In vivo (in vivo) Metody oceny funkcji i struktury komórek zwojowych siatkówki oraz nerwu wzrokowego u dużych zwierząt
26 lutego 2022
Tutaj demonstrujemy kilka testów in vivo (potencjał wywołany w trybie wizualnym flash, elektroretinogram wzorcowy i koherentna tomografia optyczna) u kóz i makaków rezusów, aby zrozumieć strukturę i funkcję nerwu wzrokowego i jego neuronów.
Cześć wszystkim. To Yikui Zhang ze szpitala okulistycznego w Wenzhou. Górny nerw nie ma eksksonów z komórek zwojowych oreksyny, a następnie przekazuje sygnał wzrokowy do mózgu.
Większy model uszkodzenia górnego nerwu jest niezbędny, aby przełożyć nowatorskie leczenie z modelu robota na aplikację limfy. Tutaj opisujemy niektóre metody in vivo do oceny struktury i funkcji komórek zwojowych oreksyny w górnym nerwie u dużych zwierząt. Przedstawiając tę metodę krok po kroku, mamy nadzieję zwiększyć eksperymentalną niepełnosprawność reprodukcyjną i ułatwić stosowanie większych modeli nerwicy nerwu wzrokowego.
Ogol się elektroniczną maszynką do golenia. I przygotuj go trzykrotnie z 70% alkoholem, aby oczyścić skórę i odsłonić żyłę podskórną. Wprowadzić dożylnie łóżeczko dożylne do żył obwodowych.
Następnie wlej atropinę i propofol. Zaintubuj kozę sześciomilimetrową rurką dotchawiczą i podłącz do sztucznego respiratora. Znieczulenie utrzymywano za pomocą 3,5% izofluranu w tlenie przy stałym natężeniu przepływu wynoszącym dwa litry.
Umieść czujnik temperatury pod językiem kozy. Przytnij szczelinę saturacji tlenem do bliższego końca ucha kozy. Przywiąż mankiet do pomiaru ciśnienia krwi u podstawy uda.
Zacisk EKG rozszczepia się na kończynach w kolejności. Następnie możemy monitorować wskaźniki życiowe kozy. Ogol włosy i zdezynfekuj skórę betadyną i 70% alkoholem trzy razy w środek kości czołowej.
Otwórz torbę sterylizatora zawierającą nożyczki i gwoździe. Wykonaj nacięcia skóry, aby odsłonić czaszkę nożyczkami. stalowe do wszczepiania w środku kości czołowej.
Ogolić włosy i zdezynfekować skórę betadyną i 70% alkoholem trzy razy w środkowym punkcie dwojga uszu w kości potylicznej. Wykonaj nacięcia skóry. stalowe do wszczepiania w środkowym punkcie dwojga uszu w kości potylicznej.
Uziemiającą elektrodę igłową wprowadza się podskórnie pod przednią czaszki. Elektroda czynna i elektroda referencyjna są połączone odpowiednio ze śrubą czołową i potyliczną za pomocą zacisków krokodylkowych w celu zmniejszenia impotencji elektrody. Załataj jedno oko.
Nałóż krople do oczu do znieczulenia miejscowego na powierzchnię oka. Źrenice po obu stronach są rozszerzone za pomocą kropli do oczu na rozszerzenie źrenic. Umieść głowę kozła w wypełnionym gazem stymulatorze skierowanym do światła ambulatoryjnego.
Połóż koc na stymulatorze i głowie kozy na pięć minut adaptacji. Wziernik powieki służy do pełnego odsłonięcia źrenicy. Sprawdź impotencję kontaktową elektrody z tkanką.
Upewnij się, że impotencja jest mniejsza niż 10 kilometrów dla każdego, aby uniknąć zakłóceń elektromagnetycznych z innych urządzeń elektrycznych w tym samym pomieszczeniu. Sprawdź podstawowy poziom hałasu bez stymulacji światłem. Rozpocznij nagrywanie w formacie FVEP.
Należy pamiętać, że nagrywanie FVEP przy każdym natężeniu światła jest wykonywane dwukrotnie. Należy pamiętać, że zwilż rogówkę sztuczną łzą, jeśli wydaje się sucha. Powtórz kroki dla przeciwległego oka.
Rozpocznij nagrywanie FVEP kolejno przy różnym natężeniu światła. Dla każdego nagrania uśredniane są 64 ślady, aby uzyskać jedną formę fali. Pierwszy dodatni i aktywny pik w postaci fali FVEP został oznaczony jako P1 i N1. Wysterylizowaną elektrodę uziemiającą umieszcza się w płatku ucha.
Wysterylizowane elektrody aktywne i referencyjne wprowadza się podskórnie wzdłuż linii środkowej oraz odpowiednio kości czołowej i potylicznej. Wziernik powieki służy do pełnego odsłonięcia źrenicy. Załataj jedno oko.
Rejestruj kolejno wzorce odpowiedzi VEP drugiego oka na różnych częstotliwościach przestrzennych. Podłącz do elektrody uziemiającej za pomocą zacisku krokodylkowego. Dwie wysterylizowane elektrody referencyjne igłowe umieszcza się pod skórą jeden centymetr za boczną kantą po obu stronach.
Wziernik powieki służy do pełnego odsłonięcia źrenicy. Dwie zdezynfekowane elektrody rejestrujące ERG są wyśrodkowane na obu rogówkach po miejscowym zastosowaniu sztucznego łzy. Przed każdym okiem umieszcza się dwa stymulatory w odległości oglądania 50 centymetrów.
Upewnij się, że impotencja jest poniżej 10 kilometrów. Śledź podstawowy szum bez stymulacji światłem. Skieruj światło ambulansu.
Rozpocznij rejestrację wzorca ERG z obu oczu jednocześnie na różnych częstotliwościach przestrzennych. Wreszcie powrót ekranu do nagrywania wzorca ERG bez stymulatorów wizualnych i aktywnej kontroli. Filtr pasmowoprzepustowy jest ustawiony na zakres od jednego do 75 Hz dla trzech wzorców CPD ERG.
Filtr pasmowoprzepustowy ma częstotliwość od jednego do 50 Hz, aby wygładzić kształt bez wpływu na jego amplitudę. Pierwsze dodatnie i aktywne piki w postaci fali są oznaczone jako P1 i N1. Wzorzec amplitudy ERG mierzony od N1 do P1.To zmniejszyć impotencję elektrod, pod skórą czołową umieszcza się wysterylizowaną igłę odniesienia. A wysterylizowaną elektrodę referencyjną igłową umieszcza się pod skórą jeden centymetr za boczną kantą z jednej strony.
Zdezynfekowaną elektrodę rejestrującą ERG umieszcza się na rogówce po miejscowym zastosowaniu sztucznego łzy. Załataj jedno oko. Wyświetlacz jest umieszczony w odległości oglądania 50 centymetrów.
Wziernik powieki służy do pełnego odsłonięcia źrenicy. Następnie kozę umieszcza się na podbródku. Dopasuj kozę do aparatu, aby wysłać jej głowę nerwu wzrokowego na konfokalny obraz z oftalmoskopii laserowej, modyfikując jej pozycję głowy.
Kliknij przycisk start, aby przejść do fazy końcowej wykrywania. Poczekaj, aż maszyna zakończy ładowanie. Naciśnij żółty przycisk start, aby rozpocząć formalne obrazowanie.
Wyreguluj joystick, aby równomiernie oświetlić obraz w podczerwieni w celu poprawy jakości obrazu. Przesuń kamerę do przodu, aż na prawym górnym rogu ekranu pojawi się obraz OCT wyprostowanej siatkówki. Zmodyfikuj joystick tak, aby równomiernie tańczył w poziomym obrazie OCT siatkówki.
Naciśnij przycisk na joysticku, aby automatycznie uchwycić obraz. Przytrzymaj ten joystick, aby utrzymać jakość obrazu na ekranie obrazu na żywo, aż do zakończenia wykonywania obrazu. Następnie naciśnij pobierz.
Wybierz zdjęcie początkowe wysokiej jakości. Kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz ustaw odniesienie. Naciśnij przycisk monitujący, aby umożliwić programowi automatyczne dopasowanie bieżącego skanowania do skanowania linii bazowej.
Po dopasowaniu naciśnij przycisk na joysticku, aby aktywować automatyczne śledzenie w czasie rzeczywistym. Kliknij przycisk pomiaru, aby wejść na platformę pomiarową. Wybierz gumkę, narzędzie i wytrzyj linię RFL, która jest automatycznie oznaczana przez maszynę.
Wybierz narzędzie do rysowania linii, aby ręcznie obrysować granicę między IPL i INL. Pomiędzy czerwoną i niebieską linią znajduje się kompleks GCC. Obrazowanie zmienione w siatkówce u makaków rezus jest wykonywane przy użyciu tego samego sprzętu i procedury, co u kóz.
Rysunek A przedstawia reprezentatywny FVEP u kóz. Rysunek B przedstawia reprezentatywny wzór kształtu fali ERG u kozy. Rysunek C przedstawia reprezentatywny wzór FVEP u makaków rezusów.
Rysunek D przedstawia reprezentatywny wzór formy fali ERG u makaka rezusa. Rycina druga przedstawia reprezentatywne obrazy OCT siatkówki wokół głowy nerwu wzrokowego i grubość kompleksu GCC w różnych regionach obwodowych u kóz i makaków rezusów. Duży model zwierzęcy odgrywa ważną rolę w badaniach translacyjnych.
W wielu przypadkach obiecujące efekty terapeutyczne w małych modelach zwierzęcych nie znalazły przełożenia na pacjentów. W niniejszej pracy przedstawiono protokół wideo FVEP, PERG i OCT u kóz i makaków rezusów. Ta metoda in vivo może być stosowana w większym modelu różnych nerwic nerwu wzrokowego, takich jak jaskra, neuropatia niedokrwienna lub urazowa nerwu wzrokowego oraz zapalenie nerwu wzrokowego.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia szereg testów in vivo, w tym błyskowy potencjał wywołany wzrokowo, elektroretinogram wzorcowy oraz optyczną koherentną tomografię u kóz i makaków rhesus. Celem badań jest analiza struktury i funkcji nerwu wzrokowego oraz jego neuronów, co pozwala na lepsze zrozumienie przekazywania sygnałów wzrokowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Elektrofizjologia
- Oftalmologia
Wstęp
- Badanie koncentruje się na funkcji komórek zwojowych oreksyny w przekazywaniu sygnałów wzrokowych.
- Większe modele zwierzęce są kluczowe dla przeniesienia metod leczenia z systemów robotycznych do zastosowań praktycznych.
- Zrozumienie funkcji nerwu wzrokowego może pogłębić wiedzę na temat zaburzeń widzenia.
- Metody in vivo są niezbędne do oceny struktur i funkcji neuronalnych.
Cel badania
- Ocena metod badania reakcji nerwu wzrokowego na bodźce wzrokowe.
- Zwiększenie powtarzalności eksperymentów z wykorzystaniem modeli większych zwierząt.
- Zrozumienie biomechaniki neuropatii wzrokowej oraz jej potencjalnych metod leczenia.
Zastosowane Metody
- Przeprowadzono testy in vivo, w tym błyskowe potencjały wywołane wzrokowo (FVEP), elektroretinogramy wzorowe (PERG) oraz optyczną koherentną tomografię (OCT).
- Modele biologiczne stanowiły kozy oraz makaki rezus.
- Każda metoda obejmowała specyficzne kroki przygotowawcze, takie jak zarządzanie znieczuleniem, przygotowanie chirurgiczne oraz monitorowanie elektryczne.
- Kluczowe etapy obejmowały zapewnienie odpowiedniej impedancji elektrod oraz przestrzeganie rygorystycznych protokołów gromadzenia danych.
Główne wyniki
- W badaniu szczegółowo opisano rejestrację odpowiedzi FVEP i PERG w celu oceny przetwarzania sygnałów wzrokowych w nerwie wzrokowym.
- Wyniki wskazały na obecność specyficznych pików (P1 i N1) w przebiegach fal, które korelowały z bodźcami wzrokowymi.
- W ramach badań przedstawiono metodologie pozwalające na utrzymanie jakości i wiarygodności danych podczas rejestracji.
- Podkreślono wnioski dotyczące odpowiedzi neuronalnych oraz potencjalne implikacje dla metod leczenia.
Wnioski
- Niniejsze badanie przedstawia skuteczne metody oceny funkcji nerwu wzrokowego z wykorzystaniem testów in vivo.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia przekazywania sygnałów wzrokowych oraz implikacji dla leczenia uszkodzeń nerwu wzrokowego.
- Otrzymane rezultaty podkreślają znaczenie modeli dużych zwierząt w przekładaniu podstawowych badań z zakresu neuronauki na zastosowania kliniczne.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ocena funkcji komórek zwojowych siatkówki i nerwu wzrokowego u dużych zwierząt stanowi pomost między wynikami przedklinicznymi a translacją kliniczną u ludzi, dostarczając modeli istotnych pod względem anatomicznym i fizjologicznym. Metody elektrofizjologiczne i obrazowe in vivo umożliwiają ilościową ocenę integralności szlaków wzrokowych, co wspiera mechanistyczną weryfikację bezpieczeństwa i skuteczności terapii neuroprotekcyjnych oraz regeneracyjnych. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów terapeutycznych dla neuropatii nerwu wzrokowego, takich jak jaskra, urazy mechaniczne oraz zaburzenia zapalne.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych dotyczących przeżycia komórek zwojowych siatkówki oraz przewodnictwa aksonalnego w systemach istotnych dla przebiegu choroby.
- Wartość operacyjna: Dostarcza funkcjonalnych i strukturalnych odczytów, które wyjaśniają stopień aktywacji szlaków oraz aktywność biologiczną nowych związków.
- Wartość prognostyczna: Wspiera identyfikację związków wiodących poprzez korelację modulacji celu z wynikami elektrofizjologicznymi i strukturalnymi w modelach na dużych zwierzętach.
Przesiewy i opracowanie testów
- Wartość naukowa: Umożliwia uzyskiwanie ilościowych, powtarzalnych pomiarów potencjałów wywołanych wzrokiem oraz grubości siatkówki w celu standaryzacji testów.
- Wartość operacyjna: Ustanawia odtwarzalne protokoły dla podłużnego monitorowania efektów leczenia w kohortach badawczych.
- Skalowalność: Ułatwia ponowne wykorzystanie platformy u różnych gatunków (koza, makak rhesus) oraz w różnych modelach uszkodzeń (niedokrwiennych, urazowych, zapalnych).
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Pomiar strukturalnych zmian istotnych dla przebiegu choroby (grubość kompleksu GCC) oraz deficytów funkcjonalnych (amplitudy VEP, PERG) spójnych z punktami końcowymi badania klinicznego.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ciągłość od etapu odkrywania do walidacji przedklinicznej poprzez monitorowanie tych samych parametrów w różnych systemach modelowych.
- Minimalizacja ryzyka: Wspiera podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez wykazanie zaangażowania celu i efektu biologicznego u gatunków istotnych translacyjnie.
Integracja potoku i przepływu pracy
Opisane metody wpisują się w proces badawczy obejmujący etapy od walidacji celu, przez optymalizację wiodących związków, aż po przedkliniczne testy skuteczności, dostarczając funkcjonalnych i strukturalnych biomarkerów stanu zdrowia nerwu wzrokowego.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez dotyczących mechanizmów neuroprotekcyjnych poprzez ilościowe określanie funkcji komórek zwojowych siatkówki oraz integralności aksonów.
- Przesiewanie: Dostarcza ustandaryzowanych wyników gotowych do analizy (amplitudy przebiegów falowych, latencje, grubość warstw siatkówki) w celu oceny związków.
- Analityka: Umożliwia statystyczne porównanie efektów leczenia za pomocą pomiarów szczytów P1/N1 oraz ilościowego określania kompleksu GCC.
- Badania translacyjne: Łączy dane z funkcjonalnej elektrofizjologii i strukturalnej OCT z klinicznymi wynikami wzrokowymi w przypadku ludzkich neuropatii nerwu wzrokowego.
- Zastosowania w przedsiębiorstwie: Tworzy międzygatunkową i między-modelową platformę do iteracyjnego testowania terapeutyków chroniących wzrok.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną poprzez powiązanie modulacji celu z mierzalną funkcją i strukturą dróg wzrokowych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki standaryzowanemu rozmieszczeniu elektrod, kontroli impedancji oraz protokołom uśredniania sygnału.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową, umożliwiając wczesne wykrycie nieefektywnych kandydatów przed kosztownymi badaniami klinicznymi.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko dzięki obiektywnym, translacyjnym biomarkerom zachowania nerwu wzrokowego.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymaga doświadczenia w zakresie elektrofizjologii, preparacji chirurgicznej oraz prowadzenia znieczulenia u dużych zwierząt.
- Zależne od systemów rejestracji elektrofizjologicznej, platform obrazowania OCT oraz urządzeń do podawania bodźców.
- Wymaga standaryzacji impedancji elektrod (<10 kΩ), oceny poziomu szumów bazowych oraz uśredniania sygnału w trzech powtórzeniach.
- Uwzględnia konieczność adaptacji do specyfiki anatomicznej danego gatunku (parametry czaszki i oka kozy w porównaniu z makakiem rhesus).
- Ograniczone przez złożoność procedur oraz wymogi dotyczące dobrostanu zwierząt, co może wpływać na wydajność i skalowalność badań.
