Analiza stresu oksydacyjnego w organoidach jelitowych myszy przy użyciu reaktywnej sondy fluorogenicznej wrażliwej na gatunki tlenu

Metoda ta jest cennym narzędziem w dziedzinie biologii komórkowej do oceny komórkowych poziomów ROS w żywych komórkach pierwotnych hodowanych in vitro jako organoidy przy użyciu sondy fluorogenicznej. Główną zaletą tej techniki jest to, że ROS można jakościowo uwidocznić w nienaruszonych organoidach jelitowych za pomocą mikroskopii i analizować ilościowo w zdysocjowanych komórkach za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu 96-dołkowych płytek. Metodę tę można zastosować do innych modeli organoidów, a alternatywne czujniki fluorescencyjne mogą być używane do analizy różnych szlaków komórkowych.

Przed zastosowaniem tego protokołu po raz pierwszy eksperymentator powinien zapoznać się z hodowlą organoidów i pasażowaniem. Chociaż nasz protokół jest dobrze dostosowany do podejść przesiewowych, początkujący powinni zacząć od kilku próbek. Procedurę zademonstruje Sophie Dulauroy, inżynier z laboratorium.

Po złożeniu w ofierze 8-10-tygodniowej myszy Lgr5-GFP, zbierz od pięciu do ośmiu centymetrów jelita czczego obejmującego obszar między dwunastnicą a jelitem krętym i umieść go w zimnym DPBS uzupełnionym antybiotykami na lodzie. Następnie oczyść treść jelitową, przepłukując ją od pięciu do 10 mililitrami zimnego DPBS zawierającego antybiotyki. Następnie za pomocą nożyczek z końcówką kulkową otwórz jelito wzdłużnie i za pomocą kleszczy przenieś tkankę na szalkę Petriego zawierającą zimny DPBS z antybiotykami.

Wstrząśnij chusteczką wewnątrz naczynia, aby ją wypłukać. Następnie chwyć jelito przez aspirację za pomocą plastikowej pipety Pasteura i przenieś je do 15-mililitrowej probówki zawierającej 10 mililitrów zimnego 10-milimolowego EDTA. Odwróć probówkę trzy razy i inkubuj ją na lodzie przez 10 minut.

Po inkubacji przenieś tkankę do probówki zawierającej 10 mililitrów DPBS i wiruj przez dwie minuty. Natychmiast dodaj 10 mikrolitrów frakcji na szalce Petriego i użyj mikroskopu, aby ocenić jakość frakcji. Po dwóch transferach w probówkach zawierających DPBS z dwuminutowym wirowaniem między każdym transferem, inkubować jelito w EDTA na lodzie przez pięć minut, jak wykazano wcześniej.

Po trzech kolejnych transferach w probówkach zawierających DPBS z trzyminutowym wirowaniem między każdym transferem, połącz najlepsze frakcje w probówkę o pojemności 50 mililitrów, trzykrotnie odwracając wybrane probówki i filtrując przez sitko o wielkości komórek 70 mikronów. Następnie obróć krypty, odrzuć supernatant i mechanicznie rozbij osad przed dodaniem pięciu mililitrów zimnego DMEM F12. Policz liczbę krypt obecnych w podwielokrotności 10 mikrolitrów ręcznie pod mikroskopem.

Po zliczeniu ponownie zakręć kryptami i ostrożnie usuń supernatant. Następnie mechanicznie rozbić osad i dodać pożywkę do hodowli wzrostu do probówki, aby uzyskać stężenie 90 krypt na mikrolitr. Następnie dodać dwie objętości nierozcieńczonej matrycy membrany podstawnej lub BMM, aby uzyskać końcowe stężenie 30 krypt na mikrolitr i ostrożnie pipetować zawiesinę w górę iw dół, nie wprowadzając pęcherzyków powietrza do mieszanki.

Do analizy cytometrii przepływowej płytkę 10 mikrolitrów krypt BMM wymieszać jako kopułę w środku każdej studzienki wstępnie podgrzanej 96-dołkowej płytki z okrągłym dnem. A do obrazowania umieść 10 mikrolitrów mieszanki jako cienką warstwę we wstępnie podgrzanej komorze ośmiodołkowej z mikroszkiełkiem. Po pozostawieniu BMM do zestalenia się w temperaturze pokojowej przez pięć minut, umieść płytki w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.

Po 15 minutach dodaj 250 mikrolitrów pożywki wzrostowej do każdej studzienki, uważając, aby nie odłączyć BMM, i umieść płytkę w inkubatorze. Aby zobrazować stres oksydacyjny za pomocą mikroskopii konfokalnej, dodaj jeden mikrolitr roztworu podstawowego n-acetylocysteiny do odpowiednich dołków ośmiodołkowej komory mikroszkiełkowej pokrytej organoidami. Po godzinnej inkubacji dodać jeden mikrolitr roztworu podstawowego wodoronadtlenku tert-butylu do odpowiednich studzienek i inkubować przez kolejne 30 minut.

Następnie dodaj jeden mikrolitr 1,25 milimolowego rozcieńczenia sondy fluorogenicznej na studzienkę, a następnie jeden mikrolitr 1,25 miligrama na mililitr roztworu Hoechsta. Po kolejnej 30-minutowej inkubacji usuń pożywkę bez naruszania BMM i delikatnie dodaj 250 mikrolitrów ciepłego DMEM bez czerwieni fenolowej. Zobrazuj organoidy za pomocą mikroskopu konfokalnego wyposażonego w komorę termiczną i dopływ gazu, który wykrywa sondę fluorogenną.

Korzystając z kontroli dodatniej, ustaw intensywność lasera i czas ekspozycji na sygnał ROS i sprawdź, czy ten sygnał jest niższy w kontroli ujemnej. Następnie, za pomocą okularu, przesiewaj szkiełko, aby zidentyfikować organoidy wyrażające GFP i dostosować intensywność lasera. Ustaw stos z 25 mikrometrów i zdefiniuj pozycje, aby uzyskać zszyty obraz całego organoidu, aby uzyskać sekcję organoidów pokazującą jedną warstwę komórek.

Dodać jeden mikrolitr roztworu podstawowego n-acetylocysteiny do studzienek kontroli ujemnej 96-dołkowej okrągłej płytki dennej zawierającej organoidy. Po godzinnej inkubacji dodać jeden mikrolitr roztworu podstawowego wodoronadtlenku tert-butylu do odpowiednich studzienek i inkubować przez 30 minut. Następnie za pomocą pipety wielokanałowej usuń pożywkę, nie naruszając dołączonego BMM i przenieś ją na inną 96-dołkową okrągłą płytkę dolną.

Odłóż ten talerz na bok. Następnie dodaj 100 mikrolitrów trypsyny i za pomocą pipety wielokanałowej pipetuj pięć razy w górę iw dół, aby zniszczyć BMM. Po krótkiej, pięciominutowej inkubacji należy oddzielić organoidy, pipetując w górę i w dół po raz drugi.

Zakręć płytką i wyrzuć supernatant, odwracając płytkę. Dodaj pożywkę zebraną wcześniej na innej 96-dołkowej płytce z powrotem do odpowiednich dołków i ponownie zawieś komórki, pipetując w górę i w dół pięć razy. Następnie dodaj jeden mikrolitr sondy fluorogenicznej i inkubuj przez 30 minut.

Następnie ponownie odkręć płytkę i ponownie zawieś komórki za pomocą 250 mikrolitrów roztworu DAPI. Przenieść próbki w probówkach do cytometrii przepływowej i utrzymywać probówki na lodzie. Zoptymalizuj ustawienia napięcia rozproszenia do przodu i bocznego na niebarwionych napięciach kontrolnych i laserowych dla każdego fluoroforu przy użyciu próbek monobarwionych.

Następnie, stosując odpowiednią strategię bramkowania, zbierz minimum 20 000 zdarzeń. Reprezentatywne obrazy konfokalne barwienia ROS i organoidów wykazały, że w obecności inhibitora NAC widoczny jest tylko sygnał z martwych komórek zawartych w świetle organoidu. W organoidach niepoddanych działaniu substancji można zaobserwować podstawowe poziomy ROS, szczególnie w komórkach GFP-dodatnich, co dowodzi, że komórki macierzyste wytwarzają wyższe ROS niż komórki zróżnicowane.

Komórki GFP dodatnie prezentują bardziej znaczący sygnał cytoplazmatyczny z induktorem w obecności sondy fluorogenicznej, co pokazuje, że poziomy ROS wzrastają szczególnie w komórkach macierzystych po leczeniu. Analiza cytometrii przepływowej produkcji ROS w organoidach jelitowych pokazuje, że podstawowe poziomy ROS zmniejszają się po stymulacji inhibitorem i wzrastają po prowokacji induktorem. Komórki wstępnie potraktowane inhibitorem, a następnie stymulowane induktorem, wykazują niższe poziomy niż te stymulowane samym induktorem.

Podobna analiza na komórkach macierzystych bramkowanych jako GFP dodatnich wykazuje 3,5-krotny spadek poziomu ROS po leczeniu inhibitorem i czterokrotny wzrost po leczeniu induktorem w porównaniu z komórkami niestymulowanymi. Podejmując się tej procedury, użytkownicy powinni pamiętać o ograniczeniu stresu komórkowego podczas manipulacji organoidami i dysocjacji. Dodatkowo, podczas analizy ROS należy zawsze uwzględniać kontrole dodatnie i ujemne.

Po tej procedurze analizę można uzupełnić o barwienie immunofluorescencyjne na utrwalonych nienaruszonych organoidach, sortowanie komórek i analizę ekspresji genów, aby uzyskać dodatkowe informacje na temat regulacji ROS. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś wiedzieć, jak hodować mysie organoidy jelitowe, przeprowadzać analizę obrazową na żywo nienaruszonych organoidów i przetwarzać narządy jelitowe do analizy cytometrii przepływowej.