachodzące w mechanobiologii jądrowej komórki. Jako reprezentatywny wynik zastosowaliśmy barwienie DNA-Hoechst do pomiaru deformacji jądra po wgłębieniu wykonanym siłami rzędu kilkuset pikoNewtonów.
Potencjalne zastosowania naszej metody poza przykładami opisanymi w niniejszym protokole Możliwość wydobycia ilościowych informacji mechanicznych z pomiarów wewnątrz żywych komórek bez zewnętrznych zakłóceń otwiera mnóstwo bezprecedensowych możliwości, które dopiero zaczynają być eksplorowane. W ten sposób prezentowany protokół naszej platformy do mikromanipulacji optycznej można rozszerzyć o bardziej złożone eksperymenty o dużej wszechstronności. Deflektory akustyczno-optyczne (AOD) mogą generować wiele pułapek optycznych do synchronicznych pomiarów siły w różnych lokalizacjach komórek, a także mogą być wykorzystywane do aktywnej mikroreologii w szerokim zakresie częstotliwości51,61. Jak już wspomniano, reakcja siły na wgłębienie może pokonać maksymalną siłę pułapki, prowadząc do ucieczki stopki z pułapki optycznej. W takim przypadku można skonfigurować sprzężenie zwrotne siły z AOD w celu zaciśnięcia siły optycznej. Podsumowując, wiele podejść mikroreologicznych, takich jak relaksacja naprężeń opisana w tym protokole, ale także aktywna mikroreologia lub podatność pełzania, można eksperymentalnie uzyskać za pomocą tej platformy i dokładnie przeanalizować za pomocą nowatorskich pakietów oprogramowania 61,62,63,64,65. Co więcej, zastosowanie sił nie ogranicza się do jądra, ale w zasadzie może być przeprowadzone w celu pomiaru różnych struktur wewnątrzkomórkowych i w złożonych tkankach, jak wykazano w przypadku zatrzymywania przepływających czerwonych krwinek w nienaruszonych naczyniach krwionośnych66,67 lub zatrzymywania i deformowania chloroplastów i mitochondriów68. Kalibracja światła-pędu jest niezależna od kształtu i rozmiaru uwięzionego obiektu, umożliwiając w ten sposób bezpośrednie pomiary siły na dowolnej sondzie siły o dowolnym kształcie38,39. Zastosowanie iniekcji mikrosfer pozwoliło na przyłożenie dużych sił do jądra przy stosunkowo niskiej mocy lasera w porównaniu z bezpośrednią manipulacją strukturami komórkowymi 69,70,71. Jednakże, biorąc pod uwagę wystarczająco dużą różnicę współczynnika załamania światła, nie jest konieczna zewnętrzna sonda siły, a organellami wewnątrzkomórkowymi można manipulować bezpośrednio bez wstrzykiwanych kulek (niepublikowane obserwacje i odniesienie70).
Potencjalne modyfikacje naszej metody w celu rozszerzenia aplikacji W zależności od eksperymentu można wstrzykiwać mikrogranulki o różnych rozmiarach, ale należy wykonać odpowiednie kontrole. Na przykład, aby badać komórki na późniejszych etapach, można wstrzykiwać mniejsze kulki. Zmniejszy to maksymalną siłę, jaką może wywierać pułapka optyczna (jak pokazano w odnośniku55). Większe kulki mogą być wstrzykiwane w celu wywarcia większych sił, ale mogą one wpływać na rozwój zarodka w zależności od ich wielkości lub etapu zainteresowania. W eksperymentach, w których wstrzyknięcie mikrogranulek nie jest opcją, różne organelle wykazujące różnice w współczynnikach załamania światła w porównaniu z cytoplazmą mogą być nadal manipulowane optycznie, powodując powstawanie sił optycznych mierzalnych na podstawie zmian pędu światła42. Jak wspomniano powyżej, metody te zostały zastosowane przez Bambardekara i wsp. do deformacji połączeń komórka-komórka w zarodku Drosophila70. Podobnie, jądro komórki ma niższy współczynnik załamania światła niż otaczający je ośrodek44, co pozwala na wgłębienie bez kulek (niepublikowane obserwacje i odniesienie72), mimo że z mniejszą siłą zatrzymywania. W ten sposób jądro nie może być łatwo uwięzione i ucieka z pułapki.
Przekładka PDMS z powłoką spinową jest wytwarzana wygodną i szybką metodą, ale może być poza zasięgiem laboratoriów bez dostępu do zakładu mikro-/nanoprodukcyjnego lub laboratoriów inżynieryjnych. W ten sposób przekładkę można łatwo zmontować z taśmy laboratoryjnej lub parafilmu (krok 4). Protokół można również dostosować poprzez produkcję kanałów mikroprzepływowych, które automatyzują dostarczanie pojedynczych komórek do predefiniowanych dołków pomiarowych lub do komory o określonej wysokości w celu oszacowania efektu uwięzienia w tej samej próbce. Jednakże takie urządzenia mikroprzepływowe muszą być zaprojektowane w taki sposób, aby mieściły się w przestrzeni między obiektywem mikroskopu a soczewką zbierającą czujnika siły optycznej, wynoszącej około 2 mm (patrz krok 3). Należy pamiętać, że czujnik siły optycznej musi być umieszczony na odpowiedniej wysokości, aby żadne aberracje optyczne wynikające z rozogniskowania nie wpływały na pomiar pędu fotonów.
Inne modyfikacje mogą obejmować zmianę reporterów biologicznych. Odkryliśmy, że fluorescencja Hoechst spektralnie krwawi do kanału GFP, a zatem faworyzujemy połączenie z histonem znakowanym mCherry jako markerem jądrowym do jednoczesnego pomiaru w dwóch kanałach fluorescencyjnych. Alternatywnie, deformację jądrową można łatwo śledzić za pomocą etykiety ukierunkowanej na wewnętrzną błonę jądrową, takiej jak Lap2b-GFP (rysunek 2).
Wgłębienie w jądrze komórkowym było rzędu 2-3 mikronów, co mogliśmy dokładnie zmierzyć za pomocą analizy obrazu mikroskopii konfokalnej z ograniczonym dyfrakcją. W przypadku sztywniejszych jąder lub mniejszych sił, wgłębienie będzie ledwo mierzalne przy użyciu tego podejścia. Jednak pęseta optyczna kalibrowana siłą bezwzględną może być również skalibrowana do pomiarów położenia uwięzionego koralika in situ przy użyciu interferometrii BFP z dokładnością nanometryczną51. Korzystając z tego podejścia, sygnał napięciowy i czujnik siły optycznej mogą być przełożone na położenie uwięzionej sondy za pomocą parametru β [nm/V], podczas gdy parametr niezmienny α [pN/V] daje wartości siły poprzez wspomnianą wcześniej kalibrację światła i pędu41 (szczegóły poniżej).
Rozwiązywanie problemów Odkryliśmy, że podczas eksperymentu mogą wystąpić następujące wyzwania:
Nie tworzy się stabilna pułapka, a mikrosfera łatwo się wydostaje Jakiekolwiek zabrudzenia na obiektywie mikroskopu lub nieprawidłowo ustawiony kołnierz korekcyjny mogą doprowadzić do awarii stabilnej pułapki. Jeśli nie zostanie znalezione natychmiastowe rozwiązanie, zmierz funkcję rozproszenia punktowego soczewki obiektywu. Jeśli badana próbka znajduje się głęboko w optycznie gęstej tkance, ognisko lasera może doświadczyć poważnych aberracji optycznych, co prowadzi do niestabilnego uwięzienia (efekt ten jest zwykle znikomy w izolowanych komórkach, ale staje się bardziej widoczny w grubszych tkankach). W przypadku wysokiej sztywności siła przywracająca jądra może przekroczyć siłę ucieczki pułapki, tak że mikrosfera zostanie utracona, a procedura wgłębiania zakończy się niepowodzeniem. Początkowo krawędź błony jądrowej bliższa pułapce optycznej jest prawie nie wcięta (ryc. S2A). Kiedy tak się dzieje, laser pułapkujący nie jest już narażony na siłę i ruchy Browna, co prowadzi do spadku siły do zera i zmniejszenia szumu sygnału (rysunek S2B). W takim przypadku moc lasera można zwiększyć, aby uzyskać silniejszą pułapkę, można zmniejszyć amplitudę trapezoidalnej trajektorii wpychającej koralik do jądra lub ustawić początkową pozycję uwięzionej mikrokulki dalej od jądra.
Komórka porusza się podczas stymulacji Jeśli komórki nie są wystarczająco połączone, optyczna pułapka gradientowa przesunie komórki podczas wykonywania procedury wgłębiania wewnątrzkomórkowego, tak że siły i podstawowa mechanika jądra są sztuczne. Aby zapobiec przemieszczaniu się całej komórki, zalecamy zwiększenie stężenia cząsteczek adhezyjnych komórek na powierzchni, np. ConA.
Kompensacja pędu początkowego Jeśli początkowa procedura kompensacji pędu nie jest dostępna na platformie OT (krok 6.5), należy skorygować sztuczny, niezależny od siły sygnał linii podstawowej. Jest to widoczne jako nachylenie na krzywej siły nawet przy braku uwięzionego ściegu (rysunek S1E). Aby wykonać korektę, tę samą trajektorię należy wykonać bez koralika, na zewnątrz komórki w dokładnie tej samej pozycji. W tym celu odsuń komórkę od pułapki za pomocą elementu sterującego stołu montażowego. Jako odniesienie, przesunięcie siły zmienia się o 5 pN w poprzek pola widzenia przy 200 mW w naszym systemie; W związku z tym staje się to nieistotne dla krótkich trajektorii. Alternatywnie można użyć stolika do skanowania piezoelektrycznego do przesuwania komórek na próbce, pozostawiając stałą pozycję lasera.
Kluczowe etapy przedstawionego protokołu Mikrosfery powinny być wstrzykiwane w odpowiednim, 1-komórkowym stadium, aby zapewnić maksymalne rozprowadzenie na zarodku. Koraliki nie powinny być fluorescencyjne, aby światło nie przedostawało się do kanałów fluorescencyjnych używanych do obrazowania. Dla przykładu, nawet typowe czerwono-fluorescencyjne kulki są wyraźnie widoczne w niebieskim kanale używanym do obrazowania jądra komórkowego po barwieniu Hoechsta ze względu na ich jasność (wzbudzenie: 405 nm; emisja: 445 nm). Stabilne przymocowanie komórki do podłoża ma kluczowe znaczenie dla zapobieżenia bocznemu przemieszczeniu podczas rutynowego wgłębiania. Jeśli komórka porusza się podczas rutyny, siły są niedoszacowane. Jeśli zdarza się to często, zoptymalizuj protokół załączników. W przypadku komórek hodowli tkankowej inne białka adhezyjne komórek, takie jak fibronektyna, kolagen lub poli-L-lizyna, prowadzą do zadowalającego przyłączenia (obserwacje niepublikowane). Podczas uwięzienia komórki są poddawane nagłemu i silnemu obciążeniu mechanicznemu. Może to spowodować uszkodzenie komórek i często eksperymentator napotka pęknięte komórki, jeśli procedura nie zostanie przeprowadzona ostrożnie. Ponadto, jeśli wysokość uwięzienia jest zbyt mała, wszystkie komórki będą cierpieć z powodu pęknięcia obwiedni jądrowej lub nieodwracalnego uszkodzenia. Aby je złagodzić, należy wolniej opuszczać górne szkiełko nakrywkowe i/lub zwiększać odstępy między szkiełkami nakrywkowymi.
Ograniczenia techniki i sugestie ich pokonania Wyraźnym ograniczeniem tej techniki jest przenikanie światła laserowego do głębokich odcinków tkanki, co prowadzi do aberracji i niestabilnego wychwytywania. Tak więc dolna granica głębokości penetracji zależy od czystości próbki, korekcji aberracji, którą można zastosować73 oraz zastosowanej mocy lasera. Należy wziąć pod uwagę, że większa moc lasera prowadzi do wzbudzenia termicznego próbki w pobliżu mikrosfery. Jednak ogrzewanie próbki pochodzące od plamki lasera o długości fali 1064 nm jest zminimalizowane, aby uniknąć prawdopodobnego stresu związanego z ciepłem na naszych próbkach biologicznych74.
Kolejnym ograniczeniem jest maksymalna siła, jaką można zmierzyć. Mimo że bezpośrednia detekcja pędu światła umożliwia pomiary siły znacznie wykraczające poza liniowy reżim odpowiedzi pułapki optycznej40,41, maksymalna przyłożona siła jest rzędu kilkuset pikontonów. Jest to ograniczone mocą lasera i wynikającym z tego progiem uszkodzenia miękkiego materiału biologicznego oraz różnicami współczynnika załamania światła, które zwykle nie są większe niż 0,1 lub 0,344. Zaproponowano kilka metod zwiększania granicy wykrywalności siły, np. przy użyciu światła strukturalnego75, mikrosfer z powłoką antyrefleksyjną76, cząstek o wysokim współczynniku załamania światła77 lub wysoce domieszkowanych kropek kwantowych78.
OT mogą być używane do pomiarów położenia w skali nanometrowej za pomocą interferometrii BFP, tak aby położenie kulki w pułapce wynosiło Δx = βSx, gdzie Sx jest sygnałem napięciowym czujnika, a β [μm/V] można kalibrować w locie zgodnie z różnymi protokołami35,54. W przypadku optycznego czujnika siły można udowodnić, że niezmienniczy współczynnik konwersji napięcia na siłę α [pN/V] bezpośrednio odnosi się do β i sztywności pułapki, k [pN/μm], do α = kβ 37) W eksperymentach z przemieszczeniami ściegów, które są zbyt małe, aby można je było wykryć za pomocą obrazowania optycznego, strategia ta może być wykorzystana do uzupełnienia pomiarów siły o wykrywanie małego położenia. Przykładem może być zastosowanie przedstawionych tu procedur eksperymentalnych do bardzo sztywnych jąder, dla których siły o rozsądnych mocach lasera (200-500 mW) nie są wystarczające do wywołania wystarczająco dużych wartości wgłębień. W takim przypadku stopka musi zetknąć się z jądrem, a sztywność pułapki musi zostać skalibrowana przed pomiarem (krok 8.6). Wcięcie d jądra w funkcji siły można pośrednio określić jako:
d = xpułapka - F/k
gdzie pułapka x jest pozycją pułapki. W odróżnieniu od niezmienniczego współczynnika świetlno-pędznego α [pN/V], współczynnik β [μm/V] musi być kalibrowany przed każdym eksperymentem, ponieważ zależy od wielu lokalnych zmiennych określających dynamikę pułapki, takich jak rozmiar cząstek, rozmiar plamki pułapki optycznej i względne współczynniki załamania.

Morfogeneza tkanek to złożony proces, w którym sygnały biochemiczne i siły fizyczne są czasowo koordynowane. W rozwijającym się zarodku gradienty biochemicznych czynników sygnalizacyjnych dyktują specyfikację losu i zapewniają prawidłowe wzorcowanie tkankowe1,2. Jednocześnie siły wewnętrzne i zewnętrzne odgrywają rolę w budowaniu architektury embrionu3,4. Wpływ mechaniki kory komórkowej w tym kontekście był szeroko badany5,6. Ścisłe powiązanie między procesami mechanochemicznymi podczas morfogenezy opiera się na właściwościach pojedynczych komórek do wyczuwania i reagowania na siły mechaniczne w mikrośrodowisku tkanek. Komórki dekodują w ten sposób sygnały mechaniczne poprzez obecność wrażliwych na siłę elementów subkomórkowych i molekularnych, które przekształcają informacje mechaniczne w określone szlaki sygnałowe kontrolujące zachowanie komórki, los komórki i mechanikę komórki.
Cechą charakterystyczną procesów rozwojowych jest to, że komórki organizują się w grupy, aby budować struktury wielokomórkowe. W związku z tym pojedyncze komórki rzadko przegrupowują się i poruszają samodzielnie, ale są powiązane w ścisłym socjotopie, w którym wykazują zachowania zbiorowe, takie jak migracja nadkomórkowa7, (nie)zagłuszające przejścia8,9 lub zagęszczenie blastocysty10. Siły mechaniczne generowane wewnątrz i między komórkami służą jako ważne wskazówki do instruowania zbiorowej dynamiki komórki7,11. Ale nawet gdy komórki poruszają się samotnie, takie jak komórki progenitorowe, które przeciskają się między arkuszami tkanek lub wąskimi niszami tkankowymi, doświadczają rozległych anizotropowych sił mechanicznych podczas poruszania się w trójwymiarowym środowisku. Te mechaniczne naprężenia na komórkach mają poważne konsekwencje dla zachowania komórek12,13. Zbadano kilka mechanizmów, które zbiegają się w jądrze jako główny element mechanotransdukcji14,15, jako pasywny lub aktywny element mechaniczny podczas migracji w gęstym środowisku tkankowym 3D15,16.
Niedawno zaproponowaliśmy mechanizm, który wyposaża komórki do pomiaru deformacji kształtu przy użyciu jądra jako elastycznego wewnątrzkomórkowego mechano-miernika12. Jądro, będące największą organellą w komórce, ulega dużym deformacjom, gdy komórki polaryzują się, migrują lub zmieniają swój kształt pod wpływem mechanicznego rozciągania, uwięzienia lub stresu osmotycznego16,17,18,19. Odkryliśmy, że rozciąganie otoczki jądrowej wraz z wewnątrzkomórkowym pozycjonowaniem jądra dostarcza komórkom informacji na temat wielkości i rodzaju deformacji komórki (takiej jak kompresja komórki w porównaniu z obrzękiem komórki). Rozciąganie jądra jest związane z rozwijaniem wewnętrznej błony jądrowej (INM), która promuje zależną od wapnia aktywność lipazy cPLA2 (cytozolowej fosfolipazy A2) w INM, a następnie uwalnianie kwasu arachidonowego (AA) i szybką aktywację miozyny II w korze komórkowej. Prowadzi to do zwiększonej kurczliwości komórek i migracji komórek ameboidalnych powyżej progu kurczliwości kory mózgowej6. Mechanowrażliwa reakcja na deformację komórki zachodzi w czasie krótszym niż minuta i jest odwracalna po uwolnieniu w zamknięciu, co sugeruje, że jądro działa jak tensometr dla propriocepcji komórkowej, regulując adaptacyjne zachowanie komórki w warunkach stresu mechanicznego. Wykazano, że ten mechanowrażliwy szlak jest aktywny w progenitorowych komórkach macierzystych pochodzących z zarodków danio pręgowanego, zarówno w komórkach pluripotencjalnych, jak i zaangażowanych w linię12 i jest konserwatywny w różnych gatunkach i liniach komórkowych20.
Oprócz właściwości jądrowych jako mechanosensora komórkowego, architektura jądrowa i mechanika są wewnętrznie regulowane podczas rozwoju i w odpowiedzi na specyfikację losu komórki21, stąd dostrajanie komórkowej mechano-czułości22,23. Konsekwencją może być zmiana podatności jądrowej, która pozwala na zmiany morfologiczne i przejścia ze stanu przedmigracyjnego do migracyjnego i odwrotnie8.
Zastosowano kilka technik pomiaru mechaniki jądra komórkowego, takich jak mikroskopia sił atomowych24,25, aspiracja mikropipety26,27, technologia mikroprzepływowa28 oraz mikroigły29. Jednak wiele z tych technik jest inwazyjnych w tym sensie, że cała komórka musi zostać zdeformowana, co ogranicza pomiar właściwości mechanicznych i zależnych od siły reakcji samego jądra. Aby uniknąć jednoczesnej deformacji powierzchni komórki i jej mechanowrażliwej kory komórkowej30, izolowane jądra badano w różnych kontekstach31,32. Nie można jednak wykluczyć, że izolacja jądrowa wiąże się ze zmianą właściwości mechanicznych jądra i ich regulacją (odniesienie24 i własne niepublikowane obserwacje).
Pęsety optyczne (OTs) to wszechstronna technologia, która pozwoliła na mnóstwo eksperymentów w mechanobiologii komórkowej i odegrała kluczową rolę w naszym zrozumieniu, w jaki sposób maszyny molekularne przekształcają energię chemiczną w mechaniczną33,34. Pęseta optyczna wykorzystuje ściśle skupioną wiązkę laserową do wywierania sił optycznych na cząstki dielektryczne, które mają współczynnik załamania światła wyższy niż otaczające je medium33. Siły te mogą być rzędu setek pikoniutonów i skutkować efektywnym uwięzieniem cząstki w ognisku pułapki laserowej, umożliwiając manipulację uwięzioną cząstką w trzech wymiarach. Wykorzystanie światła ma ważną zaletę, ponieważ pomiar można wykonać w sposób nieinwazyjny wewnątrz żywych komórek. Manipulacje optyczne są dodatkowo ograniczone do skupienia wiązki laserowej na pułapce. W związku z tym manipulacja może być wykonywana bez stymulacji otaczających błon komórkowych i nie zaburza kory aktynowej ani procesów mechanowrażliwych na błonie plazmatycznej, takich jak zależna od siły aktywacja kanałów jonowych.
Trudność podejścia pęsety optycznej polega na precyzyjnym określeniu sił przyłożonych do mikrosfery przy użyciu klasycznych metod, które polegają na pośredniej kalibracji siły opartej na twierdzeniu o ekwipartycji lub użyciu zdefiniowanych sił oporu Stokesa do pomiaru siły ucieczki zależnej od mocy lasera35. Chociaż metody te są proste do wdrożenia w eksperymencie in vitro, zwykle nie można ich przełożyć na środowisko komórkowe. Do tej dziedziny wprowadzono kilka strategii, które opierają się na bezpośredniej kalibracji siły, wywodzącej się z pierwszych zasad zachowania pędu36,37. W przeciwieństwie do innych podejść do spektroskopii sił, pomiary siły są wyprowadzane z lokalnej wymiany pędu światła z dowolnie ukształtowaną uwięzioną cząstką38,39. W naszym układzie eksperymentalnym zmiany pędu światła wynikające z sił optycznych są mierzone bezpośrednio, bez potrzeby kalibracji pułapki in situ40,41,42,43. W ten sposób pomiary stają się możliwe w lepkim środowisku, takim jak wnętrze komórki, a nawet w tkance, a siły można łatwo określić ilościowo aż do poziomu pN.
W tym protokole opisujemy test do mechanicznego manipulowania wewnątrzkomórkowymi organellami lub strukturami i ilościowej oceny ich właściwości mechanicznych za pomocą pęsety optycznej. Układ ten jest zintegrowany z mikroskopem fluorescencyjnym z wirującym dyskiem, co umożliwia równoległe obrazowanie zachowania komórek lub dynamiki wewnątrzkomórkowej. Test pozwala na scharakteryzowanie właściwości mechanicznych określonych przedziałów komórkowych, takich jak jądro, przy jednoczesnym badaniu możliwej mechanoodpowiedzi i aktywacji molekularnych szlaków sygnałowych w wyniku samej deformacji. Co więcej, optyczne uwięzienie wstrzykniętych mikrogranulek w komórkach pozwala na zwiększenie siły wgniecenia dzięki znacznie wyższemu współczynnikowi załamania światła kulki polistyrenowej (n = 1,59) w porównaniu z wewnętrznym kontrastem refrakcyjnym <klasa SUP = "xref">44 jądra (n ~ 1,35) w porównaniu z cytoplazmą (n ~ 1,38). Przedstawiona strategia może być łatwo zaadaptowana do badania innych struktur i organelli wewnątrzkomórkowych, a także innych podejść obejmujących aktywną mikroreologię, wykorzystanie wielu pułapek optycznych do jednoczesnego badania tych samych/różnych struktur subkomórkowych oraz pomiary ukierunkowane na mechanobiologię komórki w żywym zarodku.

<table><tbody><tr><td>#1.5 Okulary nakrywkowe 22 mm</td><td>Ted Pella</td><td>260148</td><td></td></tr><tr><td>#1.5 22x60 mm Okulary nakrywkowe</td><td>Ted Pella</td><td>260152</td><td></td></tr><tr><td>#1.5H naczynia ze szklanym dnem</td><td>Willco</td><td>GWST-5040</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki 10 um</td><td>Supelco</td><td>72986</td><td></td>Kapilary</tr><tr><td>szklane 1 mm</td><td>Aparat Harvard</td><td>30-0020 GC100F-15</td><td></td></tr><tr><td>Polistyren 1-um mikrogranulki</td><td>Sigma</td><td>89904</td><td></td></tr><tr><td>1-um czerwono-fluorescencyjne koraliki</td><td>ThermoFisher</td><td>F8816</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Kamery ThermoFisher</td><td>16500500</td><td></td></tr><tr><td>Aqcuisition sCMOS</td><td>Andor</td><td>Sona-4BV11-UNI</td><td></td></tr><tr><td>Kamera pomocnicza (Rysunek 3, AUX)</td><td>Blackfly,</td><td>FLIR BFS-U3-200S6M-C</td><td></td></tr><tr><td>Calbryte 520</td><td>AAT Bioquest</td><td>520 AM</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5453000011</td><td></td></tr><tr><td>Concanavalin A</td><td>Sigma</td><td>C5275</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D2906</td><td></td></tr><tr><td>DNA-Hoechst</td><td>ThermoFisher</td><td>33342</td><td></td></tr><tr><td>Podwójna taśma klejąca</td><td>Biesse Adesivi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>E3</td><td>5 mM NaCl. 0,17 mM KCl. 0,33 mM CaCl2. 0,33 mM MgSO4</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse Ti2</td><td>Kleszcze Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Narzędzia do nauki</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>GPI-GFP</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>H2A-mCh</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do akwizycji obrazu</td><td>Fusion-Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Immersion Oil</td><td>Cargille</td><td>Typ B: 16484</td><td></td></tr><tr><td>Ochrona przed podczerwienią gogle</td><td>Thorlabs</td><td>LG1</td><td></td></tr><tr><td>Lap2b-eGFP</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipeta z mikroładowarką</td><td>Eppendorf</td><td>GELoader</td><td></td></tr><tr><td>Microinjector</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYS-PV820</td><td></td></tr><tr><td>MicroManager 2.0</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prowadnica mikroukośna</td><td>ID5243 GXMGRAT-5 5mm/100 działek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olej mineralny</td><td>Sigma</td><td>M3616</td><td></td></tr><tr><td>Zmotoryzowany stolik</td><td>ASI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz igieł</td><td>Sutter instrument Co.</td><td>Model P-97</td><td></td></tr><tr><td>Platforma pęsety optycznej</td><td>Oprogramowanie Impetux Optics</td><td>Sensocell</td><td></td></tr><tr><td>OTs (LightAce)</td><td>Impetux Optics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Sigma</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>PDMS Utwardzacz</td><td>Sigma</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do przetwarzania końcowego (Matlab)</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Woda wolna od RNA</td><td>Thermofisher</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>Krótkoprzepustowe zwierciadło dichroiczne (Rysunek 3, IR-F)</td><td>Semrock</td><td>FF01-950/SP-25</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Specjalistyczne systemy powlekania</td><td>Spincoat G3P-8</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny z wirującym dyskiem</td><td>Andor</td><td>DragonFly 502</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Leica M80</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trójkątna forma mikroiniekcyjna</td><td>Adaptacyjne narzędzia naukowe</td><td>TU1</td><td></td></tr><tr><td>Piekarnik uniwersalny</td><td>Memmert</td><td>UNB 200</td><td></td></tr><tr><td>Obiektyw do zanurzenia w wodzie</td><td>Nikon</td><td>MRD07602</td><td></td></tr></tbody></table>

bezpośrednie pomiary siły mechaniki subkomórkowej w zamknięciu za pomocą pęsety optycznej

Direct Force Measurements of Subcellular Mechanics in Confinement using Optical Tweezers

Podczas rozwoju organizmu wielokomórkowego, pojedyncza zapłodniona komórka dzieli się i daje początek wielu tkankom o różnych funkcjach. Morogeneza tkanek idzie w parze ze zmianami molekularnymi i strukturalnymi na poziomie pojedynczej komórki, które powodują zmiany subkomórkowych właściwości mechanicznych. W rezultacie, nawet w tej samej komórce, różne organelle i przedziały w różny sposób opierają się naprężeniom mechanicznym; a szlaki mechanotransdukcji mogą aktywnie regulować ich właściwości mechaniczne. Zdolność komórki do przystosowania się do mikrośrodowiska niszy tkankowej wynika zatem częściowo ze zdolności do wyczuwania i reagowania na naprężenia mechaniczne. Niedawno zaproponowaliśmy nowy paradygmat mechanosensacji, w którym deformacja i pozycjonowanie jądra umożliwia komórce ocenę fizycznego środowiska 3D i wyposaża komórkę w zmysł propriocepcji w celu dekodowania zmian w kształcie komórki. W tym artykule opisujemy nową metodę pomiaru sił i właściwości materiałów, które kształtują jądro komórkowe wewnątrz żywych komórek, na przykładzie komórek przylegających i komórek zamkniętych mechanicznie. Pomiary mogą być wykonywane nieinwazyjnie za pomocą pułapek optycznych wewnątrz komórek, a siły są bezpośrednio dostępne dzięki wykrywaniu pędu światła bez kalibracji. Pozwala to na pomiar mechaniki jądra niezależnie od deformacji powierzchni komórki i umożliwia rozbiór szlaków mechanotransdukcji eksteroceptywnej i interoceptywnej. Co ważne, eksperyment z pułapką można połączyć z mikroskopią optyczną w celu zbadania odpowiedzi komórkowej i dynamiki subkomórkowej za pomocą obrazowania fluorescencyjnego cytoszkieletu, jonów wapnia lub morfologii jądrowej. Przedstawiona metoda jest prosta w zastosowaniu, kompatybilna z komercyjnymi rozwiązaniami do pomiaru siły i może być łatwo rozszerzona o badanie mechaniki innych przedziałów subkomórkowych, np. mitochondriów, włókien stresowych i endosomów.

Tutaj prezentujemy protokół do badania wewnątrzkomórkowych właściwości mechanicznych izolowanych embrionalnych komórek zebrytanicznego danio pręgowanego w trójwymiarowym zamknięciu z bezpośrednim pomiarem siły przez pułapkę optyczną.

Bezpośrednie pomiary siły mechaniki subkomórkowej w zamknięciu za pomocą pęsety optycznej

During the development of a multicellular organism, a single fertilized cell divides and gives rise to multiple tissues with diverse functions. Tissue ...

Protokół ten analizuje indywidualne właściwości mechaniczne jądra komórkowego, które sprawiają, że jest on mechanicznym miernikiem polaryzacji, różnicowania i migracji komórek. Główną zaletą tej techniki jest to, że może mierzyć właściwości mechaniczne i przykładać siły do przedziałów subkomórkowych bez zewnętrznych zaburzeń błony lub cytoszkieletu korowego. Protokół można łatwo dostosować do manipulowania koralikami wewnątrz innych komórek innego organizmu w celu zbadania mechaniki jądrowej w różnych liniach komórkowych lub modelach zwierzęcych.Ustawienie czujnika siły bezpośredniej ma kluczowe znaczenie dla wychwytywania całego światła tworzącego i opuszczającego pułapki optyczne. Zapewni to dokładne pomiary momentu pędu światła w lepkosprężystym ośrodku komórki. Przygotowanie pojedynczej komórki należy rozpocząć od umieszczenia zarodków w stadium kulistym cztery godziny po zapłodnieniu w szklanym naczyniu zawierającym pożywkę E3 za pomocą plastikowej pipety Pasteura.Następnie wybierz zarodki, które są dodatnie dla kulek i wyrażają białko fluorescencyjne w przypadku wstrzyknięcia mRNA. Za pomocą kleszczy ręcznie dokonaj dekurycji zarodków i przenieś około 10 do 15 zarodków bez kuracji do 1,5-mililitrowego pojemnika reakcyjnego za pomocą szklanej pipety Pasteura. Wyjmij pożywkę E3 z probówki i dodaj 500 mikrolitrów wstępnie podgrzanej, niezależnej od dwutlenku węgla pożywki do hodowli tkankowej.Delikatnie potrząśnij probówką, unikając tworzenia się pęcherzyków i upewnij się, że zawartość probówki stanie się mętna, gdy komórki dysocjują bez dużych kawałków widocznych dla oka. Następnie odwirować probówkę o sile 200 razy G przez trzy minuty. Po odwirowaniu usunąć sklarowany osad i zebrać osad, aby przystąpić do barwienia komórek.Aby oznaczyć jądro, ponownie zawieś komórki, dodając do probówki 500 mikrolitrów świeżo przygotowanego roztworu do barwienia barwnikiem DNA Hoechst. Inkubuj wybarwione komórki przez siedem minut w ciemności. Następnie odwirować komórki, jak opisano wcześniej, i ponownie zawiesić osad w 50 mikrolitrach DMEM dla próbek w zawiesinie lub 20 mikrolitrach DMEM dla komórek w zamknięciu.W celu przygotowania pułapek optycznych lub komory OT do eksperymentów z komórkami w zawieszeniu, należy wyciąć kawałek dwustronnej taśmy klejącej z kwadratowym otworem o wymiarach około 10 milimetrów na 10 milimetrów pośrodku. Zdejmij jedną z warstw ochronnych taśmy i umieść odsłoniętą stronę taśmy na środku naczynia ze szklanym dnem o numerze 1,5 H. Delikatnie dociśnij taśmę, aby cała powierzchnia taśmy przylegała do szkła, unikając pęcherzyków powietrza i odklej pozostałą warstwę ochronną taśmy.Inkubować powierzchnię ze 100 mikrolitrami Concanavalin A w ilości 0,5 miligrama na mililitr przez 30 minut. Następnie usuń kroplę Concanavalin A i spłucz powierzchnię DMEM. Dodać 30 mikrolitrów roztworu zawierającego komórki na powierzchnię jawy.Następnie bardzo delikatnie zamknij komorę szklaną pokrywą o wymiarach 22 na 22 milimetry. W razie potrzeby użyj skalpela lub kleszczy. Następnie przystąp do uruchomienia pęsety optycznej, włączając laser ze znacznie dużą mocą na co najmniej 30 minut przed eksperymentem, aby zoptymalizować stabilność mocy wyjściowej.Po zakończeniu włącz moduł elektroniczny optycznych jednostek mikromanipulacji i pomiaru siły. Przed ustawieniem czujnika siły optycznej umieść kroplę wody na obiektywie 60X 1.2 zanurzonym w wodzie i umieść komorę zawierającą ogniwa na stoliku. Skoncentruj się na dolnej powierzchni komory, w której zostaną umieszczone próbki komórek.Po dodaniu kropli olejku immersyjnego na szkiełko nakrywkowe zakrywające próbkę, opuść soczewkę zbiorczą czujnika siły, aż zetknie się z kroplą oleju. Postępując zgodnie ze standardową procedurą ustawiania czujnika siły optycznej, spójrz na obraz płaszczyzny próbki na kamerze pomocniczej, która ma być użyta do ustawienia OT, a następnie opuść czujnik siły optycznej, aż jego ogranicznik pola pojawi się sprzężony z płaszczyzną próbki. Aby sprawdzić, czy nie ma pęcherzyków powietrza za pomocą soczewki Bertranda, obserwuj ścieżkę obrazowania przez kamerę pomocniczą.Jeśli widoczne są jakiekolwiek zabrudzenia lub pęcherzyki powietrza, wyczyść soczewkę i komorę bezpyłową chusteczką do soczewek przed powtórzeniem procedury zgodnie z opisem, dodając więcej olejku immersyjnego. Za pomocą bocznych umieszczonych na uchwycie optycznego czujnika siły, wyśrodkuj ogranicznik pola w polu view. Aby uzyskać dokładność, otwórz ogranicznik pola prawie tak, aby zajmował pole widzenia widoczne na kamerze pomocniczej.Po umieszczeniu próbki w mikroskopie i ustawieniu czujnika siły optycznej, użyj obracającej się płytki półfalowej, aby ustawić początkową moc pułapki na 200 miliwatów, jeśli sztywność badanego jądra lub struktury międzykomórkowej nie jest znana. Po zakończeniu użyj sterownika oprogramowania stolika mikroskopu, aby wyszukać komórkę z jednym lub dwoma koralikami za pomocą transmitowanej mikroskopii jasnego pola. W arkuszu numerycznym zapisz przemieszczenie i czas każdego kolejnego kroku trajektorii.Alternatywnie należy załadować tabelę S1 z materiału uzupełniającego. W przypadku eksperymentu naprężeń/relaksacji zaprogramuj obciążenia trapezowe, które mają zostać przyłożone. W oprogramowaniu OT aktywuj pułapki optyczne.Aby zalewkować mikrosferę, ustaw płaszczyzny obrazu nieco powyżej koralika za pomocą sterownika oprogramowania stolika mikroskopu. Kliknij na mikrokulkę polistyrenową w skalibrowanym oknie obrazowania kamery pomocniczej. Pomyślne uwięzienie koralika przez pułapkę optyczną znacznie zmniejszy ruch koralika.Kliknij i przeciągnij koralik przez cytoplazmę i umieść go w odległości około dwóch mikronów od otoczki jądrowej. Upewnij się, że trajektoria jest ustawiona tak, aby wgłębienie ściegu było prostopadłe do błony jądrowej. Gdy konfiguracja będzie gotowa, przejdź do oprogramowania do obrazowania i kliknij przycisk akwizycji, aby rozpocząć akwizycję obrazu.Otwórz okno wymuszonego odczytu w czasie rzeczywistym, kliknij dane i zapisz w oknie wymuszonego odczytu w czasie rzeczywistym, aby zapisać. Rozpocznij pomiar pozycji pułapki i siły. Zainicjuj poprzednio załadowaną trajektorię, klikając prawym przyciskiem myszy na ściegu i wybierając start trajektorii.Poczekaj, aż trajektoria zostanie zakończona, a system się ustabilizuje, zanim zakończysz rejestrację danych pomiaru siły pułapki. Zatrzymaj akwizycję obrazu i wydrukuj wyniki w oprogramowaniu do przetwarzania końcowego. W analizie reprezentatywnej przedstawiono wyizolowaną komórkę macierzystą progenitora danio pręgowanego z pojedynczą mikrosferą w pobliżu jądra.Monitorowano rozmieszczenie mikrosfery polistyrenu pięć godzin po wstrzyknięciu do wnętrza zarodka. Obraz w jasnym polu i fluorescencji pokazuje, że kulki są rozproszone w tkance zarodka. Maksymalna projekcja konfokalnego fluorescencyjnego stosu Z i maksymalna projekcja podstosu w tym samym obszarze potwierdza, że duża część głębokich komórek zawierała od jednego do dwóch koralików.Po 24 godzinach od zapłodnienia koraliki zostały rozprowadzone po całym ciele zarodka. Uzyskano mikrofotografie Brightfield komórek zawiesinowych na zamkniętych komórkach z jednym lub dwoma wstrzykniętymi kulkami. Co więcej, wiele znaczników fluorescencyjnych ułatwiło badanie różnych aspektów komórek, takich jak błona międzyjądrowa, błona plazmatyczna, DNA i linia transgeniczna.Reprezentatywne migawki opisywały jądra znakowane Hoechstem pięć sekund przed/w trakcie i pięć sekund po wgnieceniu optycznie uwięzioną mikrosferą. Badano profile intensywności wzdłuż segmentu wgłębienia dla trzech różnych ramek i trajektorii dystalnych i proksymalnych granic jądra podczas eksperymentu z wgłębieniami zawieszonych i ograniczonych komórek. Zmierzono uwięzioną trajektorię i siłę doświadczaną przez optycznie uwięzioną mikrosferę podczas powtarzającego się eksperymentu z wgłębieniami jądrowymi.Mechanika jądra w komórkach w zawieszeniu i w zamknięciu potwierdziła, że uwięzienie spowodowało rozszerzenie rzutowanego obszaru i nieznaczną zmianę sztywności jądra. Jeśli kulki zostaną wstrzyknięte do zarodka w jednym stadium komórkowym, najprawdopodobniej równomiernie rozprowadzą się w późniejszych stadiach. Pamiętaj, że koralik musi być stabilnie uwięziony.Jeśli koralik wydostanie się z pułapki optycznej, ponownie zdefiniuj trajektorię lub zwiększ moc lasera. Eksperymenty te można łatwo przeprowadzić na wielu mikrogranulkach wewnątrz jednej komórki i rozszerzyć o aktywne pomiary mikroreologiczne.

direct-force-measurements-subcellular-mechanics-confinement-using

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

W niniejszej pracy opisujemy szybką i prostą metodę pomiaru sztywności komórek. Ogólna zasada tego podejścia polega na pomiarze deformacji błony w odpowiedzi na ściśle określone podciśnienie przyłożone do powierzchni komórki za pomocą mikropipety. Metoda ta stanowi potężne narzędzie do badania właściwości biomechanicznych komórek przytwierdzonych do podłoża.

Aspiracja mikropipetą komórek przytwierdzonych do podłoża w celu oszacowania sztywności komórek

Zmierzyliśmy spadek napięcia w aksonie, który został częściowo uszkodzony za pomocą laserowego dysektora, za pomocą jednoczesnego pomiaru spektroskopii siły wykonanego na optycznie uwięzionej sondzie przyklejonej do membrany aksonu. Opracowany protokół eksperymentalny ocenia adhezję aksonów do substratu hodowli.

Pomiar zwolnienia napięcia podczas uszkodzenia aksonu indukowanego laserem w celu oceny adhezji aksonów do podłoża z rozdzielczością pikontonów i milisekund

Prezentujemy zestaw pęsety optycznej sprzężonej z mikroskopem z arkuszem świetlnym oraz jej implementację do badania mechaniki komórkowej bez koralików w zarodku Drosophila.

Sondowanie mechaniki komórkowej za pomocą pęsety optycznej bez koralików w zarodku Drosophila

Tutaj prezentujemy protokół jednoczesnego użycia czujników napięcia opartych na transferze energii rezonansu Förstera do pomiaru obciążenia białkami i odzyskiwania fluorescencji po fotowybielaniu w celu pomiaru dynamiki białek, umożliwiając pomiar dynamiki białek wrażliwych na siłę w żywych komórkach.

Pomiar dynamiki białek wrażliwych na siłę w żywych komórkach przy użyciu kombinacji technik fluorescencyjnych

Korzystając z wcześniej zaprojektowanego urządzenia do mechanicznego obciążania przylegających komórek, ten artykuł opisuje przeprojektowaną geometrię podłoża i dostosowane urządzenie do obrazowania pojedynczych komórek w wysokiej rozdzielczości z obiektywem 100x zanurzenia w olejku.

Obrazowanie dynamiki jądrowej w wysokiej rozdzielczości w żywych komórkach pod wpływem jednoosiowego odkształcenia rozciągającego

Prezentowany tutaj jest obszerny protokół do przeprowadzania ultraszybkich eksperymentów z zaciskiem siły na procesyjnych silnikach miozyny-5, który można łatwo rozszerzyć do badania innych klas silników procesowych. Protokół wyszczególnia wszystkie niezbędne kroki, od ustawienia aparatury doświadczalnej po przygotowanie próbki, gromadzenie danych i analizę.

Analiza właściwości mechanoenzymatycznych miozyn procesowych za pomocą ultraszybkiej spektroskopii siłowo-zaciskowej

Ten protokół przedstawia kompletny eksperymentalny przepływ pracy do badania interakcji RNA-białko za pomocą pęsety optycznej. Przedstawiono kilka możliwych konfiguracji eksperymentalnych, w tym połączenie pęsety optycznej z mikroskopią konfokalną.

Pęseta optyczna do badania interakcji RNA-białko w regulacji translacji

Przedstawiono i omówiono tworzenie wiązek aktomiozyny in vitro oraz pomiar siły generowania zespołu miozyny za pomocą pęsety optycznej.

Sondowanie mechaniki zespołu miozyny w wiązkach filamentów aktynowych za pomocą pęsety optycznej

Tutaj prezentujemy protokół odtwarzania wiązek mikrotubul in vitro i bezpośredniego ilościowego określania sił wywieranych w ich obrębie za pomocą jednoczesnego pułapkowania optycznego i mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem. Test ten pozwala na pomiar sił i przemieszczeń generowanych przez zespoły białek w aktywnych sieciach mikrotubul na poziomie nanoskali.

Bezpośredni pomiar sił w odtworzonych wiązkach aktywnych mikrotubul

Wizualna, jednocząsteczkowa biochemia badana za pomocą komór mikroprzepływowych jest znacznie ułatwiona dzięki szklanemu cylindrowi, gazoszczelnym strzykawkom, stabilnym połączeniom rurek z komórkami przepływowymi i eliminacji pęcherzyków poprzez umieszczenie zaworów przełączających między strzykawkami a rurkami. Protokół opisuje podwójne pułapki optyczne, które umożliwiają wizualizację transakcji DNA i oddziaływań międzycząsteczkowych.

Zastosowanie podwójnej pęsety optycznej i mikrofluidyki do badań pojedynczych cząsteczek

Tutaj opisujemy szybki zestaw pęsety magnetycznej, który wykonuje nanomechaniczne pomiary na wrażliwych na siłę biomolekułach z maksymalną szybkością 1,2 kHz. Wprowadzamy jego zastosowanie do spinek do włosów DNA i kompleksów SNARE jako układów modelowych, ale będzie on miał również zastosowanie do innych cząsteczek biorących udział w zdarzeniach mechanobiologicznych.

Pęseta magnetyczna o dużej prędkości do pomiarów nanomechanicznych na elementach wrażliwych na siłę

Poznaj metodę pomiaru mechanicznych właściwości jądra komórkowego w izolowanych komórkach embrionalnych Danio rerio za pomocą pułapki optycznej. Technika ta umożliwia bezpośredni pomiar siły bez zakłócania błony komórkowej.

Bezpośrednie pomiary siły mechaniki subkomórkowej w zamknięciu za pomocą pęsety optycznej

Przeglądaj więcej filmów