Name: Tkanka traktowana radioligandem aktywowanym fluorescencją (FACS-RTT) w celu określenia komórkowego pochodzenia sygnału radioaktywnego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: Poznaj metodę FACS-RTT do analizy ekspresji białek w chorobie Alzheimera na poziomie komórkowym z wykorzystaniem modelu szczura TgF344-AD. Technika ta umożliwia precyzyjną kwantyfikację radioligandów z wysoką rozdzielczością.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Szwajcarską Narodową Fundację Nauki (grant nr 320030-184713). Autorzy, BBT i KC, są wspierani przez Fundację Velux (projekt nr 1123). Autor ST otrzymał wsparcie od Szwajcarskiej Narodowej Fundacji Nauki (stypendium Early Post-Doc Mobility Scholarship, nr P2GEP3_191446), Fundacji Prof. Dr. Maxa Cloetty (stypendium Clinical Medicine Plus) oraz Fundacji Jeana i Madeleine Vachoux.

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały przeprowadzone w porozumieniu z Komisją Etyki ds. Eksperymentów na Ludziach i Zwierzętach Kantonu Genewskiego, Kantonalną Komisją ds. Etyki Badań (CCER) oraz Ogólnym Kierownictwem Zdrowia Kantonu Genewa (Szwajcaria), odpowiednio. Dane są przedstawiane zgodnie z wytycznymi Animal Research: Reporting In-vivo Experiments (ARRIVE).
1. Przygotowanie i kalibracja kamery SPECT
<ol>
	<li>Włącz kamerę, załaduj oprogramowanie operacyjne (patrz tabela materiałów). Kliknij przycisk Home XYZ Stage, aby wykonać bazowanie.</li>
	<li>Skonfiguruj eksperyment składający się z jednego 10-minutowego skanowania. Ustaw tryb Krok na Dokładny, a tryb Akwizycji na Listmode (aby rejestrować całe spektrum emisji).</li>
	<li>Ustaw łóżko i upewnij się, że system podgrzewania, czujnik oddechu i znieczulenie są sprawne i bezpieczne (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1A-D). Następnie umieść fantom (tj. 2 ml o znanym stężeniu 125I w probówce do mikrofuge o pojemności 2 ml), w którym zostanie umieszczona głowa zwierzęcia (wyśrodkowana na obszarze, <silna klasa = "xfig">Rysunek 1E).</li>
	<li>Ustaw obszar skanowania, przesuwając kursory dla trzech wymiarów za pomocą trzech obrazów w dolnej części ekranu. Upewnij się, że objętość skanowania fantomu i zwierzęcia jest taka sama.</li>
	<li>Rozpocznij skanowanie fantomowe w celu późniejszej kalibracji z parametrami ustalonymi w krokach 1.2-1.4.</li>
</ol>
2. Konfiguracja przestrzeni roboczej do obrazowania SPECT
<ol>
	<li>Oczyść miejsce pracy środkiem dezynfekującym wirusobójczym i połóż miękkie papiery na wszystkich powierzchniach.</li>
	<li>Upewnij się, że w odpowiednich zbiornikach jest wystarczająca ilość izofluranu i tlenu.</li>
	<li>Przygotuj cewnik 24 G, odcinając płetwy cewnika motylkowego, aby mieć wyraźniejszy widok żyły ogona szczura.</li>
	<li>Pokryj cewnik, wypełniając go całkowicie roztworem heparyny (25000 j./ml) po wyjęciu igły. Następnie umieść igłę z powrotem, aby uniknąć tworzenia się skrzepów krwi po wprowadzeniu cewnika.</li>
</ol>
3. [125I]Synteza radioznacznika CLINDE
UWAGA: Radioaktywność może mieć wystarczającą energię jonizacji, aby wpływać na atomy żywych komórek i uszkadzać ich materiał genetyczny (DNA).
<ol>
	<li>Upewnij się, że pracujesz w odpowiednim środowisku, dopuszczonym do eksperymentów z udziałem radioaktywności. 
	UWAGA: Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE) do pracy z radioaktywnością, w tym dozymetry na palcach i ciele. Staraj się zachować bezpieczną odległość od wszelkich źródeł radioaktywności.</li>
	<li>Inkubować 100 μg prekursora tributyliny w 100 μl kwasu octowego z jodkiem sodu (Na125I) (patrz tabela materiałów) i 5 μl 37% kwasu nadoctowego w temperaturze 70 °C przez 20 minut w termocyklerze umieszczonym w komorze rękawicowej.</li>
	<li>Rozcieńczyć reakcję przy użyciu 50% acetonitrylu (ACN) w wodzie, aby osiągnąć objętość 500 μl. Wstrzyknąć 500 μl rozcieńczonej reakcji na kolumnę z odwróconymi fazami (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Wyizolować [125I]CLINDE za pomocą gradientu liniowego HPLC przebiegać od 5%-95% ACN w 7 mM H3PO4 przez 10 minut. Rozcieńczyć izolat w H2O, aby uzyskać końcową objętość 10 ml, a następnie wstrzyknąć rozcieńczoną reakcję do kolumny zagęszczającej (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Eluować [125I]CLINDE z kolumny za pomocą 300 μl absolutnego etanolu, a następnie odparować etanol przez inkubację w wirówce próżniowej w temperaturze pokojowej przez 40 minut.</li>
	<li>Rozcieńczyć pozostałość zawierającą [125I]CLINDE w 300 μl sterylnego roztworu soli fizjologicznej w celu uzyskania roztworu podstawowego.</li>
	<li>Po zmierzeniu jego radioaktywności rozcieńczyć roztwór podstawowy w sterylnym roztworze soli fizjologicznej, aby otrzymać roztwór 0,037 MBq w 500 μl.</li>
	<li>Oczyść znacznik za pomocą HPLC (wysokosprawna chromatografia cieczowa). Określić czas elucji za pomocą wzorcowej kalibracji przy długości fali 450 nm i wyizolować pojedynczy pik promieniotwórczy. Wykonać wzorcową krzywą kalibracyjną przy użyciu siedmiu wzorcowych stężeń zimnego (nieradioaktywnego) CLINDE (0,1 μg, 0,5 μg, 0,75 μg, 1 μg, 1,5 μg, 2 μg i 5 μg w 400 μl roztworu o stężeniu 50% ACN). Ustalić czystość radiochemiczną, mierząc pojedynczy pik w chromatografii tlenowej (TLC) (fala radiowa). Upewnij się, że czystość radiochemikaliów przekracza 60%.</li>
	<li>Sprawdzić aktywność właściwą radioligandu mierzącą absorbancję promieniowania ultrafioletowego przy długości fali 450 nm oraz krzywe kalibracyjne ustalone dla zimnych związków odniesienia. Upewnij się, że aktywność właściwa jest większa niż 1000 GBq/μmol.</li>
</ol>
4. [125I]R91150 synteza radioznacznika
UWAGA: Upewnij się, że przestrzegasz tych samych zasad bezpieczeństwa, które zostały wymienione w sekcji syntezy CLINDE.
<ol>
	<li>Zmieszać 300 μg prekursora R91150 w roztworze 3 μl absolutnego etanolu, 3 μl lodowatego kwasu octowego, 15 μl wolnego od nośników Na125I (patrz tabela materiałów) (10 mCi) w 0,05 M NaOH i 3 μl 30% H2O2 . Inkubować przez 30 minut w komorze rękawicowej.</li>
	<li>Wstrzyknąć całą reakcję do kolumny z odwróconymi fazami (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Wyizolować [125I]R91150 za pomocą izokratycznej serii HPLC (ACN/woda 50/50, 10 mM bufor kwasu octowego) o natężeniu przepływu 3 ml/min.</li>
	<li>Rozcieńczyć [125I]R91150 w H2O do końcowej objętości 10 ml.</li>
	<li>Wstrzyknąć 10 ml rozcieńczonej reakcji do kolumny stężającej (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Eluować [125I]R91150 z kolumny z 300 μl absolutnego alkoholu etylowego.</li>
	<li>Odparować etanol przez inkubację w wirówce próżniowej w temperaturze pokojowej przez 40 minut.</li>
	<li>Rozcieńczyć pozostałość zawierającą [125I]R91150 w 300 μl soli fizjologicznej.</li>
	<li>Oczyść znacznik za pomocą HPLC. Oznaczyć czas elucji, stosując wzorcową kalibrację przy długości fali 450 nm i wyizolować pojedynczy pik promieniotwórczy. Ustalić czystość radiochemiczną, mierząc pojedynczy pik w TLC radiowym. Upewnij się, że czystość radiochemikaliów przekracza 98%.</li>
</ol>
5. Przygotowanie zwierząt
<ol>
	<li>Zważyć i znieczulić szczura TgF344-AD (samca lub samicę w wieku od 2 do 24 miesięcy) w komorze indukcyjnej z 3% izofluranem. Po głębokim znieczuleniu zmniejsz przepływ izofluranu do 2% (0,4 l/min, 100% O2) w komorze.</li>
	<li>Ułóż zwierzę na wstępnie ogrzanym łóżku wyposażonym w nos anestezjologiczny. Utrzymać izofluran na poziomie 2% (0,4 l/min, 100%O2).</li>
	<li>Nałóż żel do oczu zwierzęcia i potwierdź głębokość znieczulenia poprzez monitorowanie oddechu; w razie potrzeby dostosuj znieczulenie.</li>
	<li>Wykonaj wprowadzenie cewnika 24 G do żyły ogonowej.</li>
</ol>
6. Przejęcie SPECT
<ol>
	<li>Przenieś zwierzę na łóżko kamery wyposażone w poduszkę grzewczą o kontrolowanej temperaturze ustawioną na 38°C (<silna klasa="xfig">Rysunek 1E).</li>
	<li>Przymocuj głowę zwierzęcia do belki zgryzowej i zamocuj podpórki pod głowę.</li>
	<li>Skonfiguruj eksperyment na 60-minutowym skanie, składającym się z 60 klatek po 1 minutę. Użyj ponownie wszystkich pozostałych parametrów ustawionych w kroku 1. Kliknij przycisk Aktualizuj obraz, aby zaktualizować pozycję zwierzęcia.</li>
	<li>Ustaw obszar skanowania, przesuwając kursory za pomocą trzech obrazów w dolnej części ekranu dla trzech wymiarów.</li>
	<li>Wstrzyknąć 500 μl radioaktywnego radioznacznika ([125I]CLINDE lub [125I]R91150), a następnie przepłukać probówkę 300 μl sterylnego 0,9% NaCl. Jednocześnie kliknij Rozpocznij akwizycję, aby rozpocząć skanowanie.</li>
	<li>Podczas skanowania upewnij się, że zwierzę jest w stałym znieczuleniu z monitorowaniem częstości oddechów. W razie potrzeby należy dostosować przepływ izofluranu.</li>
	<li>Po zakończeniu skanowania szybko poddaj znieczulone zwierzę eutanazji przez dekapitację.</li>
</ol>
7. Rekonstrukcja skanu
<ol>
	<li>Otwórz oprogramowanie do rekonstrukcji skanowania (patrz Spis materiałów), a następnie otwórz zestaw danych, szukając pliku [nazwa_pliku].parameters, utworzonego w folderze skanowania.</li>
	<li>Wybierz interesujący Cię izotop. Należy zauważyć, że parametr Listmode umożliwia wybór wielu izotopów na tym etapie.</li>
	<li>Wybierz następujące parametry: rozmiar woksela 0,4 mm, 4 podzbiory (POS-EM), 6 iteracji (odpowiednik 24ME-EM), brak filtra końcowego i odpowiadający izotopowi korekcja rozpadu. Wybierz format wyjściowy na NIfTI, a następnie wybierz opcję Rozpocznij rekonstrukcję SPECT.</li>
</ol>
8. Ekstrakcja mózgu szczura
<ol>
	<li>W tym samym znieczuleniu, co procedura skanowania i po zapewnieniu stanu głębokiego znieczulenia zwierzęcia poprzez monitorowanie jego częstości oddechów, należy przystąpić do dekapitacji za pomocą gilotyny i szybko przenieść głowę na salę sekcyjną.</li>
	<li>Nożyczkami ostrożnie przeciąć skórę na czubku głowy od tyłu do przodu aż do środka oczu.</li>
	<li>Odetnij nadmiar mięśni wokół podstawy czaszki i kręgów szyjnych.</li>
	<li>Następnie ostrożnie umieść jedno ostrze nożyczek w otworze z tyłu czaszki, otworze wielkim, i usuń tylną część czaszki szczypcami chirurgicznymi.</li>
	<li>Następnie za pomocą szczypiec chirurgicznych ostrożnie usuń górną część czaszki. Czaszka starych samców szczurów może być gruba, usunięta jako małe kawałki, aby uniknąć uszkodzenia mózgu.</li>
	<li>Ostrożnie przetnij opony nożyczkami. Opony mózgowe mogą uszkodzić mózg podczas procesu ekstrakcji; Usuń go jako środek ostrożności.</li>
	<li>Po usunięciu górnej części czaszki odwróć głowę zwierzęcia i za pomocą małej płaskiej szpatułki ostrożnie wyciągnij mózg, przecinając nerw wzrokowy i trójdzielny.</li>
	<li>Ostrożnie przenieś mózg na płaską, czystą szklaną powierzchnię w celu przeprowadzenia sekcji na lodzie.</li>
	<li>Użyj płaskiej metalowej szpatułki i żyletki, aby wypreparować obszary zainteresowania mózgu. Umieść tkanki w probówce wirówkowej o pojemności 2 ml i zważ otrzymaną tkankę. Użyj sekcji mózgu bezpośrednio do izolacji komórek lub szybko zamroź ją w ciekłym azocie do późniejszego wykorzystania.</li>
</ol>
9. Izolacja komórek
<ol>
	<li>Upewnij się, że pracujesz w czystym i sterylnym środowisku. Zaleca się pracę w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II (BSC). Upewnij się, że rękawice i każdy element wyposażenia wprowadzany do BSC są sterylne.</li>
	<li>Aby przygotować komórki do sortowania komórek, postępuj zgodnie z protokołem Jaclyn M. Schwarz14. 
	UWAGA: W tym eksperymencie do przygotowania komórek użyto dostępnego na rynku zestawu do dysocjacji neuronów (patrz Tabela materiałów).
	<ol>
		<li>Umieścić próbki w probówce wirówkowej o pojemności 2 ml z 1 ml HBSS (bez Ca i Mg), a następnie odwirować (300 x g, 2 min, temperatura pokojowa = RT) i usunąć supernatant bez naruszania osadu.</li>
		<li>Dodać 1900 μl mieszaniny enzymatycznej 1 i inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C, mieszając probówki przez inwersję co 5 minut.</li>
		<li>Dodać 30 μl mieszanki enzymatycznej 2, delikatnie mieszać pipetą 1 (patrz tabela materiałów) tam i z powrotem 30 razy. Następnie inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C, mieszając probówki przez odwrócenie co 5 minut.</li>
		<li>Delikatnie mieszać w tę i z powrotem za pomocą pipety 2, a następnie pipety 3 przed inkubacją przez 10 minut w temperaturze 37 °C w celu dysocjacji tkanek.</li>
		<li>Przefiltruj komórki za pomocą sitka o wielkości 80 μm, dodaj 10 ml HBSS (bez Ca i Mg). Odwirować (300 x g, 10 min, RT) i usunąć supernatant bez naruszania osadu.</li>
		<li>W celu wyczerpania mieliny należy ponownie zawiesić osad za pomocą 400 μl buforu do usuwania mieliny (patrz tabela materiałów), a następnie dodać 100 μl kulek do usuwania mieliny (patrz tabela materiałów), a następnie inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Dodać 5 ml buforu do usuwania mieliny, odwirować (300 x g, 10 min, RT) i usunąć supernatant bez naruszania osadu.</li>
		<li>Dodać 500 μl buforu do usuwania mieliny i umieścić probówkę w kolumnie pola magnetycznego. Przemyć kolumnę czterokrotnie 1 ml buforu do usuwania mieliny.</li>
		<li>Odwirować (300 x g, 2 min, RT) i usunąć supernatant bez naruszania osadu. Krótko wirować (2 s), aby zdysocjować komórki i dodać 5 μl bloku Fc CD32. Ponownie wykonać wir i inkubować przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Dodać 100 μl mieszaniny przeciwciał pierwszorzędowych będących przedmiotem zainteresowania; inkubować przez 20 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Odwirować (350 x g, 5 min, 4 °C) i usunąć supernatant bez naruszania osadu. Osusz probówki do góry nogami na miękkim papierze.</li>
		<li>Po krótkim wirowaniu (2 s) dodać 100 μl mieszaniny przeciwciał drugorzędowych i inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Dodać 2 ml buforu do usuwania mieliny, odwirować (350 x g, 5 min, 4 °C) i usunąć supernatant bez naruszania osadu. Osusz probówki do góry nogami na miękkim papierze. Ponownie zawiesić komórki w 250 μl sterylnego PBS i przejść bezpośrednio do sortowania komórek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
10. Sortowanie komórek
<ol>
	<li>Przygotuj probówkę do mikrofuge z 500 μl sterylnego PBS do zebrania posortowanych komórek.</li>
	<li>Dodać 10 μl Hoechst na 1000 μl roztworu komórkowego, aby zabarwić jądra żywych komórek i odróżnić je od martwych komórek.</li>
	<li>Przenieść komórki tak szybko, jak to możliwe, do maszyny do sortowania komórek w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Najpierw posortuj komórki według rozproszenia do przodu i bocznego, a następnie posortuj komórki dodatnie Hoechst. Następnie posortuj komórki na podstawie interesujących Cię przeciwciał. Zbierz dodatnio zabarwione komórki oddzielnie. Upewnij się, że odróżniłeś komórki dodatnie od autofluorescencyjnych.</li>
	<li>Policz liczbę posortowanych komórek dla każdej puli zainteresowań.</li>
</ol>
11. Zliczanie gamma
<ol>
	<li>Skalibrować system liczenia γ za pomocą 10 μl tego samego roztworu fantomowego, który został użyty do kalibracji SPECT, ale rozcieńczyć go w 1 ml wody. 
	UWAGA: Roztwór fantomowy jest rozcieńczany ze względu na zwiększoną precyzję systemu liczenia γ.</li>
	<li>Umieść probówkę z posortowanymi komórkami w systemie zliczania γ i przystąp do liczenia γ zgodnie z protokołem producenta.</li>
</ol>

<ol><li>Nichols, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((regional%2C+and+national+burden+of+Alzheimer%27s+disease+and+other+dementias%2C+1990-2016%3A+a+systematic+analysis+for+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2016%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Neurology%22%5BJournal%5D)">regional, and national burden of Alzheimer's disease and other dementias, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016.</a> The Lancet Neurology. 18 (1), 88-106 (2019).</li>
<li>Kinney, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+as+a+central+mechanism+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimer%27s+%26+Dementia%22%5BJournal%5D)">Inflammation as a central mechanism in Alzheimer's disease.</a> Alzheimer's & Dementia. 4, New York, N. Y. 575-590 (2018).</li>
<li>D'Amelio, M., Puglisi-Allegra, S., Mercuri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+dopaminergic+midbrain+in+Alzheimer%27s+disease%3A+Translating+basic+science+into+clinical+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+Research%22%5BJournal%5D)">The role of dopaminergic midbrain in Alzheimer's disease: Translating basic science into clinical practice.</a> Pharmacological Research. 130, 414-419 (2018).</li>
<li>D'Amelio, M., Serra, L., Bozzali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ventral+tegmental+area+in+prodromal+Alzheimer%27s+disease%3A+Bridging+the+gap+between+mice+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Alzheimer%27s+Disease%3A+JAD%22%5BJournal%5D)">Ventral tegmental area in prodromal Alzheimer's disease: Bridging the gap between mice and humans.</a> Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 63 (1), 181-183 (2018).</li>
<li>Cohen, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgenic+Alzheimer+rat+with+plaques%2C+tau+pathology%2C+behavioral+impairment%2C+oligomeric+a%CE%B2%2C+and+frank+neuronal+loss%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A transgenic Alzheimer rat with plaques, tau pathology, behavioral impairment, oligomeric aβ, and frank neuronal loss.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (15), 6245-6256 (2013).</li>
<li>Morrone, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+differences+in+Alzheimer%27s+disease+pathology+confound+behavioural+rescue+after+amyloid-%CE%B2+attenuation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%3A+A+Journal+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Regional differences in Alzheimer's disease pathology confound behavioural rescue after amyloid-β attenuation.</a> Brain: A Journal of Neurology. 143 (1), 359-373 (2020).</li>
<li>Berkowitz, L. E., Harvey, R. E., Drake, E., Thompson, S. M., Clark, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+impairment+of+directional+and+spatially+precise+trajectories+by+TgF344-Alzheimer%27s+disease+rats+in+the+Morris+Water+Task%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Progressive impairment of directional and spatially precise trajectories by TgF344-Alzheimer's disease rats in the Morris Water Task.</a> Scientific Reports. 8 (1), 16153(2018).</li>
<li>Koulousakis, P., vanden Hove, D., Visser-Vandewalle, V., Sesia, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cognitive+improvements+after+intermittent+deep+brain+stimulation+of+the+nucleus+basalis+of+meynert+in+a+transgenic+rat+model+for+Alzheimer%27s+disease%3A+A+preliminary+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Alzheimer%27s+Disease%3A+JAD%22%5BJournal%5D)">Cognitive improvements after intermittent deep brain stimulation of the nucleus basalis of meynert in a transgenic rat model for Alzheimer's disease: A preliminary approach.</a> Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 73 (2), 461-466 (2020).</li>
<li>Tournier, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+reference+learning+deficits+in+absence+of+dysfunctional+working+memory+in+the+TgF344-AD+rat+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%2C+Brain%2C+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">Spatial reference learning deficits in absence of dysfunctional working memory in the TgF344-AD rat model of Alzheimer's disease.</a> Genes, Brain, and Behavior. , 12712(2020).</li>
<li>Tournier, B. B., Tsartsalis, S., Ceyzériat, K., Garibotto, V., Millet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+TSPO+signal+and+neuroinflammation+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">In vivo TSPO signal and neuroinflammation in Alzheimer's disease.</a> Cells. 9 (9), (2020).</li>
<li>Backes, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%5B11C%5Draclopride+and+extrastriatal+binding+to+D2%2F3+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroImage%22%5BJournal%5D)">[11C]raclopride and extrastriatal binding to D2/3 receptors.</a> NeuroImage. 207, 116346(2020).</li>
<li>Millet, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+dopamine+D%282%2F3%29+receptors+in+rat+brain+using+factor+analysis+corrected+%5B18F%5DFallypride+images%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroImage%22%5BJournal%5D)">Quantification of dopamine D(2/3) receptors in rat brain using factor analysis corrected [18F]Fallypride images.</a> NeuroImage. 62 (3), 1455-1468 (2012).</li>
<li>Tsartsalis, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+simplified+reference+tissue+model+for+the+quantification+of+dopamine+D2%2F3+receptors+with+%5B18F%5DFallypride+images%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Imaging%22%5BJournal%5D)">A modified simplified reference tissue model for the quantification of dopamine D2/3 receptors with [18F]Fallypride images.</a> Molecular Imaging. 13 (8), (2014).</li>
<li>Schwarz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+fluorescence-activated+cell+sorting+to+examine+cell-type-specific+gene+expression+in+rat+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Using fluorescence-activated cell sorting to examine cell-type-specific gene expression in rat brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52537(2015).</li>
<li>Tournier, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-activated+cell+sorting+to+reveal+the+cell+origin+of+radioligand+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-activated cell sorting to reveal the cell origin of radioligand binding.</a> Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 40 (6), 1242-1255 (2020).</li>
<li>Tournier, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytic+TSPO+upregulation+appears+before+microglial+TSPO+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Alzheimer%27s+Disease%3A+JAD%22%5BJournal%5D)">Astrocytic TSPO upregulation appears before microglial TSPO in Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 77 (3), 1043-1056 (2020).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Zgodnie z naszą wiedzą, technika ta była pierwszą, która opisała podejście, które pozwala lepiej zrozumieć zmiany wiązania radioznacznika in vivo na poziomie komórkowym. Protokół opisuje wieloskalową metodę ilościowego oznaczania wiązania radioznacznika na poziomie komórkowym na przykładzie [125I]CLINDE (TSPO) lub [125I]R91150 (5HT2AR).
Technika ta jest wystarczająco solidna i czuła, aby precyzyjnie wykryć pochodzenie komórkowe szerokiego spektrum zmia...

Choroby neurodegeneracyjne, takie jak choroba Alzheimera (AD), charakteryzują się utratą neuronów związaną ze wzrostem objawów. AD, najczęstsza przyczyna demencji, stanowiąca 60%-70% przypadków, dotyka około 50 milionów ludzi na całym świecie1. Na poziomie neuropatologicznym dwie główne cechy choroby Alzheimera to nagromadzenie zewnątrzkomórkowych blaszek β amyloidu (Aβ) i wewnątrzkomórkowych splątków neurofibrylarnych Tau. Zmiany w komórkach glejowych są również związane z AD2 i możliwym zakłóceniem kilku systemów neuroprzekaźników3,4.
Linia szczura TgF344-AD została zmodyfikowana do modelu AD poprzez ekspresję ludzkich transgenówAPP i PS1 ΔE9, co prowadzi do rozpuszczalnej i nierozpuszczalnej ekspresji Aβ-40 i Aβ-42 oraz tworzenia blaszek amyloidowych5. Przedstawia również akumulację hiperfosforylowanych form białka Tau prowadzących do tauopatii. W wieku od 9 do 24 miesięcy u szczurów stopniowo rozwijają się patologiczne cechy choroby Alzheimera i upośledzenia funkcji poznawczych5,6,7,8,9.
Pozytonowa tomografia emisyjna (PET), tomografia komputerowa z emisją pojedynczych fotonów (SPECT) i autoradiografia to techniki oparte na emisji i kwantyfikacji promieni γ. Radioznaczniki określa się ilościowo albo in vivo (PET i SPECT), albo ex vivo/in vitro (autoradiografia). Te czułe techniki przyczyniły się do zrozumienia mechanizmów wielu chorób mózgu, takich jak choroba Alzheimera. Rzeczywiście, jeśli chodzi o zapalenie układu nerwowego, istnieje wiele badań oceniających białko translokatora 18 kDa (TSPO), marker zapalenia układu nerwowego in vivo, z znakowanymi radioznakami, takimi jak [11C]-(R)-PK11195 lub [11C]PBR28 (w celu przeglądu, patrz10). Ponadto badano zmiany w układach neuroprzekaźników za pomocą radioznaczników11,12,13.
Jednak te techniki nie określają komórkowego pochodzenia sygnału radioaktywnego. Może to utrudnić interpretację biologicznych podstaw zmiany w wiązaniu radioligandu w PET/SPECT. Na przykład w przypadku badań TSPO nad zapaleniem nerwów niezwykle ważne jest zrozumienie, czy wzrost czy spadek TSPO jest spowodowany zmianami astrocytowymi czy mikroglejowymi. Aby obejść te problemy, opracowano technikę sortowania komórek aktywowanych fluorescencją do tkanki traktowanej radioligandem (FACS-RTT), umożliwiając ocenę wiązania radioligandów w każdym typie komórki z osobna oraz ilościowe określenie gęstości białka docelowego na komórkę. Ta innowacyjna technika jest zatem komplementarna i wysoce kompatybilna z obrazowaniem PET i SPECT.
Tutaj ta technika została zastosowana w dwóch osiach: badaniu zapalenia nerwów za pomocą radioligandów specyficznych dla TSPO i ocenie układu serotoninergicznego. Na pierwszej osi celem było zrozumienie komórkowego pochodzenia sygnału TSPO w odpowiedzi na ostrą reakcję zapalną. W związku z tym FACS-RTT zastosowano na tkankach mózgowych szczurów po indukcji zapalenia układu nerwowego poprzez wstrzyknięcie lipopolisacharydu (LPS) i po badaniu obrazowania in vivo [125I]clinde spect. Co więcej, te same obrazowanie i protokół FACS-RTT zastosowano na 12- i 24-miesięcznych szczurach TgF344-AD oraz pasujących szczurach typu dzikiego (WT). Druga oś miała na celu określenie pochodzenia zmian w układzie serotoninergicznym w tym modelu szczurzym poprzez ocenę ex vivo gęstości 5-HT2AR według typu komórki.

<table><tbody><tr><td>Kwas octowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioVet</td><td>BioVet</td><td></td><td>Oprogramowanie do kontroli parametrów życiowych</td></tr><tr><td>Bondclone C18 kolumna z odwróconymi fazami</td><td>Phenomenex, Schlieren, Szwajcaria</td><td></td><td></td></tr><tr>Szpital Uniwersytecki<td>Des-Sur</td><td>w Genewie</td><td></td><td>Wirusobójczy</td></tr><tr><td>blok Fc / anty-CD32</td><td>BD Biosciences</td><td>BDB550270</td><td>Reaktywność dla szczura</td></tr><tr><td>Anty-szczur CD90 sprzężony z FITC</td><td>202504</td><td></td><td>Reaktywność dla szczura</td></tr><tr><td>Heparyna</td><td>B. Braun</td><td>B01AB01</td><td></td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Knauer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Insyte-W 24 GA 0,75 CALA 0,7 x 19 mm</td><td>BD Biosciences</td><td>321312</td><td>Cewnik 24 G</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Baxter</td><td>ZDG9623</td><td></td></tr><tr><td>Lacryvisc</td><td>Alcon</td><td>2160699</td><td></td></tr><tr><td>LS Kolumny</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Miękka taśma Micropore</td><td>3M</td><td>F51DA01</td><td></td></tr><tr><td>MILabs-Uspect II</td> Oprogramowanie <td>MILabs</td><td></td><td>do kamery SPECT</td></tr><tr><td>MoFlo Astrios</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>Sortownik komórek</td></tr><tr><td>Koraliki do usuwania mieliny II</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-733</td><td>Zawiera kulki i bufor do usuwania mieliny.</td></tr><tr><td>NaCl 0,9% Sterylny roztwór</td><td>B. Braun</td><td>395202</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do dysocjacji neuronów (P)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-628</td><td>Zawiera mieszaniny enzymów, pipety 1, 2 i 3.</td></tr><tr><td>Arkusz siatki nylonowej</td><td>Amazon</td><td>CMN-0074-10YD</td><td>40 cali szerokości, siatka 80 mikronów</td></tr><tr><td>Kwas nadoctowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QuadroMACS Separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>R91150 pr&eacute; kursor</td><td>CERMN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sep-Pak C18 Kolumna</td><td>Wody</td><td></td><td>Kolumna Stężenie</td></tr><tr><td>kolumny Jodek sodu Na125</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prekursor tributyliny</td><td>CERMN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>U-SPECT Rec2.38c</td><td>MILabs</td><td>Wersja Rec2.38c</td><td>Oprogramowanie do rekonstrukcji obrazów</td></tr><tr><td>SPECT USPECT II</td><td>MILabs</td><td></td><td>Spect Camera</td></tr><tr><td>Wizard 3"</td> <td>Licznik gamma</td> <td>PerkinElmer</td><td></td></tr></tbody></table>

tkanka traktowana radioligandem aktywowanym fluorescencją (facs-rtt) w celu określenia komórkowego pochodzenia sygnału radioaktywnego

Fluorescence-Activated Cell Sorting-Radioligand Treated Tissue (FACS-RTT) to Determine the Cellular Origin of Radioactive Signal

Komórki glejowe prawdopodobnie mają znaczący wpływ na patofizjologię zaburzeń neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Alzheimera (AD). Ich zmiany są być może związane ze stanem prozapalnym. Szczep szczurzy TgF344-AD został zaprojektowany do ekspresji ludzkich genów APP i ludzkich genówPS1 ΔE9, kodujących białka amyloidowe Aβ-40 i Aβ-42 oraz wykazujących patologię amyloidu i deficyty poznawcze wraz ze starzeniem się. Model szczurzy TgF344-AD jest używany w tym badaniu do oceny komórkowego pochodzenia wiązania białka translokatora 18 kDa (TSPO, marker aktywacji komórek glejowych) oraz poziomów receptora serotoninowego receptora 5HT2A (5HT2AR), które mogą być zakłócone w AD. Przedstawiona tutaj technika to sortowanie komórek aktywowanych fluorescencją do tkanki traktowanej radioligandem (FACS-RTT), ilościowa technika specyficzna dla typu komórki, uzupełniająca techniki autoradiografii in vivo PET lub SPECT lub ex vivo/in vitro. Określa ilościowo ten sam znakowany radioizotopem, który był używany przed obrazowaniem, przy użyciu licznika γ po sortowaniu komórek cytometrycznych. Pozwala to na określenie pochodzenia komórkowego białka znakowanego radioaktywnie o wysokiej swoistości komórkowej i czułości. Na przykład badania z FACS-RTT wykazały, że (i) wzrost wiązania TSPO był związany z mikroglejem w szczurzym modelu zapalenia nerwów wywołanego lipopolisacharydem (LPS), (ii) wzrost wiązania TSPO po 12 i 18 miesiącach był związany najpierw z astrocytami, a następnie mikroglejem u szczurów TgF344-AD w porównaniu ze szczurami typu dzikiego (WT) oraz (iii) gęstość prążkowia 5HT2AR zmniejsza się w astrocytach po 18 miesiącach w tym samym szczurzym modelu AD. Co ciekawe, technikę tę można rozszerzyć na praktycznie wszystkie radioznaczniki.

Szczury typu WT poddano badaniu SPECT in vivo z użyciem radiotraceru [125I]CLINDE po jednostronnym wstrzyknięciu LPS (Rysunek 2). Skan ten (wykorzystujący zsumowane dane z obrazów z okresu 45–60 min po wstrzyknięciu radiotraceru) wykazał wyższe wiązanie [125I]CLINDE w miejscu wstrzyknięcia LPS (Rysunek 2A) niż w przeciwległym obszarze mózgu (Rysunek 2B). Próbki ex vivo poddane analizie FACS-RT...

Fluorescence-Activated Cell Sorting-Radioligand Treated Tissue (FACS-RTT) to potężne narzędzie do badania roli białka translokatora 18 kDa lub ekspresji receptora serotoniny5HT 2A w chorobie Alzheimera w skali komórkowej. Protokół ten opisuje zastosowanie ex-vivo FACS-RTT w modelu szczura TgF344-AD.

Tkanka traktowana radioligandem aktywowanym fluorescencją (FACS-RTT) w celu określenia komórkowego pochodzenia sygnału radioaktywnego

Glial cells probably have a considerable implication in the pathophysiology of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD). Their ...

Protokół ten jest komplementarny z obrazowaniem in vivo. Pozwala na ilościowe określenie typu komórki i poziomu komórkowego radioznaczników, które jest inną skalą niż ta uzyskana in vivo. Główną zaletą tej techniki jest jej czułość i rozdzielczość komórkowa uzyskana dzięki zastosowaniu radioligandów i sortowaniu komórek.Włącz aparat i załaduj oprogramowanie operacyjne. Kliknij przycisk Home XYZ stage, aby wykonać bazowanie. Skonfiguruj eksperyment składający się z jednego 10-minutowego skanowania.Ustaw tryb Step na dokładny, a tryb akwizycji na Listmode, aby rejestrować całe spektrum emisji. Ustaw łóżko i upewnij się, że system podgrzewania, czujnik oddechu i znieczulenie są sprawne i bezpieczne. Następnie umieść fantom w miejscu, w którym zostanie umieszczona głowa zwierzęcia.Ustaw obszar skanowania, przesuwając kursory dla trzech wymiarów za pomocą trzech obrazów w dolnej części ekranu. Upewnij się, że objętość skanowania fantomu i zwierzęcia jest taka sama. Rozpocznij skanowanie fantomowe w celu późniejszej kalibracji z wcześniej ustalonymi parametrami.Upewnij się, że pracujesz w odpowiednim środowisku, dopuszczonym do eksperymentów z udziałem promieniotwórczości. Inkubować 100 mikrogramów prekursora tributyliny w 100 mikrolitrach kwasu octowego z jodkiem sodu i pięciu mikrolitrach 37% kwasu paracetowego w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez 20 minut w termocyklerze umieszczonym w schowku na rękawiczki. Rozcieńczyć reakcję za pomocą 50% acetonitrylu w wodzie, aby osiągnąć objętość 500 mikrolitrów.Wstrzyknąć 500 mikrolitrów rozcieńczonej reakcji do kolumny z odwróconymi fazami. Wyizolować CLINDE za pomocą HPLC o liniowym gradiencie, przebiegać od 5 do 95% ACN w siedmiomilimolowym kwasie fosforowym przez 10 minut. Rozcieńczyć izolat w wodzie, aby uzyskać końcową objętość 10 mililitrów, a następnie wstrzyknąć rozcieńczoną reakcję do kolumny zatężającej.Eluować CLINDE z kolumny za pomocą 300 mikrolitrów absolutnego etanolu, a następnie odparować etanol poprzez inkubację w wirówce próżniowej w temperaturze pokojowej przez 40 minut. Rozcieńczyć pozostałość zawierającą CLINDE w 300 mikrolitrach soli fizjologicznej, aby uzyskać roztwór podstawowy. Po zmierzeniu jego radioaktywności rozcieńczyć roztwór podstawowy w soli fizjologicznej, aby otrzymać roztwór 0,037 megabekerela w 500 mikrolitrach.Ustal krzywe kalibracyjne z zimnymi związkami odniesienia i rozwiąż równanie regresji liniowej: Y równe AX plus B, aby uzyskać współczynniki A i B. X reprezentuje masę zimnego związku, a Y reprezentuje obszar pod krzywymi. Sprawdź obszar pod krzywą radioligandu, mierząc absorbancję promieniowania ultrafioletowego przy 450 nanometrach w oparciu o krzywą kalibracyjną i obszar pod krzywą radioligandu.Oszacuj masę i zmierz aktywność radioligandu. Upewnij się, że aktywność właściwa jest większa niż 1 000 gigabekereli na mikromol. Kliknij przycisk Aktualizuj obraz, aby zaktualizować pozycję zwierzęcia.Ustaw obszar skanowania, przesuwając kursory za pomocą trzech obrazów w dolnej części ekranu dla trzech wymiarów. Skonfiguruj eksperyment na 60-minutowym skanie składającym się z 60 klatek po jedną minutę. Użyj ponownie wszystkich innych parametrów skonfigurowanych początkowo.Wstrzyknąć 500 mikrolitrów radioaktywnego radioznacznika, a następnie przepłukać probówkę 300 mikrolitrami sterylnego 0,9% chlorku sodu. Jednocześnie kliknij Rozpocznij akwizycję, aby rozpocząć skanowanie. Otwórz oprogramowanie do rekonstrukcji skanowania, a następnie otwórz zestaw danych, szukając pliku parametrów nazwy pliku utworzonego w folderze skanowania.Wybierz interesujący Cię izotop. Należy zauważyć, że parametr trybu listy umożliwia wybór wielu izotopów na tym etapie. Ustaw różne parametry rekonstrukcji, takie jak rozmiar woksela, liczba podzbiorów i iteracje, zgodnie z opisem w manuskrypcie.Wybierz format wyjściowy jako NIFTI, a następnie wybierz opcję Rozpocznij rekonstrukcję SPECT. Użyj płaskiej metalowej szpatułki i żyletki, aby wypreparować obszary zainteresowania mózgu. Umieść tkanki w dwumililitrowej probówce wirówkowej i zważ uzyskaną tkankę.Umieścić próbki w dwumililitrowej probówce wirówkowej z jednym mililitrem HBSS bez wapnia i magnezu, a następnie wirować przy 300 razy G przez dwie minuty w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant bez naruszania osadu. Dodaj 1 900 mikrolitrów enzymu, wymieszaj jeden i inkubuj przez 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, mieszając probówki przez inwersję co pięć minut. Dodaj 30 mikrolitrów mieszanki enzymatycznej dwa.Delikatnie mieszaj pipetą o pojemności 1 000 mikrolitrów w przód iw tył 30 razy. Następnie inkubować mieszaninę przez 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, mieszając probówki przez odwrócenie co pięć minut. Delikatnie mieszaj tam iz powrotem za pomocą pipety o pojemności 200 mikrolitrów, a następnie pipety o pojemności 10 mikrolitrów, a następnie inkubuj mieszaninę przez 10 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby zdysocjować tkanki.Przefiltruj komórki za pomocą sitka o długości 70 mikrometrów i dodaj 10 mililitrów HBSS bez wapnia i magnezu. Wirować przy 300 razy G przez 10 minut w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant bez naruszania osadu. W celu wyczerpania mieliny ponownie zawieś osad z 400 mikrolitrami buforu do usuwania mieliny, a następnie dodaj 100 mikrolitrów kulek do usuwania mieliny przed inkubacją przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Dodaj pięć mililitrów buforu do usuwania mieliny i odwiruj 300 razy G przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Dodaj 500 mikrolitrów buforu do usuwania mieliny i umieść zawieszone granulki w kolumnie pola magnetycznego. Przemyć kolumnę jednym mililitrem buforu do usuwania mieliny cztery razy.Wirować przy 300 razy G przez dwie minuty w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant bez naruszania osadu. Krótko odwiruj, aby oddzielić komórki i dodaj pięć mikrolitrów bloku Fc CD32. Dodać 100 mikrolitrów mieszanki przeciwciał pierwszorzędowych będących przedmiotem zainteresowania i inkubować przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Wirować w temperaturze 350 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i usunąć supernatant bez naruszania osadu. Osusz probówki do góry nogami na miękkim papierze. Krótko przetrząsnąć probówkę, a następnie dodać 100 mikrolitrów mieszanki przeciwciał wtórnych i inkubować przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Dodaj jeden mililitr buforu do usuwania mieliny i powtórz wirowanie. Wyrzuć supernatant i osusz probówki do góry nogami na miękkim papierze. Ponownie zawiesić komórki w 250 mikrolitrach sterylnego PBS i przejść bezpośrednio do sortowania komórek.Skan SPECT in vivo szczurów typu dzikiego wykazał większe wiązanie CLINDE w miejscu wstrzyknięcia lipopolisacharydu niż w przeciwległym obszarze mózgu. Próbki ex vivo, które poddano aktywowanej fluorescencją tkanki traktowanej radioligandem (FACS-RTT), wykazały obecność większej liczby miejsc wiązania CLINDE tylko w mikrogleju, co pokazuje, że komórkowym pochodzeniem sygnału CLINDE w ipsilateralnej stronie mózgu był mikroglej. Wzrost białka translokacyjnego lub wiązania TSPO po 12 miesiącach u szczurów TgF344-AD był ograniczony do astrocytów.U 24-miesięcznych szczurów zaobserwowano wzrost wiązania TSPO z powodu zmian zarówno astrocytowych, jak i mikroglejowych. U starszych szczurów TgF344-AD astrocyty prążkowia wykazywały zmniejszoną gęstość 5HT2AR w porównaniu z typem dzikim. Nadekspresję TSPO zaobserwowano zarówno w astrocytach, jak i mikrogleju osób z AD w porównaniu z grupą kontrolną w tym samym wieku, gdy FACS-RTT wykonano na ludzkich próbkach pośmiertnych AD.Podczas pracy z promieniotwórczością należy postępować zgodnie z instrukcją ochrony przed promieniowaniem i nosić odpowiedni sprzęt ochrony osobistej. Następnie, po zabiegu, należy upewnić się, że środowisko pracy zostało odkażone. Kwantyfikacja białek i analiza ekspresji genów mogą być łatwo przeprowadzone po tej procedurze na izolowanych populacjach komórek.

fluorescence-activated-cell-sorting-radioligand-treated-tissue-facs

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Opisano technikę badania partycjonowania białek fluorescencyjnych w tratwach lipidowych błony plazmatycznej żywych komórek. Metoda ta wykorzystuje różnice w czasie dyfuzji białek znajdujących się wewnątrz lub na zewnątrz tratw lipidowych. Akwizycja danych może być przeprowadzana dynamicznie w warunkach kontrolnych lub po dodaniu leku.

Oznaczanie partycji sond znakowanych fluorescencyjnie w tratwach lipidowych w żywych komórkach metodą spektroskopii korelacyjnej fluorescencji (FCS)

Fibroblasty związane z nowotworem (CAFs) wspomagają inicjację, wzrost i progresję guza poprzez sygnalizację promującą proliferację, angiogenezę i stan zapalny. W niniejszej pracy opisujemy metodę izolacji czystych populacji prawidłowych fibroblastów oraz CAFs z pobranych na świeżo tkanek mysich i ludzkich za pomocą sortowania komórek, wykorzystując PDGFRα jako marker powierzchniowy.

Izolacja fibroblastów prawidłowych i związanych z nowotworem z tkanek świeżych za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS)

Źródło: Kim, H. i in., Wieloenzymowe przesiewowe badanie z użyciem wysokoprzepustowego systemu przesiewowe enzymów genetycznych. J. Vis. Exp. (2016)Ten film demonstruje metodę przesiewania genetycznego do wykrywania ekspresji enzymów z wykorzystaniem metagenomowych bibliotek fosmidów i chromogenicznych substratów. Cytometria przepływowa identyfikuje i izoluje pojedyncze komórki produkujące produkty kolorowe, umożliwiając wysokoprzepustowy selekcję aktywnych komórek ekspresujących enzymy.

Wykrywanie ekspresji docelowych enzymów w genetycznie modyfikowanych komórkach bakteryjnych

Wideo demonstruje test cytometrii przepływowej rezonansu fluorescencji (FRET) w celu wykrycia aktywności wysiewu agregatów białkowych wyizolowanych z próbek biologicznych. Komórki ssaków wykazujące ekspresję białek reporterowych tau są inkubowane z kompleksami transdukcji liposomów zawierającymi nasiona tau. Nasiona te pośredniczą w agregacji białek reporterowych, prowadząc do generowania dodatniego sygnału FRET w cytometrze przepływowym.

Technika cytometrii przepływowej FRET do wykrywania agregacji białek reporterowych indukowanej nasionami Tau

Celem tego protokołu jest użycie techniki sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) do sortowania określonych typów komórek nerwowych w celu późniejszej analizy ekspresji genów specyficznych dla typu komórki, markerów epigenetycznych i/lub ekspresji białek.

Wykorzystanie sortowania komórek aktywowanego fluorescencją do zbadania ekspresji genów specyficznych dla typu komórki w tkance mózgowej szczura

Tutaj prezentujemy protokół Fluorescencji Aktywowanego Sortowania Komórek (FACS) do badania molekularnych zmian w zespołach neuronalnych wyrażających Fos zarówno ze świeżej, jak i mrożonej tkanki mózgowej. Zastosowanie zamrożonej tkanki pozwala na izolację FACS wielu obszarów mózgu podczas wielu sesji, aby zmaksymalizować wykorzystanie cennych zwierząt osobistych.

Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) i analiza ekspresji genów neuronów eksprymujących fos ze świeżej i mrożonej tkanki mózgowej szczura

Zgłaszamy protokół wykorzystujący sortowanie komórek aktywowane fluorescencją do izolowania plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych (pDC) o wysokiej czystości ze szpiku kostnego myszy podatnych na toczeń do badań funkcjonalnych pDC.

Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją w celu oczyszczenia plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych ze szpiku kostnego myszy

W manuskrypcie opisujemy użycie testu reporterowego fluorescencji na bazie drożdży do identyfikacji składników komórkowych zaangażowanych w procesy transportu i zabijania podjednostki cytotoksycznej A toksyny roślinnej rycyny (RTA).

Prosty test reporterowy oparty na fluorescencji do identyfikacji składników komórkowych wymaganych do transportu toksyny rycynowej A (RTA) w drożdżach

Opisujemy protokół przedklinicznego śledzenia in vivo przerzutów nowotworowych. Opiera się on na reporterze radionuklidowo-fluorescencyjnym łączącym symporter jodku sodu, wykrywany przez nieinwazyjny [18F]tetrafluoroboran-PET, oraz białko fluorescencyjne w celu usprawnionego potwierdzenia ex vivo. Metoda ma zastosowanie do przedklinicznego śledzenia komórek in vivo poza biologią guza.

Obrazowanie genu reporterowego radionuklidowo-fluorescencyjnego w celu śledzenia progresji guza w modelach guzów gryzoni

Prezentujemy eksperymentalny protokół i proces analizy danych do przeprowadzenia dwukolorowej spektroskopii korelacji krzyżowej fluorescencji (FCCS) na żywo w połączeniu z transferem energii rezonansowej Förster (FRET) w celu zbadania dynamiki receptorów błonowych w żywych komórkach przy użyciu nowoczesnych technik znakowania fluorescencji.

Dwukolorowa spektroskopia korelacji krzyżowej fluorescencji w celu zbadania interakcji białko-białko i dynamiki białek w żywych komórkach

Poznaj metodę FACS-RTT do analizy ekspresji białek w chorobie Alzheimera na poziomie komórkowym z wykorzystaniem modelu szczura TgF344-AD. Technika ta umożliwia precyzyjną kwantyfikację radioligandów z wysoką rozdzielczością.

Tkanka traktowana radioligandem aktywowanym fluorescencją (FACS-RTT) w celu określenia komórkowego pochodzenia sygnału radioaktywnego (Wideo) | JoVE Journal

Tkanka traktowana radioligandem aktywowanym fluorescencją (FACS-RTT) w celu określenia komórkowego pochodzenia sygnału radioaktywnego

Przeglądaj więcej filmów