Name: Swobodne barwienie immunologiczne mózgów myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-07T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Poznaj metodę swobodnego barwienia immunologicznego mózgów myszy w celu uzyskania wysokiej jakości obrazów histologicznych. Protokół obejmuje perfuzję, cięcie tkanek i immunobarwienie w badaniach neuroanatomicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badacze byli wspierani przez granty z NIH (K01DK119471 do CW; P01DK113954, R01DK115761, R01DK117281, R01DK125480 i R01DK120858 do YX), USDA/CRIS (51000-064-01S do YX) oraz American Heart Association Postdoctoral Fellowship (#829565) do LT.

C57BL/6J myszy obu płci (w wieku 8-16 tygodni) zostały wykorzystane w niniejszym badaniu. Opieka nad wszystkimi zwierzętami i wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Instytucjonalne Komitety ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Baylor College of Medicine.
1. Perfuzja
UWAGA: Kroki 1.1 - 1.6 są wykonywane w dygestoriach.
<ol>
	<li>znieczulenie
	<ol>
		<li>Wlać 5 ml izofluranu (patrz Tabela Materiałów) na ręcznik papierowy umieszczony na dnie eksykatora. Umieść mysz na przesłoniętej przegrodzie wewnątrz eksykatora i poczekaj, aż znikną oznaki oddychania. 
		UWAGA: Bez oddychania mysz nadal ma bicie serca przez krótki okres czasu i zostanie ono ukrwione przed zanikiem bicia serca.</li>
		<li>Zanim przejdziesz dalej, upewnij się, że nie ma odruchu na szczypanie palca u nogi.</li>
		<li>Przymocuj mysz do płyty piankowej, wbijając szpilkę w każdą stopę. Upewnij się, że płyta piankowa jest umieszczona na tacy, aby zebrać rozlaną płyn</li>.
	</ol>
	</li>
	<li>Odsłanianie serca
	<ol>
		<li>Wykonaj podłużne powierzchowne nacięcie wzdłuż linii środkowej nad klatką piersiową i brzuchem, a następnie odsuń skórę na bok, aby odsłonić ścianę mięśniową klatki piersiowej i brzucha. Następnie wykonaj nacięcie w warstwie mięśniowej, aby odsłonić wątrobę i jelito. Na koniec przetnij klatkę piersiową nożyczkami, aby otworzyć klatkę piersiową i odsłonić serce i płuca. Użyj kleszczy hemostatycznych, aby odciągnąć klatkę piersiową na bok, aby poszerzyć obszar roboczy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pobranie krwi terminalnej (opcjonalnie)
	<ol>
		<li>Ostrożnie włożyć strzykawkę o pojemności 1 ml (patrz Tabela Materiałów) do prawego przedsionka serca, aż końcówka zostanie całkowicie osadzona. Trzymać strzykawkę nieruchomo i powoli pobierać krew, aż do osiągnięcia pożądanej objętości. 
		UWAGA: Uważaj, aby nie przeniknąć poza prawe przedsionki; Pobranie 300-400 μl krwi jest osiągalne na jedną dorosłą mysz. Można stosować dodatki, takie jak przyspieszacz zakrzepów lub antykoagulant, w zależności od celu pobrania krwi.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieszczenie kaniuli perfuzyjnej
	<ol>
		<li>Dla początkujących wytnij nożyczkami mały otwór (<1 mm) w lewej komorze serca i włóż kaniulę (igła 18 G dla młodych myszy i igła 21 G dla starszych myszy) przez lewą komorę do aorty wstępującej. Alternatywnie, dla doświadczonych eksperymentatorów, przeniknij bezpośrednio do lewej komory serca kaniulą i ostrożnie włóż ją do aorty wstępującej.</li>
		<li>Umieść kołki wokół połączenia kaniuli i sprzężonej rurki na płycie piankowej, aby zapobiec ruchowi podczas perfuzji. Alternatywnie użyj kleszczy hemostatycznych, aby zamocować kaniulę na miejscu. Przystąp do przecięcia prawego przedsionka, aby umożliwić odpływ krwi z krążenia. 
		UWAGA: Kaniula perfuzyjna i sprzężone rurki są podłączone do pompy perfuzyjnej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Perfuzja z solą fizjologiczną
	<ol>
		<li>Włącz przełącznik ciśnienia soli fizjologicznej i przelej mysz przezskórnie 40-60 ml soli fizjologicznej (0,9% NaCl: 25 °C, pH 7,4). Uważnie obserwuj odpływ z prawego przedsionka i kolor wątroby. 
		UWAGA: Automatyczna pompa perfuzyjna (patrz Tabela Materiałów) służy do płukania krwi w ciągu 1-2 minut. Ponieważ zakres ciśnienia pompy wynosi 1-300 mmHg, prędkość można odpowiednio dostosować. Jeśli sól fizjologiczna wycieka z nosa i/lub płuca są napompowane, zmniejsz ciśnienie i wyreguluj kaniulę. Gdy odpływ nie zawiera już krwi, mózg jest wystarczająco przepłukany solą fizjologiczną. Tymczasem wątroba jest pozbawiona krwi i staje się brązowo-szara</li>.
	</ol>
	</li>
	<li>Perfuzja z formaliną
	<ol>
		<li>Wyłącz przełącznik ciśnienia soli fizjologicznej i włącz wyłącznik ciśnieniowy formaliny, aby przelać mysz 40 ml 10% neutralnej buforowanej formaliny (10% NBF: 25 °C, pH 6,8-7,2, patrz tabela materiałów). Obserwuj kończyny zwierzęcia pod kątem oznak drżenia. 
		UWAGA: Ruch ogona można również zaobserwować po infuzji 10% NBF. UWAGA: Ponieważ NBF jest niebezpieczny, sugeruje się, aby badacze nosili środki ochrony osobistej (np. odpowiednią maskę oddechową, osłonę twarzy) przez cały czas trwania zabiegu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Izolacja mózgu9
	<ol>
		<li>Użyj nożyczek, aby zdjąć głowę. Wykonaj środkowe nacięcie wzdłuż powłoki, aby odsłonić czaszkę. Odetnij skórę i przyczep mięśniowy nożyczkami.</li>
		<li>Wykonaj cięcie na grzbiecie oczodołu, a następnie umieść ostry koniec nożyczek tęczówki w otworze wielkim. Przesuwaj nożyczki wzdłuż wewnętrznej powierzchni czaszki, utrzymując nacisk w górę, aby uniknąć uszkodzenia mózgu. Ostrożnie usuń kości ciemieniowe/czołowe i opony mózgowe. Na koniec delikatnie wyjmij mózg z otwartej czaszki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po utrwaleniu
	<ol>
		<li>Umieść mózg w probówce o pojemności 15 ml wypełnionej 10 ml 5% NBF i 15% sacharozy w celu utrwalenia przez noc w temperaturze 4 °C. 
		UWAGA: Aby przygotować 10 ml 5% NBF i 15% sacharozy, połącz 5 ml 10% NBF i 5 ml 30% sacharozy (w/v, rozpuszczonej w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), patrz Tabela materiałów). Upewnij się, że objętość buforu utrwalającego jest co najmniej 10 razy większa niż sama próbka. Początkowo mózg będzie unosił się w buforze i opadnie na dno po całonocnym utrwaleniu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>odwodnienie
	<ol>
		<li>Przenieść próbkę mózgu do probówki o pojemności 15 ml wypełnionej 10 ml 30% sacharozy w celu odwodnienia w temperaturze 4 °C, aż do zatonięcia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Kriosekcja (przekroje koronalne)
<ol>
	<li>preparat
	<ol>
		<li>Umieść suchy lód na płytce regulacji wysokości przesuwnego mikrotomu i poczekaj, aż pojawi się biały szron. Ostrożnie rozprowadź 5 ml 30% sacharozy na wierzchu płytki, aby utworzyć warstwę stałej podstawy po całkowitym zamrożeniu roztworu sacharozy. Umieść wszystkie próbki mózgu (do 5 próbek mózgu w jednej partii) poziomo w linii na wierzchu sacharozy, a następnie dodaj 0,5 ml 30% sacharozy na dno każdego mózgu. 
		UWAGA: Mózg natychmiast przyklei się do zamrożonej bazy sacharozy i stopniowo zamarznie od dołu do góry. Umieść dodatkową sacharozę wokół zamontowanej części mózgu, aby utworzyć mocniejszą podstawę do cięcia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Cięcia
	<ol>
		<li>Po 5-10 minutach zamrażania, gdy mózg stanie się twardy i biały, przycinaj mózg, aż do osiągnięcia pożądanej warstwy/regionu. 
		UWAGA: Dostosuj ilość suchego lodu na talerzu, aby kontrolować temperaturę. Temperatura jest zbyt niska, gdy na powierzchni mózgu pojawiają się kryształki lodu. Temperatura jest zbyt wysoka, gdy mózg staje się miękki i nie jest już biały.</li>
		<li>Przełącz się z trybu Trim na tryb Feed i przekrój tkankę mózgową do grubości 25 μm. Przygotuj 48-dołkową płytkę wypełnioną 1x PBS i zaznacz pięć dołków na jeden mózg myszy. Użyj pędzla, aby zebrać każdą sekcję z jednej myszy i umieść ją w jednej studzience. Zbierz kolejną sekcję tej samej myszy i umieść ją w 2. studzience.</li>
		<li>Powtarzać 2.2.2 aż do osiągnięcia 5dołka, umieszczając sekcje 6-10 w 1-5dołku i tak dalej. Powtórz tę samą procedurę dla pozostałych mózgów jednocześnie. Powtarzaj, aż wszystkie sekcje z jednej myszy zostaną zebrane do 5 dołków w porządku anatomicznym. 
		UWAGA: Zgodnie z tą procedurą, skrawki mózgu każdej myszy są podzielone na 5 serii, które można wykorzystać do maksymalnie 5 różnych badań histologicznych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>składowanie
	<ol>
		<li>Za pomocą pędzla przenieś skrawki z każdej studzienki do mikroprobówki o pojemności 1,5 ml wypełnionej buforem krioprotektantu (20% glicerolu, 30% glikolu etylenowego i 50% PBS) i przechowuj próbki w temperaturze -20 °C. 
		UWAGA: Te sekcje przechowywane w małych probówkach (1,5 ml) mogą zaoszczędzić fizyczną przestrzeń w zamrażarce, a integralność sekcji może zostać zachowana przez kilka miesięcy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Swobodne barwienie WFA i barwienie immunologiczne anty-AVP
<ol>
	<li>Umieść sitko komórkowe w studzience 6-dołkowej płytki do hodowli komórkowej wypełnionej PBS i za pomocą pędzla przenieś jedną serię odcinków mózgu do sitka komórkowego. Przepłukać skrawki w PBS, przenosząc sitko do komórek do innego dołka wypełnionego PBS. Płukać przez 6 x 10 min na wytrząsarce w przypadku skrawków przechowywanych w buforze krioprotektantu i 3 x 10 min w przypadku świeżo pokrojonych sekcji. 
	UWAGA: Wszystkie procedury mycia są wykonywane na 6-dołkowej płytce do hodowli komórkowej z sitkiem komórkowym wewnątrz każdej studzienki (patrz Tabela materiałów). Każde sitko przechowuje interesujące sekcje mózgu każdej myszy. Aby zaoszczędzić odczynniki, wszystkie opisane poniżej procedury inkubacji są wykonywane w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Pomiędzy procedurami mycia i inkubacji użyj pędzla, aby przenieść sekcje mózgu między każdym sitkiem komórkowym a każdą probówką. Do mycia PBS wystarczy 12 ml na każdą studzienkę.</li>
	<li>Przygotować 1 ml znakowanego biotyną roztworu WFA (1:1,000) w buforze PBT (2,5 ml Triton X-100 rozpuszczony w 1,000 ml PBS) w probówce o pojemności 1,5 ml. Przenieś skrawki mózgu z sitka komórkowego do probówki i inkubuj w temperaturze pokojowej na platformie kołyszącej ~50 obr./min przez noc.</li>
	<li>Przepłukać skrawki mózgu PBS przez 3 x 10 minut, jak opisano w ppkt 3.1.</li>
	<li>Przygotować 1 ml roztworu streptawidyny-Dylight 488 (1:500) w PBT w probówce o pojemności 1,5 ml. Przenieś skrawki mózgu do probówki i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 2 godziny na platformie bujającej z prędkością ~50 obr./min. 
	UWAGA: Przykryj płytkę folią, aby uniknąć ekspozycji na światło od tego kroku.</li>
	<li>Przepłukać skrawki mózgu PBS przez 3 x 10 min. Inkubować sekcje mózgu w buforze blokującym (3% normalnej surowicy osła rozcieńczonej w PBT) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: Wybór surowicy blokującej zależy od gatunku, z którego wytwarzane jest przeciwciało drugorzędowe. Na przykład, jeśli przeciwciało drugorzędowe pochodzi od kozy, należy użyć normalnej surowicy koziej.</li>
	<li>Inkubuj sekcje mózgu w pierwotnym przeciwciałie (królicze anty-AVP, 1:500) w temperaturze pokojowej na platformie kołyszącej z prędkością ~50 obr./min przez noc. 
	UWAGA: Przygotować zarówno przeciwciała pierwszorzędowe, jak i drugorzędowe w buforze blokującym. Stężenie, czas trwania inkubacji i temperatura inkubacji muszą być zoptymalizowane w badaniach pilotażowych.</li>
	<li>Płucz sekcje mózgu PBS przez 3 x 10 min. Inkubuj sekcje mózgu w wtórnym przeciwciałie (Alexa Flour 594 donkey anti-rabbit IgG (H+L), 1:500) w temperaturze pokojowej przez 2 godziny na platformie bujanej z prędkością ~50 obr./min. Płucz sekcje mózgu PBS przez 3 x 10 min.</li>
</ol>
4. Montaż
<ol>
	<li>Napełnij dwie szalki Petriego (o średnicy 150 mm) 100 ml 1x PBS każda. Przenieś wszystkie sekcje mózgu z jednego sitka do pierwszego naczynia i wyrównaj sekcje mózgu w porządku neuroanatomicznym od ogonowego do rostralnego. 
	UWAGA: Aby uniknąć mieszania sekcji pochodzących od różnych zwierząt, montuj jedną serię sekcji mózgu od jednego zwierzęcia na raz.</li>
	<li>Po tym jak wszystkie sekcje mózgu zostaną wyrównane w pierwszym naczyniu, zanurz jeden szkiełko w drugim naczyniu z jednym końcem lekko przechylonym ze stojakiem (patrz Rysunek 1 i Rysunek 2). Za pomocą cienkiego pędzla delikatnie umieść sekcję mózgu tuż pod interfejsem bufora powietrza na pochylonym suwaku. Powtórz tę samą procedurę z inną sekcją mózgu i zamontuj ją obok pierwszej sekcji.</li>
	<li>Użyj pipety transferowej, aby powoli i delikatnie usunąć bufor, aby obniżyć jego poziom, aż obie sekcje mózgu znajdą się całkowicie powyżej granicy faz powietrze-bufor. 
	UWAGA: Uważaj, aby zminimalizować zakłócenia powierzchni buforowej, w przeciwnym razie sekcje mózgu mogą odpłynąć. Po wyschnięciu ten rząd odcinków mózgu będzie mocno przylegał do szkiełka. W razie potrzeby delikatnie wyreguluj sekcje na szkiełku, aby upewnić się, że nie ma zmarszczek ani fałd w tkance, gdy skrawki są jeszcze mokre.</li>
	<li>Powtarzaj ten proces, aż dojdziesz do dna szkiełka. Kontynuuj powtarzanie, aż wszystkie sekcje zostaną zamontowane na prowadnicy (prowadnicach).</li>
</ol>
5. Szkiełko nakrywkowe
<ol>
	<li>Po wyschnięciu wszystkich skrawków (1-24 h w temperaturze pokojowej) umieść 80-100 μl zapobiegającego blaknięciu podłoża montażowego z DAPI (patrz Tabela Materiałów) na szkiełku podstawowym i delikatnie nałóż szklane szkiełko nakrywkowe, aby przykryć próbki. 
	UWAGA: Szkiełko nakrywkowe nakładaj ostrożnie i powoli, aby uniknąć pęcherzyków.</li>
	<li>Umieść szkiełka w pudełku ze szkiełkami mikroskopowymi (patrz tabela materiałów) i przechowuj je w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Zobrazuj wszystkie sekcje w ciągu 1-3 dni, aby uniknąć blaknięcia fluorescencji i rozwoju autofluorescencji.</li>
</ol>
6. Obrazowanie
<ol>
	<li>Włącz skaner i komputer (patrz Spis materiałów). Umieść szkiełka w uchwycie szkiełek z urządzeniem ładującym i włóż uchwyt do skanera. 
	UWAGA: Skaner umożliwia skanowanie wielu kanałów (np. kanałów 4′,6-diamidino-2-fenyloindolowego (DAPI), zielonego i czerwonego) jednocześnie. Skaner skanuje preparaty tylko z 20-krotnym powiększeniem, a tradycyjny mikroskop fluorescencyjny (patrz Tabela materiałów) może być używany, gdy potrzebne jest większe powiększenie (np. 40x).</li>
	<li>Otwórz oprogramowanie skanera (patrz tabela materiałów). Wybierz odpowiednie miejsce przechowywania i profil skanowania.</li>
	<li>Rozpocznij skanowanie podglądu, klikając przycisk Rozpocznij skanowanie podglądu. Po skanowaniu podglądu otwórz kreatora wykrywania tkanek i zakreśl obszary zainteresowania do obrazowania.</li>
	<li>Kliknij przycisk Rozpocznij skanowanie po wybraniu regionów do obrazowania. Poczekaj, aż urządzenie zakończy skanowanie. Sprawdź plik wynikowy i wyeksportuj images. 
	UWAGA: Jeśli profil nie jest odpowiedni dla szkiełka, wyreguluj, ponownie ustawiając ostrość i zmieniając czas ekspozycji lub natężenie światła, aby dostosować profil do tkanek. Więcej informacji technicznych można znaleźć w instrukcji skanera (tabela materiałów).</li>
</ol>

<ol><li>Must, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Disease+burden+associated+with+overweight+and+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Medical+Association%22%5BJournal%5D)">The Disease burden associated with overweight and obesity.</a> Journal of the American Medical Association. 282 (16), 1523-1529 (1999).</li>
<li>Apovian, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity%3A+definition%2C+comorbidities%2C+causes%2C+and+burden%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Managed+Care%22%5BJournal%5D)">Obesity: definition, comorbidities, causes, and burden.</a> The American Journal of Managed Care. 22 (7), Suppl 176-185 (2016).</li>
<li>Wong, S. K., Chin, K. Y., Suhaimi, F. H., Fairus, A., Ima-Nirwana, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+metabolic+syndrome%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrition+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Animal models of metabolic syndrome: a review.</a> Nutrition & Metabolism. 13 (1), 1-12 (2016).</li>
<li>Kennedy, A. J., Ellacott, K. L., King, V. L., Hasty, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+the+metabolic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Mouse models of the metabolic syndrome.</a> Disease Models & Mechanisms. 3 (3-4), 156-166 (2010).</li>
<li>Schacht, V., Kern, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basics+of+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Basics of immunohistochemistry.</a> The Journal of Investigative Dermatology. 135 (3), 1-4 (2015).</li>
<li>Mepham, B. L., Britten, K. J. M. Immunostaining methods for frozen and paraffin sections. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMepham%2C+BL+%22Lymphoproliferative+Diseases%22">Lymphoproliferative Diseases</a>. Jones, D. B., Wright, D. H. 15, Springer. Dordrecht. 187-211 (1990).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TPH2+in+the+dorsal+raphe+nuclei+regulates+energy+balance+in+a+sex-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">TPH2 in the dorsal raphe nuclei regulates energy balance in a sex-dependent manner.</a> Endocrinology. 162 (1), 1-16 (2021).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+vitamin+D+receptor+expression+in+the+brain+using+a+novel+VDR%28Cre%29+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Defining vitamin D receptor expression in the brain using a novel VDR(Cre) mouse.</a> Journal of Comparative Neurology. 529 (9), 2362-2375 (2020).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e3564(2012).</li>
<li>Whittington, N. C., Wray, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+red+blood+cell+autofluorescence+for+immunocytochemistry+on+fixed+embryonic+mouse+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Suppression of red blood cell autofluorescence for immunocytochemistry on fixed embryonic mouse tissue.</a> Current Protocols in Neuroscience. 81 (1), 2-28 (2017).</li>
<li>Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation%2C+embedding%2C+and+sectioning+of+tissues%2C+embryos%2C+and+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Fixation, embedding, and sectioning of tissues, embryos, and single cells.</a> Current Protocols in Pharmacology. , Appendix 3 (2001).</li>
<li>Potts, E. M., Coppotelli, G., Ross, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological-based+stainings+using+free-floating+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Histological-based stainings using free-floating tissue sections.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (162), e61622(2020).</li>
<li>He, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small+potassium+current+in+AgRP%2FNPY+neurons+regulates+feeding+behavior+and+energy+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A small potassium current in AgRP/NPY neurons regulates feeding behavior and energy metabolism.</a> Cell Reports. 17 (7), 1807-1818 (2016).</li>
<li>Xu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+serotonin+2C+receptors+in+dopamine+neurons+inhibits+binge-like+eating+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biololgical+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Activation of serotonin 2C receptors in dopamine neurons inhibits binge-like eating in mice.</a> Biololgical Psychiatry. 81 (9), 737-747 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Protokół ten zapewnia ustaloną metodę badań neuroanatomicznych mózgu myszy, w tym perfuzji, sekcji tkanek, swobodnego barwienia immunologicznego, montażu tkanek i obrazowania. Należy jednak zoptymalizować kilka kluczowych szczegółów niezbędnych do uzyskania spójnych i wiarygodnych wyników.
Jakość perfuzji ma kluczowe znaczenie dla udanego barwienia. Wyniki barwienia mogą być zakłócone, jeśli krew pozostaje w mózgu, biorąc pod uwagę, że komórki krwi (np. czerwone krwinki) mogą generować sztuczn...

Rozpowszechnienie otyłości i związanych z nią chorób współistniejących osiągnęło poziom epidemii, powodując ogromne obciążenie społeczno-ekonomiczne1,2. Aby lepiej zrozumieć procesy biologiczne odpowiedzialne za otyłość, opracowano różne modele myszy3,4. Ponieważ mechanizmy centralne są ważne dla regulacji homeostazy energetycznej w tych modelach zwierzęcych, badania neuroanatomiczne mózgów myszy stały się niezbędną techniką w tej dziedzinie. Jednak jakość, wiarygodność i odtwarzalność technik histologicznych mózgu różnią się znacznie między laboratoriami, a nawet badaczami w tym samym laboratorium z różnych powodów (np. przeciwciała, tkanki, leczenie, gatunki, cele badań). Dlatego konieczne jest ustalenie ogólnego protokołu badań histologicznych mózgu myszy, w tym perfuzji, sekcji mózgu, swobodnego barwienia immunologicznego, montowania tkanek i obrazowania. Tymczasem początkujący mogą szybko nauczyć się, opanować i dostosować ten protokół do swoich indywidualnych potrzeb.
Barwienie immunohistochemiczne to sprawdzona metoda, która była szeroko stosowana do wizualizacji określonych typów komórek, mRNA i białek w różnych tkankach (np. mózgu i tkankach obwodowych)5,6. Mówiąc dokładniej, antygen będący przedmiotem zainteresowania może być znakowany przez specyficzne przeciwciało pierwszorzędowe i odpowiadające mu przeciwciało drugorzędowe połączone z enzymem (np. immunohistochemia chromogenna) lub barwnikiem fluorescencyjnym (izotiocyjanian fluoresceiny)<klasa sup = "xref">6. Jako przykład użyteczności tych technik, β-endorfina [jeden peptyd kodowany przez pro-opiomelanokortynę (POMC)] i c-fos (marker aktywności neuronalnej) zostały wybarwione w jądrze łukowatym. Wykazano, że delecja hydroksylazy tryptofanu 2 (enzymu integralnie związanego z syntezą serotoniny) w jądrze szwu grzbietowego zmniejsza ekspresję c-fos w neuronach POMC w jądrze łukowatym7. Ponadto dystrybucja mRNA receptora witaminy D została zmapowana w mózgu myszy za pomocą hybrydyzacji in situ (RNAscope)8. W artykule przedstawiono wiarygodną i wydajną metodę z przepływem pracy krok po kroku do swobodnego barwienia immunologicznego, mającą na celu poprawę jakości i odtwarzalności badań histologicznych mózgu myszy.

<table><tbody><tr><td>Alexa Flour 594 osioł anty-królik IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A21207</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 30% sacharozy</td><td>VWR</td><td>470302</td><td>30 g Sacharozy rozdzielonej na 100 ml PBS&</td></tr><tr><td>nbsp; Neutralna buforowana formalina</td><td>VWR</td><td>16004-128</td><td>10%, 25 &deg; C, pH 6,8-7,2</td></tr><tr><td>1 ml Sub-Q Strzykawka</td><td>BD</td><td>309597</td><td></td></tr><tr><td>48-dołkowa płytka do hodowli komórkowych</td><td>Corning</td><td>3548</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowa płytka do hodowli komórkowej</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Zapobiegające blaknięciu media montażowe z DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Autoklawowalny eksykator z tworzywa sztucznego</td><td>Thermo Scientific Nalgene</td><td>5315-0150</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało AVP</td><td>Phoenix Pharmaceuticals</td><td>H-065-07</td><td></td></tr><tr><td>Sitko do komórek</td><td>Corning</td><td>431752</td><td></td></tr><tr><td>Bufor krioprotekcyjne</td><td>Preferencje użytkownika</td><td>Nie dotyczy</td><td>20% glicerol, 30% glikolu etylenowego i 50% PBS</td></tr><tr><td>Izofluran</td><td>Covetrus</td><td>11695-6777-2</td><td></td></tr><tr><td>Leica DFC310FX mikroskop</td><td>Leica</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>Pudełka na preparaty mikroskopowe (50 miejsc)</td><td>VWR</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr><td>PBT</td><td>Preferencje użytkownika</td><td>Nie dotyczy</td><td>2,5 ml Triton X-100 rozpuszczony w 1000 ml PBS</td></tr><tr><td>Perfuzja dwa zautomatyzowane systemy perfuzyjne</td><td>Leica</td><td>39471005</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) 20x</td><td>VWR</td><td>VWRVE703-1L</td><td>25 &deg; C, pH 7,3-7,5, 1x skład:137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 9,8 mM Bufor fosforanowy</td></tr><tr><td>Mikrotom przesuwny Microm HM450</td><td>ThermoFisher</td><td>Microm HM450</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>RICCA Chemical</td><td>7220-32</td><td>0,9%, 25 &deg; C, pH 7,4</td></tr><tr><td>Białko streptawidyny, DyLight 488</td><td>ThermoFisher</td><td>#21832</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>089k01921</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało WFA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L1516</td><td></td></tr><tr><td>Skaner Zeiss Axio Z1</td><td>Zeiss</td><td>Nie dotyczy</td><td></td></tr><tr>Oprogramowanie <td></td><td></td><td>skanera</td> <td>Zen 3.1</td></tr></tbody></table>

swobodne barwienie immunologiczne mózgów myszy

Free-floating Immunostaining of Mouse Brains

Immunohistochemiczne barwienie mózgów myszy jest rutynową techniką powszechnie stosowaną w neurobiologii do badania centralnych mechanizmów leżących u podstaw regulacji metabolizmu energetycznego i innych procesów neurobiologicznych. Jednak jakość, wiarygodność i odtwarzalność wyników histologii mózgu może się różnić w zależności od laboratorium. Dla każdego eksperymentu barwienia konieczna jest optymalizacja kluczowych procedur w oparciu o różnice w gatunkach, tkankach, docelowych białkach i warunkach pracy odczynników. W tym artykule szczegółowo przedstawiono niezawodny przebieg pracy, w tym perfuzję wewnątrzaortalną, sekcję mózgu, swobodne barwienie immunologiczne, montaż tkanek i obrazowanie, które mogą być łatwo śledzone przez naukowców w tej dziedzinie.
Omówiono również, jak zmodyfikować te procedury, aby zaspokoić indywidualne potrzeby badaczy. Aby zilustrować wiarygodność i skuteczność tego protokołu, sieci okołoneuronalne wybarwiono znakowaną biotyną aglutyniną Wisteria florbunda (WFA) i wazopresyną argininy (AVP) z przeciwciałem anty-AVP w mózgu myszy. Na koniec omówiono kluczowe szczegóły całej procedury oraz zalety tego protokołu w porównaniu z innymi protokołami. Podsumowując, w artykule przedstawiono zoptymalizowany protokół swobodnego barwienia immunologicznego tkanki mózgowej myszy. Przestrzeganie tego protokołu ułatwia ten proces zarówno młodszym, jak i starszym naukowcom w celu poprawy jakości, wiarygodności i odtwarzalności badań nad barwieniem immunologicznym.

Schemat tego protokołu został krótko przedstawiony na Rysunku 1. Procedura kriosekcjonowania w tym laboratorium jest zaprezentowana na Rysunku 2A, na którym jednocześnie wykonano sekcje 5 próbek mózgu. Montowanie przekrojów mózgu pokazano na Rysunku 2B, a w pełni zamontowany preparat z przekrojami mózgu zilustrowano na Rysunku 2C. Na Rysunku 3 przedstawiono reprezentatywne ...

Ten protokół opisuje skuteczne i powtarzalne podejście do badań histologicznych mózgu myszy, w tym perfuzję, sekcję mózgu, swobodne barwienie immunologiczne, montowanie tkanek i obrazowanie.

Swobodne barwienie immunologiczne mózgów myszy

Immunohistochemical staining of mouse brains is a routine technique commonly used in neuroscience to investigate central mechanisms underlying the ...

Barwienie immunohistochemiczne mózgów myszy jest powszechnie stosowaną techniką w badaniach neurobiologicznych. Jednak jakość, wiarygodność i powtarzalność wyników histologii mózgu może się różnić w zależności od badacza i laboratorium. Przedstawiamy uznaną metodologię badań histologicznych mózgów myszy, która okazała się powtarzalna, wiarygodna i wydajna.W zademonstrowaniu procedury pomoże dr Chunmei Wang, adiunkt z mojego laboratorium Po potwierdzeniu udanego znieczulenia u ośmio- do 16-tygodniowej myszy C57 black/6J, przymocuj mysz do piankowej deski i wykonaj podłużne powierzchowne nacięcie wzdłuż linii środkowej nad klatką piersiową i brzuchem, a następnie odsuń skórę na bok, aby odsłonić ścianę mięśniową klatki piersiowej i brzucha. Następnie wykonaj nacięcie w warstwie mięśniowej, aby odsłonić wątrobę i jelito. Następnie za pomocą nożyczek przetnij klatkę piersiową, aby otworzyć klatkę piersiową i odsłonić serce i płuca.Za pomocą kleszczy hemostatycznych odciągnij klatkę piersiową na bok, aby poszerzyć obszar roboczy. Następny. Aby umieścić kaniulę perfuzyjną, należy bezpośrednio przeniknąć do lewej komory serca kaniulą i ostrożnie wprowadzić ją do aorty wstępującej. Umieść kołki wokół połączenia kaniuli i sprzężonej rurki na płycie piankowej, aby zamocować kaniulę na miejscu podczas perfuzji, a następnie przystąp do cięcia prawego przedsionka, aby umożliwić odpływ krwi z krążenia.W celu perfuzji solą fizjologiczną włącz przełącznik ciśnienia soli fizjologicznej i przetapij mysz przezskórnie 40 do 60 mililitrami soli fizjologicznej. Uważnie obserwuj odpływ z prawego przedsionka i kolor wątroby. Następnie, aby przeprowadzić perfuzję z formaliną, wyłącz przełącznik ciśnienia soli fizjologicznej i włącz przełącznik ciśnienia formaliny, aby przepłukać mysz 40 mililitrami 10% neutralnie buforowanej formaliny.Obserwuj kończyny zwierzęcia pod kątem oznak drżenia. W celu izolacji mózgu użyj nożyczek, aby usunąć głowę i wykonaj środkowe nacięcie wzdłuż powłoki, aby odsłonić czaszkę, a następnie odetnij skórę i przyczep mięśniowy. Następnie wykonaj nacięcie na grzbiecie oczodołu i umieść ostry koniec nożyczek do tęczówki w otworze wielkim.Przesuwaj nożyczki wzdłuż wewnętrznej powierzchni czaszki, utrzymując nacisk w górę, aby uniknąć uszkodzenia mózgu. Następnie ostrożnie usuń kości ciemieniowe i czołowe oraz opony mózgowe przed usunięciem mózgu z otwartej czaszki. Umieść suchy lód na wierzchu płytki regulacji wysokości przesuwanego mikrotomu i poczekaj, aż pojawi się biały szron, a następnie ostrożnie rozprowadź pięć mililitrów 30% sacharozy na wierzchu płytki, aby po zamrożeniu sacharozy utworzyć solidną warstwę podstawową.Następnie umieść wszystkie próbki mózgu poziomo w linii na wierzchu podstawy sacharozy z 500 mikrolitrami 30% sacharozy. Po pięciu do 10 minutach zamrażania, gdy mózg stanie się twardy i biały, przycinaj mózg, aż zostanie osiągnięta pożądana warstwa lub obszar, a następnie przełącz się z trybu przycinania na tryb karmienia i przetnij tkankę mózgową, aby wygenerować skrawki o grubości 25 mikrometrów. Następnie przygotuj 48-dołkową płytkę wypełnioną PBS i zaznacz pięć dołków na jeden mózg myszy.Za pomocą pędzla zbierz jedną sekcję i umieść ją w jednej studzience, a następnie zbierz kolejną sekcję tej samej myszy i umieść ją w drugiej studzience. Powtarzaj procedurę, aż zostanie osiągnięta piąta studzienka, umieszczając sekcje od sześciu do 10 w pierwszej do piątej studzienki i tak dalej. Umieścić sitko komórkowe w jednym dołku z sześciodołkowej płytki do hodowli komórkowej wypełnionej PBS i za pomocą pędzla przenieść jedną serię skrawków mózgu do sitka komórkowego.Przepłukać te skrawki w PBS, przenosząc sitko do komórek do innego dołka wypełnionego PBS na wytrząsarce. Następnie przenieś sekcje mózgu z sitka komórkowego do 1,5-mililitrowej probówki zawierającej jeden mililitr WFA znakowanego biotyną i inkubuj na platformie kołyszącej z prędkością 50 obr./min przez noc. Następnego dnia przepłucz skrawki mózgu PBS, jak pokazano wcześniej, a następnie przenieś skrawki do probówki zawierającej jeden mililitr roztworu streptawidyny i światła dziennego 488 i inkubuj przez dwie godziny na platformie do kołysania.Po ponownym przepłukaniu skrawków mózgu PBS, inkubuj je w buforze blokującym przez dwie godziny, a następnie inkubuj w pierwotnym przeciwciałie przez noc na platformie kołyszącej. Następnego dnia, po płukaniu PBS, inkubuj skrawki w przeciwciałach drugorzędowych przez dwie godziny. Napełnij dwie szalki Petriego 100 mililitrami PBS i przenieś wszystkie sekcje mózgu z jednego sitka do pierwszego naczynia.Ułóż sekcje mózgu w porządku neuroanatomicznym od ogonowego do rostralnego. Następnie zanurz jeden szkiełko w drugim naczyniu z jednym końcem lekko przechylonym za pomocą podstawki i za pomocą cienkiego pędzla delikatnie umieść sekcję mózgu tuż pod interfejsem bufora powietrza na pochylonym suwaku. Następnie, za pomocą pipety transferowej, powoli i delikatnie wyjmij bufor, aby obniżyć jego poziom, aż sekcja mózgowa znajdzie się całkowicie powyżej granicy faz bufora powietrza.Kontynuuj ten proces, aż dojdziesz do dolnej części zjeżdżalni i wszystkie sekcje zostaną zamontowane na zjeżdżalni. W celu obrazowania włącz skaner i komputer, a następnie umieść slajdy w uchwycie na slajdy za pomocą urządzenia ładującego i włóż uchwyt do skanera. Otwórz oprogramowanie skanera i wybierz odpowiednie miejsce przechowywania oraz profil skanowania.Rozpocznij skanowanie podglądu, klikając przycisk Rozpocznij skanowanie podglądu. Po zakończeniu skanowania otwórz kreatora wykrywania tkanek i zakreśl obszary zainteresowania do obrazowania. Po wybraniu regionów do obrazowania kliknij przycisk Rozpocznij skanowanie i poczekaj, aż urządzenie zakończy skanowanie.Sprawdź plik wynikowy i wyeksportuj obrazy. Pokazano tutaj reprezentatywne fluorescencyjne obrazy immunohistochemiczne koronalnych odcinków mózgu myszy przy ujemnym 0,82 milimetra Bregma, pokazujące rozkład aglutyniny glicynii floribunda, wazopresyny argininy i DAPI. Sygnały aglutyniny Wisteria floribunda obserwuje się w obszarze okołofornialnym przedniego podwzgórza i jądra siatkowatego, natomiast sygnały wazopresyny argininy obserwuje się w jądrze przykomorowym.Wypróbowując ten protokół po raz pierwszy, sugerujemy wykonanie go pod nadzorem doświadczonego badacza. Protokół pomoże w generowaniu optymalnych i spójnych wyników histologicznych wśród różnych badaczy i laboratoriów oraz posłuży jako punkt odniesienia dla początkujących uczących się tej techniki.

free-floating-immunostaining-of-mouse-brains

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Wielkoskalowa immunodetekcja białek docelowych w całym mózgu naczelnych jest możliwa dzięki zastosowaniu nowatorskich metod zatapiania i krojenia tkanek w połączeniu z wykorzystaniem innowacyjnego urządzenia do masowego barwienia wielu wolnopływających skrawków jednocześnie.

Seryjne barwienie immunohistochemiczne do wielkoskalowej detekcji białek w całym mózgu małpy

Ten film przedstawia procedurę barwienia immunologicznego utrwalonego wycinka tkanki mózgowej myszy za pomocą fluorescencyjnie znakowanych astrocytów przy użyciu przeciwciał pierwszorzędowych i wtórnych oraz przechwytywania obrazów barwionych astrocytów za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Barwienie immunologiczne znakowanych fluorescencyjnie astrocytów w wycinku tkanki mózgowej myszy

Źródło: Schönherr, S., et. al. Połączono znakowanie immunologiczne replik optogenetycznych i zamrażalniczo-łamliwych w celu zbadania specyficznego dla danych wejściowych rozmieszczenia receptorów glutaminianu w ciele migdałowatym myszy. J. Vis. Exp. (2016)Ten film demonstruje znakowanie immunologiczne pękniętych przez zamrożenie replik tkanki mózgowej myszy do mikroskopii elektronowej. Pęknięte i pokryte repliki są trawione w celu odsłonięcia receptorów. Przeciwciała pierwszorzędowe i...

Znakowanie immunologiczne białek błony neuronalnej w pękniętej przez lód próbce tkanki mózgowej myszy

Źródło: Baleriola, J.,  et. al., Wykrywanie aksonalnie zlokalizowanych mRNA w sekcjach mózgu przy użyciu hybrydyzacji in situ o wysokiej rozdzielczości.  J. Vis. Exp. (2015)Ten film demonstruje wykrywanie mRNA w aksonach cholinergicznych w utrwalonych mysich wycinkach hipokampa przy użyciu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ i barwienia przeciwciałami. Mikroskopia fluorescencyjna ujawnia przestrzenną lokalizację znakowanych sondą mRNA i acetylotransferazy choliny w neuronach cholinergicznych.

Barwienie immunologiczne neuronów w wycinkach mózgu myszy po fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ

Ten protokół wprowadzający opisuje odczynniki, sprzęt i techniki wymagane do przeprowadzenia immunohistochemicznego barwienia mózgów gryzoni, używając jako przykładu markerów dla mikrogleju i elementów neuronalnych.

Podstawa immunohistochemii na kriowyciętej tkance mózgowej szczura: przykładowe barwienie mikrogleju i neuronów

Tutaj opisujemy ilościowe podejście do określania rozkładu białka synaptycznego względem białka markerowego za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego, mikroskopii konfokalnej i analizy komputerowej.

Kwantyfikacja niejednorodnego rozmieszczenia białka synaptycznego w mózgu myszy za pomocą immunofluorescencji

Konwekcja wspomagana dostarczaniem (CED) to metoda umożliwiająca skuteczne dostarczanie leków do mózgu poprzez bezpośrednią perfuzję dużych objętości tkanek. Zabieg wymaga użycia cewników i zoptymalizowanej procedury iniekcji. Protokół ten opisuje metodologię CED przeciwciała w mózgu myszy.

Dostarczanie przeciwciał do mózgu myszy za pomocą dostarczania wzmocnionego konwekcją

Ten protokół opisuje krok po kroku proces immunofluorescencyjnego barwienia IBA1 i TMEM119, oprócz analizy gęstości, rozmieszczenia i morfologii mikrogleju, a także infiltracji obwodowych komórek szpikowych w tkance mózgowej myszy.

Barwienie immunofluorescencyjne przy użyciu IBA1 i TMEM119 do analizy gęstości mikrogleju, morfologii i infiltracji obwodowych komórek szpikowych w mózgu myszy

Technika swobodnego pływania pozwala badaczom na wykonywanie barwień histologicznych, w tym immunohistochemii na stałych odcinkach tkanki, w celu wizualizacji struktur biologicznych, typu komórki oraz ekspresji i lokalizacji białek. Jest to wydajna i niezawodna technika histochemiczna, która może być przydatna do badania wielu tkanek, takich jak mózg, serce i wątroba.

Barwienia histologiczne z wykorzystaniem swobodnie unoszących się skrawków tkanek

Ten protokół opisuje metodę łączenia fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) i immunohistochemii fluorescencji (IHC) zarówno w świeżo mrożonych, jak i stałych sekcjach mózgu myszy, w celu uzyskania wieloznakowego sygnału FISH i fluorescencji IHC. IHC celował w białka cytoplazmatyczne i przyłączone do błony.

Połączenie hybrydyzacji fluorescencji in situ multipleksowej z immunohistochemią fluorescencyjną na świeżo zamrożonych lub utrwalonych wycinkach mózgu myszy

Możliwość trwałego oznaczania komórek macierzystych i ich potomstwa za pomocą fluoroforu za pomocą indukowalnej linii myszy śledzącej transgeniczną linię genealogiczną pozwala na przestrzenną i czasową analizę aktywacji, proliferacji, migracji i/lub różnicowania in vivo. Śledzenie linii może ujawnić nowe informacje na temat zaangażowania w linię, odpowiedzi na interwencję (interwencje) i multipotencji.

Śledzenie linii indukowalnych fluorescencyjnie znakowanych komórek macierzystych w mózgu dorosłej myszy

Poznaj metodę swobodnego barwienia immunologicznego mózgów myszy w celu uzyskania wysokiej jakości obrazów histologicznych. Protokół obejmuje perfuzję, cięcie tkanek i immunobarwienie w badaniach neuroanatomicznych.

Swobodne barwienie immunologiczne mózgów myszy

Przeglądaj więcej filmów