Od komórek do bezkomórkowej syntezy białek w ciągu 24 godzin dzięki bezkomórkowemu przepływowi pracy

Bezkomórkowa metoda autoindukcji zmniejsza nadzór naukowców i czas potrzebny do wytworzenia funkcjonalnych ekstraktów komórkowych. Upraszcza to wcześniejsze protokoły syntezy białek in vitro, które były bardziej czasochłonne i intensywne. Technika ta jest mniej skomplikowana, a także wysoce wydajna, co umożliwi większej liczbie odbiorców wdrożenie ekspresji bezkomórkowej.

Metoda ta podkreśla znaczenie metabolizmu energetycznego podczas wzrostu komórek i w reakcjach bezkomórkowych. Zacznij od przygotowania 960 mililitrów bezkomórkowych pożywek do autoindukcji. Następnie wysterylizuj pożywkę w 2,5-litrowej kolbie z przegrodą przez autoklawowanie przez 30 minut w temperaturze 121 stopni Celsjusza.

Następnie, po przygotowaniu 40 mililitrów roztworu cukru, przefiltruj go i wysterylizuj do osobnego autoklawowanego szklanego pojemnika. Po autoklawowaniu, gdy pożywka hodowlana ostygnie do temperatury poniżej 40 stopni Celsjusza, dodaj wysterylizowany przez filtr roztwór cukru bezpośrednio do pożywki. Następnie zaszczepij pożywkę, przesuwając pętlę pełną kolonii z wcześniej pokrytej świeżej płytki gwiaździstej E.coli BL21 i wkładając pętlę bezpośrednio do pożywki.

Zakręć pętlę w nośniku, nie dotykając ścianek pojemnika. Następnie umieść zaszczepioną pożywkę na noc w inkubatorze o temperaturze 30 stopni Celsjusza z wytrząsaniem przy 200 obr./min. Następnego dnia zbierz komórki, przenosząc jeden litr pożywki do litrowej butelki wirówki i odwirowując w temperaturze 5 000 razy G w temperaturze od czterech do 10 stopni Celsjusza przez 10 minut.

Po odrzuceniu supernatantu za pomocą sterylnej szpatułki przenieść osad do wstępnie schłodzonej i uprzednio zważonej stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Następnie umyj granulkę raz 30 do 40 mililitrami zimnego bufora S30, ponownie zawieszając granulkę poprzez wirowanie w 30-sekundowych seriach z okresami odpoczynku na lodzie. Po całkowitym ponownym zawieszeniu osadu należy odwirować zawiesinę komórki, wyrzucić supernatant i za pomocą czystej chusteczki wytrzeć nadmiar supernatantu z wewnętrznych ścianek 50-mililitrowej probówki, nie dotykając osadu.

Następnie zważ granulkę przed błyskawicznym zamrożeniem jej w ciekłym azocie i przechowuj w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do dalszego użycia. Aby przygotować ekstrakt komórkowy, dodaj jeden mililitr buforu S30 na gram zamrożonego osadu komórkowego i pozwól osadkowi rozmrozić się na lodzie przez 30 do 60 minut. Następnie ponownie zawiesić rozmrożony granulat poprzez wirowanie w seriach trwających 30 sekund z okresami odpoczynku na lodzie, aż nie pozostaną żadne widoczne grudki komórek.

W celu lizy komórek przenieś 1,4 mililitra podwielokrotności zawiesiny komórkowej do 1,5-mililitrowych probówek do mikrofuge. Następnie sonikować zawiesinę komórkową w każdej probówce z częstotliwością 20 kiloherców i amplitudą 50% przez trzy serie po 45 sekund z 59 sekundami odpoczynku na cykl w łaźni lodowej Odwróć rurkę między cyklami, a po ostatnim cyklu sonikacji natychmiast dodaj 4,5 mikrolitra jednomolowego ditiotreitolu. Po sonikacji zawiesiny komórkowej we wszystkich probówkach, należy odwirować probówki i zebrać supernatant w 600-mikrolitrowych podwielokrotnościach do świeżych 1,5-mililitrowych probówek do mikrofuge.

Błyskawicznie zamrozić i przechowywać porcje w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu dalszego użycia. Aby przeprowadzić 15 mikrolitrów bezkomórkowej reakcji syntezy białek w 1,5-mililitrowych probówkach do mikrofug w poczwórnym tempie, rozmrozić jedną porcję ekstraktu komórkowego. Po przygotowaniu każdej 15-mikrolitrowej mieszaniny reakcyjnej pozwól reakcji toczyć się przez co najmniej cztery godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Aby określić ilościowo białko reporterowe, połącz 48 mikrolitrów 50-milimolowego buforu HEPES o pH 7,2 z dwoma mikrolitrami każdego produktu reakcji syntezy białek bezkomórkowych w czarnej polistyrenowej 96-dołkowej płytce. Określ ilościowo intensywność fluorescencji superfolderu białka zielonej fluorescencji lub sfGFP, używając długości fali wzbudzenia 485 i długości fali emisji 528 nanometrów. Następnie przelicz względne jednostki fluorescencji na wolumetryczną wydajność sfGFP, tworząc krzywą wzorcową przy użyciu oczyszczonego plazmidu pJL1 sfGFP.

Pokazano tutaj bezkomórkowe granulki pożywek autoindukcyjnych po zebraniu komórek o różnych gęstościach optycznych mierzonych przy 600 nanometrach. Pożywka wyhodowana do gęstości optycznej 10 wytworzyła większą ilość osadu komórkowego w ogólnym ekstrakcie niż pożywka wyhodowana do gęstości optycznej 2,5. Dalsza analiza całkowitego stężenia białka nie wykazała znaczącej różnicy w ogólnym białku między obydwoma ekstraktami.

Mimo że pożywka została wyhodowana do różnych poziomów gęstości optycznej, oba ekstrakty wykazały podobne wyniki w bezkomórkowych reakcjach eksprymujących sfGFP. Ważne jest utrzymanie sterylnych warunków podczas przygotowywania pożywki i roztworu cukru. Ta metoda ekstrakcji komórek CFAI może być stosowana w większości zastosowań ekspresji bezkomórkowej.

Obejmują one edukację biotechnologiczną i inżynierię białek, a także diagnostykę przyłóżkową. Ta metoda skraca czas i wymaga umiejętności technicznych, poprawia odtwarzalność i wytwarza większe ilości ekstraktu.