Name: Od komórek do bezkomórkowej syntezy białek w ciągu 24 godzin dzięki bezkomórkowemu przepływowi pracy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 8 s
Description: Poznaj uproszczoną metodę bezkomórkowej autoindukcji do syntezy białek z Escherichia coli w ciągu 24 godzin. Technika zmniejsza nadzór badacza i zwiększa dostępność badań biotechnologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują dr Jennifer VanderKelen i Andrei Laubscher za wsparcie techniczne. Autorzy chcieliby również podziękować Nicole Gregorio, Maxowi Levine'owi, Alissie Mullin, Byungcheol So, Augustowi Brookwellowi, Elizabeth (Lizzy) Vojvodzie, Loganowi Burringtonowi i Jillian Kasman za pomocne dyskusje. Autorzy dziękują również za wsparcie finansowe ze strony Bill and Linda Frost Fund, Center for Applications in Biotechnology's Chevron Biotechnology Applied Research Endowment Grant, Cal Poly Research, Scholarly i National Science Foundation (NSF-1708919).

1. Wzrost mediów
<ol>
	<li>Przygotować 960 ml pożywki CFAI zgodnie z opisem w Tabeli 1 i dostosować pH do 7,2 za pomocą KOH.</li>
	<li>Przenieść pożywkę hodowlaną do kolby z przegrodami o pojemności 2,5 l i sterylizować w autoklawie przez 30 minut w temperaturze 121 °C.</li>
	<li>Przygotować 40 ml roztworu cukru zgodnie z opisem w Tabeli 1. Przefiltrować i wysterylizować roztwór do oddzielnego autoklawizowanego szklanego pojemnika. 
	UWAGA: Roztwór cukru można przechowywać w inkubatorze o temperaturze 30 °C do czasu dalszego użycia.</li>
	<li>Pozostawić podłoże do całkowitego ostygnięcia do temperatury poniżej 40 °C po sterylizacji w autoklawie.</li>
	<li>Przed inokulacją pożywki CFAI należy dodać roztwór cukru bezpośrednio do pożywki CFAI.</li>
	<li>Aby zaszczepić pożywkę, przesuń pętlę kolonii z wcześniej pokrytej prążkami płytki E. coli BL21 Star (DE3) i włóż bezpośrednio do pożywki. Zakręć pętlę w nośniku, ale unikaj dotykania boków pojemnika. Upewnij się, że płytka smugowa jest świeża i zawiera żywe komórki.</li>
	<li>Umieścić kolbę z zaszczepioną pożywką w inkubatorze o temperaturze 30 °C, wytrząsając z prędkością 200 obr./min. Pozwól kulturze rosnąć przez noc. Jeśli komórki zostaną zaszczepione wieczorem, hodowla osiągnie przybliżoną gęstość optyczną, mierzoną przy 600 nm (OD600), wynoszącą 10 następnego ranka. Czas inokulacji i zbiorów można dostosować w zależności od potrzeb.</li>
</ol>
2. Zbieranie komórek
<ol>
	<li>Przygotuj wcześniej bufor S30 i utrzymuj go w chłodzie. Przygotować bufor S30 zgodnie z tabelą 2 do końcowego pH 8.2. 
	UWAGA: Bufor S30 można przygotować na kilka dni przed pobraniem komórek. W takim przypadku należy przygotować bez ditiotreitolu i przechowywać w temperaturze 4 °C. Dodać ditiotreitol tuż przed użyciem.</li>
	<li>Od tego momentu wszystkie roztwory i materiały należy trzymać na lodzie. Przenieść 1 l pożywki do 1 litrowej butelki wirówkowej i odwirować w temperaturze 5 000 x g w temperaturze 4-10 °C przez 10 minut. Zdekantować i usunąć supernatant. Za pomocą sterylnej szpatułki przenieść granulat do wstępnie schłodzonej i uprzednio zważonej probówki stożkowej o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Przemyć raz 30-40 ml zimnego buforu S30, ponownie zawieszając granulkę przez wirowanie w 30-sekundowych seriach z okresami odpoczynku na lodzie. 
	UWAGA: Ze względu na większą objętość osadu, podzielenie osadu komórkowego na dwie stożkowe probówki o pojemności 50 ml może być pomocne na etapie mycia. Przechowywanie komórek w mniejszych porcjach zapewnia również elastyczność w dalszym przetwarzaniu.</li>
	<li>Odwirować ponowne zawieszenie komórek w temperaturze 5000 x g w temperaturze 4-10 °C przez 10 minut.</li>
	<li>Usunąć supernatant i wytrzeć jego nadmiar z wewnętrznych ścianek stożkowej probówki o pojemności 50 ml czystą chusteczką, unikając dotykania samej osadki. Zważyć i błyskawicznie zamrozić osad w ciekłym azocie. Przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia. 
	UWAGA: Granulki mogą nie wymagać błyskawicznego zamrażania, jeśli użytkownik planuje kontynuować protokół przygotowania ekstraktu.</li>
</ol>
3. Przygotowanie ekstraktu
<ol>
	<li>Połączyć zamrożony granulat z 1 ml buforu S30 na każdy 1 g osadu komórkowego i pozostawić do rozmrożenia na lodzie przez około 30-60 minut. Ponownie zawiesić rozmrożony granulat poprzez wirowanie w seriach trwających 30 s z okresami odpoczynku na lodzie. Wiruj, aż nie pozostaną żadne widoczne grudki komórek. 
	UWAGA: Mniejsze grudki można ponownie zawiesić, mieszając za pomocą pipety.</li>
	<li>Przenieś podwielokrotności 1,4 ml resuspension komórek do 1,5 ml probówek do mikrofuge w celu lizy komórek. Sonizuj każdą lampę z częstotliwością 20 kHz i amplitudą 50% przez trzy serie po 45 s z 59 s spoczynku na cykl w otoczeniu łaźni lodowej. Odwróć probówkę między cyklami i natychmiast dodaj 4,5 μl 1 M ditiotreitolu po ostatnim cyklu sonikacji. 
	UWAGA: Ze względu na ciepło uwalniane podczas sonikacji, niezwykle ważne jest, aby upewnić się, że wszystkie porcje są trzymane na lodzie, gdy nie są poddawane sonikacji. Kąpiel lodowa powinna być stale uzupełniana lub wystarczająco duża, aby pozostać chłodna przez cały proces sonikacji.</li>
	<li>Odwirować każdą probówkę przy 18 000 x g i temperaturze 4 °C przez 10 minut. Pobrać supernatant i podwielokrotność do probówek do mikrodynków o pojemności 1,5 ml w podwielokrotnościach o pojemności 600 μl. Błyskawiczne zamrożenie porcji i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia. Należy zachować ostrożność, aby pipetować tylko supernatant.</li>
</ol>
4. Bezkomórkowa synteza białek
<ol>
	<li>Rozmrozić jedną porcję ekstraktu z poprzedniego etapu, aby przeprowadzić 15 μl bezkomórkowych reakcji syntezy białek w 1,5 ml probówkach do mikrofuge w poczwórnym tempie.</li>
	<li>Przygotować każdą reakcję, łącząc 240 ng DNA (16 μg/ml stężenia końcowego), 2,20 μl roztworu A, 2,10 μl roztworu B, 5,0 μl ekstraktu i różną objętość wody molekularnej w celu napełnienia reakcji do 15 μl. Ta reakcja może być skalowana do większych objętości. Wskaźniki przedstawiono w tabeli 3.
	<ol>
		<li>Przygotować roztwory A i B zgodnie z tabelą 4. Każdy roztwór można przygotować w partiach od 100 μl do 1 ml, podaszkować i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia. 
		UWAGA: Ilość DNA może się różnić w zależności od białka będącego przedmiotem zainteresowania. W tym przypadku zastosowany plazmid, pJL1-sfGFP, został zoptymalizowany do działania przy 16 μg/ml lub 597 μM.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pozostawić reakcje na czas co najmniej 4 godzin w temperaturze 37 °C.</li>
</ol>
5. Kwantyfikacja białka reporterowego, super folderowego białka zielonej fluorescencji (sfGFP)
<ol>
	<li>Używając 96-dołkowej czarnej płytki polistyrenowej o połowie powierzchni, połącz 2 μl każdego produktu reakcji syntezy białek bez komórek z 48 μl 0,05 M buforu HEPES o pH 7,2. Zalecane są trzy do czterech powtórzeń każdej probówki reakcyjnej.</li>
	<li>Określić ilościowo intensywność fluorescencji sfGFP przy długości fali wzbudzenia 485 nm i długości fali emisji 528 nm.</li>
	<li>W celu przeliczenia względnych jednostek fluorescencji na wydajność objętościową (μg/ml) sfGFP należy ustalić krzywą wzorcową przy użyciu oczyszczonego pJL1-sfGFP.</li>
</ol>

<ol><li>Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+user%27s+guide+to+cell-free+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">A user's guide to cell-free protein synthesis.</a> Methods and Protocols. 2 (1), 1-34 (2019).</li>
<li>Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+gene+expression%3A+an+expanded+repertoire+of+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications.</a> Nature Reviews Genetics. 21 (3), (2020).</li>
<li>Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+biological+applications+using+cell-free+metabolic+engineering%3A+An+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolic+Engineering%22%5BJournal%5D)">Expanding biological applications using cell-free metabolic engineering: An overview.</a> Metabolic Engineering. 50, 156-172 (2018).</li>
<li>Jared, B., Dopp, L., Tamiev, D. D., Reuel, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+supplement+mixtures%3A+Elucidating+the+history+and+biochemical+utility+of+additives+used+to+support+in+vitro+protein+synthesis+in+E.+coli+extract%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Advances%22%5BJournal%5D)">Cell-free supplement mixtures: Elucidating the history and biochemical utility of additives used to support in vitro protein synthesis in E. coli extract.</a> Biotechnology Advances. 37 (1), 246-258 (2019).</li>
<li>Jewett, M. C., Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mimicking+the+Escherichia+coli+cytoplasmic+environment+activates+long-lived+and+efficient+cell-free+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Mimicking the Escherichia coli cytoplasmic environment activates long-lived and efficient cell-free protein synthesis.</a> Biotechnology and Bioengineering. 86 (1), 19-26 (2004).</li>
<li>Calhoun, K. A., Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energizing+cell-free+protein+synthesis+with+glucose+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Energizing cell-free protein synthesis with glucose metabolism.</a> Biotechnology and Bioengineering. 90 (5), 606-613 (2005).</li>
<li>Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli-based+cell-free+protein+synthesis%3A+Protocols+for+a+robust%2C+flexible%2C+and+accessible+platform+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli-based cell-free protein synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology.</a> Journal of Visualized Experiments. (144), e58882(2019).</li>
<li>Sun, Z. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+for+Implementing+an+Escherichia+coli+Based+TX-TL+Cell-Free+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22System+for+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression.</a> System for Synthetic Biology. , 1-14 (2013).</li>
<li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Portable%2C+on-demand+biomolecular+manufacturing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Portable, on-demand biomolecular manufacturing.</a> Cell. 167, 248-254 (2016).</li>
<li>Moore, S. J., Macdonald, J. T., Freemont, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+synthetic+biology+for+in+vitro+prototype+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Cell-free synthetic biology for in vitro prototype engineering.</a> Biochemical Society Transactions. 45 (3), 785-791 (2017).</li>
<li>Cole, S. D., Miklos, A. E., Chiao, A. C., Sun, Z. Z., Lux, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodologies+for+preparation+of+prokaryotic+extracts+for+cell-free+expression+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Synthetic+and+Systems+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems.</a> Synthetic and Systems Biotechnology. 5 (4), 252-267 (2020).</li>
<li>Didovyk, A., Tonooka, T., Tsimring, L., Hasty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+scalable+preparation+of+bacterial+lysates+for+cell-free+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Rapid and scalable preparation of bacterial lysates for cell-free gene expression.</a> ACS Synthetic Biology. 6 (12), 2198-2208 (2017).</li>
<li>Dopp, J. L., Reuel, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Process+optimization+for+scalable+E.+coli+extract+preparation+for+cell-free+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Engineering+Journal%22%5BJournal%5D)">Process optimization for scalable E. coli extract preparation for cell-free protein synthesis.</a> Biochemical Engineering Journal. 138, 21-28 (2018).</li>
<li>Kwon, Y. C., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+preparation+methods+of+crude+extract+for+robust+cell-free+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis.</a> Scientific Reports. 5, 8663(2015).</li>
<li>Endo, Y., Sawasaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+expression+systems+for+eukaryotic+protein+production%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell-free expression systems for eukaryotic protein production.</a> Current Opinion in Biotechnology. 17 (4), 373-380 (2006).</li>
<li>Zemella, A., Thoring, L., Hoffmeister, C., Kubick, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+protein+synthesis%3A+Pros+and+cons+of+prokaryotic+and+eukaryotic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Cell-free protein synthesis: Pros and cons of prokaryotic and eukaryotic systems.</a> ChemBioChem. 16 (17), 2420-2431 (2015).</li>
<li>Laohakunakorn, N., Grasemann, L., Lavickova, B., Michielin, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bottom-up+construction+of+complex+biomolecular+systems+with+cell-free+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Bottom-up construction of complex biomolecular systems with cell-free synthetic biology.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, (2020).</li>
<li>Ahn, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+synthesis+of+recombinant+proteins+from+PCR-amplified+genes+at+a+comparable+productivity+to+that+of+plasmid-based+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Cell-free synthesis of recombinant proteins from PCR-amplified genes at a comparable productivity to that of plasmid-based reactions.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 338 (3), 1346-1352 (2005).</li>
<li>Kim, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+procedures+for+the+construction+of+a+robust+and+cost-effective+cell-free+protein+synthesis+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Simple procedures for the construction of a robust and cost-effective cell-free protein synthesis system.</a> Journal of Biotechnology. 126 (4), 554-561 (2006).</li>
<li>Hunt, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streamlining+the+preparation+of+%22endotoxin-free%22+ClearColi+cell+extract+with+autoinduction+media+for+cell-free+protein+synthesis+of+the+therapeutic+protein+crisantaspase%5BTitle%5D)+AND+%22Synthetic+and+Systems+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Streamlining the preparation of "endotoxin-free" ClearColi cell extract with autoinduction media for cell-free protein synthesis of the therapeutic protein crisantaspase.</a> Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 220-224 (2019).</li>
<li>Studier, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+production+by+auto-induction+in+high-density+shaking+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Protein production by auto-induction in high-density shaking cultures.</a> Protein Expression and Purification. 41, 207-234 (2005).</li>
<li>Shrestha, P., Holland, T. M., Bundy, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streamlined+extract+preparation+for+Escherichia+coli-based+cell-free+protein+synthesis+by+sonication+or+bead+vortex+mixing%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Streamlined extract preparation for Escherichia coli-based cell-free protein synthesis by sonication or bead vortex mixing.</a> BioTechniques. 53 (3), 163-174 (2012).</li>
<li>Bosdriesz, E., Molenaar, D., Teusink, B., Bruggeman, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+fast-growing+bacteria+robustly+tune+their+ribosome+concentration+to+approximate+growth-rate+maximization%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">How fast-growing bacteria robustly tune their ribosome concentration to approximate growth-rate maximization.</a> FEBS Journal. 282 (10), 2029-2044 (2015).</li>
<li>Zawada, J., Swartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintaining+rapid+growth+in+moderate-density+Escherichia+coli+fermentations%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Maintaining rapid growth in moderate-density Escherichia coli fermentations.</a> Biotechnology and Bioengineering. 89 (4), 407-415 (2005).</li>
<li>Kim, J., Copeland, C. E., Padumane, S. R., Kwon, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+crude+extract+preparation+and+optimization+from+a+genomically+engineered+Escherichia+coli+for+the+cell-free+protein+synthesis+system%3A+Practical+laboratory+guideline%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">A crude extract preparation and optimization from a genomically engineered Escherichia coli for the cell-free protein synthesis system: Practical laboratory guideline.</a> Methods and Protocols. 2 (3), 1-15 (2019).</li>
<li>Failmezger, J., Rauter, M., Nitschel, R., Kraml, M., Siemann-Herzberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+protein+synthesis+from+non-growing%2C+stressed+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Cell-free protein synthesis from non-growing, stressed Escherichia coli.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-10 (2017).</li>
<li>Levine, M. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+energy+metabolism+through+growth+media+reformulation+enables+a+24-h+workflow+for+cell-free+expression%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Activation of energy metabolism through growth media reformulation enables a 24-h workflow for cell-free expression.</a> ACS Synthetic Biology. 9 (10), 2765-2774 (2020).</li>
<li>Martin, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+protein+synthesis+from+genomically+recoded+bacteria+enables+multisite+incorporation+of+noncanonical+amino+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Cell-free protein synthesis from genomically recoded bacteria enables multisite incorporation of noncanonical amino acids.</a> Nature Communications. , 1-9 (2018).</li>
<li>Soye, B. J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resource+A+highly+productive%2C+One-pot+cell-free+protein+synthesis+platform+based+on+genomically+recoded+Escherichia+coli+resource%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Resource A highly productive, One-pot cell-free protein synthesis platform based on genomically recoded Escherichia coli resource.</a> Cell Chemical Biology. 26 (12), 1743-1754 (2019).</li>
<li>Ezure, T., Suzuki, T., Ando, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell-free+protein+synthesis+system+from+insect+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A cell-free protein synthesis system from insect cells.</a> Methods in Molecular Biology. , 285-296 (2014).</li>
<li>Heide, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((development+and+optimization+of+a+functional+mammalian+cell-free+protein+synthesis+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">development and optimization of a functional mammalian cell-free protein synthesis platform.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 1-10 (2021).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych finansowych konfliktów interesów.

Nadzór naukowców jest tradycyjnie potrzebny w przypadku dwóch kluczowych działań podczas wzrostu komórek: indukcji RNAP T7 i pobierania komórek przy określonym OD600. CFAI znosi oba te wymagania, aby skrócić czas badacza i jego szkolenie techniczne wymagane do przygotowania wysokiej jakości ekstraktów komórkowych. Automatyczna indukcja T7 RNAP osiąga się poprzez zastąpienie glukozy laktozą jako głównym cukrem w pożywce, eliminując wcześniejszą potrzebę aktywnego monitorowania wzrostu, a następnie indukowania z...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62866">From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours using Cell-Free Autoinduction Workflow</a>. The Authors&#160;section was&#160;updated.
The Authors section was updated from:
Philip E.J. Smith1,2, Taylor Slouka1,2,&#160;Javin P. Oza1,2 
1Department of Chemistry and Biochemistry, California Polytechnic State University 
2Center for Application in Biotechnology, California Polytechnic State University
to:
Philip E.J. Smith1,2, Taylor Slouka1,2, Mona Dabbas 1,2, Javin P. Oza1,2 
1Department of Chemistry and Biochemistry, California Polytechnic State University 
2Center for Application in Biotechnology, California Polytechnic State University

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62866">From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours using Cell-Free Autoinduction Workflow</a>. The Authors&#160;section was&#160;updated.

Erratum: From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours using Cell-Free Autoinduction Workflow

Wykorzystanie bezkomórkowej syntezy białek (CFPS) do zastosowań biotechnologicznych znacznie wzrosło w ciągu ostatnich kilku lat1,2,3. Rozwój ten można częściowo przypisać zwiększonym wysiłkom na rzecz zrozumienia procesów zachodzących w CFPS i roli każdego komponentu4,5. Dodatkowo, zmniejszone koszty związane ze zoptymalizowanymi ustawieniami i alternatywnymi źródłami energii sprawiły, że technologia bezkomórkowa jest łatwiejsza do wdrożenia dla nowych użytkowników6,7,8,9. W celu implementacji niezbędnych czynników transkrypcyjnych i translacyjnych do syntezy białek, ekstrakt komórkowy jest często używany do napędzania reakcji bezkomórkowych10. Niedawno opublikowane podręczniki użytkownika zawierają proste protokoły tworzenia funkcjonalnego ekstraktu, ułatwiając jego implementację zarówno nowym, jak i doświadczonym użytkownikom1,11,12,13,14. Ekstrakt komórkowy jest zwykle uzyskiwany w procesie lizy hodowli komórkowej, która może być hodowana przy użyciu różnych organizmów w zależności od konkretnego pożądanego zastosowania1,15,16.
Escherichia coli (E. coli) szybko stała się jednym z najczęściej używanych organizmów gospodarzy do produkcji funkcjonalnych ekstraktów17. Szczep BL21 Star (DE3) jest preferowany, ponieważ usuwa proteazy z błony zewnętrznej (proteaza OmpT) i cytoplazmy (proteaza Lon), zapewniając optymalne środowisko dla ekspresji rekombinowanego białka. Dodatkowo DE3 zawiera λDE3, który przenosi gen polimerazy RNA T7 (T7 RNAP) pod kontrolą promotora lacUV5; komponent gwiazdy zawiera zmutowany gen RNaseE, który zapobiega rozszczepieniu mRNA4,14,18,19. Pod promotorem lacUV5 indukcja izopropylo-tiogalaktopiranozydu (IPTG) umożliwia ekspresję T7 RNAP20,21. Szczepy te są wykorzystywane do wzrostu i zbierania komórek, które dają surowiec do przygotowania ekstraktu. Liza komórek może być przeprowadzana przy użyciu różnych metod, w tym ubijania kulek, prasy francuskiej, homogenizacji, sonikacji i kawitacji azotu1,11,12,22.
Proces hodowli i zbierania bakterii jest spójny na większości platform przy użyciu E. coli, ale wymaga wielu dni i intensywnego nadzoru badaczy1,11,13. Proces ten zwykle rozpoczyna się od nocnej hodowli nasion w bulionie LB, który po nocnym wzroście jest następnie zaszczepiany do większej kultury 2xYTPG (drożdże, trypton, bufor fosforanowy, glukoza) następnego dnia. Wzrost tej większej kultury jest monitorowany, aż osiągnie wczesną i środkową fazę logarytmiczną, przy gęstości optycznej (OD) 2,514,20. Wymagany jest ciągły pomiar, ponieważ wcześniej wykazano, że składniki transkrypcji i translacji są bardzo aktywne w wczesnej i środkowej fazie logarytmu23,24. Chociaż proces ten może stworzyć powtarzalny ekstrakt, nasze laboratorium opracowało niedawno nową metodę wykorzystującą pożywkę do autoindukcji bez komórek (CFAI), która zmniejsza nadzór badaczy, zwiększa ogólną wydajność ekstraktu dla danego litra hodowli komórkowej i poprawia dostęp do preparatu ekstraktu na bazie E. coli zarówno dla doświadczonych, jak i nowych użytkowników (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). W tym miejscu przedstawiamy przewodnik krok po kroku, jak wdrożyć przepływ pracy CFAI, aby przejść od smugowej płytki komórek do zakończonej reakcji CFPS w ciągu 24 godzin.

<table><tbody><tr><td>1,5 ml probówki do mikrofuge</td><td>Phenix</td><td>MPC-425Q</td><td></td></tr><tr><td>1L Probówka wirówkowa</td><td>Beckman Coulter</td><td>A99028</td><td></td></tr><tr><td>Avanti J-E Wirówka</td><td>Beckman Coulter</td><td>369001</td><td></td></tr><tr><td>CoA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3144-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Cytacja 5 Obrazowanie komórek Czytnik wielomodowy</td><td>Biotek</td><td>BTCYT5F</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Fisher</td><td>D16-3</td><td></td></tr><tr><td>D-Laktoza</td><td>Alfa Aesar</td><td>J66376</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>ThermoFisher</td><td>15508013</td><td></td></tr><tr><td>Kwas folinowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7878-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7126-100G</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>ThermoFisher</td><td>11344041</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6758-1G</td><td></td></tr><tr><td>JLA-8.1000</td><td>Rotor Beckman Coulter</td><td>366754</td><td></td></tr><tr><td>K(Glu)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1501-500G</td><td></td></tr><tr><td>K(OAc)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1190-1KG</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5958-500G</td><td></td></tr><tr><td>L-Alanina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7627-100G</td><td></td></tr><tr><td>L-Arginine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8094-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-Asparagine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0884-25G</td><td></td></tr><tr><td>Kwas L-Asparaginowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7219-100G</td><td></td></tr><tr><td>L-Cysteina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7352-25G</td><td></td></tr><tr><td>Kwas L-Glutaminowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1501-500G</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G3126-250G</td><td></td></tr><tr><td>L-Histadine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8000-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-Izoleucyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2752-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-Leucyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L8000-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-Lizyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5501-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-Metionina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9625-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-Fenyloalanina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2126-100G</td><td></td></tr><tr><td>L-Prolina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0380-100G</td><td></td></tr><tr><td>L-Serine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4500-100G</td><td></td></tr><tr><td>L-Treonina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8625-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-Tryptofan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0254-25G</td><td></td></tr><tr><td>L-Tyrozyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3754-100G</td><td></td></tr><tr><td>Bulion Luria</td><td>ThermoFisher</td><td>12795027</td><td></td></tr><tr><td>L-walina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V0500-25G</td><td></td></tr><tr><td>Mg(Glu)2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49605-250G</td><td></td></tr><tr><td>Mg(OAc)2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5661-250G</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge 20</td><td>Beckman Coulter</td><td>B30134</td><td></td></tr><tr><td>Woda molekularna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7732-18-5</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Alfa Aesar</td><td>A12313</td><td></td></tr><tr><td>NAD</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N8535-15VL</td><td></td></tr><tr><td>Nowy Brunszwik Inkubator Innova 42/42R</td><td>Eppendorf</td><td>M1335-0000</td><td></td></tr><tr><td>NH4(Glu)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>09689-250G</td><td></td></tr><tr><td>NTPs</td><td>ThermoFisher</td><td>R0481</td><td></td></tr><tr><td>Kwas szczawiowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0963-100G</td><td></td></tr><tr><td>PEP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>860077-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu dwuzasadowy</td><td>Acros, substancje organiczne</td><td>A0382124</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu Monobasic</td><td>Acros, Organics</td><td>A0379904</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do przygotowania plazmidu PureLink HiPure</td><td>ThermoFisher</td><td>K210007</td><td></td></tr><tr><td>Putrescine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D13208-25G</td><td></td></tr><tr><td>Spermidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0266-5G</td><td></td></tr><tr><td>Tris(OAc)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6066-500G</td><td></td></tr><tr><td>tRNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10109541001</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>73049-73-7</td><td></td></tr><tr><td>Tunair 2.5L Baffled Shake Kolba</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z710822</td><td></td></tr><tr><td>Procesor</td> <td>ultradźwiękowyQSonica</td><td>Q125-230V/50HZ</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>Bioodczynniki Fisher</td><td>1/2/8013</td><td></td></tr></tbody></table>

od komórek do bezkomórkowej syntezy białek w ciągu 24 godzin dzięki bezkomórkowemu przepływowi pracy

From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours Using Cell-Free Autoinduction Workflow

Bezkomórkowa synteza białek (CFPS) rozrosła się jako platforma biotechnologiczna, która przechwytuje maszynerię transkrypcji i translacji in vitro. Liczne rozwiązania sprawiły, że platforma CFPS stała się bardziej dostępna dla nowych użytkowników i rozszerzyła zakres zastosowań. W przypadku systemów CFPS opartych na lizacie ekstrakty komórkowe mogą być generowane z różnych organizmów, wykorzystując unikalną biochemię tego gospodarza w celu zwiększenia syntezy białek. W ciągu ostatnich 20 lat Escherichia coli (E. coli) stała się jednym z najczęściej stosowanych organizmów do wspierania CFPS ze względu na swoją przystępność cenową i wszechstronność. Pomimo wielu kluczowych postępów, proces przygotowania ekstraktu z komórek E. coli pozostał kluczowym wąskim gardłem dla nowych użytkowników w celu wdrożenia CFPS w swoich zastosowaniach. Proces przygotowania ekstraktu jest czasochłonny i wymaga specjalistycznej wiedzy technicznej w celu osiągnięcia powtarzalnych wyników. Aby pokonać te bariery, informowaliśmy wcześniej o opracowaniu 24-godzinnego przepływu pracy z autoindukcją bez komórek (CFAI), który zmniejsza nakład pracy użytkownika i wymaganą wiedzę techniczną. Przepływ pracy CFAI minimalizuje nakład pracy i umiejętności techniczne wymagane do generowania ekstraktów komórkowych, jednocześnie zwiększając całkowite ilości uzyskiwanych ekstraktów komórkowych. W tym miejscu opisujemy ten przepływ pracy krok po kroku, aby poprawić dostęp i wesprzeć szerokie wdrożenie CFPS opartego na E. coli.

Podczas przygotowywania pożywki CFAI glukozę zastąpiono zwiększoną ilością laktozy i glicerolu jako głównych substratów energetycznych w pożywce. Ponadto zwiększono również pojemność buforową pożywki CFAI. Szczegółowy skład tych komponentów przedstawiono w Tabeli 1.
Komórki hodowano następnie do poziomu OD600 wynoszącego zarówno 10, jak i standardowej wartości 2,5 w pożywce CFAI, aby wykazać spójność jakości ekstraktu niezależnie od różniących się ilości uzyskanego ...

Ta praca opisuje przygotowanie ekstraktu komórkowego z Escherichia coli (E. coli), po którym następują reakcje syntezy białek bez komórek (CFPS) w czasie krótszym niż 24 godziny. Wyjaśnienie protokołu autoindukcji bezkomórkowej (CFAI) zawiera szczegółowe informacje o ulepszeniach wprowadzonych w celu zmniejszenia nadzoru badaczy i zwiększenia ilości uzyskiwanego ekstraktu komórkowego.

Od komórek do bezkomórkowej syntezy białek w ciągu 24 godzin dzięki bezkomórkowemu przepływowi pracy

Cell-free protein synthesis (CFPS) has grown as a biotechnology platform that captures transcription and translation machinery in vitro. Numerous ...

Bezkomórkowa metoda autoindukcji zmniejsza nadzór naukowców i czas potrzebny do wytworzenia funkcjonalnych ekstraktów komórkowych. Upraszcza to wcześniejsze protokoły syntezy białek in vitro, które były bardziej czasochłonne i intensywne. Technika ta jest mniej skomplikowana, a także wysoce wydajna, co umożliwi większej liczbie odbiorców wdrożenie ekspresji bezkomórkowej.Metoda ta podkreśla znaczenie metabolizmu energetycznego podczas wzrostu komórek i w reakcjach bezkomórkowych. Zacznij od przygotowania 960 mililitrów bezkomórkowych pożywek do autoindukcji. Następnie wysterylizuj pożywkę w 2,5-litrowej kolbie z przegrodą przez autoklawowanie przez 30 minut w temperaturze 121 stopni Celsjusza.Następnie, po przygotowaniu 40 mililitrów roztworu cukru, przefiltruj go i wysterylizuj do osobnego autoklawowanego szklanego pojemnika. Po autoklawowaniu, gdy pożywka hodowlana ostygnie do temperatury poniżej 40 stopni Celsjusza, dodaj wysterylizowany przez filtr roztwór cukru bezpośrednio do pożywki. Następnie zaszczepij pożywkę, przesuwając pętlę pełną kolonii z wcześniej pokrytej świeżej płytki gwiaździstej E.coli BL21 i wkładając pętlę bezpośrednio do pożywki.Zakręć pętlę w nośniku, nie dotykając ścianek pojemnika. Następnie umieść zaszczepioną pożywkę na noc w inkubatorze o temperaturze 30 stopni Celsjusza z wytrząsaniem przy 200 obr./min. Następnego dnia zbierz komórki, przenosząc jeden litr pożywki do litrowej butelki wirówki i odwirowując w temperaturze 5 000 razy G w temperaturze od czterech do 10 stopni Celsjusza przez 10 minut.Po odrzuceniu supernatantu za pomocą sterylnej szpatułki przenieść osad do wstępnie schłodzonej i uprzednio zważonej stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Następnie umyj granulkę raz 30 do 40 mililitrami zimnego bufora S30, ponownie zawieszając granulkę poprzez wirowanie w 30-sekundowych seriach z okresami odpoczynku na lodzie. Po całkowitym ponownym zawieszeniu osadu należy odwirować zawiesinę komórki, wyrzucić supernatant i za pomocą czystej chusteczki wytrzeć nadmiar supernatantu z wewnętrznych ścianek 50-mililitrowej probówki, nie dotykając osadu.Następnie zważ granulkę przed błyskawicznym zamrożeniem jej w ciekłym azocie i przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do dalszego użycia. Aby przygotować ekstrakt komórkowy, dodaj jeden mililitr buforu S30 na gram zamrożonego osadu komórkowego i pozwól osadkowi rozmrozić się na lodzie przez 30 do 60 minut. Następnie ponownie zawiesić rozmrożony granulat poprzez wirowanie w seriach trwających 30 sekund z okresami odpoczynku na lodzie, aż nie pozostaną żadne widoczne grudki komórek.W celu lizy komórek przenieś 1,4 mililitra podwielokrotności zawiesiny komórkowej do 1,5-mililitrowych probówek do mikrofuge. Następnie sonikować zawiesinę komórkową w każdej probówce z częstotliwością 20 kiloherców i amplitudą 50% przez trzy serie po 45 sekund z 59 sekundami odpoczynku na cykl w łaźni lodowej Odwróć rurkę między cyklami, a po ostatnim cyklu sonikacji natychmiast dodaj 4,5 mikrolitra jednomolowego ditiotreitolu. Po sonikacji zawiesiny komórkowej we wszystkich probówkach, należy odwirować probówki i zebrać supernatant w 600-mikrolitrowych podwielokrotnościach do świeżych 1,5-mililitrowych probówek do mikrofuge.Błyskawicznie zamrozić i przechowywać porcje w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu dalszego użycia. Aby przeprowadzić 15 mikrolitrów bezkomórkowej reakcji syntezy białek w 1,5-mililitrowych probówkach do mikrofug w poczwórnym tempie, rozmrozić jedną porcję ekstraktu komórkowego. Po przygotowaniu każdej 15-mikrolitrowej mieszaniny reakcyjnej pozwól reakcji toczyć się przez co najmniej cztery godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Aby określić ilościowo białko reporterowe, połącz 48 mikrolitrów 50-milimolowego buforu HEPES o pH 7,2 z dwoma mikrolitrami każdego produktu reakcji syntezy białek bezkomórkowych w czarnej polistyrenowej 96-dołkowej płytce. Określ ilościowo intensywność fluorescencji superfolderu białka zielonej fluorescencji lub sfGFP, używając długości fali wzbudzenia 485 i długości fali emisji 528 nanometrów. Następnie przelicz względne jednostki fluorescencji na wolumetryczną wydajność sfGFP, tworząc krzywą wzorcową przy użyciu oczyszczonego plazmidu pJL1 sfGFP.Pokazano tutaj bezkomórkowe granulki pożywek autoindukcyjnych po zebraniu komórek o różnych gęstościach optycznych mierzonych przy 600 nanometrach. Pożywka wyhodowana do gęstości optycznej 10 wytworzyła większą ilość osadu komórkowego w ogólnym ekstrakcie niż pożywka wyhodowana do gęstości optycznej 2,5. Dalsza analiza całkowitego stężenia białka nie wykazała znaczącej różnicy w ogólnym białku między obydwoma ekstraktami.Mimo że pożywka została wyhodowana do różnych poziomów gęstości optycznej, oba ekstrakty wykazały podobne wyniki w bezkomórkowych reakcjach eksprymujących sfGFP. Ważne jest utrzymanie sterylnych warunków podczas przygotowywania pożywki i roztworu cukru. Ta metoda ekstrakcji komórek CFAI może być stosowana w większości zastosowań ekspresji bezkomórkowej.Obejmują one edukację biotechnologiczną i inżynierię białek, a także diagnostykę przyłóżkową. Ta metoda skraca czas i wymaga umiejętności technicznych, poprawia odtwarzalność i wytwarza większe ilości ekstraktu.

from-cells-to-cell-free-protein-synthesis-within-24-hours-using-cell

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Ten pięciodniowy protokół przedstawia wszystkie kroki, sprzęt i dodatkowe oprogramowanie niezbędne do stworzenia i uruchomienia od podstaw wydajnego, endogennego systemu ekspresji TX-TL opartego na Escherichia coli. W przypadku odczynników protokół potrzebuje 8 godzin lub mniej na przygotowanie reakcji, zebranie i przetworzenie danych.

Protokoły wdrażania bezkomórkowego systemu ekspresji TX-TL opartego na Escherichia coli w biologii syntetycznej

W tym artykule wideo opisujemy syntezę in vitro zmodyfikowanego mRNA do indukcji ekspresji białek w komórkach.

In vitro Synteza zmodyfikowanego mRNA do indukcji ekspresji białek w komórkach ludzkich

Opisano mikrofabrykowane urządzenie z zamykanymi komorami reakcyjnymi o objętości femtolitrów. Raport ten zawiera protokół uszczelniania bezkomórkowych reagentów syntezy białek w tych komorach w celu zrozumienia roli stłoczenia i uwięzienia w ekspresji genów.

Zamykane matryce komór femtolitrowych dla biologii bezkomórkowej

Opisujemy prostą procedurę litograficzną do unieruchamiania cząsteczek DNA o długości genu na powierzchni, która może być użyta do przeprowadzenia eksperymentów z ekspresją genów na biochipach bez komórek.

Funkcjonalne powierzchniowe unieruchomienie genów za pomocą wieloetapowej litografii przemieszczenia nici

Ten protokół szczegółowo opisuje kroki, koszty i sprzęt niezbędny do generowania ekstraktów komórkowych na bazie E. coli i przeprowadzania reakcji syntezy białek in vitro w ciągu 4 dni lub krócej. Aby wykorzystać elastyczny charakter tej platformy do szerokich zastosowań, omawiamy warunki reakcji, które można dostosować i zoptymalizować.

Bezkomórkowa synteza białek na bazie Escherichia coli: Protokoły dla solidnej, elastycznej i dostępnej technologii platformy

Ten protokół opisuje metodę, materiały, sprzęt i kroki do oddolnego przygotowania RNA i komórek syntetycznych produkujących białka. Wewnętrzna komora wodna komórek syntetycznych zawierała lizat bakteryjny S30 zamknięty w dwuwarstwie lipidowej (tj. stabilnych liposomach), przy użyciu metody przenoszenia emulsji woda w oleju.

Przygotowanie syntetycznych komórek wytwarzających białka przy użyciu ekstraktów bakteryjnych wolnych od komórek, liposomów i transferu emulsji

Badanie opisuje protokół tworzenia dużych (μg-mg) ilości DNA do kampanii przesiewowych białek z syntetycznych fragmentów genów bez klonowania lub używania żywych komórek. Minimalny szablon jest trawiony enzymatycznie i okrężny, a następnie amplifikowany za pomocą izotermicznego amplifikacji tocznego koła. Bezkomórkowe reakcje ekspresji można przeprowadzić z nieoczyszczonym produktem.

Szybkie, enzymatyczne metody amplifikacji minimalnych, liniowych matryc do prototypowania białek przy użyciu systemów bezkomórkowych

Dobrze scharakteryzowane części genetyczne są niezbędne do projektowania nowych obwodów genetycznych. W tym miejscu opisujemy ekonomiczną, wysokoprzepustową metodę szybkiego charakteryzowania części genetycznych. Nasza metoda zmniejsza koszty i czas dzięki połączeniu lizatów bezkomórkowych, liniowego DNA w celu uniknięcia klonowania oraz akustycznej obsługi cieczy w celu zwiększenia przepustowości i zmniejszenia objętości reakcji.

Szybka charakterystyka części genetycznych za pomocą systemów bezkomórkowych

Prezentowany tutaj jest protokół przygotowania i kalibracji buforu ekstraktów komórkowych z egzonukleazy V nokautujących szczepów Escherichia coli BL21 Rosetta2 (ΔrecBCD i ΔrecB). Jest to szybkie, łatwe i bezpośrednie podejście do ekspresji w bezkomórkowych systemach syntezy białek przy użyciu liniowych matryc DNA.

Bezkomórkowa synteza białek z ekstraktów komórkowych z niedoborem egzonukleazy z wykorzystaniem liniowych matryc DNA

Ten protokół opisuje system Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) używany do budowy syntetycznych komórek. Przedstawiono w nim kluczowe etapy z reprezentatywnymi wynikami w różnych mikrokompartmentach. Protokół ma na celu ustanowienie najlepszych praktyk dla różnych laboratoriów w społeczności komórek syntetycznych, przyspieszając postęp w rozwoju komórek syntetycznych.

Bezkomórkowy system syntezy białek do budowy komórek syntetycznych

Poznaj uproszczoną metodę bezkomórkowej autoindukcji do syntezy białek z Escherichia coli w ciągu 24 godzin. Technika zmniejsza nadzór badacza i zwiększa dostępność badań biotechnologicznych.

Od komórek do bezkomórkowej syntezy białek w ciągu 24 godzin dzięki bezkomórkowemu przepływowi pracy

Przeglądaj więcej filmów