Tkanka traktowana radioligandem aktywowanym fluorescencją (FACS-RTT) w celu określenia komórkowego pochodzenia sygnału radioaktywnego

Protokół ten jest komplementarny z obrazowaniem in vivo. Pozwala na ilościowe określenie typu komórki i poziomu komórkowego radioznaczników, które jest inną skalą niż ta uzyskana in vivo. Główną zaletą tej techniki jest jej czułość i rozdzielczość komórkowa uzyskana dzięki zastosowaniu radioligandów i sortowaniu komórek.

Włącz aparat i załaduj oprogramowanie operacyjne. Kliknij przycisk Home XYZ stage, aby wykonać bazowanie. Skonfiguruj eksperyment składający się z jednego 10-minutowego skanowania.

Ustaw tryb Step na dokładny, a tryb akwizycji na Listmode, aby rejestrować całe spektrum emisji. Ustaw łóżko i upewnij się, że system podgrzewania, czujnik oddechu i znieczulenie są sprawne i bezpieczne. Następnie umieść fantom w miejscu, w którym zostanie umieszczona głowa zwierzęcia.

Ustaw obszar skanowania, przesuwając kursory dla trzech wymiarów za pomocą trzech obrazów w dolnej części ekranu. Upewnij się, że objętość skanowania fantomu i zwierzęcia jest taka sama. Rozpocznij skanowanie fantomowe w celu późniejszej kalibracji z wcześniej ustalonymi parametrami.

Upewnij się, że pracujesz w odpowiednim środowisku, dopuszczonym do eksperymentów z udziałem promieniotwórczości. Inkubować 100 mikrogramów prekursora tributyliny w 100 mikrolitrach kwasu octowego z jodkiem sodu i pięciu mikrolitrach 37% kwasu paracetowego w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez 20 minut w termocyklerze umieszczonym w schowku na rękawiczki. Rozcieńczyć reakcję za pomocą 50% acetonitrylu w wodzie, aby osiągnąć objętość 500 mikrolitrów.

Wstrzyknąć 500 mikrolitrów rozcieńczonej reakcji do kolumny z odwróconymi fazami. Wyizolować CLINDE za pomocą HPLC o liniowym gradiencie, przebiegać od 5 do 95% ACN w siedmiomilimolowym kwasie fosforowym przez 10 minut. Rozcieńczyć izolat w wodzie, aby uzyskać końcową objętość 10 mililitrów, a następnie wstrzyknąć rozcieńczoną reakcję do kolumny zatężającej.

Eluować CLINDE z kolumny za pomocą 300 mikrolitrów absolutnego etanolu, a następnie odparować etanol poprzez inkubację w wirówce próżniowej w temperaturze pokojowej przez 40 minut. Rozcieńczyć pozostałość zawierającą CLINDE w 300 mikrolitrach soli fizjologicznej, aby uzyskać roztwór podstawowy. Po zmierzeniu jego radioaktywności rozcieńczyć roztwór podstawowy w soli fizjologicznej, aby otrzymać roztwór 0,037 megabekerela w 500 mikrolitrach.

Ustal krzywe kalibracyjne z zimnymi związkami odniesienia i rozwiąż równanie regresji liniowej: Y równe AX plus B, aby uzyskać współczynniki A i B. X reprezentuje masę zimnego związku, a Y reprezentuje obszar pod krzywymi. Sprawdź obszar pod krzywą radioligandu, mierząc absorbancję promieniowania ultrafioletowego przy 450 nanometrach w oparciu o krzywą kalibracyjną i obszar pod krzywą radioligandu.

Oszacuj masę i zmierz aktywność radioligandu. Upewnij się, że aktywność właściwa jest większa niż 1 000 gigabekereli na mikromol. Kliknij przycisk Aktualizuj obraz, aby zaktualizować pozycję zwierzęcia.

Ustaw obszar skanowania, przesuwając kursory za pomocą trzech obrazów w dolnej części ekranu dla trzech wymiarów. Skonfiguruj eksperyment na 60-minutowym skanie składającym się z 60 klatek po jedną minutę. Użyj ponownie wszystkich innych parametrów skonfigurowanych początkowo.

Wstrzyknąć 500 mikrolitrów radioaktywnego radioznacznika, a następnie przepłukać probówkę 300 mikrolitrami sterylnego 0,9% chlorku sodu. Jednocześnie kliknij Rozpocznij akwizycję, aby rozpocząć skanowanie. Otwórz oprogramowanie do rekonstrukcji skanowania, a następnie otwórz zestaw danych, szukając pliku parametrów nazwy pliku utworzonego w folderze skanowania.

Wybierz interesujący Cię izotop. Należy zauważyć, że parametr trybu listy umożliwia wybór wielu izotopów na tym etapie. Ustaw różne parametry rekonstrukcji, takie jak rozmiar woksela, liczba podzbiorów i iteracje, zgodnie z opisem w manuskrypcie.

Wybierz format wyjściowy jako NIFTI, a następnie wybierz opcję Rozpocznij rekonstrukcję SPECT. Użyj płaskiej metalowej szpatułki i żyletki, aby wypreparować obszary zainteresowania mózgu. Umieść tkanki w dwumililitrowej probówce wirówkowej i zważ uzyskaną tkankę.

Umieścić próbki w dwumililitrowej probówce wirówkowej z jednym mililitrem HBSS bez wapnia i magnezu, a następnie wirować przy 300 razy G przez dwie minuty w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant bez naruszania osadu. Dodaj 1 900 mikrolitrów enzymu, wymieszaj jeden i inkubuj przez 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, mieszając probówki przez inwersję co pięć minut. Dodaj 30 mikrolitrów mieszanki enzymatycznej dwa.

Delikatnie mieszaj pipetą o pojemności 1 000 mikrolitrów w przód iw tył 30 razy. Następnie inkubować mieszaninę przez 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, mieszając probówki przez odwrócenie co pięć minut. Delikatnie mieszaj tam iz powrotem za pomocą pipety o pojemności 200 mikrolitrów, a następnie pipety o pojemności 10 mikrolitrów, a następnie inkubuj mieszaninę przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby zdysocjować tkanki.

Przefiltruj komórki za pomocą sitka o długości 70 mikrometrów i dodaj 10 mililitrów HBSS bez wapnia i magnezu. Wirować przy 300 razy G przez 10 minut w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant bez naruszania osadu. W celu wyczerpania mieliny ponownie zawieś osad z 400 mikrolitrami buforu do usuwania mieliny, a następnie dodaj 100 mikrolitrów kulek do usuwania mieliny przed inkubacją przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Dodaj pięć mililitrów buforu do usuwania mieliny i odwiruj 300 razy G przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Dodaj 500 mikrolitrów buforu do usuwania mieliny i umieść zawieszone granulki w kolumnie pola magnetycznego. Przemyć kolumnę jednym mililitrem buforu do usuwania mieliny cztery razy.

Wirować przy 300 razy G przez dwie minuty w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant bez naruszania osadu. Krótko odwiruj, aby oddzielić komórki i dodaj pięć mikrolitrów bloku Fc CD32. Dodać 100 mikrolitrów mieszanki przeciwciał pierwszorzędowych będących przedmiotem zainteresowania i inkubować przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Wirować w temperaturze 350 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i usunąć supernatant bez naruszania osadu. Osusz probówki do góry nogami na miękkim papierze. Krótko przetrząsnąć probówkę, a następnie dodać 100 mikrolitrów mieszanki przeciwciał wtórnych i inkubować przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Dodaj jeden mililitr buforu do usuwania mieliny i powtórz wirowanie. Wyrzuć supernatant i osusz probówki do góry nogami na miękkim papierze. Ponownie zawiesić komórki w 250 mikrolitrach sterylnego PBS i przejść bezpośrednio do sortowania komórek.

Skan SPECT in vivo szczurów typu dzikiego wykazał większe wiązanie CLINDE w miejscu wstrzyknięcia lipopolisacharydu niż w przeciwległym obszarze mózgu. Próbki ex vivo, które poddano aktywowanej fluorescencją tkanki traktowanej radioligandem (FACS-RTT), wykazały obecność większej liczby miejsc wiązania CLINDE tylko w mikrogleju, co pokazuje, że komórkowym pochodzeniem sygnału CLINDE w ipsilateralnej stronie mózgu był mikroglej. Wzrost białka translokacyjnego lub wiązania TSPO po 12 miesiącach u szczurów TgF344-AD był ograniczony do astrocytów.

U 24-miesięcznych szczurów zaobserwowano wzrost wiązania TSPO z powodu zmian zarówno astrocytowych, jak i mikroglejowych. U starszych szczurów TgF344-AD astrocyty prążkowia wykazywały zmniejszoną gęstość 5HT2AR w porównaniu z typem dzikim. Nadekspresję TSPO zaobserwowano zarówno w astrocytach, jak i mikrogleju osób z AD w porównaniu z grupą kontrolną w tym samym wieku, gdy FACS-RTT wykonano na ludzkich próbkach pośmiertnych AD.

Podczas pracy z promieniotwórczością należy postępować zgodnie z instrukcją ochrony przed promieniowaniem i nosić odpowiedni sprzęt ochrony osobistej. Następnie, po zabiegu, należy upewnić się, że środowisko pracy zostało odkażone. Kwantyfikacja białek i analiza ekspresji genów mogą być łatwo przeprowadzone po tej procedurze na izolowanych populacjach komórek.