Name: Analiza stresu oksydacyjnego w organoidach jelitowych myszy przy użyciu reaktywnej sondy fluorogenicznej wrażliwej na gatunki tlenu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-17T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Poznaj metodę analizy stresu oksydacyjnego w jelitowych organoidach myszy przy użyciu fluorogenicznej sondy wrażliwej na gatunki tlenu. Technika umożliwia jakościową wizualizację mikroskopową i ilościową analizę cytometryczną poziomów ROS w żywych komórkach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Francuską Narodową Agencję Badawczą (ANR) grant 17-CE14-0022 (i-Stress).

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone po zatwierdzeniu przez Komitet Użytkowania Instytutu Pasteura i przez francuskie Ministerstwo Rolnictwa nr 2016-0022. Wszystkie etapy są wykonywane w kapturze do hodowli tkankowej.
1. Przygotowanie odczynników i materiałów do hodowli organoidów jelitowych
<ol>
	<li>Aby przygotować pożywkę do hodowli wzrostu, wymieszaj zaawansowany DMEM/F-12 uzupełniony 1x glutaminą, 1x roztworem penicyliny/streptomycyny (P/S), 10 mM HEPES, 50 ng/ml mysiego EGF, 20 μg/ml mysiego Noggin, 500 ng/ml mysiego R-Spondin1 (patrz Tabela materiałów). Pozostaw pożywkę w temperaturze pokojowej (RT) podczas ekstrakcji krypty. 
	UWAGA: Niewykorzystane podłoże zamrozić w porcjach w temperaturze -20 °C. Unikać zamrażania i rozmrażania.</li>
	<li>Napełnij probówkę o pojemności 50 ml 40 ml Advanced DMEM/F-12 i trzymaj ją na lodzie. 
	UWAGA: Niewykorzystane podłoże należy przechowywać w temperaturze 4 °C. Będzie używany do pasażowania organoidów.</li>
	<li>Płytki do hodowli komórkowych (komory 8-dołkowe μ-Slide i/lub 96-dołkowe okrągłe dno) w inkubatorze w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Rozmrozić podwielokrotności matrycy membrany podstawnej (BMM) (patrz tabela materiałów) na lodzie (przed rozpoczęciem protokołu lub co najmniej 1 godzinę przed poszyciem krypt). 
	UWAGA: BMM szybko zestala się, jeśli nie jest przechowywany w niskiej temperaturze.</li>
	<li>Przygotować roztwór do mycia/płukania, dodając 1% roztwór penicyliny i streptomycyny do DPBS (DPBS-P/S).</li>
	<li>Napełnij szalkę Petriego o średnicy 100 mm 10 ml zimnego DPBS-P/S. Napełnij sześć probówek o pojemności 15 ml 10 ml DPBS i oznacz je od F1 do F6.</li>
	<li>Przygotować 30 ml 10 mM roztworu EDTA przez rozcieńczenie z 0,5 M EDTA w DPBS. Napełnij dwie probówki o pojemności 15 ml 10 ml 10 ml EDTA i oznacz je jako E1 i E2.</li>
	<li>Wszystkie roztwory należy wstępnie schłodzić w temperaturze 4°C i przechowywać je na lodzie podczas zabiegu.</li>
</ol>
2. Hodowla organoidów jelitowych
<ol>
	<li>Poświęć 8-10 tygodniową mysz Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP) zgodnie z krajowymi przepisami i regulacjami.</li>
	<li>Zbierz 5-8 cm jelita czczego obejmującego obszar między dwunastnicą (5 cm od żołądka) a jelitem krętym (10 cm od jelita ślepego) i trzymaj w chłodnym DPBS-P/S na lodzie.</li>
	<li>Oczyść treść jelitową, przepłukując ją 5-10 ml zimnego DPBS-P/S. 
	UWAGA: Domowe strzykawki do płukania można uzyskać, podłączając końcówkę o pojemności 200 μl do dyszy strzykawki o pojemności 10 ml.</li>
	<li>Otworzyć jelito wzdłużnie za pomocą nożyczek z końcówką kulkową (patrz tabela materiałów) (aby zapobiec uszkodzeniu tkanki).</li>
	<li>Za pomocą kleszczy przenieś tkankę na szalkę Petriego zawierającą zimny DPBS-P/S w temperaturze pokojowej i wstrząśnij nią w celu spłukania.</li>
	<li>Za pomocą plastikowej pipety Pasteura chwyć jelito przez aspirację i przenieś je do 15 ml probówki oznaczonej E1 zawierającej 10 ml zimnego 10 mM EDTA.</li>
	<li>Odwróć probówkę 3 razy i inkubuj na lodzie przez 10 minut.</li>
	<li>Za pomocą plastikowej pipety Pasteura przenieś tkankę do probówki F1 zawierającej 10 ml DPBS. Wiruj przez 2 minuty (w normalnym wirze, trzymając rurkę w ręku i upewniając się, że jelito ładnie wiruje).</li>
	<li>Umieść 10 μl frakcji na szalce Petriego i oceń jakość frakcji pod mikroskopem. 
	UWAGA: Wszystkie etapy wirowania są wykonywane z maksymalną prędkością, a jakość każdej frakcji powinna być oceniana pod mikroskopem (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).</li>
	<li>Za pomocą plastikowej pipety Pasteura chwycić jelito przez aspirację i przenieść je do probówki F2 zawierającej 10 ml DPBS i wirować przez 2 minuty.</li>
	<li>Powtórzyć krok 2.10, przenosząc tkankę do probówki F3 zawierającej 10 ml DPBS i wirować przez 2 minuty.</li>
	<li>Powtórzyć inkubację EDTA, jak w kroku 2.6, przenosząc tkankę do probówki E2 zawierającej 10 mM EDTA.</li>
	<li>Odwróć probówkę 3 razy i inkubuj na lodzie przez 5 minut.</li>
	<li>Powtórzyć krok 2.10, przenosząc tkankę do probówki F4 zawierającej 10 ml DPBS i wirować przez 3 minuty.</li>
	<li>Powtórzyć krok 2.14, przenosząc tkankę do probówki F5 zawierającej 10 ml DPBS i wirować przez 3 minuty.</li>
	<li>Powtórzyć krok 2.15, przenosząc tkankę do probówki F6 zawierającej 10 ml DPBS i wirować przez 3 minuty.</li>
	<li>Połącz najlepsze frakcje filtrowane grawitacyjnie przez sitko o pojemności 70 μm z probówką o pojemności 50 ml (na lodzie), aby wyeliminować kosmki i znaczne zanieczyszczenia. 
	UWAGA: Zazwyczaj F5 i F6 to frakcje zawierające liczne krypty i mniej gruzu.</li>
	<li>Wirować krypty w temperaturze 150 x g w temperaturze 4 °C przez 3 minuty.</li>
	<li>Opróżnij probówkę, rozbij osad mechanicznie i dodaj 5 ml zimnego DMEM/F12.</li>
	<li>Umieścić 10 μl zawiesiny na szalce Petriego i ręcznie pod mikroskopem policzyć liczbę krypt obecnych w podwielokrotności. 
	UWAGA: Nie licz pojedynczych komórek ani małych zanieczyszczeń.</li>
	<li>Oblicz wymaganą objętość (V) zawiesiny krypt w μl, biorąc pod uwagę, że 300 krypt jest platerowanych na jeden dołek, W to liczba dołków, a N to liczba krypt liczonych z 10 μl zawiesiny. Przenieś krypty do nowej probówki o pojemności 15 ml. 
	UWAGA: V = 300 x W x 10/N. Jeśli w planowanym eksperymencie zostanie użyta mała objętość, można użyć probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Wirować krypty w temperaturze 200 x g w temperaturze 4 °C przez 3 minuty.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć supernatant za pomocą pipety.</li>
	<li>Mechanicznie rozdrobnić osad i delikatnie dodać pożywkę do hodowli wzrostu, aby uzyskać stężenie 90 krypt/μl.</li>
	<li>Dodać 2 objętości nierozcieńczonego BMM, aby uzyskać końcowe stężenie 30 krypt/μl. Ostrożnie pipetować w górę i w dół, nie wprowadzając pęcherzyków powietrza do mieszanki. 
	UWAGA: Zawsze trzymaj rurkę na lodzie, aby uniknąć zestalenia BMM.</li>
	<li>Płytka 10 μl krypt/BMM wymieszać z każdą studzienką. Do analizy cytometrii przepływowej należy używać okrągłodennych 96-dołkowych płytek. Rozprowadź 10 μl na środku każdej studzienki jako kopułę. Do obrazowania należy użyć μ-szkiełka 8 (patrz Tabela materiałów) i umieścić 10 μl jako cienką warstwę. 
	UWAGA: Ułóż organoidy jako cienką warstwę do testu obrazowania, aby umożliwić ich dogłębne obrazowanie.</li>
	<li>Pozostaw płytkę na 5 minut w temperaturze pokojowej, aby BMM zestalił się. Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 na 15 minut.</li>
	<li>Dodaj 250 μl pożywki wzrostowej do każdej studzienki, uważając, aby nie odłączyć BMM.</li>
	<li>Umieścić płytki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Wykonaj analizę ROS między 4 a 6 dniem hodowli. W przeciwnym razie zmień podłoże i podziel organoidy po pojawieniu się kilku długich pączkujących struktur oraz gdy martwe komórki gromadzą się w światłach organoidów.</li>
</ol>
3. Organoidy pasażujące
<ol>
	<li>Rozpocznij pasażowanie organoidów jelita cienkiego od 6dnia hodowli, kiedy uformowały się znaczące struktury pączkujące, a światła organoidów stały się ciemne. 
	UWAGA: Światło organoidu ciemnieje z powodu nagromadzenia martwych komórek, zanieczyszczeń i śluzu. Nie pozwól, aby organoidy przerosły przed podziałem. Współczynnik podziału zależy od wzrostu organoidów. Zaleca się pasażowanie organoidów w stosunku 1:2 w 6. dniu i 1:3 w 10. dniu.</li>
	<li>Napełnij probówkę o pojemności 15 ml 4 ml zimnego Advanced DMEM/F-12 i trzymaj ją na lodzie. 
	UWAGA: Tutaj podane są objętości dla 96-dołkowej płytki hodowlanej. Jeśli używany jest inny format, dostosuj odpowiednio głośność.</li>
	<li>Ostrożnie odessać pożywkę za pomocą pipety lub pompy próżniowej ze studzienek, nie dotykając kopuł BMM, i wyrzucić ją.</li>
	<li>Dodać 100 μl zimnego Advanced DMEM/F-12 do dołka. Pipetować w górę i w dół, aby rozbić BMM i przenieść zawartość studzienki do probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Umyj studzienkę 200 μl zimnego Advanced DMEM/F-12 i zbierz ją do tej samej probówki. 
	UWAGA: W przypadku przechodzenia przez wiele studzienek z tych samych warunków eksperymentalnych, zawartość studzienek można zebrać w tej samej probówce zbiorczej o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Wirować probówkę zbiorczą o pojemności 15 ml przy 100 x g przez 5 minut w temperaturze 4°C.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i dodać 1 ml zimnego Advanced DMEM/F-12 do osadu. Używając końcówki P1000, weź końcówkę P10 (bez filtra) i pipetuj w górę i w dół co najmniej 20 razy.</li>
	<li>Dodać 4 ml zimnego Advanced DMEM/F-12 do probówki. Wirować z prędkością 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4°C.</li>
	<li>Odessać supernatant za pomocą pipety lub pompy próżniowej, nie naruszając osadu. Następnie rozerwij granulkę mechanicznie.</li>
	<li>Dodać BMM rozcieńczony w pożywce do hodowli wzrostu (stosunek 2:1). Ostrożnie pipetować w górę i w dół, nie wprowadzając pęcherzyków powietrza do mieszanki.</li>
	<li>Płytka 10 μl krypt/BMM wymieszać z każdą studzienką.</li>
	<li>Trzymaj płytkę przez 5 minut w temperaturze pokojowej, aby BMM zastygł. Umieścić płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 na 15 minut.</li>
	<li>Dodać 250 μl pożywki wzrostowej do każdej studzienki. 
	UWAGA: Uważaj, aby nie odczepić BMM.</li>
	<li>Umieścić płytki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
</ol>
4. Przygotowanie odczynników i materiałów do oceny stresu oksydacyjnego w organoidach jelitowych
<ol>
	<li>Przygotować 250 mM roztwór podstawowy inhibitora N-acetylocysteiny (NAC) (patrz tabela materiałów), ponownie zawiesić 10 mg z 245 μl DPBS. Stosować w stężeniu końcowym 1 mM.</li>
	<li>Przygotować 50 mM roztwór podstawowy induktora wodoronadtlenku tert-butylu (tBHP), 70% w wodzie, rozcieńczyć 3,22 μl z 496,8 μl DPBS. Stosować w stężeniu końcowym 200 μM.</li>
	<li>Do badania cytometrii przepływowej należy przygotować roztwór roboczy o stężeniu 250 μM z sondy fluorogenicznej (patrz tabela materiałów), rozcieńczając roztwór podstawowy w stosunku 1:10 w DMSO. Stosować przy stężeniu końcowym 1 μM. 
	UWAGA: Jak wskazano w instrukcjach producenta, sonda fluorogeniczna jest wrażliwa na światło i tlen. Akcje i podwielokrotności nie powinny być otwierane i zamykane zbyt wiele razy.</li>
	<li>Do badania obrazowego należy przygotować roztwór roboczy sondy fluorogenicznej o stężeniu 1,25 mM, rozcieńczając roztwór podstawowy w stosunku 1/2 w DMSO. Stosować w stężeniu końcowym 5 μM.</li>
	<li>Przygotować końcowy roztwór 0,1 μg/ml DAPI w DPBS, który ma być użyty do dyskryminacji martwych komórek w teście cytometrii przepływowej.</li>
	<li>Rozcieńczyć Hoechst 33342 do 1,25 mg/ml w DPBS. Stosować w końcowym stężeniu 5 μg/ml do stosowania do barwienia jądrowego w teście obrazowania.</li>
	<li>Ciepły DMEM bez czerwieni fenolowej w temperaturze 37 °C. 
	UWAGA: Kroki te opisują stosowanie kontroli ujemnych i pozytywnych, które muszą być uwzględnione we wszelkich testach, przy użyciu warunków wskazanych w <silna klasa="xfig">Rysunek 2A. Test może być stosowany do badania związków przeciw- lub prooksydacyjnych. Kroki są takie same, a jedyna różnica polega na tym, że związki są dodawane przed użyciem barwnika fluorogenicznego.</li>
</ol>
5. Wizualizacja stresu oksydacyjnego w organoidach 3D za pomocą mikroskopii konfokalnej
<ol>
	<li>Pobrać organoidy posiane w 8 studzienkach μ-Slide i dodać 1 μl roztworu podstawowego NAC do odpowiednich studzienek, aby uzyskać końcowe stężenie 1 mM.</li>
	<li>Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Dodać 1 μl roztworu podstawowego tBHP do odpowiednich studzienek, aby uzyskać końcowe stężenie 200 μM.</li>
	<li>Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Dodać 1 μl na studzienkę z rozcieńczenia 1,25 mM sondy fluorogenicznej, aby uzyskać końcowe stężenie 5 μM.</li>
	<li>Dodać 1 μl na studzienkę rozcieńczenia 1,25 mg/ml Hoeschta, aby uzyskać końcowe stężenie 5 μg/ml.</li>
	<li>Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Usuń podłoże, nie naruszając BMM. Delikatnie dodaj 250 μl ciepłego DMEM bez czerwieni fenolowej. 
	UWAGA: Jeśli planowane jest długoterminowe przejęcie, dodaj do DMEM związki czynników wzrostu bez czerwieni fenolowej.</li>
	<li>Zobrazuj organoidy za pomocą mikroskopu konfokalnego wyposażonego w komorę termiczną i dopływ gazu, który wykrywa sondę fluorogeniczną (ROS). 
	UWAGA: Wzbudzenie/emisja (ex/em) dla sondy fluorogenicznej wynosi 644/665, ex/em dla Hoechst (jądra) wynosi 361/486, a ex/em dla GFP (jelitowa komórka macierzysta od myszy Lgr5-GFP) wynosi 488/510. Obiektyw z 63-krotnym zanurzeniem w oleju służy do wykrywania sygnałów w komórkach macierzystych. Nie zmieniaj ustawień lasera między próbkami. Obiektyw 20x może być użyty, aby umożliwić przegląd produkcji ROS.</li>
	<li>Użyj kontroli dodatniej, aby ustawić intensywność lasera i czas ekspozycji na sygnał ROS i sprawdź, czy ten sygnał jest niższy w kontroli ujemnej.</li>
	<li>Korzystanie z ekranu okularu szkiełka do identyfikacji organoidów GFP wyrażających i regulacji intensywności lasera. 
	UWAGA: Ten krok jest wykonywany ręcznie.</li>
	<li>Zdefiniuj pozycje, aby uzyskać zszyty obraz całego organoidu. Ustaw stos z 25 μm (rozmiar kroku 5 μm), aby uzyskać sekcję organoidów pokazującą jedną warstwę komórek. 
	UWAGA: Zapoznaj się z instrukcją obsługi mikroskopu, aby zoptymalizować konfigurację. Korzystając z żywych komórek, akwizycję należy przeprowadzić w ciągu 1 godziny po zakończeniu inkubacji.</li>
	<li>Otwórz obrazy w oprogramowaniu do przetwarzania obrazów o otwartym kodzie źródłowym (patrz Spis materiałów).</li>
	<li>Przejdź przez z-stack i wybierz sekcję, w której środek organoidów jest dobrze reprezentowany i utwórz nowy obraz z wybranym obszarem.</li>
	<li>Określ ilościowo obrazy zgodnie z krokami 5.15.1 - 5.15.5.
	<ol>
		<li>Wybierz narzędzie Linia odręczna.</li>
		<li>Narysuj linię wzdłuż jąder. 
		UWAGA: Wybierz tylko regiony prezentujące komórki GFP-dodatnie, jeśli analizowane są tylko komórki macierzyste.</li>
		<li>Zwiększ szerokość linii, aby pokryć warstwę komórki linią bez uwzględniania resztek świetlnych.</li>
		<li>Wybierz kanał dla sygnału ROS i zmierz intensywność fluorescencji w wybranym regionie i dodaj adnotacje do wartości.</li>
		<li>Narysuj linię w miejscu, w którym nie ma sygnału i zmierz natężenie fluorescencji tła, które zostanie odjęte od poprzedniej wartości, aby uzyskać ostateczną intensywność.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Kwantyfikacja stresu oksydacyjnego na zdysocjowanych organoidach za pomocą cytometru przepływowego
<ol>
	<li>Dodać 1 μl roztworu podstawowego NAC do studzienek w celu kontroli ujemnej, aby uzyskać końcowe stężenie 1 mM. 
	UWAGA: Użyć organoidów posianych w 96-dołkowych płytkach z okrągłym dnem.</li>
	<li>Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Dodać 1 μl roztworu podstawowego tBHP do odpowiednich studzienek, aby uzyskać końcowe stężenie 200 μM.</li>
	<li>Inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Za pomocą pipety wielokanałowej usuń pożywkę, nie naruszając dołączonego BMM i przenieś ją na inną 96-dołkową okrągłą płytkę denną. Odłóż ten talerz na bok.</li>
	<li>Dodaj 100 μl trypsyny i za pomocą pipety wielokanałowej pipetuj w górę i w dół co najmniej pięć razy, aby zniszczyć BMM.</li>
	<li>Inkubować nie dłużej niż 5 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Za pomocą pipety wielokanałowej pipetę należy pipetować w górę i w dół co najmniej pięć razy, aby oddzielić organoidy.</li>
	<li>Wirować z prędkością 300 x g przez 5 minut przy RT.</li>
	<li>Odrzucić supernatant przez odwrócenie płytki. Dodać z powrotem pożywkę zebraną w kroku 6.3 do odpowiednich studzienek i ponownie zawiesić komórki, pipetując w górę i w dół 5 razy.</li>
	<li>Dodać sondę fluorogeniczną o końcowym stężeniu 1 μM. Dodać 1 μl do studzienki z rozcieńczenia 250 μM i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2, 
	UWAGA: Nie dodawaj sondy fluorogenicznej do dołków potrzebnych do ustawień przyrządu (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 2B).</li>
	<li>Wirować z prędkością 300 x g przez 5 minut przy RT.</li>
	<li>Zawiesić komórki w 250 μl 0,1 μg/ml roztworu DAPI. Przenieś próbki do odpowiednich probówek do cytometrii przepływowej, trzymaj probówki na lodzie i kontynuuj analizę. 
	UWAGA: Dodaj PBS zamiast DAPI do studzienek potrzebnych do ustawień instrumentu (Rysunek 2B).</li>
	<li>Zoptymalizuj ustawienia napięcia rozproszenia przedniego i bocznego na niebarwionych napięciach kontrolnych i laserowych dla każdego fluoroforu przy użyciu monobarwionych próbek.</li>
	<li>Stosując odpowiednią strategię bramkowania (Rysunek 4A), zbierz co najmniej 20 000 zdarzeń. 
	UWAGA: Preferowanych jest 50 000 wydarzeń. Szczegółowe ustawienia akwizycji różnią się w zależności od używanego instrumentu.</li>
</ol>

<ol><li>Aviello, G., Knaus, U. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NADPH+oxidases+and+ROS+signaling+in+the+gastrointestinal+tract+review-article%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">NADPH oxidases and ROS signaling in the gastrointestinal tract review-article.</a> Mucosal Immunology. 11 (4), 1011-1023 (2018).</li>
<li>Holmström, K. M., Finkel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+mechanisms+and+physiological+consequences+of+redox-dependent+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular mechanisms and physiological consequences of redox-dependent signalling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (6), 411-421 (2014).</li>
<li>vander Post, S., Birchenough, G. M. H., Held, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NOX1-dependent+redox+signaling+potentiates+colonic+stem+cell+proliferation+to+adapt+to+the+intestinal+microbiota+by+linking+EGFR+and+TLR+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">NOX1-dependent redox signaling potentiates colonic stem cell proliferation to adapt to the intestinal microbiota by linking EGFR and TLR activation.</a> Cell Reports. 35 (1), 108949(2021).</li>
<li>Schieber, M., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROS+function+in+redox+signaling+and+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">ROS function in redox signaling and oxidative stress.</a> Current Biology. 24 (10), 453-462 (2014).</li>
<li>Myant, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROS+production+and+NF-%CE%BAB+activation+triggered+by+RAC1+facilitate+WNT-driven+intestinal+stem+cell+proliferation+and+colorectal+cancer+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">ROS production and NF-κB activation triggered by RAC1 facilitate WNT-driven intestinal stem cell proliferation and colorectal cancer initiation.</a> Cell Stem Cell. 12 (6), 761-773 (2013).</li>
<li>Juhasz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NADPH+oxidase+1+supports+proliferation+of+colon+cancer+cells+by+modulating+reactive+oxygen+species-dependent+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">NADPH oxidase 1 supports proliferation of colon cancer cells by modulating reactive oxygen species-dependent signal transduction.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (19), 7866-7887 (2017).</li>
<li>Aviello, G., Knaus, U. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROS+in+gastrointestinal+inflammation%3A+Rescue+Or+Sabotage%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">ROS in gastrointestinal inflammation: Rescue Or Sabotage.</a> British Journal of Pharmacology. 174 (12), 1704-1718 (2017).</li>
<li>Gomes, A., Fernandes, E., Lima, J. L. F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+probes+used+for+detection+of+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemical+and+Biophysical+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species.</a> Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 65 (2-3), 45-80 (2005).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Levy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+receptor+NOD2+mediates+LGR5%2B+intestinal+stem+cell+protection+against+ROS+cytotoxicity+via+mitophagy+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Innate immune receptor NOD2 mediates LGR5+ intestinal stem cell protection against ROS cytotoxicity via mitophagy stimulation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (4), 1994-2003 (2020).</li>
<li>Choi, H., Yang, Z., Weisshaar, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell%2C+real-time+detection+of+oxidative+stress+induced+in+escherichia+coli+by+the+antimicrobial+peptide+CM15%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Single-cell, real-time detection of oxidative stress induced in escherichia coli by the antimicrobial peptide CM15.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 303-310 (2015).</li>
<li>Amri, F., Ghouili, I., Amri, M., Carrier, A., Masmoudi-Kouki, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroglobin+protects+astroglial+cells+from+hydrogen+peroxide-induced+oxidative+stress+and+apoptotic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Neuroglobin protects astroglial cells from hydrogen peroxide-induced oxidative stress and apoptotic cell death.</a> Journal of Neurochemistry. 140 (1), 151-169 (2017).</li>
<li>Ahn, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-Photon+Fluorescence+Microscopy+Imaging+of+Cellular+Oxidative+Stress+Using+Profluorescent+Nitroxides%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Two-Photon Fluorescence Microscopy Imaging of Cellular Oxidative Stress Using Profluorescent Nitroxides.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (10), 4721-4730 (2012).</li>
<li>Bidaux, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+TRPM8+channel+isoform+controls+the+balance+between+keratinocyte+proliferation+and+differentiation+in+a+cold-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Epidermal TRPM8 channel isoform controls the balance between keratinocyte proliferation and differentiation in a cold-dependent manner.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (26), 3345-3354 (2015).</li>
<li>Van de Bittner, G. C., Dubikovskaya, E. A., Bertozzi, C. R., Chang, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+hydrogen+peroxide+production+in+a+murine+tumor+model+with+a+chemoselective+bioluminescent+reporter%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of hydrogen peroxide production in a murine tumor model with a chemoselective bioluminescent reporter.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (50), 21316(2010).</li>
<li>Rabbani, P. S., Abdou, S. A., Sultan, D. L., Kwong, J., Duckworth, A., Ceradini, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+reactive+oxygen+species+in+a+murine+wound+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of reactive oxygen species in a murine wound model.</a> Journal of Visualized Experiments. (141), e58450(2018).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Praca ta zapewnia krok po kroku protokół izolacji mysich krypt jelita czczego, hodowli ich w organoidy 3D i analizy ROS w organoidach poprzez połączenie czułej na ROS sondy fluorogenicznej z jakościowym obrazowaniem mikroskopowym całych organoidów i ilościowym pomiarem ROS za pomocą cytometrii przepływowej na pojedynczych komórkach po dysocjacji organoidów.
Pierwszym krytycznym krokiem w tej metodzie jest procedura ekstrakcji krypt. Rzeczywiście, jakość przygotowania krypt jest kluczem do udan...

Reaktywne formy tlenu (ROS) są naturalnymi produktami ubocznymi metabolizmu komórkowego. Mogą być również aktywnie wytwarzane przez wyspecjalizowane kompleksy enzymatyczne, takie jak oksydazy NADPH związane z błoną (NOX) i podwójne oksydazy (DUOX), które generują aniony ponadtlenkowe i nadtlenek wodoru1. Poprzez ekspresję enzymów antyoksydacyjnych i zmiataczy ROS, komórki mogą precyzyjnie dostroić swoją równowagę redoks, chroniąc w ten sposób homeostazę tkanek2. Chociaż ROS może być wysoce toksyczny dla komórek i uszkadzać DNA, białka i lipidy, są kluczowymi cząsteczkami sygnałowymi2. W nabłonku jelitowym do proliferacji komórek macierzystych i progenitorowych wymagane są umiarkowane poziomy ROS3; wysokie poziomy ROS prowadzą do ich apoptozy4. Przewlekły stres oksydacyjny jest związany z wieloma chorobami przewodu pokarmowego, takimi jak nieswoiste zapalenie jelit czy nowotwory. Na przykład, w mysim modelu raka jelita napędzanego przez Wnt, stwierdzono, że zwiększona produkcja ROS poprzez aktywację oksydaz NADPH jest wymagana do hiperproliferacji komórek rakowych5, 6. Określenie, w jaki sposób komórki jelitowe, w szczególności komórki macierzyste, komórki macierzyste radzą sobie ze stresem oksydacyjnym i jak środowisko komórkowe może wpływać na tę zdolność, jest niezbędne do lepszego zrozumienia etiologii tej choroby7.
W tkance różne typy komórek prezentują podstawowy stan utlenienia, który może się różnić w zależności od ich funkcji i metabolizmu oraz ekspresji różnych poziomów cząsteczek utleniających i przeciwutleniających4,7. Monitorowanie ROS in vivo jest bardzo trudne. Barwniki przepuszczalne dla komórek, które emitują fluorescencję zgodnie ze stanem redoks, zostały opracowane do wizualizacji i pomiaru komórkowych ROS w żywych komórkach i zwierzętach. Jednak ich skuteczność zależy od ich dyfuzji w żywych tkankach i ich szybkiego odczytu, co czyni je trudnymi do użycia w modelach zwierzęcych8.
W przeszłości badanie wpływu związków na generowanie ROS odbywało się przy użyciu linii komórkowych, ale może to nie odzwierciedlać sytuacji in vivo. Model organoidów jelitowych, opracowany przez grupę Clevers9, umożliwia wzrost pierwotnych komórek jelitowych ex vivo. Hodowla krypt jelitowych w matrycach, w obecności określonych czynników wzrostu, prowadzi do powstania trójwymiarowych struktur, zwanych organoidami (mini-jelitami), które odtwarzają organizację krypta-kosmki, z komórkami z różnych linii nabłonkowych wyściełającymi wewnętrzne światło, a jelitowe komórki macierzyste znajdują się w małych wypukłościach przypominających krypty.
Tutaj, korzystając z tego modelu, opisana jest prosta metoda badania stresu oksydacyjnego w pierwotnych komórkach jelitowych w rozdzielczości pojedynczej komórki, poprzez dodanie dostępnego na rynku barwnika wrażliwego na ROS do pożywki do hodowli organoidów.
Czytniki płyt są często używane do wykrywania produkcji ROS w całej populacji. Protokół ten wykorzystuje cytometrię przepływową lub test obrazowania do wykrywania ROS w określonym typie komórek z genetycznie zmodyfikowanymi komórkami lub specyficznym barwieniem przeciwciał. Praca ta obejmuje hodowlę organoidów jelitowych myszy i wizualizację ROS za pomocą obrazowania konfokalnego i kwantyfikację za pomocą cytometrii przepływowej. Korzystając z organoidów jelita cienkiego pochodzących od myszy Lgr5-GFP, możliwe jest specyficzne przeanalizowanie poziomu stresu oksydacyjnego w jelitowych komórkach macierzystych po różnych zabiegach. Protokół ten można dostosować do badania wpływu cząsteczek egzogennych, takich jak dipeptyd muramylowy (MDP) pochodzący z mikrobioty10, na równowagę ROS, po stymulacji organoidów wybranymi związkami.

<table><tbody><tr><td><silne>Myszy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP)</td><td>The Jackson Laboratory</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Growth culture podłoże</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM F12 (DMEM/F12)</td><td>Suplement ThermoFisher</td><td>12634010</td><td></td></tr><tr><td>B-27, bez witaminy A</td><td>ThermoFisher</td><td>12587010</td><td>Stężenie magazynowe: 50x</td></tr><tr><td>GlutaMAX (glutamina)</td><td>ThermoFisher</td><td>35050038</td><td>Stężenie magazynowe: 100x</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>ThermoFisher</td><td>15630056</td><td>Stężenie w magazynie: 1 M</td></tr><tr><td>Murine EGF</td><td>R& D</td><td>2028-EG-200</td><td>Stężenie zapasów: 500 &mikro; g/ml w</td></tr><tr><td>PBS mysi Noggin</td><td>R& D</td><td>1967-NG/CF</td><td>Stężenie zapasów: 100 &mikro; g/ml w PBS</td></tr><tr><td>Mysia R-spondyna1</td><td>R& D</td><td>3474-RS-050</td><td>Stężenie magazynu: 50 &mikro; g/ml w</td></tr><tr><td>suplemencie PBS N-2</td><td>ThermoFisher</td><td>17502048</td><td>Stężenie magazynowe: 100x</td></tr><tr><td>penicylina-streptomycyna (P/S)</td><td>ThermoFisher</td><td>15140122</td><td>Stężenie zapasowe: 100x (10 000 jednostek/ml penicyliny i 10 000 &mikro; g/ml streptomycyny)</td></tr><tr><td><silny>Materiał</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70 &mikro; m sitko komórkowe</td><td>Corning</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowe okrągłe dno</td><td>Nożyczki</td> z końcówką kulkową Corning <td>3799</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fine Science Tools GMBH</td><td>14086-09</td><td></td></tr><tr><td>CellROX&reg; Odczynnik Deep Red</td><td>ThermoFisher</td><td>C10422</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-diamidyno-2-ph&eacute; nyindol, dichlorhydrat) (sonda fluorgeniczna)</td><td>ThermoFisher</td><td>D1306</td><td>stock przy 10 mg/ml</td></tr><tr><td>DPBS 1x bez wapnia i magnezu (DPBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>FLuoroBrite DMEM (DMEM bez czerwieni fenolowej)</td><td>ThermoFisher</td><td>A1896701</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>ThermoFisher</td><td>H3570</td><td>w sile 10 mg/ml</td></tr><tr><td>Matrigel Growth Factor Reduction, Phenol Red Free (Basement Membrane Matrix)</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>po otrzymaniu rozmrozić o/n w lodówce, przechowywać przez 1 godzinę na lodzie i przygotować 500 ml porcji i przechowywać w temperaturze -20 stopni; C</td></tr><tr><td>&micro;-Slide 8 Studzienki</td><td>Ibidi</td><td>80826</td><td></td></tr><tr><td>N-acetylocysteina (NAC)</td><td>Sigma</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>roztwór wodoronadtlenku tert-butylu (tBCHP) (70% wag. W H2O2)</td><td>Sigma</td><td>458139</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme (1X), bez czerwieni fenolowej (trypsyna)</td><td>ThermoFisher</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0,5 M EDTA, pH8,0</td><td>ThermoFisher</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Sigma</td><td>Y0503</td><td>Inhibitor skał do stosowania w celu zminimalizowania śmierci komórki po dysocjacji tkanek</td></tr> <tr><td>Programy i sprzęt</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Attune NxT (Flow Cytometer)</td><td>ThermoFischer</td><td></td><td>Analizator cytometru przepływowego</td></tr><tr><td>Fiji/ImageJ</td><td>Generowanie</td><td>obrazów</td>https://imagej.net/software/fiji/downloads <td></td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td>Analiza FACS</td></tr><tr><td>Observer.Z1</td><td>System konfokalny</td><td>Zeiss</td><td></td></tr><tr><td>Opterra (konfokalny pole zamiatane)</td><td>System konfokalny</td> <td>Bruker</td><td></td></tr><tr><td>szybka kamera EMCCD Evolve Delta 512</td><td>Fotometryczny</td><td></td><td>system konfokalny</td></tr><tr><td>Prism</td><td>GraphPad Oprogramowanie</td><td></td><td>do analizy statystycznej</td></tr></tbody></table>

analiza stresu oksydacyjnego w organoidach jelitowych myszy przy użyciu reaktywnej sondy fluorogenicznej wrażliwej na gatunki tlenu

Analyzing Oxidative Stress in Murine Intestinal Organoids using Reactive Oxygen Species-Sensitive Fluorogenic Probe

Reaktywne formy tlenu (ROS) odgrywają istotną rolę w homeostazie jelit. ROS są naturalnymi produktami ubocznymi metabolizmu komórkowego. Są one wytwarzane w odpowiedzi na infekcję lub uraz na poziomie błony śluzowej, ponieważ biorą udział w reakcjach przeciwdrobnoustrojowych i gojeniu się ran. Są również krytycznymi wtórnymi posłańcami, regulującymi kilka szlaków, w tym wzrost i różnicowanie komórek. Z drugiej strony, nadmierny poziom ROS prowadzi do stresu oksydacyjnego, który może być szkodliwy dla komórek i sprzyjać chorobom jelit, takim jak przewlekłe stany zapalne lub rak. Praca ta zapewnia prostą metodę wykrywania ROS w jelitowych organoidach mysich za pomocą obrazowania na żywo i cytometrii przepływowej, przy użyciu dostępnej na rynku sondy fluorogenicznej. W tym miejscu protokół opisuje badanie wpływu związków, które modulują równowagę redoks w organoidach jelitowych i wykrywają poziomy ROS w określonych typach komórek jelitowych, czego przykładem jest analiza jelitowych komórek macierzystych genetycznie znakowanych GFP. Protokół ten może być używany z innymi sondami fluorescencyjnymi.

W ramach dowodu koncepcji opisanego protokołu, do charakterystyki komórek macierzystych jelita 10 wykorzystano krypty otrzymane z linii myszy Lgr5-eGFP-IRES-CreERT2, opracowanej przez Barkera i współpracowników, w której komórki macierzyste jelita wykazują mozaikową ekspresję GFP, co pozwoliło na zmapowanie tych komórek na podstawie ich ekspresji GFP. W ten sposób stworzono model umożliwiający porównanie poziomów ROS w konkretnej populacji typów komórkowych po różnych zabiegach. Aby zwizualizować ...

Obecny protokół opisuje metodę wykrywania reaktywnych form tlenu (ROS) w jelitowych organoidach mysich za pomocą obrazowania jakościowego i cytometrii ilościowej. Prace te mogą być potencjalnie rozszerzone na inne sondy fluorescencyjne w celu zbadania wpływu wybranych związków na ROS.

Analiza stresu oksydacyjnego w organoidach jelitowych myszy przy użyciu reaktywnej sondy fluorogenicznej wrażliwej na gatunki tlenu

Reactive oxygen species (ROS) play essential roles in intestinal homeostasis. ROS are natural by-products of cell metabolism. They are produced in ...

Metoda ta jest cennym narzędziem w dziedzinie biologii komórkowej do oceny komórkowych poziomów ROS w żywych komórkach pierwotnych hodowanych in vitro jako organoidy przy użyciu sondy fluorogenicznej. Główną zaletą tej techniki jest to, że ROS można jakościowo uwidocznić w nienaruszonych organoidach jelitowych za pomocą mikroskopii i analizować ilościowo w zdysocjowanych komórkach za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu 96-dołkowych płytek. Metodę tę można zastosować do innych modeli organoidów, a alternatywne czujniki fluorescencyjne mogą być używane do analizy różnych szlaków komórkowych.Przed zastosowaniem tego protokołu po raz pierwszy eksperymentator powinien zapoznać się z hodowlą organoidów i pasażowaniem. Chociaż nasz protokół jest dobrze dostosowany do podejść przesiewowych, początkujący powinni zacząć od kilku próbek. Procedurę zademonstruje Sophie Dulauroy, inżynier z laboratorium.Po złożeniu w ofierze 8-10-tygodniowej myszy Lgr5-GFP, zbierz od pięciu do ośmiu centymetrów jelita czczego obejmującego obszar między dwunastnicą a jelitem krętym i umieść go w zimnym DPBS uzupełnionym antybiotykami na lodzie. Następnie oczyść treść jelitową, przepłukując ją od pięciu do 10 mililitrami zimnego DPBS zawierającego antybiotyki. Następnie za pomocą nożyczek z końcówką kulkową otwórz jelito wzdłużnie i za pomocą kleszczy przenieś tkankę na szalkę Petriego zawierającą zimny DPBS z antybiotykami.Wstrząśnij chusteczką wewnątrz naczynia, aby ją wypłukać. Następnie chwyć jelito przez aspirację za pomocą plastikowej pipety Pasteura i przenieś je do 15-mililitrowej probówki zawierającej 10 mililitrów zimnego 10-milimolowego EDTA. Odwróć probówkę trzy razy i inkubuj ją na lodzie przez 10 minut.Po inkubacji przenieś tkankę do probówki zawierającej 10 mililitrów DPBS i wiruj przez dwie minuty. Natychmiast dodaj 10 mikrolitrów frakcji na szalce Petriego i użyj mikroskopu, aby ocenić jakość frakcji. Po dwóch transferach w probówkach zawierających DPBS z dwuminutowym wirowaniem między każdym transferem, inkubować jelito w EDTA na lodzie przez pięć minut, jak wykazano wcześniej.Po trzech kolejnych transferach w probówkach zawierających DPBS z trzyminutowym wirowaniem między każdym transferem, połącz najlepsze frakcje w probówkę o pojemności 50 mililitrów, trzykrotnie odwracając wybrane probówki i filtrując przez sitko o wielkości komórek 70 mikronów. Następnie obróć krypty, odrzuć supernatant i mechanicznie rozbij osad przed dodaniem pięciu mililitrów zimnego DMEM F12. Policz liczbę krypt obecnych w podwielokrotności 10 mikrolitrów ręcznie pod mikroskopem.Po zliczeniu ponownie zakręć kryptami i ostrożnie usuń supernatant. Następnie mechanicznie rozbić osad i dodać pożywkę do hodowli wzrostu do probówki, aby uzyskać stężenie 90 krypt na mikrolitr. Następnie dodać dwie objętości nierozcieńczonej matrycy membrany podstawnej lub BMM, aby uzyskać końcowe stężenie 30 krypt na mikrolitr i ostrożnie pipetować zawiesinę w górę iw dół, nie wprowadzając pęcherzyków powietrza do mieszanki.Do analizy cytometrii przepływowej płytkę 10 mikrolitrów krypt BMM wymieszać jako kopułę w środku każdej studzienki wstępnie podgrzanej 96-dołkowej płytki z okrągłym dnem. A do obrazowania umieść 10 mikrolitrów mieszanki jako cienką warstwę we wstępnie podgrzanej komorze ośmiodołkowej z mikroszkiełkiem. Po pozostawieniu BMM do zestalenia się w temperaturze pokojowej przez pięć minut, umieść płytki w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.Po 15 minutach dodaj 250 mikrolitrów pożywki wzrostowej do każdej studzienki, uważając, aby nie odłączyć BMM, i umieść płytkę w inkubatorze. Aby zobrazować stres oksydacyjny za pomocą mikroskopii konfokalnej, dodaj jeden mikrolitr roztworu podstawowego n-acetylocysteiny do odpowiednich dołków ośmiodołkowej komory mikroszkiełkowej pokrytej organoidami. Po godzinnej inkubacji dodać jeden mikrolitr roztworu podstawowego wodoronadtlenku tert-butylu do odpowiednich studzienek i inkubować przez kolejne 30 minut.Następnie dodaj jeden mikrolitr 1,25 milimolowego rozcieńczenia sondy fluorogenicznej na studzienkę, a następnie jeden mikrolitr 1,25 miligrama na mililitr roztworu Hoechsta. Po kolejnej 30-minutowej inkubacji usuń pożywkę bez naruszania BMM i delikatnie dodaj 250 mikrolitrów ciepłego DMEM bez czerwieni fenolowej. Zobrazuj organoidy za pomocą mikroskopu konfokalnego wyposażonego w komorę termiczną i dopływ gazu, który wykrywa sondę fluorogenną.Korzystając z kontroli dodatniej, ustaw intensywność lasera i czas ekspozycji na sygnał ROS i sprawdź, czy ten sygnał jest niższy w kontroli ujemnej. Następnie, za pomocą okularu, przesiewaj szkiełko, aby zidentyfikować organoidy wyrażające GFP i dostosować intensywność lasera. Ustaw stos z 25 mikrometrów i zdefiniuj pozycje, aby uzyskać zszyty obraz całego organoidu, aby uzyskać sekcję organoidów pokazującą jedną warstwę komórek.Dodać jeden mikrolitr roztworu podstawowego n-acetylocysteiny do studzienek kontroli ujemnej 96-dołkowej okrągłej płytki dennej zawierającej organoidy. Po godzinnej inkubacji dodać jeden mikrolitr roztworu podstawowego wodoronadtlenku tert-butylu do odpowiednich studzienek i inkubować przez 30 minut. Następnie za pomocą pipety wielokanałowej usuń pożywkę, nie naruszając dołączonego BMM i przenieś ją na inną 96-dołkową okrągłą płytkę dolną.Odłóż ten talerz na bok. Następnie dodaj 100 mikrolitrów trypsyny i za pomocą pipety wielokanałowej pipetuj pięć razy w górę iw dół, aby zniszczyć BMM. Po krótkiej, pięciominutowej inkubacji należy oddzielić organoidy, pipetując w górę i w dół po raz drugi.Zakręć płytką i wyrzuć supernatant, odwracając płytkę. Dodaj pożywkę zebraną wcześniej na innej 96-dołkowej płytce z powrotem do odpowiednich dołków i ponownie zawieś komórki, pipetując w górę i w dół pięć razy. Następnie dodaj jeden mikrolitr sondy fluorogenicznej i inkubuj przez 30 minut.Następnie ponownie odkręć płytkę i ponownie zawieś komórki za pomocą 250 mikrolitrów roztworu DAPI. Przenieść próbki w probówkach do cytometrii przepływowej i utrzymywać probówki na lodzie. Zoptymalizuj ustawienia napięcia rozproszenia do przodu i bocznego na niebarwionych napięciach kontrolnych i laserowych dla każdego fluoroforu przy użyciu próbek monobarwionych.Następnie, stosując odpowiednią strategię bramkowania, zbierz minimum 20 000 zdarzeń. Reprezentatywne obrazy konfokalne barwienia ROS i organoidów wykazały, że w obecności inhibitora NAC widoczny jest tylko sygnał z martwych komórek zawartych w świetle organoidu. W organoidach niepoddanych działaniu substancji można zaobserwować podstawowe poziomy ROS, szczególnie w komórkach GFP-dodatnich, co dowodzi, że komórki macierzyste wytwarzają wyższe ROS niż komórki zróżnicowane.Komórki GFP dodatnie prezentują bardziej znaczący sygnał cytoplazmatyczny z induktorem w obecności sondy fluorogenicznej, co pokazuje, że poziomy ROS wzrastają szczególnie w komórkach macierzystych po leczeniu. Analiza cytometrii przepływowej produkcji ROS w organoidach jelitowych pokazuje, że podstawowe poziomy ROS zmniejszają się po stymulacji inhibitorem i wzrastają po prowokacji induktorem. Komórki wstępnie potraktowane inhibitorem, a następnie stymulowane induktorem, wykazują niższe poziomy niż te stymulowane samym induktorem.Podobna analiza na komórkach macierzystych bramkowanych jako GFP dodatnich wykazuje 3,5-krotny spadek poziomu ROS po leczeniu inhibitorem i czterokrotny wzrost po leczeniu induktorem w porównaniu z komórkami niestymulowanymi. Podejmując się tej procedury, użytkownicy powinni pamiętać o ograniczeniu stresu komórkowego podczas manipulacji organoidami i dysocjacji. Dodatkowo, podczas analizy ROS należy zawsze uwzględniać kontrole dodatnie i ujemne.Po tej procedurze analizę można uzupełnić o barwienie immunofluorescencyjne na utrwalonych nienaruszonych organoidach, sortowanie komórek i analizę ekspresji genów, aby uzyskać dodatkowe informacje na temat regulacji ROS. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś wiedzieć, jak hodować mysie organoidy jelitowe, przeprowadzać analizę obrazową na żywo nienaruszonych organoidów i przetwarzać narządy jelitowe do analizy cytometrii przepływowej.

analyzing-oxidative-stress-murine-intestinal-organoids-using-reactive

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten film opisuje technikę wizualizacji stresu oksydacyjnego w hodowanych organoidach. Praca ta pomaga w zrozumieniu poziomu stresu oksydacyjnego spowodowanego akumulacją ROS w różnych typach komórek obecnych w organoidzie po leczeniu różnymi modulatorami ROS.

Test obrazowania za pomocą sondy fluorescencyjnej: technika wizualizacji stresu oksydacyjnego w reaktywnych formach tlenu Hodowane komórki organoidów jelitowych poddane działaniu induktora

Ten film demonstruje test cytometrii przepływowej do ilościowego określenia poziomów ROS w organoidach jelitowych 3D uzyskanych od transgenicznych myszy wykazujących ekspresję GFP. Metoda ta zapewnia eksperymentalny model in vitro do zbadania skuteczności badanych związków w produkcji ROS.

Test cytometrii przepływowej do ilościowego określania stresu oksydacyjnego: Test do ilościowego określania reaktywnych form tlenu w organoidach jelitowych za pomocą sond fluorogennych

Dostosowaliśmy zestaw protokołów do pomiaru reaktywnych form tlenu (ROS), które mogą być stosowane w różnych modelach komórkowych ameb i ssaków do badań jakościowych i ilościowych.

Wykrywanie, wizualizacja i ilościowe określanie wytwarzania reaktywnych form tlenu w systemie modelu Amoeba

Tutaj przedstawiamy protokół pomiaru stresu oksydacyjnego u żywych zarodków danio pręgowanego. Procedura ta umożliwia wykrywanie reaktywnych form tlenu (ROS) zarówno w całych tkankach zarodka, jak i w populacjach pojedynczych komórek. W ramach tego protokołu zostaną przeprowadzone zarówno analizy jakościowe, jak i ilościowe.

Analiza stresu oksydacyjnego w zarodkach danio pręgowanego

Ten manuskrypt opisuje użycie genetycznie kodowanych reporterów fluorogenicznych w zastosowaniu obrazowania żywych komórek do badania stresu oksydacyjnego wywołanego ksenobiotykami. To eksperymentalne podejście oferuje niezrównaną rozdzielczość czasoprzestrzenną, czułość i swoistość, unikając jednocześnie wielu niedociągnięć konwencjonalnych metod stosowanych do wykrywania toksykologicznego stresu oksydacyjnego.

Obrazowe podejścia do oceny toksykologicznego stresu oksydacyjnego przy użyciu genetycznie kodowanych czujników fluorogennych

Opisujemy nieinwazyjny protokół obrazowania in vivo, który jest uproszczony i opłacalny, wykorzystując L-012, chemiluminescencyjny analog luminolu, do wizualizacji i ilościowego określenia reaktywnych form tlenu (ROS) generowanych w mysim modelu rany wycinającej.

In vivo (in vivo) Obrazowanie reaktywnych form tlenu w mysim modelu rany

Tutaj opisujemy technikę ilościowego określania integralności bariery organoidów jelita cienkiego. Fakt, że metoda opiera się na żywych organoidach, umożliwia sekwencyjne badanie różnych substancji modulujących integralność bariery lub ich kombinacji w sposób rozdzielczy w czasie.

Badanie rozpadu bariery jelitowej w żywych organoidach

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania całkowitej komórkowej reaktywnej formy tlenu (ROS) za pomocą dioctanu 2',7'-dichlorodihydrofluoresceiny (DCFH-DA). Ta metoda może wizualizować komórkową lokalizację ROS w przylegających komórkach za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego i określać ilościowo intensywność ROS za pomocą czytnika płytek fluorescencyjnych. Ten protokół jest prosty, wydajny i opłacalny.

Wykrywanie całkowitych reaktywnych form tlenu w przylegających komórkach za pomocą barwienia dioctianem 2',7'-dichlorodihydrofluoresceiny

Ten protokół opisuje ocenę statusu redoks specyficznego dla kompartmentu subkomórkowego w komórce. Wrażliwa na redoks sonda fluorescencyjna umożliwia wygodną analizę ratiometryczną w nienaruszonych komórkach.

Ocena utleniania komórkowego przy użyciu subkomórkowego białka zielonej fluorescencji wrażliwego na redoks specyficznego dla przedziału subkomórkowego

Tutaj proponujemy usystematyzowany, dostępny i powtarzalny protokół do wykrywania komórkowych reaktywnych form tlenu (ROS) za pomocą sondy dioctanu 2′,7′-dichlorofluoresceiny (DCFH-DA) w komórkach glejowych Müllera (MGC). Ta metoda określa ilościowo całkowite komórkowe poziomy ROS za pomocą cytometru przepływowego. Ten protokół jest bardzo łatwy w użyciu, odpowiedni i powtarzalny.

Kwantyfikacja reaktywnych form tlenu za pomocą sondy dioctanu 2′,7′-dichlorofluoresceiny i cytometrii przepływowej w komórkach glejowych Müllera

Poznaj metodę analizy stresu oksydacyjnego w jelitowych organoidach myszy przy użyciu fluorogenicznej sondy wrażliwej na gatunki tlenu. Technika umożliwia jakościową wizualizację mikroskopową i ilościową analizę cytometryczną poziomów ROS w żywych komórkach.

Analiza stresu oksydacyjnego w organoidach jelitowych myszy przy użyciu reaktywnej sondy fluorogenicznej wrażliwej na gatunki tlenu (Wideo) | JoVE Journal

Analiza stresu oksydacyjnego w organoidach jelitowych myszy przy użyciu reaktywnej sondy fluorogenicznej wrażliwej na gatunki tlenu

Przeglądaj więcej filmów