Name: Globalna identyfikacja sieci oddziaływań kotranslacyjnych poprzez selektywne profilowanie rybosomów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-07T13:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 58 s
Description: Poznaj metodę selektywnego profilowania rybosomów do analizy kotranslacyjnych oddziaływań białek w Saccharomyces cerevisiae. Technika ta umożliwia globalną identyfikację czynników wiążących się z rybosomami w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować wszystkim członkom laboratorium za owocne dyskusje oraz Muhammadowi Makhzumy za krytyczną lekturę manuskryptu. Praca ta została sfinansowana z grantu ISF (Israeli Science Foundation) 2106/20.

<ol><li>Oh, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+ribosome+profiling+reveals+the+cotranslational+chaperone+action+of+trigger+factor+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Selective ribosome profiling reveals the cotranslational chaperone action of trigger factor in vivo.</a> Cell. 147 (6), 1295-1308 (2011).</li>
<li>Shiber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cotranslational+assembly+of+protein+complexes+in+eukaryotes+revealed+by+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cotranslational assembly of protein complexes in eukaryotes revealed by ribosome profiling.</a> Nature. 561 (7722), 268-272 (2018).</li>
<li>Becker, A. H., Oh, E., Weissman, J. S., Kramer, G., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+ribosome+profiling+as+a+tool+for+studying+the+interaction+of+chaperones+and+targeting+factors+with+nascent+polypeptide+chains+and+ribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Selective ribosome profiling as a tool for studying the interaction of chaperones and targeting factors with nascent polypeptide chains and ribosomes.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2212-2239 (2013).</li>
<li>Galmozzi, C. V., Merker, D., Friedrich, U. A., Döring, K., Kramer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+ribosome+profiling+to+study+interactions+of+translating+ribosomes+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Selective ribosome profiling to study interactions of translating ribosomes in yeast.</a> Nature Protocols. , (2019).</li>
<li>Knorr, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome-NatA+architecture+reveals+that+rRNA+expansion+segments+coordinate+N-terminal+acetylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Ribosome-NatA architecture reveals that rRNA expansion segments coordinate N-terminal acetylation.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 26 (1), 35-39 (2019).</li>
<li>Matsuo, Y., Inada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribosome+collision+sensor+Hel2+functions+as+preventive+quality+control+in+the+secretory+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">The ribosome collision sensor Hel2 functions as preventive quality control in the secretory pathway.</a> Cell Reports. 34 (12), (2021).</li>
<li>Döring, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+Ssb-Nascent+chain+interactions+reveals+principles+of+Hsp70-assisted+folding%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Profiling Ssb-Nascent chain interactions reveals principles of Hsp70-assisted folding.</a> Cell. , (2017).</li>
<li>Chartron, J. W., Hunt, K. C. L., Frydman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cotranslational+signal-independent+SRP+preloading+during+membrane+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cotranslational signal-independent SRP preloading during membrane targeting.</a> Nature. 536 (7615), 224-228 (2016).</li>
<li>Janke, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+toolbox+for+PCR-based+tagging+of+yeast+genes%3A+New+fluorescent+proteins%2C+more+markers+and+promoter+substitution+cassettes%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">A versatile toolbox for PCR-based tagging of yeast genes: New fluorescent proteins, more markers and promoter substitution cassettes.</a> Yeast. 21 (11), 947-962 (2004).</li>
<li>Levi, O., Arava, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+CRISPR%2FCas9+Toolbox+for+Gene+Engineering+in+S.+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Expanding the CRISPR/Cas9 Toolbox for Gene Engineering in S. cerevisiae.</a> Current Microbiology. 77 (3), 468-478 (2020).</li>
<li>Giannoukos, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+and+robust+RNA-seq+process+for+cultured+bacteria+and+complex+community+transcriptomes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Efficient and robust RNA-seq process for cultured bacteria and complex community transcriptomes.</a> Genome Biology. 13 (3), 23(2012).</li>
<li>Guide, P. Illumina Index Adapters - Pooling Guide. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/experiment-design/index-adapters-pooling-guide-1000000041074-05.pdf">https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/experiment-design/index-adapters-pooling-guide-1000000041074-05.pdf</a> (2019).</li>
<li>Kanagawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bias+and+artifacts+in+multitemplate+polymerase+chain+reactions+%28PCR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bioscience+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Bias and artifacts in multitemplate polymerase chain reactions (PCR).</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 96 (4), 317-323 (2003).</li>
<li>Bertolini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+nascent+proteins+translated+by+adjacent+ribosomes+drive+homomer+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Interactions between nascent proteins translated by adjacent ribosomes drive homomer assembly.</a> Science. 371 (6524), (2021).</li>
<li>Kramer, G., Shiber, A., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+cotranslational+maturation+of+newly+synthesized+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of cotranslational maturation of newly synthesized proteins.</a> Annual Review of Biochemistry. 88, 337-364 (2019).</li>
<li>Joazeiro, C. A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+functions+of+ribosome-associated+protein+quality+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and functions of ribosome-associated protein quality control.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (6), 368-383 (2019).</li>
<li>Beaupere, C., Chen, R. B., Pelosi, W., Labunskyy, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+quantification+of+translation+in+budding+yeast+by+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Genome-wide quantification of translation in budding yeast by ribosome profiling.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (130), e56820(2017).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

W tym miejscu protokół szczegółowo opisuje podejście do selektywnego profilowania rybosomów w celu wychwytywania oddziaływań kotranslacyjnych w rozdzielczości bliskiej kodonowi. Ponieważ rybosom rośnie jako centrum koordynacji wyłaniania się łańcucha rodzącego się w zatłoczonej cytoplazmie, jest to kluczowa metoda identyfikacji i charakteryzowania różnych interakcji kotranslacyjnych wymaganych do zapewnienia funkcjonalnego proteomu, a także do badania różnych chorób. Do tej pory SeRP jest jedyną metodą, która może uchwyc...

Selektywne Profilowanie Ribosomów (SeRP) jest jedyną znaną do tej pory metodą, która bezpośrednio wychwytuje i charakteryzuje interakcje kotranslacyjne in vivo1,2,3,4,5,6. SeRP umożliwia globalne profilowanie interakcji dowolnego czynnika z translującymi rybosomami z rozdzielczością zbliżoną do pojedynczego kodonu2,7.
Metoda opiera się na błyskawicznym zamrażaniu rosnących komórek i zachowaniu aktywnej translacji. Lizaty komórkowe są następnie traktowane RNazą I w celu strawienia całego mRNA w komórce, z wyjątkiem fragmentów mRNA chronionych przez rybosomy, zwanych „śladami rybosomalnymi” (ribosome footprints). Próbkę dzieli się następnie na dwie części; jedną część wykorzystuje się bezpośrednio do izolacji wszystkich komórkowych śladów rybosomalnych, co reprezentuje całą trwającą translację w komórce. Druga część służy do oczyszczania powinowactwem specyficznego podzbioru rybosomów związanych z analizowanym czynnikiem, na przykład: enzymami modyfikującymi, czynnikami translokacyjnymi, chaperonami zwijającymi lub oddziaływaniami podczas składania kompleksów. Oczyszczone metodą powinowactwa ślady rybosomalne określa się zbiorczo mianem interaktomu. Następnie ekstrahuje się chronione przez rybosomy cząsteczki mRNA i wykorzystuje je do generowania biblioteki cDNA, a następnie do sekwencjonowania głębokiego.
Analiza porównawcza próbek całkowitego translatomu i interaktomu pozwala na identyfikację wszystkich orf, które wiążą się z badanym czynnikiem, a także na charakterystykę profilu interakcji każdego orf. Profil ten określa dokładne sekwencje rozpoczęcia i zakończenia zaangażowania, na podstawie których można wywnioskować odkodowane kodony i odpowiadające im reszty powstającego łańcucha polipeptydowego, a także wariacje prędkości rybosomu podczas interakcji7,8. Rysunek 1 przedstawia schemat protokołu.
<img alt="Schemat selektywnego profilowania rybosomów; proces: od hodowli do analizy danych; przygotowanie biblioteki cDNA." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62878/62878fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Przegląd protokołu SeRP. Cały protokół można przeprowadzić w ciągu 7-10 dni. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62878/62878fig1v2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

<table><tbody><tr><td>3'-Fosforylowany 28 nt RNA kontrolny oligonukleotyd</td><td>IDT</td><td>na zamówienie niestandardowe</td><td>Oczyszczanie HPLC bez RNaz; 5'-AUGUAGUCGGAGUCGAGGCGC GACGCGA/3Phos/-3'Absolutny</td></tr> <tr><td>etanol</td><td>VWR</td><td>20821</td><td></td></tr><tr><td>Kwaśny fenol&ndash; chloroform</td><td>Ambion</td><td>AM9722</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało: mysi monklonalny anty-HA</td><td>Merck</td><td>11583816001</td><td>12CA5</td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Roth</td><td>A162.3</td><td></td></tr><tr><td>ATP*</td><td>NEB</td><td>P0756S</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Agar Bacto</td><td>BD</td><td>214030</td><td></td></tr><tr><td>Pepton Bacto</td><td>BD</td><td>211820</td><td></td></tr><tr><td>Bacto trypton</td><td>BD</td><td></td><td></td>211699</tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy Bacto</td><td>BD</td><td>212720</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek bestatyny</td><td>Roth</td><td>2937.2</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Merck</td><td>102445</td><td></td></tr><tr><td>CircLigase II ssDNA Ligaza*</td><td>Epicentrum</td><td>CL9025K</td><td>100 U/&mu; L</td></tr><tr><td>Koloidalny roztwór barwiący Coomassie</td><td>Roth</td><td>4829</td><td></td></tr><tr><td>cKompletne, wolne od EDTA tabletki koktajlowe inhibitora proteazy</td><td>Roche Diagnostics</td><td>29384100</td><td></td></tr><tr><td>Cycloheximide</td><td>Biological Industries</td><td>A0879</td><td></td></tr><tr><td>DEPC uzdatniona i sterylna filtrowana woda*</td><td>Sigma</td><td>95284</td><td></td></tr><tr><td>D-glukoza bezwodna</td><td>Merck</td><td>G5767-500G</td><td></td></tr><tr><td>Diethylpyrocarbonate</td><td>Roth</td><td>K028</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsuloxide *</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>drabinka DNA, 10 pz O'RangeRuler*</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SM1313</td><td></td></tr><tr><td>barwnik ładujący DNA*</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0631</td><td>6 razy;</td></tr><tr><td>DNaza I, rekombinowany</td><td>Roche</td><td>4716728001</td> zestaw roztworów dNTP <td>wolnych od RNAza</td></tr><tr><td>*</td><td>NEB</td><td>N0446S</td><td></td></tr><tr><td>EDTA*</td><td>Roth</td><td>8043</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>VWR</td><td>24388.260.</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór glicyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>67419-1ML-F</td><td>1 M</td></tr><tr><td>GlycoBlue</td><td>Ambion</td><td>AM9516</td><td>15 mg/ml</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Roth</td><td>HN78.3</td><td></td></tr><tr><td>HF Polimeraza Phusion*</td><td>NEB</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>HK z S. cerevisiae</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6380-1.5KU</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny</td><td>AppliChem</td><td>A1305</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>33539</td><td></td></tr><tr><td>Izopropyl &beta;-D-1-tiogalaktopiranozyd</td><td>Roth</td><td>CN08</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycyna</td><td>Roth</td><td>T832.4</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Roth</td><td>6781.1</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Roth</td><td>3904.1</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Roth</td><td>CN33.4</td><td></td></tr><tr><td>Linker L(rt)</td><td>IDT</td><td>na zamówienie</td><td></td></tr><tr><td>Ciekły azot</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Roth</td><td>KK36.3</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Roth</td><td>P030.2</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4&middot; 2H2O</td><td>Roth</td><td>T879.3</td><td></td></tr><tr><td>NaCl*</td><td>Invitrogen</td><td>AM97606</td><td>5 M</td></tr><tr><td>NaH2PO4&middot; H2O</td><td>Roth</td><td>K300.2</td><td></td></tr><tr><td>Sepharose aktywowany przez NHS 4 kulki o szybkim przepływie</td><td>GE Life Sciences</td><td>17090601</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P 40 substytut</td><td>Sigma</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatyna A</td><td>Roth</td><td>2936.2</td><td></td></tr><tr><td>Fluorek fenylometylosulfonylu</td><td>Roth</td><td>6367</td><td></td></tr><tr><td>Prefabrykaty żelowe</td><td>Bio-Rad</td><td>5671034</td><td>10% i 12%</td></tr><tr><td>RNaza I</td><td>Ambion</td><td>AM2294</td><td></td></tr><tr><td>SDS, 20%</td> <td>Ambion</td><td>AM9820</td> Bez <td>RNaz</td></tr><tr><td>Octan sodu*</td><td>Ambion</td><td>AM9740</td><td>3 M, pH 5,5</td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>Merck</td><td>S8032-100G</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Roth</td><td>9265</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu*</td><td>Sigma</td><td>S2770</td><td>1 N</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16104</td><td></td></tr><tr><td>SUPERase-In Inhibitor RNazy</td><td>Ambion</td><td>AM2694</td><td></td></tr><tr><td>Indeks górny III Odwrotna transcyptaza *</td> <td>Invitrogen</td><td>18080-044</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Gold *</td> <td>Invitrogen</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>Kinaza polinukleotydowa T4 *</td> <td>NEB</td><td>M0201L</td><td></td></tr><tr><td>Ligaza RNA T4 2 *</td> <td>NEB</td><td>M0242L</td><td></td></tr><tr><td>Żel poliakrylamidowy TBE*</td><td>Novex</td><td>EC6215BOX</td><td>8%</td></tr><tr><td>TBE&ndash; żel poliakryloamidowy mocznik*</td><td>Novex</td><td>EC68752BOX</td><td>10%</td></tr><tr><td>TBE&ndash; żel poliakryloamidowy mocznik*</td><td>Novex</td><td>EC6885BOX</td><td>15%</td></tr><tr><td>TBE&ndash; bufor próbki mocznika *</td> <td>Novex</td><td>LC6876</td><td>2 razy;</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Roth</td><td>4855</td><td></td></tr><tr><td>Tris*</td><td>Ambion</td><td>AM9851</td><td>1 M, pH 7,0</td></tr><tr><td>Tris*</td><td>Ambion</td><td>AM9856</td><td>1 M, pH 8,0</td></tr><tr><td>UltraPure 10 razy; Bufor TBE*</td><td>Invitrogen</td><td>15581-044</td><td></td></tr><tr><td>* - do przygotowania</td><td></td><td></td><td></td>biblioteki</tr><tr><td>uszczelka i zacisk sprężynowy, 90 mm,Millipore</td><td></td><td>&nbsp; </td><td></td>XX1009020</tr><tr><td>Kolba do fugowania szlifowanego 1 L,</td> <td>Millipore</td><td>XX1504705</td><td></td></tr></tbody></table>

globalna identyfikacja sieci oddziaływań kotranslacyjnych poprzez selektywne profilowanie rybosomów

Global Identification of Co-Translational Interaction Networks by Selective Ribosome Profiling

W ostatnich latach stało się oczywiste, że rybosomy nie tylko dekodują nasze mRNA, ale także kierują powstawaniem łańcucha polipeptydowego w zatłoczonym środowisku komórkowym. Rybosomy stanowią platformę do kontrolowanego przestrzennie i kinetycznie wiązania czynników ukierunkowanych na błonę, modyfikowania enzymów i fałdowania białek opiekuńczych. Niedawno odkryto, że nawet składanie się w oligomeryczne kompleksy wysokiego rzędu, jak również etapy tworzenia sieci białko-białko, są skoordynowane z syntezą.
Tutaj opisujemy Selektywne Profilowanie Rybosomów, metodę opracowaną do uchwycenia interakcji kotranslacyjnych in vivo. Omówimy szczegółowo różne etapy oczyszczania powinowactwa wymagane do wychwytywania kompleksów rybosom-powstających łańcuchów wraz z interaktorami kotranslacyjnymi, a także etapy ekstrakcji mRNA, wykluczania wielkości, odwrotnej transkrypcji, głębokiego sekwencjonowania i analizy dużych zbiorów danych, wymagane do rozszyfrowania interakcji kotranslacyjnych w rozdzielczości bliskiej kodonowi.

Jak pokazano na schemacie blokowym niniejszego protokołu (Rysunek 1), komórki hodowano do fazy logarytmicznej, a następnie szybko zbierano poprzez filtrację i lizowano za pomocą mielenia kriogenicznego. Lizat podzielono na dwie części: jedną przeznaczoną do analizy całkowitych odcisków mRNA chronionych przez rybosomy, a drugą do wybranych odcisków mRNA chronionych przez rybosomy, w której przeprowadzono oczyszczanie powinowactwa w celu wyizolowania kompleksów znakowanego białka, rybosomu i n...

Interakcje kotranslacyjne odgrywają kluczową rolę w modyfikacjach powstających łańcuchów, celowaniu, składaniu i ścieżkach montażu. W tym miejscu opisujemy selektywne profilowanie rybosomów, metodę bezpośredniej analizy in vivo tych interakcji w modelu eukarionta Saccharomyces cerevisiae.

Globalna identyfikacja sieci oddziaływań kotranslacyjnych poprzez selektywne profilowanie rybosomów

In recent years, it has become evident that ribosomes not only decode our mRNA but also guide the emergence of the polypeptide chain into the crowded ...

Interakcje kotranslacyjne odgrywają kluczową rolę w powstających modyfikacjach łańcuchów ukierunkowanych na szlaki składania i składania. W tym miejscu opisujemy selektywne profilowanie rybosomów, metodę bezpośredniej analizy in vivo tych interakcji w modelowym eukarioncie Saccaromyces cerevisiae. Selektywne profilowanie rybosomów jest jak dotąd jedyną metodą, która w bezpośredni sposób wychwytuje i charakteryzuje interakcje kotranslacyjne in vivo.Selektywne profilowanie rybosomów umożliwia globalne profilowanie dowolnych czynników i interakcji z translującymi rybosomami w rozdzielczości bliskiej kodonowi. Zacznij od zebrania skonstruowanych komórek drożdży zawierających pożądane oznakowane białka. Przeprowadź lizę komórek za pomocą mielenia kriogenicznego w młynie mieszającym dwa razy przez dwie minuty przy 30 Hz.Wirować przez dwie minuty w temperaturze 30 000 razy G w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby usunąć lizat i zebrać supernatant. Przenieś 200 mikrolitrów supernatantu do probówki mikrowirówkowej w celu całkowitej analizy RNA i 700 mikrolitrów do probówki mikrowirówkowej w celu oczyszczenia immunologicznego. Trawić wcześniej oddzieloną całkowitą próbkę RNA przy użyciu 10 jednostek RNazy I przez 25 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza na obrotowym stojaku do mieszania z prędkością 30 obrotów na minutę.Przygotować wzorcową mieszankę poduszkową z sacharozą zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym. Następnie załadować próbkę na 400 mikrolitrów poduszki sacharozy i odwirować przez 90 minut w temperaturze 245 000 razy G i w czterech stopniach Celsjusza. Szybko usunąć supernatant za pomocą pompy próżniowej i nałożyć granulki na 150 mikrolitrów buforu do lizy.Zabezpiecz próbkę folią parafinową i ponownie zawieś granulki, wstrząsając przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przy 300 obrotach na minutę. Przepłukać od 100 do 400 mikrolitrów matrycy wiążącej powinowactwo na próbkę trzykrotnie jednym mililitrem buforu do lizy poprzez ponowne zawieszenie matrycy powinowactwa w buforze do lizy. Następnie obracaj z prędkością 30 obrotów na minutę za pomocą obrotowego stojaka do mieszania o temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut.Wytrącić przez odwirowanie. Wylej górny płyn i powtórz ten proces trzy razy. Dodaj matrycę wiążącą powinowactwo do wcześniej oddzielonej próbki oczyszczania immunologicznego i traw ją za pomocą RNazy I. Obracaj przez 25 minut przy 30 obrotach na minutę i czterech stopniach Celsjusza za pomocą obrotowego stojaka do mieszania, aby związać białko z matrycą powinowactwa.Przygotować główną mieszankę buforu do płukania zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym. Przemyć matrycę wiążącą powinowactwa jednym mililitrem buforu do przemywania przez około jedną minutę, obracając w ruszcie do mieszania. Następnie wytrącić przez odwirowanie w temperaturze 3000 razy G przez 30 sekund w temperaturze czterech stopni Celsjusza i wyrzucić górny płyn.Powtórz trzy razy. Umyj jeszcze dwa razy w jednym mililitrze bufora do mycia, za każdym razem przez pięć minut, obracając się w ruszcie do mieszania. Wytrącić ponownie przez odwirowanie.Użyj 50 mikrolitrów kulek do elucji białek z taką samą ilością bufora 2X próbki. Odwirować, aby granulować kulki i wyrzucić górny płyn. Elute za pomocą 700 mikrolitrów 10-milimolowego Tris.Następnie zamrozić w ciekłym azocie. Usunąć próbkę z ciekłego azotu i przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, aby można ją było wykorzystać do późniejszej ekstrakcji RNA. Oceń powodzenie etapu oczyszczania powinowactwa za pomocą barwienia Western blot lub Coomassie z podwielokrotnościami każdego etapu, używając pozorowanego adresu IP na nieoznakowanym szczepie typu dzikiego jako kontroli niespecyficznego wiązania z macierzą powinowactwa.Wyniki Western blot po oczyszczeniu powinowactwa wykazały sukces ekspresji znakowanego białka. Izolacja śladów stóp chronionych rybosomem została zwalidowana przy użyciu wyników bioanalizatora. Podczas generowania biblioteki cDNA do głębokiego sekwencjonowania i analizy dużych zbiorów danych, niedostateczny cykl prowadzi do niskiej wydajności.Jednak przy nadal obecnych dNTP reakcja postępuje, generując dłuższe artefakty PCR z sekwencjami chimerycznymi z powodu przygotowania produktów PCR. Wygenerowana biblioteka została następnie zweryfikowana za pomocą elektroforezy DNA o wysokiej czułości w celu dokładnego rozkładu wielkości i kwantyfikacji. Biblioteka sekwencji została przycięta pod kątem adapterów i kodów kreskowych, a uzyskane odczyty podzielono na różne grupy sekwencji kodujących, intronów i sekwencji międzygenowych.Profile rybosomów analizujące kotranslacyjne oddziaływania Vma2p z rybosomem opiekuńczym Ssb1p, Pfk2p i Fas1p są pokazane tutaj wraz ze schematem eksperymentalnym oczyszczania powinowactwa każdego z nich. Stwierdzono zajętość rybosomów wzdłuż otwartej ramki odczytu całkowitej liczby translatomów w porównaniu z interaktomami Ssb1, Pfk2p i Fas1p. Średnie wzbogacenie Ssb1p, Pfk2p i Fas1p w każdej pozycji rybosomu wzdłuż otwartej ramki odczytu pokazano tutaj.Metoda ta umożliwia identyfikację i charakterystykę różnych interakcji kotranslacyjnych, zapewniając funkcjonalny proteom, a także badanie różnych chorób. Do tej pory selektywne profilowanie rybosomów jest jedyną metodą, która może uchwycić i scharakteryzować te interakcje w bezpośredni sposób in vivo.

global-identification-co-translational-interaction-networks-selective

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejszy artykuł opisuje protokół ekstrakcji rybosomów translacyjnych z komórek eukariotycznych. Po ekstrakcji rybosomy są rozdzielane na monosomy i polirybosomy za pomocą frakcjonowania w gradiencie sacharozy, co pozwala na analizę różnych populacji rybosomalnych. W związku z tym metoda ta stanowi złoty standard w badaniu regulacji translacji.

Analiza profilu polirybosomów eukariotycznych

Opisano technikę identyfikacji miejsc zatrzymania translacji na mRNA. Procedura ta opiera się na izolacji nowo powstających polipeptydów gromadzących się na rybosomach podczas translacji in vitro docelowego mRNA, a następnie na analizie wielkości łańcuchów nascentnych przy użyciu denaturującej elektroforezy żelowej.

Izolacja związanych z rybosomami nowo powstałych polipeptydów in vitro w celu identyfikacji miejsc pauzy translacyjnej wzdłuż mRNA

Ten protokół ilustruje istotne modyfikacje frakcjonowania polirybosomów w celu zbadania translatomii próbek OUN in vivo. Umożliwia globalną ocenę regulacji translacji i transkrypcji poprzez izolację i porównanie całkowitego RNA z frakcjami RNA związanymi z rybosomami.

In vivo (in vivo) Badanie translatomii ośrodkowego układu nerwowego przez frakcjonowanie polirybosomów

Rybosomy odgrywają kluczową rolę w syntezie białek. Frakcjonowanie polirybosomów (polisomów) za pomocą wirowania w gradiencie gęstości sacharozy umożliwia bezpośrednie określenie wydajności translacji poszczególnych mRNA w skali całego genomu. Ponadto metoda ta może być stosowana do analizy biochemicznej czynników związanych z rybosomami i polisomami, takich jak białka opiekuńcze i cząsteczki sygnałowe.

Frakcjonowanie polisomów i analiza translatomiów ssaków w skali całego genomu

Zdolność komórek do adaptacji do stresu jest kluczowa dla ich przetrwania. Regulacja translacji mRNA jest jedną z takich strategii adaptacyjnych, zapewniającą szybką regulację proteomu. W tym miejscu zapewniamy ustandaryzowany protokół profilowania polisomów w celu identyfikacji określonych mRNA, które ulegają selektywnej translacji w warunkach stresu.

Ocena selektywnej translacji mRNA w komórkach ssaków za pomocą profilowania polisomów

Tutaj prezentujemy protokół przechwytywania interaktomii zastosowany do protoplastów mezofilu z liści Arabidopsis thaliana. Metoda ta opiera się w dużej mierze na sieciowaniu UV in vivo i pozwala na izolację i identyfikację białek wiążących mRNA roślin ze środowiska fizjologicznego.

Wychwytywanie interaktomu mRNA z protoplastów roślinnych

Regulacja translacyjna odgrywa ważną rolę w kontroli obfitości białek. W tym miejscu opisujemy wysokoprzepustową metodę ilościowej analizy translacji w pączkujących drożdżach Saccharomyces cerevisiae.

Kwantyfikacja translacji w całym genomie u pączkujących drożdży za pomocą profilowania rybosomów

Tutaj opisujemy etapy pobierania próbek i przygotowania do sekwencji RIBO u bakterii. Sekwencjonowanie bibliotek przygotowanych zgodnie z tymi wytycznymi daje wystarczające dane do kompleksowej analizy bioinformatycznej. Prezentowany przez nas protokół jest prosty, wykorzystuje standardowy sprzęt laboratoryjny i od lizy do uzyskania bibliotek mija siedem dni.

RIBO-seq w bakteriach: protokół pobierania próbek i przygotowania biblioteki do sekwencjonowania NGS

Prezentujemy technikę szybkiej stabilizacji kompleksów translacyjnych (biosyntezy białek) za pomocą sieciowania formaldehydem w żywych komórkach drożdży i ssaków. Podejście to umożliwia analizę przejściowych produktów pośrednich i dynamicznych interakcji RNA-białko. Usieciowane kompleksy mogą być wykorzystywane w wielu dalszych zastosowaniach, takich jak metody profilowania oparte na głębokim sekwencjonowaniu, mikroskopia i spektrometria mas.

Szybkie utrwalanie in vivo i izolacja kompleksów translacyjnych z komórek eukariotycznych

Translacja rybosomów dekoduje trzy nukleotydy na kodon na peptydy. Ich ruch wzdłuż mRNA, wychwycony przez profilowanie rybosomów, wytwarza ślady wykazujące charakterystyczną okresowość trypletową. Protokół ten opisuje, w jaki sposób używać RiboCode do rozszyfrowania tej wyróżniającej się cechy na podstawie danych profilowania rybosomów w celu identyfikacji aktywnie translowanych otwartych ramek odczytu na poziomie całego transkryptomu.

De novo Identyfikacja aktywnie translowanych otwartych ramek odczytu z danymi profilowania rybosomów

Poznaj metodę selektywnego profilowania rybosomów do analizy kotranslacyjnych oddziaływań białek w Saccharomyces cerevisiae. Technika ta umożliwia globalną identyfikację czynników wiążących się z rybosomami w czasie rzeczywistym.

Globalna identyfikacja sieci oddziaływań kotranslacyjnych poprzez selektywne profilowanie rybosomów

Przeglądaj więcej filmów