Izolacja i selekcja grzybów entomopatogenicznych z próbek glebowych oraz ocena zjadliwości grzybów wobec szkodników owadzich

Metoda izolacji grzybów entomopatogenicznych jest ważna dla opracowania środków kontroli mikrobiologicznej. Protokół ten może być stosowany do izolowania i selekcji entomopatogenicznych izolatów grzybów o wysokiej zjadliwości z próbek gleby. Technika ta obejmuje trzy etapy badania przesiewowego patogenności i łączy test termotolerancji i produkcji konidiów w celu stworzenia skutecznego rankingu liczby konidiów.

Metoda ta może pomóc w selekcji nowych izolatów grzybów o wysokiej zjadliwości i obiecujących entomopatogenach do komercjalizacji. Protokół ten koncentruje się na kontroli biologicznej, może być również wykorzystany do odkrycia entomopatogenicznych izolatów grzybów w celu zbadania interakcji między szkodnikami a grzybami entomopatogenicznymi. Procedurę zademonstrują Yao-Chia Liu i Nian-Tong Ni, mistrz z mojego laboratorium.

Rozpocznij od pobrania próbki gleby, usuwając jeden centymetr gleby z powierzchni, a następnie zbierając glebę na głębokości od pięciu do 10 centymetrów z każdego miejsca pobierania próbek za pomocą łopaty. Po zarejestrowaniu szczegółów każdego miejsca pobierania próbek, należy pobrać i przechowywać 100 gramów próbki gleby w plastikowej torbie w temperaturze pokojowej, aby w ciągu trzech godzin wykonać protokół izolacji grzybów. Aby wyizolować potencjalne grzyby entomopatogeniczne lub EPF, dodaj 100 gramów próbki gleby do plastikowego kubka i umieść pięć robaków Tenebrio molitor na powierzchni gleby w temperaturze pokojowej w ciemności przez dwa tygodnie, obserwując i rejestrując codziennie śmiertelność larw i grzybicy.

Martwą larwę należy przechowywać w kubku do dwóch tygodni w celu izolacji grzybów. Po dwóch tygodniach przenieś martwe owady na czystą ławkę i użyj sterylnej wykałaczki, aby zebrać konidia. Aby uzyskać pierwotną kulturę grzybów, zebrane konidia należy rozprowadzić na pożywce agarowej z dekstrozą Sabouraud o mocy ćwiartki mocy lub SDA na 55-milimetrowej płytce w celu inkubacji w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez siedem dni.

Ósmego dnia należy ponownie umieścić każdą podstawową kulturę grzybów na jednej 55-milimetrowej płytce SDA o ćwierć milimetra w okapie z przepływem laminarnym, a następnie inkubować kulturę w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez siedem dni, aby uzyskać pojedyncze kolonie grzybów. W pierwszym badaniu przesiewowym chorobotwórczości umieść pięć larw Tenebrio molitor bezpośrednio na powierzchni każdej czystej płytki kultury grzybów w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Po obserwacji i zarejestrowaniu grzybicy i śmiertelności przez 10 dni, należy wybrać izolaty grzybów do dalszej analizy.

Aby wykonać drugi test wirulencji, należy zebrać konidia z każdego izolatu grzyba, wirując przez jedną minutę i policzyć liczbę konidiów za pomocą hemocytometru. Po zakończeniu dostosuj zawiesinę konidiów do stężenia od jednego razy 10 do 1/7 konidiów na mililitr w 0,03% roztworze środka powierzchniowo czynnego, a następnie rozprowadź 10 mikrolitrów zawiesiny grzybów na 55-milimetrowej płytce SDA o ćwierć milimetra, aby rosła przez siedem dni w temperaturze 25 stopni Celsjusza w ciemności. Ósmego dnia umieść pięć larw Tenebrio molitor bezpośrednio na powierzchni każdej czystej płytki kultury grzybów i uszczelnij płytki folią Parafilm w celu inkubacji, obserwując grzybicę i śmiertelność, jak opisano wcześniej.

Po powtórzeniu drugiego testu wirulencji w trzech egzemplarzach dla każdego izolatu grzyba, należy wybrać izolaty do przeprowadzenia trzeciego testu wirulencji na docelowego szkodnika, takiego jak Spodoptera litura. Zbierz około jednego milimetra kwadratowego EPF z siedmiodniowej płytki SDA o ćwiartce mocy, aby wyekstrahować genomowe DNA grzyba za pomocą zestawu do ekstrakcji genomowego DNA grzyba. Następnie amplifikuj wewnętrzny transkrybowany przekład grzyba lub region ITS przez PCR próbki DNA zgodnie z programem PCR opisanym w manuskrypcie tekstowym.

Po zsekwencjonowaniu produktu amplifikowanego PCR za pomocą komercyjnej usługi sekwencjonowania, użyj NCBI BLAST, aby wyszukać podobne grzyby w bazie danych NCBI i wybrać względne gatunki grzybów do analizy filogenetycznej. Wyrównaj wiele sekwencji i ręcznie przytnij konserwatywny region sekwencji za pomocą GeneDoc. Wykonaj analizę filogenetyczną w oparciu o metody minimalnej ewolucji, łączenia sąsiadów i maksymalnego prawdopodobieństwa.

Aby zbadać morfologię grzybów, uchwyć wzrost kolonii kultur grzybów przez siedem dni za pomocą aparatu i zarejestruj wzrost, formę: puszystą lub jędrną oraz kolor kolonii. Aby zaobserwować konidia w konidioforach, zeskrob konidia z kolonii grzybów czystej kultury za pomocą pętli inokulacyjnej i przenieś zarodniki na szklane szkiełko zawierające 0,1% roztwór Tween 80. Za pomocą skalpela przeciąć blok agaru z kolonii grzybów, a następnie przenieść blok agaru na szklane szkiełko i dodać 0,1% roztwór Tween 80, aby zmyć większość nadmiaru konidiów na agrze.

Następnie przykryj szkiełko szkiełkiem nakrywkowym w celu lekkiej obserwacji mikroskopowej konidiów. Zmierz i zapisz szerokość i długość konidiów i konidioforów, aby porównać różnicę między różnymi izolatami grzybów. Zorganizować test produkcji konidialnej, hodując wybrany izolat grzyba na pożywce SDA o ćwierć mocy w temperaturze około 25 stopni Celsjusza w ciemności przez 10 dni.

Następnie przygotuj jedną mililitrową zawiesinę konidialną izolatu grzybów w 0,03% roztworze środka powierzchniowo czynnego, a następnie dostosuj stężenie do 1 razy 10 do 1/7 konidiów na mililitr, jak opisano wcześniej. Po dodaniu trzech kropelek 10 mikrolitrów zawiesiny konidialnej na płytce SDA o ćwiartce mocy, inkubuj kulturę w temperaturze 25 stopni Celsjusza w ciemności przez siedem, 10 i 14 dni, aby policzyć zarodnikowanie grzybów. W każdym punkcie czasowym odłącz pięciomilimetrowy blok agaru od środka kolonii za pomocą świdra korkowego i przenieś blok do 1,5-mililitrowej probówki mikrowirówkowej zawierającej jeden mililitr 0,03% roztworu środka powierzchniowo czynnego.

Po wirowaniu rurki z prędkością 3 000 obrotów na minutę w temperaturze pokojowej przez 15 minut, użyj hemocytometru, aby policzyć liczbę konidiów. Do testu termotolerancji należy wyhodować wybrany izolat grzybów i przygotować jeden raz po 10 do 1/7 konidiów na mililitr zawiesiny, jak pokazano wcześniej. Po wirowaniu podgrzej zawiesinę konidialną w suchej kąpieli w temperaturze 45 stopni Celsjusza w różnych odstępach czasu.

Po ekspozycji na ciepło dodaj trzy kropelki po pięć mikrolitrów zawiesiny konidialnej na 55-milimetrowej płytce SDA o ćwierć milimetra w każdym punkcie czasowym, a następnie inkubuj płytki w temperaturze około 25 stopni Celsjusza przez 18 godzin. Aby określić szybkość kiełkowania, policz liczbę kiełkujących zarodników konidiów z pięcioma losowo wybranymi polami pod mikroskopem świetlnym w 200-krotnym powiększeniu. Oblicz całkowitą efektywną liczbę konidiów lub ECN za pomocą wzoru, a następnie oblicz analizę głównych składników lub PCA szczepów grzybów zgodnie z opisem w manuskrypcie.

Wybierz najlepiej działające szczepy grzybów na podstawie ECN lub PCA, aby przeprowadzić test zjadliwości docelowych szkodników. W drugim teście wirulencji oceniono zjadliwość 26 izolatów grzybów wobec mącznika mącznika Tenebrio molitor. Do testu wirulencji przeciwko Spodoptera litura wybrano 12 izolatów grzybów o wysokiej zjadliwości.

Aby lepiej zrozumieć pozycje taksonomiczne grzybów, 26 izolatów z pierwszego badania przesiewowego patogenności poddano analizie molekularnej w oparciu o region ITS. Dzięki metodzie czyszczenia obserwacji morfologicznych grzybów, struktury konidioforów można było wyraźnie zobaczyć przy użyciu 0,1%Tween 80 roztworu. Kolor, kształt i ułożenie konidiów badano poprzez obserwacje mikroskopowe kolonii konidiów.

ECN łączy dane dotyczące produkcji konidiów i termotolerancji każdego EPF. Wysoką żywotność szczepu grzyba zaobserwowano, gdy wartość ECN była wysoka. Ujawniono również ścisłą koordynację między PCA a ECN, co sugeruje, że ECN może być wykorzystywana do oceny hierarchii parametrów związanych z rentownością.

W procedurze ważne są badania przesiewowe patogenności, ekstrakcja DNA grzyba i hodowla izolatu grzyba. Korzystając ze wzoru obliczeniowego ECN, można wybrać idealne wewnętrzne grzyby chorobotwórcze. Połączenie różnych gatunków owadów, takich jak woskowa i mącznik młynarka, w celu zwabienia grzybów entomopatogenicznych z próbek gleby, może zwiększyć różnorodność grzybów entomopatogenicznych.

Różnorodność mikroorganizmów w glebie jest bardzo interesującym tematem podczas funkcjonowania tego protokołu. Za pomocą tego protokołu można by również dalej badać w przyszłości.