Globalna identyfikacja sieci oddziaływań kotranslacyjnych poprzez selektywne profilowanie rybosomów

Interakcje kotranslacyjne odgrywają kluczową rolę w powstających modyfikacjach łańcuchów ukierunkowanych na szlaki składania i składania. W tym miejscu opisujemy selektywne profilowanie rybosomów, metodę bezpośredniej analizy in vivo tych interakcji w modelowym eukarioncie Saccaromyces cerevisiae. Selektywne profilowanie rybosomów jest jak dotąd jedyną metodą, która w bezpośredni sposób wychwytuje i charakteryzuje interakcje kotranslacyjne in vivo.

Selektywne profilowanie rybosomów umożliwia globalne profilowanie dowolnych czynników i interakcji z translującymi rybosomami w rozdzielczości bliskiej kodonowi. Zacznij od zebrania skonstruowanych komórek drożdży zawierających pożądane oznakowane białka. Przeprowadź lizę komórek za pomocą mielenia kriogenicznego w młynie mieszającym dwa razy przez dwie minuty przy 30 Hz.

Wirować przez dwie minuty w temperaturze 30 000 razy G w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby usunąć lizat i zebrać supernatant. Przenieś 200 mikrolitrów supernatantu do probówki mikrowirówkowej w celu całkowitej analizy RNA i 700 mikrolitrów do probówki mikrowirówkowej w celu oczyszczenia immunologicznego. Trawić wcześniej oddzieloną całkowitą próbkę RNA przy użyciu 10 jednostek RNazy I przez 25 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza na obrotowym stojaku do mieszania z prędkością 30 obrotów na minutę.

Przygotować wzorcową mieszankę poduszkową z sacharozą zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym. Następnie załadować próbkę na 400 mikrolitrów poduszki sacharozy i odwirować przez 90 minut w temperaturze 245 000 razy G i w czterech stopniach Celsjusza. Szybko usunąć supernatant za pomocą pompy próżniowej i nałożyć granulki na 150 mikrolitrów buforu do lizy.

Zabezpiecz próbkę folią parafinową i ponownie zawieś granulki, wstrząsając przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przy 300 obrotach na minutę. Przepłukać od 100 do 400 mikrolitrów matrycy wiążącej powinowactwo na próbkę trzykrotnie jednym mililitrem buforu do lizy poprzez ponowne zawieszenie matrycy powinowactwa w buforze do lizy. Następnie obracaj z prędkością 30 obrotów na minutę za pomocą obrotowego stojaka do mieszania o temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut.

Wytrącić przez odwirowanie. Wylej górny płyn i powtórz ten proces trzy razy. Dodaj matrycę wiążącą powinowactwo do wcześniej oddzielonej próbki oczyszczania immunologicznego i traw ją za pomocą RNazy I. Obracaj przez 25 minut przy 30 obrotach na minutę i czterech stopniach Celsjusza za pomocą obrotowego stojaka do mieszania, aby związać białko z matrycą powinowactwa.

Przygotować główną mieszankę buforu do płukania zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym. Przemyć matrycę wiążącą powinowactwa jednym mililitrem buforu do przemywania przez około jedną minutę, obracając w ruszcie do mieszania. Następnie wytrącić przez odwirowanie w temperaturze 3000 razy G przez 30 sekund w temperaturze czterech stopni Celsjusza i wyrzucić górny płyn.

Powtórz trzy razy. Umyj jeszcze dwa razy w jednym mililitrze bufora do mycia, za każdym razem przez pięć minut, obracając się w ruszcie do mieszania. Wytrącić ponownie przez odwirowanie.

Użyj 50 mikrolitrów kulek do elucji białek z taką samą ilością bufora 2X próbki. Odwirować, aby granulować kulki i wyrzucić górny płyn. Elute za pomocą 700 mikrolitrów 10-milimolowego Tris.

Następnie zamrozić w ciekłym azocie. Usunąć próbkę z ciekłego azotu i przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza, aby można ją było wykorzystać do późniejszej ekstrakcji RNA. Oceń powodzenie etapu oczyszczania powinowactwa za pomocą barwienia Western blot lub Coomassie z podwielokrotnościami każdego etapu, używając pozorowanego adresu IP na nieoznakowanym szczepie typu dzikiego jako kontroli niespecyficznego wiązania z macierzą powinowactwa.

Wyniki Western blot po oczyszczeniu powinowactwa wykazały sukces ekspresji znakowanego białka. Izolacja śladów stóp chronionych rybosomem została zwalidowana przy użyciu wyników bioanalizatora. Podczas generowania biblioteki cDNA do głębokiego sekwencjonowania i analizy dużych zbiorów danych, niedostateczny cykl prowadzi do niskiej wydajności.

Jednak przy nadal obecnych dNTP reakcja postępuje, generując dłuższe artefakty PCR z sekwencjami chimerycznymi z powodu przygotowania produktów PCR. Wygenerowana biblioteka została następnie zweryfikowana za pomocą elektroforezy DNA o wysokiej czułości w celu dokładnego rozkładu wielkości i kwantyfikacji. Biblioteka sekwencji została przycięta pod kątem adapterów i kodów kreskowych, a uzyskane odczyty podzielono na różne grupy sekwencji kodujących, intronów i sekwencji międzygenowych.

Profile rybosomów analizujące kotranslacyjne oddziaływania Vma2p z rybosomem opiekuńczym Ssb1p, Pfk2p i Fas1p są pokazane tutaj wraz ze schematem eksperymentalnym oczyszczania powinowactwa każdego z nich. Stwierdzono zajętość rybosomów wzdłuż otwartej ramki odczytu całkowitej liczby translatomów w porównaniu z interaktomami Ssb1, Pfk2p i Fas1p. Średnie wzbogacenie Ssb1p, Pfk2p i Fas1p w każdej pozycji rybosomu wzdłuż otwartej ramki odczytu pokazano tutaj.

Metoda ta umożliwia identyfikację i charakterystykę różnych interakcji kotranslacyjnych, zapewniając funkcjonalny proteom, a także badanie różnych chorób. Do tej pory selektywne profilowanie rybosomów jest jedyną metodą, która może uchwycić i scharakteryzować te interakcje w bezpośredni sposób in vivo.