Name: Izolacja i selekcja grzybów entomopatogenicznych z próbek glebowych oraz ocena zjadliwości grzybów wobec szkodników owadzich (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Naucz się izolować grzyby entomopatogeniczne z próbek glebowych przy użyciu przynęty Tenebrio molitor. Metoda ECN pozwala wybrać szczepy o wysokiej zjadliwości i odporności na stres do biologicznej zwalczania szkodników.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez Grant 109-2313-B-005 -048 -MY3 z Ministerstwa Nauki i Technologii (MOST).

UWAGA: Cały schemat blokowy przedstawiono na Rysunku 1.
1. Izolacja i selekcja potencjalnych grzybów entomopatogennych (EPF)
<ol>
	<li>Pobierz próbkę gleby
	<ol>
		<li>Usuń 1 cm powierzchniowej warstwy gleby, a następnie za pomocą łopaty pobierz próbkę gleby z głębokości 5–10 cm z każdego miejsca poboru. 
		UWAGA: Miejscami poboru próbek powinny być góry, lasy lub obszary słabo zaludnione, aby uniknąć kontaminacji sztucznie rozpylonymi szczepami EPF. Należy upewnić się, że obszary przeznaczone do pobierania próbek gleby są pokryte roślinnością ruderalną na powierzchni. Gleba sucha lub wilgotna nie nadaje się do tego eksperymentu.</li>
		<li>Zapisz szczegółowe dane dla każdego punktu poboru prób, w tym współrzędne GPS, wysokość nad poziomem morza, typ pola, średnią roczną temperaturę, roczną sumę opadów, czas zbioru (pora roku), rodzaj gleby oraz wartość pH.</li>
		<li>Należy zebrać 100 g próbki gleby do plastikowej torby i przechowywać ją w temperaturze pokojowej, jeśli protokół izolacji grzybów w laboratorium zostanie przeprowadzony w ciągu 3 h. 
		UWAGA: Jeśli próbka nie zostanie wykorzystana w ciągu 3 h, należy przechowywać glebę w temperaturze pokojowej, w ciemności. Jeśli eksperyment nie zostanie przeprowadzony niezwłocznie, próbkę gleby można przechowywać w 4 °C przez 1 tydzień przed rozpoczęciem protokołu18,19.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przynęta i izolacja EPF za pomocą mącznika (Tenebrio molitor)
	<ol>
		<li>Umieść 100 g próbki gleby w plastikowym kubku (średnica otworu = 8,5 cm, wysokość = 12,5 cm), a następnie umieść 5 mączników na powierzchni gleby w temperaturze pokojowej w ciemności na 2 tygodnie. 
		UWAGA: Można również stosować inne rodzaje plastikowych kubków. Jeśli gleba jest zbyt sucha (spękana lub piaszczysta), należy spryskać ją sterylną wodą ddH2O2O (około 5-10 ml) na glebę. Długość ciała ok. 2,5 cm (14th stadium larwalne) z T. molitor larwy pomagają w przesiewaniu izolatów grzybów20.</li>
		<li>Codziennie obserwuj i zapisuj śmiertelność oraz występowanie mykozy u larw; martwe larwy przechowuj w kubku przez 2 tygodnie w celu izolacji grzybów. 
		UWAGA: Zarodniki konidia grzybów w próbkach gleby przyłączą się do larw mącznika podczas opisanego wyżej procesu. Mykozę grzybiczą będzie można zaobserwować w momencie, gdy strzępki zaczną wyrastać z błony międzysegmentowej, a następnie całe ciało zostanie pokryte grzybnią. Sporulacja rozpocznie się po 7 dniach, a kolor infekcji grzybiczej zmieni się na kolor masy konidialnej.</li>
		<li>Przenieść martwe owady do komory z laminarnym przepływem powietrza i za pomocą sterylnej wykałaczki zebrać konidia. Wysiać je w laboratorium na płytkę (55 mm) z pożywką Sabourauda z dekstrozą o ćwiartkowej koncentracji (¼ SDA).21Inkubować płytkę z kulturą w temperaturze 25 °C przez 7 dni w celu uzyskania kultury pierwotnej grzybów. 
		UWAGA: Płytkę ¼ SDA przygotowuje się w następujący sposób: zmieszać 1,5 g bulionu Sabourauda z dekstrozą i 3 g agaru w 200 ml H2Następnie należy sterylizować przez 20 min. Przed zestaleniem należy odlać po ¼ objętości podłoża SDA do każdej szalki Petriego o średnicy 55 mm. Zestalone płytki z ¼ SDA przechowuje się w 4 °C do momentu użycia.</li>
		<li>Ponownie wysewiaj każdy pierwotny grzyb z kultury na jedną płytkę SDA o średnicy 55 mm w komorze z laminarnym przepływem powietrza, a następnie inkubuj płytkę z kulturą w temperaturze 25 °C przez 7 dni w celu uzyskania pojedynczych kolonii grzybów.</li>
		<li>Powtórz tę reizolację około 2–3 razy i obserwuj pod mikroskopem świetlnym, aby uzyskać pojedyncze i czyste morfologicznie kolonie grzybów. 
		UWAGA: Wyizolować wszystkie EPF za pomocą T. molitor-przynętę i przechowywać zgodnie z opisem w następnej sekcji. Separację, konserwację, hodowlę czystą oraz posiewy w kolejnych sekcjach należy przeprowadzić w laminarnym przepływie powietrza.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przechowywanie izolatów EPF
	<ol>
		<li>Za pomocą wycinaka do korka wyciąć 3 bloki agaru o rozmiarze 5 mm z brzegu każdej płytki z izolowaną czystą kulturą grzyba i umieścić je w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml jako jedną powtórkę. 
		UWAGA: W celu przechowywania szczepów EPF po 2 zaleca się przygotowanie trzech powtórzeń dla każdego izolatu grzyband test wirulencji. W przypadku ograniczonej przestrzeni magazynowej zaleca się również identyfikację molekularną.</li>
		<li>Dodaj 250 µL 0,03% roztworu surfaktantu (Tabela materiałów) i 250 µL do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml 60% glicerolu za pomocą mikropipety, a następnie mieszać na wirówce typu vortex przez 10 s.</li>
		<li>Zamknąć probówkę do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml folią parafinową i schłodzić wstępnie w -20 °C lodówce przez 24 h. Następnie przenieść schłodzone zapasy grzybów do -80 °C lodówka do krioterapii. 
		UWAGA: W sekcji 1.4 wykorzystano dodatkowe szalki z czystą kulturą grzybów (poza próbkami przechowywanymi w kriokonserwacji).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>1st badanie patogenności izolatów grzybów
	<ol>
		<li>Umieść pięć T. molitor larwy bezpośrednio na powierzchni każdej płytki z czystą kulturą grzyba w 25 °C.</li>
		<li>Obserwować i rejestrować występowanie mykozy oraz śmiertelność przez 10 dni. Wybrać izolat grzyba do dalszych analiz. 
		UWAGA: Do etapu 2 wybierane są izolaty grzybów powodujące 100% śmiertelnoścind test wirulencji w celu potwierdzenia ich zjadliwości wobec T. molitor larwy. Alternatywnie badacz może dostosować kryteria zgodnie z zakresem własnego badania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>2nd test wirulencji izolatów grzybów 
	UWAGA: Na podstawie 1Wstęp badanie patogenności, odzyskanie wybranych izolatów grzybów z -80 °C dla 2nd test wirulencji. Celem 2nd test wirulencji służy do ilościowego określenia patogenności wybranych izolatów grzybów po 1Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. rundę przesiewową.
	<ol>
		<li>Zbierz konidia każdego izolatu grzyba, mieszając je w wirówce vorex przez 1 min, a następnie policz liczbę konidiów za pomocą hemocytometru.</li>
		<li>Dostosuj stężenie zawiesiny konidiów do poziomu 1 x 107 konidia/ml w 0,03% roztworze surfaktanta (Tabela materiałów).</li>
		<li>Rozprzestrzenianie 10 µL zawiesiny grzybowej na płytki z agar Sabouraud (SDA) o średnicy 55 mm i inkubować przez 7 dni w temperaturze 25 °C w ciemności.</li>
		<li>Umieść pięć T. molitor larwy bezpośrednio na powierzchni każdej szalki z czystą kulturą grzybów (ok. 6 x 107 konidia). Płytki uszczelnić folią parafinową i inkubować w 25 °C w ciemności.</li>
		<li>Obserwować i rejestrować występowanie mykozy oraz śmiertelność przez 10 dni.</li>
		<li>Powtórz test (od kroku 1.5.1 do 1.5.5) w trzech powtórzeniach dla każdego izolatu grzyba. 
		UWAGA: Do etapu 3 wyselekcjonowano izolaty grzybów powodujące 100% śmiertelnoścird test wirulencji w celu potwierdzenia ich wirulencji wobec docelowego szkodnika.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>3rd test wirulencji izolatów grzybowych wobec docelowego szkodnika (Spodoptera litura na przykład)
	<ol>
		<li>Powtórz kroki od 1.5.2 do 1.5.6 dla wybranych izolatów z 2nd wirulencja w celu przetestowania wirulencji przeciwko docelowemu szkodnikowi.</li>
		<li>Oblicz LT50 każdego izolatu grzyba22. 
		UWAGA: LT50 Wartość dla każdego izolatu grzybowego obliczono za pomocą uogólnionych modeli liniowych (GLM) w programie R studio (wersja 3.4.1); w celu uwzględnienia nadmiernej dyspersji zastosowano kwazibinomialny rozkład błędów oraz funkcję linku logarytmicznego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Identyfikacja molekularna EPF
<ol>
	<li>Ekstrakcja genomowego DNA grzybów
	<ol>
		<li>Pobrać ok. 1 cm2 EPF z 7-dniowej płytki ¼ SDA.</li>
		<li>Wyekstrahować genomowe DNA grzybów przy użyciu zestawu do ekstrakcji genomowego DNA grzybów zgodnie z instrukcjami producenta23 (Tabela materiałów).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Amplifikacja PCR i sekwencjonowanie DNA
	<ol>
		<li>Amplifikować region ITS grzybów metodą PCR z próbki DNA21, używając PCR Master Mix (2x) oraz zestawu starterów ITS1F/ITS4R24 (Tabela 1) według następującego programu PCR: 94 °C przez 1 min, a następnie 35 cykli obejmujących 94 °C przez 30 s, 55 °C przez 30 s oraz 72 °C przez 1 min, a na koniec 7 min finalnej elongacji w 72 °C. 
		UWAGA: Zestaw starterów ITS1F/ITS4R służy do identyfikacji na poziomie rodzaju.</li>
		<li>Przeprowadzić sekwencjonowanie produktów PCR w komercyjnej usłudze sekwencjonowania.</li>
		<li>Użyć wyszukiwania NCBI BLAST w celu znalezienia podobnych grzybów w bazie danych NCBI i wybrać pokrewne gatunki typowe grzybów do analizy filogenetycznej. 
		UWAGA: Gatunki grzybów należące do rodzaju Metarhizium lub Beauveria powinny zostać dalej zidentyfikowane na poziomie gatunku przy użyciu zestawu starterów tef-983F/tef-2218R25 (powtórzyć kroki od 2.1.1 do 2.2.3). W przypadku grzybów, które nie należą do rodzajów Metarhizium lub Beauveria, do identyfikacji gatunku można wykorzystać inne markery molekularne, w tym lyazę DNA (APN2), beta-tubulinę (BTUB), największą podjednostkę polimerazy RNA II (RPB1), drugą co do wielkości podjednostkę polimerazy RNA II (RPB2) oraz fragment 3' czynnika elongacji translacji 1 alfa (TEF)25,26.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza filogenetyczna
	<ol>
		<li>Użyć oprogramowania ClustalX 2.127 do dopasowania wielu sekwencji z kroków 2.2.2 i 2.2.3. Ręcznie przyciąć regiony sekwencji konserwowanych za pomocą programu GeneDoc28.</li>
		<li>Przeprowadzić analizę filogenetyczną za pomocą oprogramowania MEGA729 w oparciu o metody minimum ewolucyjnego (ME), Neighbor-Joining (NJ) oraz maksymalnego wiarygodności (ML). 
		UWAGA: Zastosowanie wszystkich trzech metod może pomóc w potwierdzeniu i dokładnym ustaleniu statusu klasyfikacji. Izolaty grzybów przesianne w 1.st badaniu patogenności są wykorzystywane do identyfikacji molekularnej na poziomie rodzaju. Izolaty grzybów przesianne w 2.nd teście wirulencji są wykorzystywane do molekularnej i morfologicznej identyfikacji na poziomie gatunku.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Identyfikacja morfologiczna EPF
<ol>
	<li>Obserwacja morfologii kolonii grzyba
	<ol>
		<li>Za pomocą aparatu fotograficznego dokumentuj wzrost kolonii kultury grzyba przez 7 dni, zapisując tempo wzrostu, formę (puszystą, zwartą) oraz kolor kolonii.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obserwacja konidiów i konidioforów
	<ol>
		<li>Zeskrob konidia z kolonii czystej kultury grzyba za pomocą pętli do szczepienia i przenieś zarodniki na szkiełko przedmiotowe z 0,1% roztworem Tween 80. Następnie przykryj je szkiełkiem nakrywką w celu obserwacji konidiów pod mikroskopem świetlnym.</li>
		<li>Za pomocą skalpela wytnij blok agaru o powierzchni 5 mm2 z pasma strzępek na brzegu kolonii grzyba, a następnie przenieś blok agaru na szkiełko przedmiotowe.</li>
		<li>Przeprowadź oczyszczanie w następujący sposób: nanieś 0,1% roztwór Tween 80 na blok agaru za pomocą plastikowego zakraplacza i usuń pęsetą większość nadmiaru konidiów. Następnie przykryj preparat szkiełkiem nakrywką w celu obserwacji pod mikroskopem świetlnym. 
		UWAGA: 0,1% Tween 80 można zastąpić innym, silniejszym surfaktantem (Tabela materiałów) w zależności od gatunku grzyba i jego hydrofobowości.</li>
		<li>Zmierz i zapisz szerokość oraz długość konidiów i konidioforów, aby porównać różnice między poszczególnymi izolatami grzybów.</li>
		<li>Użyj testu ANOVA Welcha oraz testu Gamesa-Howella (test post-hoc) w programie R studio (wersja 3.4.1), aby przeanalizować szerokość i długość konidiów każdego szczepu. 
		UWAGA: Analiza danych dotyczących cech morfologicznych może być dostosowana do konkretnych przypadków. Izolaty grzybów przebadane w ramach 3rd testu wirulencji są wykorzystywane do charakterystyki fizjologicznej i rankingu ECN w sekcjach 4 i 5.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Badanie produktywności konidiów i termotolerancji
<ol>
	<li>Analiza produkcji konidiów
	<ol>
		<li>Kultywuj wybrany izolat grzyba na podłożu ¼ SDA w temperaturze 25 ± 1 °C w ciemności przez 10 dni.</li>
		<li>Przygotuj 1 mL zawiesiny konidiów izolatu grzyba w 0,03% roztworze surfaktantu i dostosuj stężenie do 1 x 107 konidiów/mL zgodnie z powyższym opisem.</li>
		<li>Nanieś trzy krople po 10 µL zawiesiny konidiów na ¼ SDA i inkubuj w temperaturze 25 °C w ciemności przez 7, 10 i 14 dni w celu policzenia sporulacji grzybów. 
		UWAGA: 10 µL to optymalna objętość, aby pobrać blok 5 mm z równomierną sporulacją grzybów po ich wzroście przez 7-14 dni.</li>
		<li>Użyj wycinaka do agaru, aby odciąć blok agaru o średnicy 5 mm z centrum kolonii i przenieś go do 1 mL 0,03% roztworu surfaktantu (Tabela materiałów) w probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL dla każdego punktu czasowego.</li>
		<li>Mieszaj probówkę w vortexie przy 3 000 obr./min w temperaturze pokojowej przez 15 min i użyj hemocytometru do policzenia liczby konidiów. 
		UWAGA: Wzór używany do liczenia to liczba konidiów na 25 kwadratów najmniejszej komórki (rozmiar = 0,025 mm2; głębokość komory = 0,1 mm): 
		Całkowita liczba konidiów w 5 kwadratach ÷ 80 × (4 × 106)</li>
		<li>Powtórz procedurę trzykrotnie dla każdego izolatu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza termotolerancji
	<ol>
		<li>Kultywuj wybrany izolat grzyba na podłożu ¼ SDA w temperaturze 25 ± 1 °C w ciemności przez 10 dni.</li>
		<li>Przygotuj 1 mL zawiesiny konidiów izolatu grzyba w 0,03% roztworze surfaktantu i dostosuj stężenie do 1 x 107 konidiów/mL zgodnie z powyższym opisem.</li>
		<li>Wymieszaj zawiesinę konidiów w vortexie i podgrzewaj ją w suchej kąpieli w temperaturze 45 °C przez 0, 30, 60, 90 i 120 min. Nanieś trzy krople po 5 µL zawiesiny konidiów na podłoże 55 mm ¼ SDA w każdym punkcie czasowym po ekspozycji na ciepło i inkubuj w temperaturze 25 ± 1 °C przez 18 h. 
		UWAGA: Unikaj rozcierania kropel grzyba, aby móc lepiej skupić się na danym obszarze.</li>
		<li>Policz liczbę wykiełkowanych zarodników konidiów w pięciu losowo wybranych polach pod mikroskopem świetlnym przy powiększeniu 200x, aby określić stopień kiełkowania.</li>
		<li>Wykonaj trzy powtórzenia dla każdego izolatu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Ranking liczby efektywnych konidiów (ECN)
<ol>
	<li>Obliczanie ECN 
	UWAGA: Przed obliczeniem całkowitej wartości ECN należy uzyskać dane dotyczące produkcji konidiów oraz termotolerancji każdego potencjalnego szczepu grzyba21.
	<ol>
		<li>Oblicz krotność zmiany (FC) produkcji konidiów w każdym punkcie czasowym: 
		<img alt="Wzór na absorpcję przejściową; równanie symboliczne, schemat badania spektroskopowego." src="/files/ftp_upload/62882/62882eq01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 1"> 
		gdzie x = punkt czasowy zbioru danych; ncp = liczba konidiów po każdym dniu wzrostu; a I = początkowa liczba zaszczepionych konidiów.</li>
		<li>Oblicz liczbę konidiów w warunkach stresowych w każdym punkcie czasowym, korzystając z następującego wzoru: 
		<img alt="Równanie przedstawiające obliczanie ECN: ECNy = I × FCx × TT0 × Współczynnik stresu(TTz)." src="/files/ftp_upload/62882/62882eq02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 2"> 
		Gdzie y = ECN w punkcie czasowym poddanym działaniu czynnika; TT0 = wskaźnik kiełkowania konidiów niedostępnych dla stresu cieplnego (= wskaźnik kiełkowania przy 0 min obróbki cieplnej); TTz = współczynnik stresu, będący wskaźnikiem kiełkowania konidiów w różnych czasach obróbki cieplnej (z).</li>
		<li>Oblicz całkowity ECN, korzystając z następującego wzoru: 
		<img alt="Równanie równowagi statycznej, ΣECNy = I × FGx × TTo × Współczynnik stresu(TTz), schemat wzoru." src="/files/ftp_upload/62882/62882eq03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 3"></li>
		<li>Porównaj ECN każdego szczepu grzyba.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza głównych składowych (PCA) szczepów grzybów 
	UWAGA: Analiza PCA potwierdza ranking ECN i pomaga w zrozumieniu korelacji między wartościami cech fizjologicznych. Porównaj wartości ECN i wybierz izolaty EPF o wyższych wartościach ECN.</li>
	<li>Użyj oprogramowania R, aby stworzyć PCA za pomocą kodu: 
	#Wprowadzenie pliku danych PCA 
	​a = read.table("PCA.csv",sep=',',header=T)
	<ol>
		<li># Przetwarzanie danych próbek 
		row.names(a) &lt;- c("NCHU-9","NCHU-11", "NCHU-64", "NCHU-69", "NCHU-95", "NCHU-113") 
		X=row.names(a) 
		df&lt;- a[2:11]</li>
		<li>#Obliczenia PCA 
		pca &lt;- prcomp(df, center = TRUE, scale = TRUE) 
		vars &lt;- (pca$sdev)^2 
		pc1_percent = vars[1] / sum(vars) 
		pc2_percent = vars[2] / sum(vars) 
		value = pca$x</li>
		<li>#Wyjście do pliku wizualizacji PCA 
		png(file = 'pca.png', height = 2000, width = 2000, res = 300) 
		UWAGA: Do przeprowadzenia analizy głównych składowych (PCA) w celu potwierdzenia rankingu ECN należy użyć danych produkcji konidiów z okresu od 7 do 14 dni oraz wszystkich danych dotyczących termotolerancji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wybierz najlepiej rokujące szczepy grzybów na podstawie ECN lub PCA i przeprowadź test wirulencji na docelowych szkodnikach w celu dalszych badań.</li>
</ol>

Autorzy deklarują, że w tej pracy nie występuje konflikt interesów.

Grzyby entomopatogeniczne (EPF) zostały wykorzystane do zwalczania owadów. Istnieje kilka metod izolacji, selekcji i identyfikacji EPF30,31,32. Porównując różne rodzaje metod przynęty na owady, Beauveria bassiana i Metarhizium anisopliae były powszechnie spotykane w przynętach na owady 6,12,13,14.<sup class=...

Obecnie, grzyby entomopatogeniczne (EPF) są szeroko stosowane w zwalczaniu mikrobiologicznym szkodników rolniczych, leśnych i ogrodniczych. Zaletami EPF są jego szeroki zakres żywicieli, dobra zdolność adaptacji do środowiska, przyjazny dla środowiska charakter oraz to, że może być stosowany z innymi chemikaliami, aby pokazać synergiczny efekt integrowanej ochrony przed szkodnikami1,2. Do stosowania jako środek do zwalczania szkodników konieczne jest odizolowanie dużej liczby EPF od chorych owadów lub środowiska naturalnego.
Pobieranie próbek tych organizmów od ich gospodarzy pomaga w zrozumieniu geograficznego rozmieszczenia i częstości występowania EPF w naturalnych gospodarzach3,4,5. Jednak zbiór owadów zakażonych grzybami jest zwykle ograniczony przez czynniki środowiskowe i populacje owadów w terenie4. Biorąc pod uwagę, że żywiciele owadów umierają po zakażeniu EPF, a następnie wpadają do gleby, izolacja EPF od próbek gleby może być stabilnym zasobem3,6. Na przykład saprofity są znane z tego, że wykorzystują martwego gospodarza jako zasób do wzrostu. Systemy przynęty glebowej i selektywnego podłoża są szeroko stosowane do wykrywania i izolowania EPF od gleby3,4,7,8,9,10.
W metodzie selektywnej pożywki, rozcieńczony roztwór glebowy jest powlekany na pożywce zawierającej antybiotyki o szerokim spektrum działania (np. chloramfenikol, tetracyklinę lub streptomycynę) w celu zahamowania rozwoju bakterii2,3,9,11. Doniesiono jednak, że metoda ta może zniekształcić różnorodność i gęstość szczepu oraz może spowodować przeszacowanie lub niedoszacowanie wielu społeczności drobnoustrojów6. Ponadto wyizolowane szczepy są mniej chorobotwórcze i konkurują z saprofitami podczas izolacji. Trudno jest wyizolować EPF z rozcieńczonego roztworu glebowego3. Zamiast używać selektywnego podłoża, metoda przynęty glebowej izoluje EPF od zakażonych martwych owadów, które mogą być przechowywane przez 2-3 tygodnie, zapewniając w ten sposób bardziej wydajną i standardową metodę separacji EPF3,4,7,6. Ponieważ metoda jest łatwa w obsłudze, można wyizolować różne szczepy chorobotwórcze przy niskich kosztach4. Dlatego jest szeroko stosowany przez wielu badaczy.
Po porównaniu różnych typów systemów przynęt na owady, Beauveria bassiana i Metarhizium anisopliae są najczęstszymi gatunkami EPF, które występują u owadów należących do Hemiptera, Lepidoptera, Blattella i Coleoptera6,12,13,14. Wśród tych przynęt na owady, Galleria mellonella (rząd Lepidoptera) i Tenebrio molitor (rząd Coleoptera) wykazują wyższe wskaźniki odzysku Beauveria i Metarhizium spp. w porównaniu z innymi owadami. Dlatego G. mellonella i T. molitor są powszechnie stosowane do nęcenia owadów. Z biegiem lat Departament Rolnictwa Stanów Zjednoczonych (USDA) utworzył bibliotekę EPF (Agricultural Research Service Collection of EPF cultures, ARSEF), która zawiera szeroką gamę gatunków, w tym 4081 gatunków Beauveria spp., 18 gatunków Clonostachys spp., 878 gatunków Cordyceps spp., 2473 gatunki Metarhizium spp., 226 gatunków Purpureocillium spp., i 13 gatunków Pochonia spp. między innymi15. Kolejna biblioteka EPF została zbudowana przez Laboratorium Badań Entomologicznych (ERL) z Uniwersytetu Vermont w Stanach Zjednoczonych na ok. 30 lat. Zawiera 1345 szczepów EPF ze Stanów Zjednoczonych, Europy, Azji, Afryki i Bliskiego Wschodu16.
Aby kontrolować lokalne lub inwazyjne szkodniki na Tajwanie, wymagana jest izolacja i selekcja rodzimego EPF. Dlatego w tym protokole zmodyfikowaliśmy i opisaliśmy procedurę metody przynęty glebowej i połączyliśmy ją z systemem przynęty na owady (mącznik, Tenebrio molitor) 17. W oparciu o ten protokół stworzono bibliotekę EPF. Przeprowadzono dwie rundy badań przesiewowych (kwantyfikacja inokulacji) dla wstępnych izolatów EPF. Izolaty EPF wykazały chorobotwórczość dla owadów. Potencjalne szczepy poddano identyfikacji morfologicznej i molekularnej, a następnie poddano dalszej analizie za pomocą testu termotolerancji i produkcji konidialnej. Ponadto zaproponowano również koncepcję efektywnej liczby konidiów (ECN). Korzystając z formuły ECN i analizy głównych składowych (PCA), potencjalne szczepy analizowano pod symulowanym ciśnieniem środowiskowym, aby zakończyć proces tworzenia i badania przesiewowego biblioteki EPF. Następnie zbadano chorobotwórczość obiecujących szczepów EPF pod kątem docelowego agrofaga (np. Spodoptera litura). Obecny protokół integruje dane dotyczące termotolerancji i produkcji konidiów z formułą ECN i analizą PCA, które mogą być używane jako standardowy system rankingowy dla badań związanych z EPF.

<table><tbody><tr><td>Agar Klasa bakteriologiczna</td><td>BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd.</td><td>AGR001</td><td>Nadaje się do większości zastosowań w hodowlach komórkowych / biologii molekularnej.</td></tr><tr><td>AGAROSE, klasa biotechnologiczna</td><td>BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd.</td><td>AGA001</td><td>Do elektroforezy DNA.</td></tr><tr><td>BioGreen Safe DNA Gel Buffer</td><td>BIOMAN</td><td>SDB001T</td><td></td></tr><tr><td>Mosiężny świdr korkowy</td><td>Dogger</td><td>D89A-44001</td><td></td></tr><tr><td>Canon kiss x2</td><td>Canon</td><td>EOS 450D</td><td>Do rekordowej morfologii kolonii szczepów</td></tr><tr><td>Inkubator o stałej temperaturze</td><td>Yihder Co., Ltd.</td><td>LE-509RD</td><td>Hodowla grzybów.</td></tr><tr><td>cubee Mini-wirówka</td><td>GeneReach</td><td>MC-CUBEE</td><td></td></tr><tr><td>DigiGel 10 Cyfrowy system obrazowania żelu</td><td>TOPBIO</td><td>DGIS-12S</td><td></td></tr><tr><td>Finnpipette F2 0,2 do 2 i mikro; L Pipeta</td><td>Thermo Scientific</td><td>4642010</td><td></td></tr><tr><td>Finnpipette F2 1 do 10 i mikro; L Pipeta</td><td>Thermo Scientific</td><td>4642030</td><td></td></tr><tr><td>Finnpipette F2 10 do 100 i mikro; L Pipeta</td><td>Thermo Scientific</td><td>4642070</td><td></td></tr><tr><td>Finnpipette F2 100 do 1000 i mikro; L Pipeta</td><td>Thermo Scientific</td><td>4642090</td><td></td></tr><tr><td>Finnpipette F2 2 do 20 i mikro; L Pipeta</td><td>Thermo Scientific</td><td>4642060</td><td></td></tr><tr><td>Finnpipette F2 20 do 200 i mikro; L Pipeta</td><td>Thermo Scientific</td><td>4642080</td><td></td></tr><tr><td>GeneAmp PCR System 9700</td><td>Applied Biosystems</td><td>4342718</td><td></td></tr><tr><td>GenepHlow Gel/PCR Kit GenepHlow</td> Inkubator do suchej kąpieli <td>Geneaid</td><td>DFH100</td><td></td></tr><tr><td>Genius</td><td>Major Science</td><td>MD-01N</td><td></td></tr><tr><td>Cylinder z podziałką Niestandardowy A 100mL</td><td>SIBATA</td><td>SABP-1195906</td><td>Zmierz objętość odczynników.</td></tr><tr><td>Ręczny licznik tally</td><td>SDI</td><td>NO.1055</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometr</td><td>bioman</td><td>AP-0650010</td><td>Oblicz liczbę zarodników</td></tr><tr><td>Pętla inokulacyjna</td><td>Dogger</td><td>D8GA-23000</td><td></td></tr><tr><td>pokrywka</td><td>IDEAHOUSE</td><td>RS92004</td><td></td></tr><tr><td>Szkło z mikro pokrywą</td><td>MUTO PURE CHEMICALS CO., LTD</td><td>24241</td><td></td></tr><tr><td>System obrazowania mikroskopowego</td><td>SAGE VISION CO., LTD</td><td>SGHD-3.6C</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe</td><td>DOGGER</td><td>DG75001-07105</td><td></td></tr><tr><td>Mupid-2plus Elektroforeza żelowa DNA</td><td>ADVANCE</td><td>AD110</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop optyczny Nikon</td><td>SAGE VISION CO., LTD</td><td>Eclipse CI-L</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowy kubek</td><td>IDEAHOUSE</td><td>CS60016</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw drożdży Presto Mini gDNA</td><td>Geneaid</td><td>GYBY300</td><td>Zestaw do ekstrakcji genomowego DNA grzybów</td></tr><tr><td>Sabouraud Dextrose Broth (Sabouraud Liquid Medium)</td><td>HiMedia Leading BioSciences Company</td><td>M033</td><td>Służy do hodowli drożdży, pleśni i mikroorganizmów kwaśnych.</td></tr><tr><td>Ostrze skalpela nr 23</td><td>Swann-Morton</td><td>310</td><td></td></tr><tr><td>Rękojeść skalpela nr 4</td><td>AGARWAL SURGICALS</td><td>SSS -FOR-01-91</td><td></td></tr><tr><td>Łopata</td><td>Zapisz & Bezpieczny</td><td>A&nbsp;-1580242&nbsp;-00</td><td></td></tr><tr><td>Silwet L-77</td><td>bioman(phytotech)</td><td>S7777</td><td>Surfaktant</td></tr><tr><td>Sorvall Legend Micro 17 Mikrowirówka</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002403</td><td></td></tr><tr><td>Stalowa pęseta</td><td>SIPEL ELECTRONIC SA</td><td>GG-SA</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna szalka Petriego</td><td>BIOMAN SCIENTIFIC Co., Ltd.</td><td>1621</td><td>Płytkie cylindryczne pojemniki z dopasowanymi pokrywkami, przeznaczone specjalnie do stosowania w mikrobiologii lub hodowlach komórkowych.</td></tr><tr><td>ThermoCell MixingBlock</td><td>BIOER</td><td>MB-101</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td><td>164-21775</td><td></td></tr><tr><td>Zamrażarka TwinGuard ULT</td><td>Panasonic Healthcare Holdings Co., Ltd.</td><td>MDF-DU302VX-80</td><td>&deg; C próbka przechowywana.</td></tr><tr><td>Pionowa szafka podłogowa</td><td>Chih Chin</td><td>BSC-3</td><td>Hodowla grzybów.</td></tr><tr><td>Vortex Genie II</td><td>Scientific</td><td>SIG560</td><td></td></tr><tr><td>Torby do przechowywania na zamek błyskawiczny</td><td>Zapisz i Bezpieczny</td><td>A&nbsp;-1248915&nbsp;-00</td><td></td></tr><tr><td>100 pz Drabinka DNA</td><td>Geneaid</td><td>DL007-20</td><td></td></tr><tr><td>&deg; C Zamrażarka</td><td>FRIGIDAIRE</td><td>Frigidaire</td> <td>FFFU21M1QW-20&deg; C próbka i odczynniki doświadczalne przechowywane.</td></tr><tr><td>2X SuperRed PCR Master Mix</td><td>TOOLS</td><td>TE-SR01</td><td></td></tr><tr><td>50X TAE Bufor</td><td>BIOMAN</td><td>TAE501000</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja i selekcja grzybów entomopatogenicznych z próbek glebowych oraz ocena zjadliwości grzybów wobec szkodników owadzich

Isolation and Selection of Entomopathogenic Fungi from Soil Samples and Evaluation of Fungal Virulence against Insect Pests

Grzyby entomopatogeniczne (EPF) są jednym z czynników kontroli mikrobiologicznej w zintegrowanej ochronie przed szkodnikami. Aby zwalczać szkodniki lokalne lub inwazyjne, ważne jest, aby wyizolować i wybrać rodzimy EPF. W związku z tym w tym badaniu zastosowano metodę przynęty glebowej w połączeniu z systemem przynęty na owady (mącznik, Tenebrio molitor) z pewnymi modyfikacjami. Wyizolowany EPF poddano następnie testowi zjadliwości przeciwko agrofagowi rolniczemu Spodoptera litura. Ponadto potencjalne szczepy EPF poddano identyfikacji morfologicznej i molekularnej. Ponadto przeprowadzono test produkcji konidiów i termotolerancji dla obiecujących szczepów EPF i porównano; dane te zostały następnie podstawione do wzoru na efektywną liczbę konidiów (ECN) dla rankingu laboratoriów. System przynęty glebowej i mącznika mącznika oraz formułę ECN można ulepszyć poprzez zastąpienie gatunków owadów i włączenie większej liczby czynników stresowych do oceny komercjalizacji i zastosowania w terenie. Protokół ten zapewnia szybkie i skuteczne podejście do selekcji EPF i poprawi badania nad środkami kontroli biologicznej.

Izolacja i selekcjapotencjalnych grzybów entomopatogennych (EPF) 
Poprzez zastosowanie Tenebrio molitormetodzie tworzenia biblioteki grzybów entomopatogennych (EPF), liczba grzybów pozbawionych zdolności do zabijania owadów zostałaby wykluczona; w ten sposób można by znacznie zwiększyć wydajność izolacji oraz selekcję EPF. Podczas stosowania tej metody rejestrowano informacje o miejscach poboru próbek, próbkach gleby oraz wskaźnikach kiełkowania grzybów (<str...

Tutaj prezentujemy protokół oparty na systemie przynęty na mącznika mącznika (Tenebrio molitor), który był używany do izolowania i selekcji grzybów entomopatogenicznych (EPF) z próbek gleby. Skuteczna formuła liczby konidiów (ECN) jest stosowana do wyboru EPF o wysokiej tolerancji na stres w oparciu o cechy fizjologiczne do zwalczania mikrobiologicznego szkodników na polu.

Izolacja i selekcja grzybów entomopatogenicznych z próbek glebowych oraz ocena zjadliwości grzybów wobec szkodników owadzich

Entomopathogenic fungi (EPF) are one of the microbial control agents for integrated pest management. To control local or invasive pests, it is important ...

Metoda izolacji grzybów entomopatogenicznych jest ważna dla opracowania środków kontroli mikrobiologicznej. Protokół ten może być stosowany do izolowania i selekcji entomopatogenicznych izolatów grzybów o wysokiej zjadliwości z próbek gleby. Technika ta obejmuje trzy etapy badania przesiewowego patogenności i łączy test termotolerancji i produkcji konidiów w celu stworzenia skutecznego rankingu liczby konidiów.Metoda ta może pomóc w selekcji nowych izolatów grzybów o wysokiej zjadliwości i obiecujących entomopatogenach do komercjalizacji. Protokół ten koncentruje się na kontroli biologicznej, może być również wykorzystany do odkrycia entomopatogenicznych izolatów grzybów w celu zbadania interakcji między szkodnikami a grzybami entomopatogenicznymi. Procedurę zademonstrują Yao-Chia Liu i Nian-Tong Ni, mistrz z mojego laboratorium.Rozpocznij od pobrania próbki gleby, usuwając jeden centymetr gleby z powierzchni, a następnie zbierając glebę na głębokości od pięciu do 10 centymetrów z każdego miejsca pobierania próbek za pomocą łopaty. Po zarejestrowaniu szczegółów każdego miejsca pobierania próbek, należy pobrać i przechowywać 100 gramów próbki gleby w plastikowej torbie w temperaturze pokojowej, aby w ciągu trzech godzin wykonać protokół izolacji grzybów. Aby wyizolować potencjalne grzyby entomopatogeniczne lub EPF, dodaj 100 gramów próbki gleby do plastikowego kubka i umieść pięć robaków Tenebrio molitor na powierzchni gleby w temperaturze pokojowej w ciemności przez dwa tygodnie, obserwując i rejestrując codziennie śmiertelność larw i grzybicy.Martwą larwę należy przechowywać w kubku do dwóch tygodni w celu izolacji grzybów. Po dwóch tygodniach przenieś martwe owady na czystą ławkę i użyj sterylnej wykałaczki, aby zebrać konidia. Aby uzyskać pierwotną kulturę grzybów, zebrane konidia należy rozprowadzić na pożywce agarowej z dekstrozą Sabouraud o mocy ćwiartki mocy lub SDA na 55-milimetrowej płytce w celu inkubacji w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez siedem dni.Ósmego dnia należy ponownie umieścić każdą podstawową kulturę grzybów na jednej 55-milimetrowej płytce SDA o ćwierć milimetra w okapie z przepływem laminarnym, a następnie inkubować kulturę w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez siedem dni, aby uzyskać pojedyncze kolonie grzybów. W pierwszym badaniu przesiewowym chorobotwórczości umieść pięć larw Tenebrio molitor bezpośrednio na powierzchni każdej czystej płytki kultury grzybów w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Po obserwacji i zarejestrowaniu grzybicy i śmiertelności przez 10 dni, należy wybrać izolaty grzybów do dalszej analizy.Aby wykonać drugi test wirulencji, należy zebrać konidia z każdego izolatu grzyba, wirując przez jedną minutę i policzyć liczbę konidiów za pomocą hemocytometru. Po zakończeniu dostosuj zawiesinę konidiów do stężenia od jednego razy 10 do 1/7 konidiów na mililitr w 0,03% roztworze środka powierzchniowo czynnego, a następnie rozprowadź 10 mikrolitrów zawiesiny grzybów na 55-milimetrowej płytce SDA o ćwierć milimetra, aby rosła przez siedem dni w temperaturze 25 stopni Celsjusza w ciemności. Ósmego dnia umieść pięć larw Tenebrio molitor bezpośrednio na powierzchni każdej czystej płytki kultury grzybów i uszczelnij płytki folią Parafilm w celu inkubacji, obserwując grzybicę i śmiertelność, jak opisano wcześniej.Po powtórzeniu drugiego testu wirulencji w trzech egzemplarzach dla każdego izolatu grzyba, należy wybrać izolaty do przeprowadzenia trzeciego testu wirulencji na docelowego szkodnika, takiego jak Spodoptera litura. Zbierz około jednego milimetra kwadratowego EPF z siedmiodniowej płytki SDA o ćwiartce mocy, aby wyekstrahować genomowe DNA grzyba za pomocą zestawu do ekstrakcji genomowego DNA grzyba. Następnie amplifikuj wewnętrzny transkrybowany przekład grzyba lub region ITS przez PCR próbki DNA zgodnie z programem PCR opisanym w manuskrypcie tekstowym.Po zsekwencjonowaniu produktu amplifikowanego PCR za pomocą komercyjnej usługi sekwencjonowania, użyj NCBI BLAST, aby wyszukać podobne grzyby w bazie danych NCBI i wybrać względne gatunki grzybów do analizy filogenetycznej. Wyrównaj wiele sekwencji i ręcznie przytnij konserwatywny region sekwencji za pomocą GeneDoc. Wykonaj analizę filogenetyczną w oparciu o metody minimalnej ewolucji, łączenia sąsiadów i maksymalnego prawdopodobieństwa.Aby zbadać morfologię grzybów, uchwyć wzrost kolonii kultur grzybów przez siedem dni za pomocą aparatu i zarejestruj wzrost, formę: puszystą lub jędrną oraz kolor kolonii. Aby zaobserwować konidia w konidioforach, zeskrob konidia z kolonii grzybów czystej kultury za pomocą pętli inokulacyjnej i przenieś zarodniki na szklane szkiełko zawierające 0,1% roztwór Tween 80. Za pomocą skalpela przeciąć blok agaru z kolonii grzybów, a następnie przenieść blok agaru na szklane szkiełko i dodać 0,1% roztwór Tween 80, aby zmyć większość nadmiaru konidiów na agrze.Następnie przykryj szkiełko szkiełkiem nakrywkowym w celu lekkiej obserwacji mikroskopowej konidiów. Zmierz i zapisz szerokość i długość konidiów i konidioforów, aby porównać różnicę między różnymi izolatami grzybów. Zorganizować test produkcji konidialnej, hodując wybrany izolat grzyba na pożywce SDA o ćwierć mocy w temperaturze około 25 stopni Celsjusza w ciemności przez 10 dni.Następnie przygotuj jedną mililitrową zawiesinę konidialną izolatu grzybów w 0,03% roztworze środka powierzchniowo czynnego, a następnie dostosuj stężenie do 1 razy 10 do 1/7 konidiów na mililitr, jak opisano wcześniej. Po dodaniu trzech kropelek 10 mikrolitrów zawiesiny konidialnej na płytce SDA o ćwiartce mocy, inkubuj kulturę w temperaturze 25 stopni Celsjusza w ciemności przez siedem, 10 i 14 dni, aby policzyć zarodnikowanie grzybów. W każdym punkcie czasowym odłącz pięciomilimetrowy blok agaru od środka kolonii za pomocą świdra korkowego i przenieś blok do 1,5-mililitrowej probówki mikrowirówkowej zawierającej jeden mililitr 0,03% roztworu środka powierzchniowo czynnego.Po wirowaniu rurki z prędkością 3 000 obrotów na minutę w temperaturze pokojowej przez 15 minut, użyj hemocytometru, aby policzyć liczbę konidiów. Do testu termotolerancji należy wyhodować wybrany izolat grzybów i przygotować jeden raz po 10 do 1/7 konidiów na mililitr zawiesiny, jak pokazano wcześniej. Po wirowaniu podgrzej zawiesinę konidialną w suchej kąpieli w temperaturze 45 stopni Celsjusza w różnych odstępach czasu.Po ekspozycji na ciepło dodaj trzy kropelki po pięć mikrolitrów zawiesiny konidialnej na 55-milimetrowej płytce SDA o ćwierć milimetra w każdym punkcie czasowym, a następnie inkubuj płytki w temperaturze około 25 stopni Celsjusza przez 18 godzin. Aby określić szybkość kiełkowania, policz liczbę kiełkujących zarodników konidiów z pięcioma losowo wybranymi polami pod mikroskopem świetlnym w 200-krotnym powiększeniu. Oblicz całkowitą efektywną liczbę konidiów lub ECN za pomocą wzoru, a następnie oblicz analizę głównych składników lub PCA szczepów grzybów zgodnie z opisem w manuskrypcie.Wybierz najlepiej działające szczepy grzybów na podstawie ECN lub PCA, aby przeprowadzić test zjadliwości docelowych szkodników. W drugim teście wirulencji oceniono zjadliwość 26 izolatów grzybów wobec mącznika mącznika Tenebrio molitor. Do testu wirulencji przeciwko Spodoptera litura wybrano 12 izolatów grzybów o wysokiej zjadliwości.Aby lepiej zrozumieć pozycje taksonomiczne grzybów, 26 izolatów z pierwszego badania przesiewowego patogenności poddano analizie molekularnej w oparciu o region ITS. Dzięki metodzie czyszczenia obserwacji morfologicznych grzybów, struktury konidioforów można było wyraźnie zobaczyć przy użyciu 0,1%Tween 80 roztworu. Kolor, kształt i ułożenie konidiów badano poprzez obserwacje mikroskopowe kolonii konidiów.ECN łączy dane dotyczące produkcji konidiów i termotolerancji każdego EPF. Wysoką żywotność szczepu grzyba zaobserwowano, gdy wartość ECN była wysoka. Ujawniono również ścisłą koordynację między PCA a ECN, co sugeruje, że ECN może być wykorzystywana do oceny hierarchii parametrów związanych z rentownością.W procedurze ważne są badania przesiewowe patogenności, ekstrakcja DNA grzyba i hodowla izolatu grzyba. Korzystając ze wzoru obliczeniowego ECN, można wybrać idealne wewnętrzne grzyby chorobotwórcze. Połączenie różnych gatunków owadów, takich jak woskowa i mącznik młynarka, w celu zwabienia grzybów entomopatogenicznych z próbek gleby, może zwiększyć różnorodność grzybów entomopatogenicznych.Różnorodność mikroorganizmów w glebie jest bardzo interesującym tematem podczas funkcjonowania tego protokołu. Za pomocą tego protokołu można by również dalej badać w przyszłości.

isolation-selection-entomopathogenic-fungi-from-soil-samples

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Nicienie entomopatogeniczne to glisty zamieszkujące glebę, które pasożytują na szerokiej gamie owadów.  Pokazujemy metody pobierania próbek stosowane do izolacji tych nicieni z gleby przy użyciu dwóch technik: przynęty na owady i zmodyfikowanej białej pułapki, do odzyskiwania nicieni odpowiednio z próbek gleby i zakażonych zwłok owadów.

Pobieranie próbek z gleby i izolacja nicieni entomopatogenicznych (Steinernematidae, Heterorhabditidae)

Tutaj opisujemy różne etapy związane z opartym na wiedzy rozwojem skutecznego środka mykosektycydowego, w tym izolację, identyfikację, badania przesiewowe i wybór "najlepiej dopasowanego" grzyba entomopatogenicznego, Metarhizium anisopliae, do zwalczania szkodników owadzich w rolnictwie.

Rozwój Metarhizium anisopliae jako mykosektycydu: od izolacji do wydajności polowej

Entomopatogeniczne kolonie grzybów są izolowane z próbek gleby tropikalnej za pomocą przynęty Tenebrio, przynęty Galleria, a także selektywnego sztucznego podłoża, tj. agaru z dekstrozą ziemniaczaną wzbogaconego ekstraktem drożdżowym uzupełnionym chloramfenikolem, tiabendazolem i cykloheksymidem (pożywka CTC).

Porównanie metod izolowania grzybów entomopatogenicznych z próbek gleby

Tutaj prezentujemy protokół pozyskiwania entomopatogenicznych grzybów z omacnicy leśnej oraz zastępczy sposób oceny ich entomopatogenicznej aktywności za pomocą modelowego owada Coleoptera. Ta metoda jest skuteczna i wygodna w badaniu entomopatogenicznych zasobów grzybów ze szkodników owadzich drążących drewno w lasach naturalnych.

Izolacja, identyfikacja behawioralna i ocena chorobotwórczości grzybów entomopatogenicznych z omacnicy leśnej

W niniejszym filmie przedstawiono procedurę izolacji nienaruszonych protoplastów z tkanek 14-dniowych siewek Arabidopsis. Biorąc pod uwagę, że wyizolowane protoplasty pozostają nienaruszone przez co najmniej 96h i są izolowane z siewek zamiast z miesięcznych, dojrzałych roślin, procedura ta przyspiesza analizy wymagające zastosowania nienaruszonych protoplastów.

Izolacja protoplastów z tkanek 14-dniowych siewek Arabidopsis thaliana

Problemy w przetwarzaniu próbek biologicznych do obserwacji skaningowej mikroskopii elektronowej obejmują zapadanie się komórek, traktowanie próbek z wilgotnych mikrośrodowisk i niszczenie komórek. Niedrogie i stosunkowo szybkie protokoły odpowiednie do przygotowania trudnych próbek, takich jak merystemy kwiatowe, cysty lęgniowców i grzyby (Agaricales) są kompilowane i szczegółowo opisywane tutaj.

Protokoły skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) dla problematycznych próbek roślin, lęgniowców i grzybów

Ten raport opisuje protokół przygotowania próbki i specyficzne warunki obrazowania do wykonywania skaningowej transmisyjnej tomografii elektronowej grubych próbek biologicznych.

Przygotowanie i obserwacja grubych próbek biologicznych metodą skaningowej transmisyjnej tomografii elektronowej

Ten protokół immunofluorescencyjnego znakowania zarówno białek wirusa roślinnego, jak i białek wektorów owadów w wyciętych jelitach owadów może być używany do badania interakcji między wirusem a owadami-wektorami, funkcji białek owadów i mechanizmów molekularnych leżących u podstaw transmisji wirusa.

Znakowanie immunofluorescencyjne białek wektorów wirusów roślinnych i owadów w jelitach pluskwiaka

Grzyby entomopatogeniczne zyskały na znaczeniu jako środki biologicznej kontroli szkodników rolniczych. W tym badaniu z powodzeniem przeprowadzono masową produkcję wystarczającej liczby odpornych zakaźnych propagul południowoafrykańskich izolatów zarówno Metarhizium robertsii, jak i M. pinghaense do komercyjnego stosowania przeciwko szkodnikom owadzim, przy użyciu rolnych produktów zbożowych.

Masowa produkcja grzybów entomopatogenicznych, Metarhizium robertsii i Metarhizium pinghaense, do komercyjnego stosowania przeciwko szkodnikom owadzim

Ten protokół jest skuteczną, szybką metodą hodowli drożdży i pleśni Aspergillus fumigatus z dużych zestawów próbek gleby w ciągu zaledwie 7 dni. Metody te można łatwo modyfikować w celu dostosowania do różnych pożywek inkubacyjnych i temperatur w zależności od potrzeb eksperymentów.

Izolacja drożdży i pleśni nadających się do hodowli z gleb w celu zbadania struktury populacji grzybów

Naucz się izolować grzyby entomopatogeniczne z próbek glebowych przy użyciu przynęty Tenebrio molitor. Metoda ECN pozwala wybrać szczepy o wysokiej zjadliwości i odporności na stres do biologicznej zwalczania szkodników.

Izolacja i selekcja grzybów entomopatogenicznych z próbek glebowych oraz ocena zjadliwości grzybów wobec szkodników owadzich

Przeglądaj więcej filmów