Swobodne barwienie immunologiczne mózgów myszy

Barwienie immunohistochemiczne mózgów myszy jest powszechnie stosowaną techniką w badaniach neurobiologicznych. Jednak jakość, wiarygodność i powtarzalność wyników histologii mózgu może się różnić w zależności od badacza i laboratorium. Przedstawiamy uznaną metodologię badań histologicznych mózgów myszy, która okazała się powtarzalna, wiarygodna i wydajna.

W zademonstrowaniu procedury pomoże dr Chunmei Wang, adiunkt z mojego laboratorium Po potwierdzeniu udanego znieczulenia u ośmio- do 16-tygodniowej myszy C57 black/6J, przymocuj mysz do piankowej deski i wykonaj podłużne powierzchowne nacięcie wzdłuż linii środkowej nad klatką piersiową i brzuchem, a następnie odsuń skórę na bok, aby odsłonić ścianę mięśniową klatki piersiowej i brzucha. Następnie wykonaj nacięcie w warstwie mięśniowej, aby odsłonić wątrobę i jelito. Następnie za pomocą nożyczek przetnij klatkę piersiową, aby otworzyć klatkę piersiową i odsłonić serce i płuca.

Za pomocą kleszczy hemostatycznych odciągnij klatkę piersiową na bok, aby poszerzyć obszar roboczy. Następny. Aby umieścić kaniulę perfuzyjną, należy bezpośrednio przeniknąć do lewej komory serca kaniulą i ostrożnie wprowadzić ją do aorty wstępującej. Umieść kołki wokół połączenia kaniuli i sprzężonej rurki na płycie piankowej, aby zamocować kaniulę na miejscu podczas perfuzji, a następnie przystąp do cięcia prawego przedsionka, aby umożliwić odpływ krwi z krążenia.

W celu perfuzji solą fizjologiczną włącz przełącznik ciśnienia soli fizjologicznej i przetapij mysz przezskórnie 40 do 60 mililitrami soli fizjologicznej. Uważnie obserwuj odpływ z prawego przedsionka i kolor wątroby. Następnie, aby przeprowadzić perfuzję z formaliną, wyłącz przełącznik ciśnienia soli fizjologicznej i włącz przełącznik ciśnienia formaliny, aby przepłukać mysz 40 mililitrami 10% neutralnie buforowanej formaliny.

Obserwuj kończyny zwierzęcia pod kątem oznak drżenia. W celu izolacji mózgu użyj nożyczek, aby usunąć głowę i wykonaj środkowe nacięcie wzdłuż powłoki, aby odsłonić czaszkę, a następnie odetnij skórę i przyczep mięśniowy. Następnie wykonaj nacięcie na grzbiecie oczodołu i umieść ostry koniec nożyczek do tęczówki w otworze wielkim.

Przesuwaj nożyczki wzdłuż wewnętrznej powierzchni czaszki, utrzymując nacisk w górę, aby uniknąć uszkodzenia mózgu. Następnie ostrożnie usuń kości ciemieniowe i czołowe oraz opony mózgowe przed usunięciem mózgu z otwartej czaszki. Umieść suchy lód na wierzchu płytki regulacji wysokości przesuwanego mikrotomu i poczekaj, aż pojawi się biały szron, a następnie ostrożnie rozprowadź pięć mililitrów 30% sacharozy na wierzchu płytki, aby po zamrożeniu sacharozy utworzyć solidną warstwę podstawową.

Następnie umieść wszystkie próbki mózgu poziomo w linii na wierzchu podstawy sacharozy z 500 mikrolitrami 30% sacharozy. Po pięciu do 10 minutach zamrażania, gdy mózg stanie się twardy i biały, przycinaj mózg, aż zostanie osiągnięta pożądana warstwa lub obszar, a następnie przełącz się z trybu przycinania na tryb karmienia i przetnij tkankę mózgową, aby wygenerować skrawki o grubości 25 mikrometrów. Następnie przygotuj 48-dołkową płytkę wypełnioną PBS i zaznacz pięć dołków na jeden mózg myszy.

Za pomocą pędzla zbierz jedną sekcję i umieść ją w jednej studzience, a następnie zbierz kolejną sekcję tej samej myszy i umieść ją w drugiej studzience. Powtarzaj procedurę, aż zostanie osiągnięta piąta studzienka, umieszczając sekcje od sześciu do 10 w pierwszej do piątej studzienki i tak dalej. Umieścić sitko komórkowe w jednym dołku z sześciodołkowej płytki do hodowli komórkowej wypełnionej PBS i za pomocą pędzla przenieść jedną serię skrawków mózgu do sitka komórkowego.

Przepłukać te skrawki w PBS, przenosząc sitko do komórek do innego dołka wypełnionego PBS na wytrząsarce. Następnie przenieś sekcje mózgu z sitka komórkowego do 1,5-mililitrowej probówki zawierającej jeden mililitr WFA znakowanego biotyną i inkubuj na platformie kołyszącej z prędkością 50 obr./min przez noc. Następnego dnia przepłucz skrawki mózgu PBS, jak pokazano wcześniej, a następnie przenieś skrawki do probówki zawierającej jeden mililitr roztworu streptawidyny i światła dziennego 488 i inkubuj przez dwie godziny na platformie do kołysania.

Po ponownym przepłukaniu skrawków mózgu PBS, inkubuj je w buforze blokującym przez dwie godziny, a następnie inkubuj w pierwotnym przeciwciałie przez noc na platformie kołyszącej. Następnego dnia, po płukaniu PBS, inkubuj skrawki w przeciwciałach drugorzędowych przez dwie godziny. Napełnij dwie szalki Petriego 100 mililitrami PBS i przenieś wszystkie sekcje mózgu z jednego sitka do pierwszego naczynia.

Ułóż sekcje mózgu w porządku neuroanatomicznym od ogonowego do rostralnego. Następnie zanurz jeden szkiełko w drugim naczyniu z jednym końcem lekko przechylonym za pomocą podstawki i za pomocą cienkiego pędzla delikatnie umieść sekcję mózgu tuż pod interfejsem bufora powietrza na pochylonym suwaku. Następnie, za pomocą pipety transferowej, powoli i delikatnie wyjmij bufor, aby obniżyć jego poziom, aż sekcja mózgowa znajdzie się całkowicie powyżej granicy faz bufora powietrza.

Kontynuuj ten proces, aż dojdziesz do dolnej części zjeżdżalni i wszystkie sekcje zostaną zamontowane na zjeżdżalni. W celu obrazowania włącz skaner i komputer, a następnie umieść slajdy w uchwycie na slajdy za pomocą urządzenia ładującego i włóż uchwyt do skanera. Otwórz oprogramowanie skanera i wybierz odpowiednie miejsce przechowywania oraz profil skanowania.

Rozpocznij skanowanie podglądu, klikając przycisk Rozpocznij skanowanie podglądu. Po zakończeniu skanowania otwórz kreatora wykrywania tkanek i zakreśl obszary zainteresowania do obrazowania. Po wybraniu regionów do obrazowania kliknij przycisk Rozpocznij skanowanie i poczekaj, aż urządzenie zakończy skanowanie.

Sprawdź plik wynikowy i wyeksportuj obrazy. Pokazano tutaj reprezentatywne fluorescencyjne obrazy immunohistochemiczne koronalnych odcinków mózgu myszy przy ujemnym 0,82 milimetra Bregma, pokazujące rozkład aglutyniny glicynii floribunda, wazopresyny argininy i DAPI. Sygnały aglutyniny Wisteria floribunda obserwuje się w obszarze okołofornialnym przedniego podwzgórza i jądra siatkowatego, natomiast sygnały wazopresyny argininy obserwuje się w jądrze przykomorowym.

Wypróbowując ten protokół po raz pierwszy, sugerujemy wykonanie go pod nadzorem doświadczonego badacza. Protokół pomoże w generowaniu optymalnych i spójnych wyników histologicznych wśród różnych badaczy i laboratoriów oraz posłuży jako punkt odniesienia dla początkujących uczących się tej techniki.