Name: Przygotowanie próbki za pomocą korelacyjnego mielenia wiązki jonów w 3D do tomografii krioelektronowej o wysokiej rozdzielczości (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: Poznaj metodę korelacyjnego mielenia wiązki jonów w 3D do tomografii krioelektronowej. Technika ta umożliwia precyzyjne lokalizowanie fluorescencyjnie znakowanych białek w komórkach ssaków, drożdży i bakterii, poprawiając wskazywanie rzadkich struktur komórkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Inga Wolf za wsparcie infrastruktury IT, Florianowi Beckowi za wsparcie obliczeniowe i Oda H. Schiøtz za krytyczną lekturę rękopisu. Finansowanie zostało częściowo zapewnione dzięki stypendium Alexandra von Humboldta dla powracających Philippa S. Erdmanna oraz długoterminowemu stypendium EMBO ALTF 764-2014 dla Floriana Wilflinga. Anna Bieber otrzymała stypendium doktoranckie Boehringer Ingelheim Fonds.

<ol><li>Beck, M., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-Electron+tomography%3A+Can+it+reveal+the+molecular+sociology+of+cells+in+atomic+detail%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cryo-Electron tomography: Can it reveal the molecular sociology of cells in atomic detail.</a> Trends in Cell Biology. 26 (11), 825-837 (2016).</li>
<li>Plitzko, M., Villa, E., Schaffer, M., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opening+windows+into+the+cell+focused-ion-beam+milling+for+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Opening windows into the cell focused-ion-beam milling for cryo-electron tomography.</a> Current Opinion in Structural Biology. 23, 771-777 (2013).</li>
<li>Schaffer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+cryo-focused+ion+beam+sample+preparation+aimed+at+in+situ+structural+studies+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Optimized cryo-focused ion beam sample preparation aimed at in situ structural studies of membrane proteins.</a> Journal of Structural Biology. 197 (2), 73-82 (2017).</li>
<li>Tegunov, D., Xue, L., Dienemann, C., Cramer, P., Mahamid, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-particle+cryo-EM+refinement+with+M+visualizes+ribosome-antibiotic+complex+at+3.5+%C3%85+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Multi-particle cryo-EM refinement with M visualizes ribosome-antibiotic complex at 3.5 Å in cells.</a> Nature Methods. 18 (2), 186-193 (2021).</li>
<li>Klein, S., Wachsmuth-Melm, M., Winter, S. L., Kolovou, A., Chlanda, P. Cryo-correlative light and electron microscopy workflow for cryo-focused ion beam milled adherent cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKlein%2C+S+%22Methods+in+Cell+Biology%22">Methods in Cell Biology</a>. 162, Elsevier Inc. 273-302 (2021).</li>
<li>Klein, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-correlation+on-lamella+cryo-CLEM+reveals+the+membrane+architecture+of+lamellar+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Post-correlation on-lamella cryo-CLEM reveals the membrane architecture of lamellar bodies.</a> Communications Biology. 4 (1), 1-12 (2021).</li>
<li>Arnold, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-Specific+Cryo-focused+ion+beam+sample+preparation+guided+by+3D+correlative+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Site-Specific Cryo-focused ion beam sample preparation guided by 3D correlative microscopy.</a> Biophysical Journal. 110 (4), 860-869 (2016).</li>
<li>Wilfling, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+selective+autophagy+pathway+for+phase-separated+endocytic+protein+deposits%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">A selective autophagy pathway for phase-separated endocytic protein deposits.</a> Molecular Cell. 80 (5), 764-778 (2020).</li>
<li>Scientific volume imaging, Nyquist calculator. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://svi.nl/NyquistCalculator">https://svi.nl/NyquistCalculator</a> (2021).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Huygens Professional version 19.04. , Scientific Volume Imaging. The Netherlands. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://svi.nl">http://svi.nl</a> (2021).</li>
<li>de Chaumont, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Icy%3A+an+open+bioimage+informatics+platform+for+extended+reproducible+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Icy: an open bioimage informatics platform for extended reproducible research.</a> Nature Methods. 9 (7), 690-696 (2012).</li>
<li>Arnold, J. 3DCT. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://3dct.semper.space/">https://3dct.semper.space/</a> (2021).</li>
<li>Klumpe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modular+platform+for+streamlining+automated+cryo-FIB+workflows%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">A modular platform for streamlining automated cryo-FIB workflows.</a> bioRxiv. , 444745(2021).</li>
<li>Wolff, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mind+the+gap%3A+Micro-expansion+joints+drastically+decrease+the+bending+of+FIB-milled+cryo-lamellae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Mind the gap: Micro-expansion joints drastically decrease the bending of FIB-milled cryo-lamellae.</a> Journal of Structural Biology. 208 (3), 0-3 (2019).</li>
<li>Buckley, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+cryo-lamella+preparation+for+high-throughput+in-situ+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Automated cryo-lamella preparation for high-throughput in-situ structural biology.</a> Journal of Structural Biology. 210 (2), 107488(2020).</li>
<li>Tacke, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+streamlined+workflow+for+automated+cryo+focused+ion+beam+milling%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">A streamlined workflow for automated cryo focused ion beam milling.</a> bioRxiv. , 963033(2020).</li>
<li>Zachs, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+automated%2C+sequential+focused+ion+beam+milling+for+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Fully automated, sequential focused ion beam milling for cryo-electron tomography.</a> eLife. 9, e52286(2020).</li>
<li>Fung, H. K. H. tools3dct. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://github.com/hermankhfung/tools3dct">https://github.com/hermankhfung/tools3dct</a> (2021).</li>
<li>Mastronarde, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+electron+microscope+tomography+using+robust+prediction+of+specimen+movements%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Automated electron microscope tomography using robust prediction of specimen movements.</a> Journal of Structural Biology. 152 (1), 36-51 (2005).</li>
<li>Yang, J. E., Larson, M. R., Sibert, B. S., Shrum, S., Wright, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CorRelator%3A+Interactive+software+for+real-time+high+precision+cryo-correlative+light+and+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">CorRelator: Interactive software for real-time high precision cryo-correlative light and electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 213 (2), 107709(2021).</li>
<li>Hagen, W. J. H., Wan, W., Briggs, J. A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implementation+of+a+cryo-electron+tomography+tilt-scheme+optimized+for+high+resolution+subtomogram+averaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Implementation of a cryo-electron tomography tilt-scheme optimized for high resolution subtomogram averaging.</a> Journal of Structural Biology. 197 (2), 191-198 (2017).</li>
<li>Bäuerlein, F. J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+architecture+and+cellular+interactions+of+polyQ+inclusions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">In situ architecture and cellular interactions of polyQ inclusions.</a> Cell. 171 (1), 179-187 (2017).</li>
<li>Toro-Nahuelpan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailoring+cryo-electron+microscopy+grids+by+photo-micropatterning+for+in-cell+structural+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Tailoring cryo-electron microscopy grids by photo-micropatterning for in-cell structural studies.</a> Nature Methods. 17 (1), 50-54 (2020).</li>
<li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).</li>
<li>Kaufmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+microscopy+using+standard+fluorescent+proteins+in+intact+cells+under+cryo-conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Super-resolution microscopy using standard fluorescent proteins in intact cells under cryo-conditions.</a> Nano Letters. 14 (7), 4171-4175 (2014).</li>
<li>Booy, F. P., Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-crinkling%3A+what+happens+to+carbon+films+on+copper+grids+at+low+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Cryo-crinkling: what happens to carbon films on copper grids at low temperature.</a> Ultramicroscopy. 48 (3), 273-280 (1993).</li>
<li>Krull, A., Buchholz, T. O., Jug, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise2void-Learning+denoising+from+single+noisy+images%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+IEEE+Computer+Society+Conference+on+Computer+Vision+and+Pattern+Recognition%22%5BJournal%5D)">Noise2void-Learning denoising from single noisy images.</a> Proceedings of the IEEE Computer Society Conference on Computer Vision and Pattern Recognition. 2019, 2124-2132 (2019).</li>
<li>Gorelick, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIE-scope%2C+integrated+cryo-correlative+light+and+FIB%2FSEM+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">PIE-scope, integrated cryo-correlative light and FIB/SEM microscopy.</a> eLife. 8, 1-15 (2019).</li>
<li>Delmic METEOR. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.delmic.com/en/products/cryo-solutions/meteor">https://www.delmic.com/en/products/cryo-solutions/meteor</a> (2021).</li>
<li>T. F. Scientific. iFLM. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/MSD/Datasheets/iflm-aquilos-datasheet-ds0366.pdf">https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/MSD/Datasheets/iflm-aquilos-datasheet-ds0366.pdf</a> (2021).</li>
<li>Mahamid, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid-crystalline+phase+transitions+in+lipid+droplets+are+related+to+cellular+states+and+specific+organelle+association%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Liquid-crystalline phase transitions in lipid droplets are related to cellular states and specific organelle association.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (34), 16866-16871 (2019).</li>
<li>Scher, N., Rechav, K., Paul-Gilloteaux, P., Avinoam, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+fiducial+markers+for+3D+correlative+cryo-fluorescence+and+FIB-SEM+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">In situ fiducial markers for 3D correlative cryo-fluorescence and FIB-SEM imaging.</a> iScience. 24 (7), 102714(2021).</li>
<li>Mahamid, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+focused+ion+beam+milling+and+lift-out+approach+for+site-specific+preparation+of+frozen-hydrated+lamellas+from+multicellular+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">A focused ion beam milling and lift-out approach for site-specific preparation of frozen-hydrated lamellas from multicellular organisms.</a> Journal of Structural Biology. 192, 262-269 (2015).</li>
<li>Schaffer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cryo-FIB+lift-out+technique+enables+molecular-resolution+cryo-ET+within+native+Caenorhabditis+elegans+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A cryo-FIB lift-out technique enables molecular-resolution cryo-ET within native Caenorhabditis elegans tissue.</a> Nature Methods. 16 (8), 757-762 (2019).</li>
<li>Wu, G. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-scale+3D+cryo-correlative+microscopy+for+vitrified+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Multi-scale 3D cryo-correlative microscopy for vitrified cells.</a> Structure. 28 (11), 1231-1237 (2020).</li>
<li>Liu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+super-resolution+protein+localization+correlated+with+vitrified+cellular+context%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional super-resolution protein localization correlated with vitrified cellular context.</a> Scientific Reports. 5, 13017(2015).</li>
<li>Weisenburger, S., Jing, B., Renn, A., Sandoghdar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryogenic+localization+of+single+molecules+with+angstrom+precision%5BTitle%5D)+AND+%22SPIE+NanoScience+%2B+Engineering%22%5BJournal%5D)">Cryogenic localization of single molecules with angstrom precision.</a> SPIE NanoScience + Engineering. 8815, (2013).</li>
<li>Tuijtel, M. W., Koster, A. J., Jakobs, S., Faas, F. G. A., Sharp, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+cryo+super-resolution+light+and+electron+microscopy+on+mammalian+cells+using+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Correlative cryo super-resolution light and electron microscopy on mammalian cells using fluorescent proteins.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1-11 (2019).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

1. Kluczowe etapy protokołu
Optymalizacja parametrów hodowli komórkowych i zagłębiania siatki ma fundamentalne znaczenie dla tego przepływu pracy. Na początku projektu warto zainwestować czas w optymalizację strategii tagowania, rozmieszczenia komórek i koralików fiducial oraz przetestowanie różnych parametrów przygotowania siatki i bibuły. Praca z optymalnie zamrożoną próbką wgłębną znacznie ułatwi dalsze przetwarzanie.
Podobnie jak w przypadku każdego eksperymentu TEM, wymagane są próbki ciała szklistego. W przypadku dużych komórek ssaków, takich jak HeLa, preferowane są 1-2 komórki na kwadrat siatki, ale komórki mogą być nadal szkliste przy większej gęstości. Opcjonalnie witryfikację można poprawić w komórkach ssaków (np. HEK293, HeLa) poprzez inkubację z 2,5-10% (v/v) glicerolem dodanym do pożywki hodowlanej 10 minut przed zanurzeniem23. Jeśli to możliwe, można zastosować wzór siatki, aby zapewnić idealne rozmieszczenie i rozmieszczenie komórek, poprawiając w ten sposób witryfikację i późniejszą korelację24.
Podczas gdy określone komórki mogą być wybierane podczas przepływu pracy, zbyt mała liczba komórek, które wykazują interesującą cechę biologiczną, znacznie zmniejszy ogólną przepustowość. Aby poprawić korelację w komórkach POI-dodatnich, należy stosować wystarczająco jasne fluorofory. Jest to szczególnie ważne na endogennych poziomach ekspresji. Odkryliśmy, że w warunkach kriogenicznych mVenus często działał lepiej niż EGFP ze względu na zwiększoną jasność25 i przesunięcie hipsochromiczne, co sprawia, że nadaje się do standardowych konfiguracji filtrów GFP w warunkach kriogenicznych26. W przypadku struktur docelowych nieprzypominających punktów należy również wziąć pod uwagę kompromis między długością fali a dokładnością lokalizacji (granica dyfrakcji Abbego).
Wydajna korelacja 3D wymaga również, aby siatki były stabilne mechanicznie i były obsługiwane z dużą ostrożnością. Podczas gdy można stosować standardowe siatki złote lub miedziane z podparciem węglowym, wskaźnik sukcesu można znacznie zwiększyć poprzez zastosowanie sztywniejszych folii SiO2 w zależności od projektu. Jednak nie ustalono jeszcze jednoznacznie, czy (a) stabilność mechaniczna, czy (b) dopasowanie współczynników rozszerzalności cieplnej (podłoże vs. folia) w celu zmniejszenia krio-marszczenia27, jest najważniejszym czynnikiem udanej korelacji 3D. Ponadto do zbierania delikatnych siatek Au można stosować naczynia pokryte polidimetylosiloksanem5.
Oprócz zapewnienia stabilności próbki, staranny dobór parametrów obrazowania FLM jest niezbędny do uzyskania wysokiej jakości stosów fluorescencyjnych, które nadają się do optymalnego celowania podczas mielenia FIB. W związku z tym zaleca się również testowanie różnych technik odszumiania28 lub dekonwolucji na danych FLM, ponieważ może to znacznie poprawić lokalizację sygnałów referencyjnych i komórkowych. Podczas korelacji sygnału fluorescencji z obrazami FIB-SEM ważne jest dobre próbkowanie kulek odniesienia. Powinny być dobrze rozmieszczone wokół komórek i możliwie na różnych wysokościach z. Dobrą praktyką jest również walidacja spójności korelacji poprzez sprawdzenie przewidywanych i rzeczywistych pozycji koralików, które zostały celowo pominięte w modelu odniesienia, ale mogą być wyraźnie skorelowane na oko. Wartości RMSE 3DCT powinny być również zawsze brane pod uwagę w celu sprawdzenia spójności rejestracji.
Ponieważ osadzanie się zmielonego materiału i resztkowej wody z komory FIB-SEM (tj. ponowne zanieczyszczenie) zwiększa efektywną grubość lameli poprzez dodanie materiału amorficznego po obu jej stronach, utrzymywanie drobno zmielonych lameli w mikroskopie przez dłuższy czas na ogół obniża jakość danych TEM z powodu dodatkowych zdarzeń rozpraszania elektronów. W związku z tym frezowanie najczęściej odbywa się w dwóch etapach: najpierw wszystkie pozycje są frezowane z grubsza (tj. do około 800 nm), a następnie drobno (do ~150-250 nm), a siatka jest rozładowywana natychmiast po zakończeniu ostatniej lameli. Lepszy sukces korelacji można jednak osiągnąć poprzez obróbkę interesujących pozycji w sposób specyficzny dla danego miejsca, a więc wykonywanie frezowania zgrubnego i dokładnego na tej samej lameli bezpośrednio po drugiej, ponieważ nie pozostawia to czasu na zginanie lub deformację. Zmniejsza to jednak maksymalną liczbę lameli, które można wyprodukować na siatkę, w zależności od szybkości ponownego zanieczyszczenia systemu. Przy wydajności 20 nm/h w ciągu 1-1,5 godziny wytwarza się 4-6 lameli.
Ruch całej siatki lub zgrubnie frezowanych lameli >300 nm spowoduje słabą lub nieudaną korelację (patrz również ograniczenia omówione poniżej). Dlatego należy go regularnie sprawdzać, np. porównując obrazy IB przed, w trakcie i po frezowaniu FIB. Miejsca, które wykazują znaczny ruch (>300 nm), należy wyrzucić. Zoptymalizuj przygotowanie próbki (tj. wybór typu siatki, gęstości komórek i parametrów zagłębiania; patrz rozdział 1 protokołu) i strategię mielenia, aby uniknąć tych ruchów. Gięcie lameli można znacznie zmniejszyć, frezując na miejscu, jak opisano w kroku 3.6 i zmniejszając szerokość lameli. Jak wspomniano wcześniej, chociaż nacięciaodprężające 15 zostały zaprojektowane w celu zmniejszenia wyginania się lameli, często skutkują one skoordynowanym ruchem odsprzężonej lameli, skutecznie zapobiegając w ten sposób korelacji. Do rozwiązania tego problemu można zastosować zintegrowane systemy FLM.
2. Modyfikacje i rozwiązywanie problemów z metodą
Zdecydowanie zaleca się przeprowadzenie dokładnej charakterystyki próbki w obrazowaniu żywych komórek przed przejściem do warunków kriogenicznych. Optymalizacja próbek komórkowych, schematów leczenia i wiedza o tym, jakiego rodzaju sygnału należy się spodziewać przed wejściem do krioprzepływu pracy, może znacznie poprawić jego wskaźnik sukcesu.
W przedstawionym tutaj przepływie pracy samodzielny mikroskop fluorescencyjny z kriostolikiem służy do obrazowania próbek, a następnie przenosi siatki do mikroskopu z skupioną wiązką jonów. Został on jednak przetestowany na systemach, w których mikroskop fluorescencyjny jest zintegrowany z komorą FIB-SEM, a zatem do uzyskania obrazów fluorescencyjnych nie jest wymagane przenoszenie próbki 29,30,31. Korzystając z takich zintegrowanych systemów, można obrazować interesujące pozycje w trakcie i po mieleniu FIB w celu sprawdzenia obecności docelowego sygnału fluorescencji bez zwiększania ryzyka zanieczyszczenia końcowych lameli. Należy jednak pamiętać o parametrach optycznych stosowanych mikroskopów, ponieważ np. obiektyw o niskim NA ograniczy precyzję, z jaką można zlokalizować kulki referencyjne i sygnały docelowe. Niemniej jednak, zintegrowane konfiguracje FLM pomogą również lepiej radzić sobie z niewielkimi deformacjami siatek i lameli, ponieważ stosy FLM mogą być stale aktualizowane i porównywane z aktualnymi widokami SEM i IB.
Jako alternatywę dla obrazowania fluorescencyjnego blaszki pomiędzy mieleniem FIB a akwizycją danych TEM, korelacja post-TEM może być wykorzystana do weryfikacji prawidłowego rozmieszczenia i frezowania lameli 5,6.
Na wszystkich etapach przepływu pracy korelacyjnej, ale szczególnie podczas TEM, zaleca się tworzenie nakładki rzutowanych danych fluorescencyjnych na obrazy FIB-SEM/TEM. Takie klasyczne widoki CLEM pomagają bardziej intuicyjnie zrozumieć, która część komórek jest zawarta w blaszkach. Służy to również jako przydatna kontrola poprawności w celu zweryfikowania dokładności korelacji.
3. Ograniczenia metody
Podejście FIB oparte na korelacji 3D wymaga próbek, które mogą być dostarczane z kulkami odniesienia. W związku z tym metoda ta jest obecnie ograniczona do siatek zamrażanych wgłębnie. W przypadku próbek (tkankowych) zamrożonych pod wysokim ciśnieniem (HPF) można obecnie wykonać tylko korelacje 2D-2D. Potencjalnie rozwiązaniem tego problemu mogą być wewnętrzne markery odniesienia (np. organelle, barwione kropelki lipidów)32,33. Ostateczny wskaźnik powodzenia korelacji zależy od wielu czynników, w tym jakości próbki, ustawienia mikroskopii fluorescencyjnej, grubości lameli i wielkości docelowej struktury. Szacuje się, że dokładność korelacji przy użyciu opisanego podejścia do rejestracji 3D mieści się w zakresie 200-300 nm na końcowym obrazie IB, co w przybliżeniu odpowiada typowej grubości lameli frezowanych FIB7. W związku z tym struktury komórkowe znacznie mniejsze niż ta będą obecnie trudne do ukierunkowania. Dodatkowo, nadmierny ruch w miejscu frezowania (>300 nm) również zmniejsza dokładność korelacji, co jest problemem, który potencjalnie można rozwiązać za pomocą konfiguracji FLM zintegrowanych z instrumentami FIB/SEM. Lamele, które wykazują silne odkształcenia lub wygięcia podczas frezowania, powinny być w każdym przypadku wyłączone z dalszego przepływu pracy.
Ogólnie rzecz biorąc, obrazowanie kriofluorescencyjne jest obecnie ograniczone przez kryterium dyfrakcji Abbego. Dzięki bardziej rutynowemu zastosowaniu (i komercjalizacji) superrozdzielczych metod cryo-FLM, możliwe może stać się dokładniejsze celowanie w struktury komórkowe, zwłaszcza po zintegrowaniu z FIB/SEM do operacji w locie.
4. Znaczenie metody
Zwłaszcza w porównaniu z technikami nieukierunkowanymi i post-korelacji, skorelowane z 3D podejście do frezowania FIB pozwala na wybór odpowiednich pozycji przed czasochłonnym i zasobochłonnym etapem TEM. W ten sposób umożliwia bardziej efektywne gromadzenie danych i planowanie projektów. Co więcej, skorelowane dane dotyczące fluorescencji dodają warstwę informacji, które mogą mieć kluczowe znaczenie dla interpretacji tomogramów i integracji wyników krio-ET w projektach wieloskalowych, zwłaszcza gdy mamy do czynienia z nieustrukturyzowanymi zespołami białek lub zbyt małymi, aby można było dopasować matrycę i uśrednić subtomogram.
5. Znaczenie i potencjalne przyszłe zastosowania
W połączeniu z zaawansowanymi procesami pracy, takimi jak kriolifting z próbek HPF34,35, krio-FIB-SEM objętość36 i obrazowanie fluorescencyjne w superrozdzielczości 26,37,38,39, przygotowanie lameli ukierunkowanych na 3D daje perspektywę nie tylko preparowania procesów biologicznych w izolowanych komórkach, ale także udostępnienia tkanek i próbek pacjentów do mielenia FIB i kriotomografii elektronowej. W związku z tym pozwoli na analizę procesów patologicznych w wysokiej rozdzielczości, a tym samym będzie integralnym elementem konstrukcyjnym biopsji w nanoskali.

Mielenie skupionej wiązki jonów pozwala na przygotowanie cienkich próbek biologicznych z próbek krioutrwalonych bez problemów często związanych z mechanicznymi cięciami, takich jak ślady noża i artefakty kompresji1. W połączeniu z krio-tomografią elektronową, mielenie FIB umożliwia badania biologiczne morfologii komórek w wysokiej rozdzielczości i określanie struktury kompleksów makromolekularnych bezpośrednio z wnętrza komórek w rozdzielczości subnanometrowej2,3,4. Podczas gdy liczne gatunki, takie jak rybosomy, można łatwo znaleźć w losowo pociętych blaszkach FIB, wiele procesów komórkowych opiera się na kolokalizacji kilku kompleksów lub jest zlokalizowanych w określonych miejscach w komórce. W związku z tym konieczne jest skuteczne ukierunkowanie, aby nie utracić interesującej cechy biologicznej podczas procesu mielenia i ograniczyć się do przypadkowych trafień. Konieczne jest zatem podejście korelacyjne, które łączy dane ze skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM)-FIB i mikroskopu światła kriofluorescencyjnego (FLM). Chociaż możliwe jest pominięcie początkowej korelacji i połączenie danych FLM i cryo-ET dopiero po akwizycji TEM5,6, mielenie skupionej wiązki jonów sterowane fluorescencją umożliwia dokładny wybór obszaru mielenia z wyprzedzeniem, co skutkuje bardziej efektywnym pozyskiwaniem danych. Od momentu powstania7, zastosowanie korelowanego 3D mielenia FIB w badaniach biologicznych było ograniczone, aż do niedawna, kiedy poinformowaliśmy o zidentyfikowaniu nowego komory ciecz-ciecz rozdzielanego fazowo (LLPS) w drożdżach przy użyciu tej techniki8.
Opisany tutaj jest uogólniony protokół kriokorelowanej mikroskopii świetlnej i elektronowej 3D (CLEM), który może być używany do badania szerokiej gamy próbek, od bakterii po drożdże i komórki ssaków. Chociaż eksperymenty zostały przeprowadzone przy użyciu określonego zestawu instrumentów, poszczególne kroki nie są powiązane z konkretnym sprzętem i mogą być łatwo przeniesione do innych systemów jako rozszerzenie istniejących protokołów3,5. Lista testowanych urządzeń i sugerowane ustawienia znajdują się w Tabeli materiałów i Tabeli 1. Cztery kluczowe etapy procesu to: (1) przygotowanie próbki, (2) lokalizacja interesujących cech za pomocą mikroskopii kriofluorescencyjnej, (3) korelowane 3D mielenie skupionej wiązki jonów oraz (4) lokalizacja docelowych struktur do pozyskiwania danych krio-ET na lamelach w kriotransmisyjnym mikroskopie elektronowym (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).

<table><tbody><tr><td>Autogrids</td><td>Thermo Fisher Scientific / Domowe</td><td>1036173 (bez wycięcia), 1205101 (z wycięciem)</td><td></td></tr><tr><td>C-ringi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1036171</td><td></td></tr><tr><td>Corrsight z modułem kriogenicznym</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>FLM Alternatywa 1</td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne COOH</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>65011</td><td>zalecany 1 &mikro; m koraliki referencyjne</td></tr><tr><td>EM Grids R1/4 SiO2</td><td>Quantifoil</td><td>N1-S13nAu20-01</td><td></td></tr><tr><td>Kamera Falcon 4 z filtrem energii po kolumnie Selectris X</td><td>Kamera/filtr</td>naukowy <td>Thermo Fisher</td><td></td> Alternatywa 1</tr><tr><td>FIB Aquilos 1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>FIB Alternatywa 1</td></tr><tr><td>FIB Aquilos 2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>FIB Alternatywa 2</td></tr><tr><td>FIB Quanta 3D FEG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>FIB Alternatywa 3</td></tr><tr><td>FIB Scios</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>FIB Alternatywa 4</td></tr><tr><td>Kamera szczytowa K2 z pokolumnowym filtrem energetycznym 968 Quantum K2</td><td>Alternatywa</td><td></td> dla <td>kamery/filtra Quantum</td>K2</tr> 2 <tr><td>Leica TCS SP8 z modułem kriogenicznym</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>FLM Alternative 2</td></tr><tr><td>Odkurzacz plazmowy PDC-3XG</td><td></td> Arkusz teflonowy Harrick <td></td><td></td></tr><tr><td>(0,25 mm)</td><td>plastx24.de</td><td>11645</td><td>Przycięte do tych samych wymiarów co bibuła filtracyjna</td></tr><tr><td>TEM Titan Krios XFEG 300 kV Gi2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>TEM Alternatywa 1</td></tr><tr><td>TEM Titan Krios XFEG 300 kV Gi4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>TEM Alternatywa 2</td></tr><tr><td>Imager THUNDER&nbsp; EM Cryo CLEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>FLM Alternative 3</td></tr><tr><td>Vitrobot Mark IV</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>alternatywnie użyj tłoka ręcznego</td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna Whatman</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10311807</td><td>średnicy 55 mm; musi być przycięty, aby pasował do Vitrobot</td></tr></tbody></table>

przygotowanie próbki za pomocą korelacyjnego mielenia wiązki jonów w 3d do tomografii krioelektronowej o wysokiej rozdzielczości

Sample Preparation by 3D-Correlative Focused Ion Beam Milling for High-Resolution Cryo-Electron Tomography

Krioelektronowa tomografia (cryo-ET) stała się metodą z wyboru do badania ultrastruktury komórkowej i kompleksów molekularnych w ich naturalnym, zamrożonym i uwodnionym stanie. Jednak cryo-ET wymaga, aby próbki były wystarczająco cienkie, aby nie rozpraszać ani nie blokować padającej wiązki elektronów. W przypadku grubych próbek komórkowych można to osiągnąć przez mielenie wiązką jonów krioogniskowanych (FIB). Protokół ten opisuje, w jaki sposób celować w określone miejsca komórkowe podczas mielenia FIB przy użyciu podejścia korelacyjnego 3D, które łączy dane z trójwymiarowej mikroskopii fluorescencyjnej z informacjami ze skaningowego mikroskopu elektronowego FIB. Korzystając z tej techniki, rzadkie zdarzenia i struktury komórkowe mogą być celowane z dużą dokładnością i wizualizowane w rozdzielczości molekularnej za pomocą kriotransmisyjnej mikroskopii elektronowej (cryo-TEM).

Protokół zawiera szczegółowy opis procedury wykorzystanej do odkrycia zależnych od białka Ede1 (EH domain-containing and endocytosis protein 1) endocytycznych złogów białkowych (END) oraz ich degradacji i uwięzienia w ciałkach autofagicznych8. END to przedział powstały w wyniku separacji faz ciecz-ciecz (LLPS) w S. cerevisiae, który pełni rolę bufora dla różnych białek zaangażowanych w endocytozę zależną od klatryny (CME) po niepowodzeniu zdarzeń endocytycznych. Jednym z jego głównych składników jest Ede1, który pełni podwójną funkcję: komponentu CME oraz selektywnego receptora autofagii odpowiedzialnego za degradację tego nowego przedziału LLPS. W związku z tym, w celu wizualizacji END, zastosowano fuzję Ede1 z EGFP (EGFP-Ede1) pod kontrolą promotora dehydrogenazy alkoholowej (ADH), ponieważ nadekspresja Ede1 zakłóca wczesne etapy endocytozy, a tym samym konstytutywnie indukuje LLPS.
Na siatce zamrożonej metodą plunge-freezing z komórkami drożdży nadekspresującymi EGFP-Ede1 oraz markerami fiducyjnymi 1 µm wybrano pięć pozycji do akwizycji stosów FLM w kanale GFP (Rycyna 6A; TFS Corrsight; tryb konfokalny, krok ogniskowania 300 nm, zakres 10 µm). Siatkę przeniesiono do urządzenia FIB (Quanta 3D FEG), a pola siatki, dla których wykonano stosy FLM, zidentyfikowano poprzez przeprowadzenie korelacji 2D-2D obrazów przeglądowych fluorescencyjnych i SEM (por. krok 3.2).
Dla każdego z wybranych kwadratów wykonano obrazy wiązką jonową przy niskim natężeniu prądu (10 pA, powiększenie 1200x), a odpowiadające im pozycje znaczników zarejestrowano w 3DCT. Po wybraniu pozycji zawierających interesujące cechy biologiczne i dopasowaniu ich pozycji 3D w stosie FLM, wyznaczoną transformację zastosowano do domniemanych pozycji END i wybrano miejsca do przygotowania lameli (Rycina 6B). W przedstawionych tutaj przykładach zastosowano wiązkę FIB nachyloną pod kątem 11° względem powierzchni siatki (wstępne nachylenie szybkotoku FIB 45°; nachylenie stolika 18°). Pozycje z obszarów zainteresowania zostały przeniesione, a wzory FIB narysowano ręcznie (Rycina 6D), mierząc odległość przewidywanych pozycji względem wyraźnych punktów orientacyjnych na obrazie FIB (np. otworów, zanieczyszczeń lodowych, kulek znaczników). Dokładność rejestracji oceniono poprzez celowe pominięcie kulek, które można było jednoznacznie zidentyfikować na obrazach FLM i IB, a następnie porównanie ich rzeczywistych i przewidywanych pozycji w widoku wiązki jonowej (np. romb na Rycynie 6B,C). Stwierdzono, że korelacja dla kwadratu pokazanego na Rycynie 6C była dokładna (tj. przewidywane pozycje kulek FLM idealnie pokrywały się z ich odpowiadającymi lokalizacjami w IB, a 3DCT raportowało subpikselowe wartości RMSE dla rejestracji). W związku z tym lamelie wycięto w przewidywanych pozycjach (Miejsce B) i poddano precyzyjnemu frezowaniu do grubości ~200 nm (końcowy offset wzoru).
<img alt="Rysunek 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62886/62886fig06.jpg" /> 
Rysunek 6: Reprezentatywne wyniki 3D-korelacyjnego celowania w endocytowe złogi białkowe (END) u drożdży. (A) Przegląd siatki w SEM przed frezowaniem. Kolorowe ramki wskazują pola siatki, dla których wcześniej wykonano serie obrazów fluorescencyjnych. (B-C) Korelacja 3D w polu siatki. Po zarejestrowaniu kilku odpowiadających sobie koralików fiducjalnych (kolorowe ramki) w danych FLM (B, przedstawionych tutaj jako projekcja maksymalnej intensywności) i na obrazie z wiązki jonowej (C), dokładność rejestracji 3D została zweryfikowana poprzez przewidzenie pozycji koralika oznaczonego rombem. Następnie w widoku wiązki jonowej przewidziano pozycje sygnału docelowego (czerwone okręgi) dla dwóch potencjalnych miejsc frezowania. (D) Powiększenie Miejsca B pokazujące przewidywane pozycje trzech punktów docelowych (czerwone okręgi) oraz początkowe wzory frezowania (żółte ramki). Przewidziano, że czwarty punkt fluorescencyjny znajduje się znacznie niżej niż pozostałe punkty, w związku z czym nie był on celem podczas frezowania (szary okrąg). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62886/62886fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
Po pomyślnym frezowaniu FIB i przeniesieniu siatki do kriomikroskopu elektronowego transmisyjnego (Titan Krios pracujący przy 300 kV, wyposażony w bezpośredni detektor elektronów Gatan K2 i filtr energetyczny Bioquantum), w programie SerialEM zarejestrowano obraz ogólny siatki, który posłużył do zlokalizowania pól z lamelami. Dla każdej lameli wykonano obrazy ogólne, a dane FLM zarejestrowano w programie 3DCT (3D-2D) przy użyciu odpowiadających im kulek fiducyjnych. Następnie, wykorzystując transformację obliczoną na podstawie kulek fiducyjnych, przewidziano położenie interesujących cech biologicznych (Rysunek 7A). Obrazy ogólne lamel zarejestrowane przy większym powiększeniu zostały zszyte, a miejsca zainteresowania skorelowano przy użyciu wyraźnie widocznych punktów orientacyjnych (np. kulek fiducyjnych). Alternatywnie, obrazy ogólne w klasycznej metodzie CLEM można wygenerować w różnych programach komputerowych10,12.
Na podstawie korelacji, dla lamelki pokazanej na Rysunku 7A, zidentyfikowano cztery potencjalne miejsca do pozyskania tomogramów. Obejmowało to jednak również pozycję, która nie była celem podczas 3D-skorelowanego frezowania FIB (porównać z Rysunkiem 6D; szare koło) oraz pozycję zablokowaną przez zanieczyszczenie lodem (Rysunek 7; szare ramki). W związku z tym tomogramy można było zarejestrować tylko dla dwóch pozycji (Rysunek 7B). Ogólnie osiągnięto sukces korelacji na poziomie ~75%, co oznacza, że lamelki przetrwały transfer do TEM, a struktury END znaleziono w przewidzianych miejscach (12 skorelowanych miejsc). Po rekonstrukcji tomogramów, segmentacji i dopasowaniu wzorców, poszczególne struktury END można zwizualizować w ich natywnym kontekście (Rysunek 7C,D). Obejmuje to fenestrowany retikulum endoplazmatyczne (ER) otaczające END, krople lipidowe sporadycznie nawiązujące kontakt oraz rybosomy, które są wykluczone z przedziału LLPS. Wspólnie pokazuje to, w jaki sposób 3D-skorelowane frezowanie FIB może dostarczyć informacji na poziomie molekularnym o rzadkich procesach biologicznych w nienaruszonych komórkach.
<img alt="Rycina 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62886/62886fig07.jpg" /> 
Rycina 7: Reprezentatywne wyniki wizualizacji END za pomocą cryo-ET. (A) Przegląd miejsca frezowania wykonany za pomocą TEM przy niskim powiększeniu, przedstawiony na Rycynie 6, można łatwo skorelować z projekcją maksymalnej intensywności FLM (Rycina 6B), aby zlokalizować interesujące cechy biologiczne (czerwone krzyżyki). (B) W drugim kroku można skorelować widok przy wyższym powiększeniu (zeszyty obrazów) i wyznaczyć pozycje do akwizycji tomogramów (żółte ramki). Pominięto lokalizacje wynikające z sygnału poza płaszczyzną (szara ramka, porównać z Rycina 6D). (C-D) Dzięki zastosowaniu tej 3D-korelacyjnej metody FIB można zwizualizować endocytowy osad białkowy (END) w jego naturalnym środowisku. Można zidentyfikować i zwizualizować struktury takie jak siateczka śródplazmatyczna (ER), rybosomy, błony i krople lipidowe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62886/62886fig07large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ustawienia urządzenia do czyszczenia plazmowego</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oczyszczacz plazmowy Harrick Plasma Cleaner PDG-3XG :</td>
			<td colspan="3">Ustawienia częstotliwości radiowej: &#34;Cześć&#34;, 30 s; plazma N2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ustawienia tłoka</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TFS Vitrobot Mk IV:</td>
			<td colspan="3">wilgotność 100%; siła docisku (blotforce) = 8; czas docisku (blottime) = 10 s; czas oczekiwania 0 s; (powinno to działać w przypadku większości komórek w zawiesinie i przylegających)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pozycje i czasy GIS w FIB</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quanta 3D FEG:</td>
			<td colspan="3">Nachylenie = 0, Rotacja = -180,&#160; Pozycja Z = 13,5, Wartość zadana temperatury =26.15&#176; , Czas = 8 s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TFS Scios:</td>
			<td colspan="3">Nachylenie = 0, Rotacja = -180, Pozycja Z = 9,8, Wartość zadana temperatury =28&#176; C, Czas = 7 s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TFS Aquilos 1:</td>
			<td colspan="3">Pozycja zdefiniowana programowo, Wartość zadana temperatury = 28&#176; , Czas = 7 s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TFS Aquilos 2:</td>
			<td colspan="3">Pozycja zdefiniowana programowo, Wartość zadana temperatury = 28&#176;, czas = 7 s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ustawienia napylacza FIB</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>System kworum:</td>
			<td colspan="3">W komorze przygotowawczej Quorum: 10 mA, 40 s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TFS Scios:</td>
			<td colspan="3">10 W, 500 V, 250 mA, 0,2 mbar, 15 s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TFS Aquilos 1:</td>
			<td colspan="3">1 kV, 10 mA, 10 Pa, 15 s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TFS Aquilos 2:</td>
			<td colspan="3">1 kV, 10 mA, 10 Pa, 15 s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pozyskiwanie tomogramów</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titan Krios G2i</td>
			<td colspan="3">kamera K2, filtr energetyczny Gatan Bioquantum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="3">szczelina 20 eV; symetryczny schemat nachylenia dawki (Hagen) z 2&#176; kroki; zacznij od +10&#176; (wstępne nachylenie lameli!) do +70&#176;i -50&#176;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Titan Krios Gi4</td>
			<td colspan="3">Falcon 4; filtr energetyczny Selectris X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="3">szczelina 10 eV; symetryczny schemat nachylenia dawki (Hagen) z 2&#176; kroki; zacząć od +10&#176; (wstępne nachylenie lamelki!) do +70&#176; i -50&#176;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Akwizycja FLM</td>
			<td colspan="3"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corrsight (tryb konfokalny)</td>
			<td colspan="3">Obiektyw: Zeiss EC Plan-Neofluar 40&#215;/0,9 NA Pol; Parametry akwizycji stosu: rozmiar piksela x-y = 161,25 nm, krok z = 300 nm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kriomikroskop konfokalny Leica SP8</td>
			<td colspan="3">Obiektyw: Leica HCX PL APO 50x / 0,90 CLEM; Parametry akwizycji stosu: rozmiar piksela x-y = 84 nm, wielkość kroku z = 300 nm.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Lista przetestowanego sprzętu i sugerowane ustawienia.

Tutaj prezentujemy proces frezowania wiązki jonów z korelacją 3D, który kieruje przygotowaniem próbek komórkowych do tomografii krioelektronowej. Pozycja 3D fluorescencyjnie znakowanych białek będących przedmiotem zainteresowania jest najpierw określana za pomocą mikroskopii kriofluorescencyjnej, a następnie kierowana do mielenia. Protokół jest odpowiedni dla komórek ssaków, drożdży i bakterii.

Przygotowanie próbki za pomocą korelacyjnego mielenia wiązki jonów w 3D do tomografii krioelektronowej o wysokiej rozdzielczości

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has become the method of choice for investigating cellular ultrastructure and molecular complexes in their native, ...

Mielenie FIB z korelacją 3D sprawia, że specyficzne, a nawet rzadkie zdarzenia komórkowe są dostępne dla Cryo-TEM. Pozwalając na ujawnienie ultra struktury tego wydarzenia bezpośrednio w rodzimym środowisku. Korelacyjny przepływ pracy poprawia wskaźnik sukcesu w celowaniu w rzadkie struktury komórkowe i pomaga je jednoznacznie zidentyfikować w zatłoczonym środowisku komórkowym.Procedurę zademonstrują Anna Bieber i Christina Capitanio, ekspertki w dziedzinie korelacyjnej krioelektronowej tomografii. Rozpocznij mikroskopię kriofluorescencyjną siatek zasianych komórkami, uzyskując szeroki przegląd pola w trybie fluorescencji i odbicia. Następnie wybierz odpowiednie kwadraty siatki z sygnałem fluorescencyjnym.Po upewnieniu się, że komórki i koraliki są równomiernie rozmieszczone w kierunku środka każdego kwadratu, wybierz kwadraty na 200 siatkach, które są dostępne zarówno dla instrumentu FIB-SEM, jak i TEM i są oddalone od krawędzi siatki o co najmniej trzy kwadraty. Na każdym z wybranych kwadratów siatki zdobądź stos fluorescencyjny z odpowiednim skupionym krokiem. Należy stosować obiektywy o dużej aperturze numerycznej, aby zwiększyć liczbę fotonów i dokładność lokalizacji.Na mikroskopie konfokalnym z obiektywem o aperturze numerycznej 0,9 uzyskaj stosy o wielkości kroku 300 nanometrów i nadpróbkuj wartość Nyquista. Nagrywaj wiele stosów kolorów i przechowuj siatki pod ciekłym azotem do dalszego użycia. Użyj znaczników wycięcia lub orientacji, aby zapewnić prawidłową orientację siatki do późniejszego umieszczenia w TEM.Załaduj siatki do instrumentu kriogenicznego FIB-SEM. Upewnij się, że kierunek frezowania jest prostopadły do osi nachylenia TEM. Aby pokryć kratki ochronną warstwą metaloorganiczną, należy użyć kodera plazmowego i systemu wtrysku gazu w pozycjach stopnia predefiniowanych przez konfigurację FIB-SEM.Następnie nagraj przegląd siatki SEM i wykonaj korelację 2D z przeglądami FLM. Znajdź kwadraty siatki, ręcznie sprawdzając zarejestrowane przeglądy siatki lub korzystając z pakietu oprogramowania. Zaznacz i zaznacz cztery odpowiadające im pozycje kwadratów w przeglądzie siatki FLM i SEM i oblicz transformację między zaznaczonymi punktami dla korelacji FLM-SEM.Następnie umieść znaczniki w środku odpowiednich kwadratów siatki, dla których uzyskano stosy FLM, zanim przewidzisz ich położenie w widoku SEM. Dla każdego skorelowanego kwadratu siatki wykonaj obraz wiązki jonów o niskim natężeniu prądu pod wybranym kątem frezowania FIB i wybierz pole view o żądanej pozycji i powiększeniu, które pasują do danych fluorescencji. W przypadku siatek 200 należy uzyskać dane FIB-SEM, które zawierają pojedyncze kwadraty siatki, w tym paski siatki.Następnie wykonaj obraz SEM tego samego kwadratu, aby pomóc w identyfikacji odpowiadających im koralików w widoku fluorescencji i wiązki jonów. Wykonaj rejestrację surowego lub zdekonwolucjonowanego stosu FLM 3D i widoku wiązki jonów 2D dla każdej pozycji za pomocą zestawu narzędzi do korelacji 3D, 3D CT, ładując odpowiedni ponownie pocięty stos FLM 3D i widok wiązki jonów w 3D CT.In danych fluorescencji, wybierz cztery koraliki odniesienia i kliknij prawym przyciskiem myszy listę pozycji, aby określić pozycję 3D koralików za pomocą dopasowania Gaussa sygnału w X, Y i Z. Następnie wybierz odpowiednie koraliki na obrazie wiązki jonów, aby wykonać początkową korelację 3D. Podobnie dodaj więcej koralików do pasowania, aby sprawdzić dokładność korelacji.Pomiń niektóre koraliki referencyjne wyraźnie rozpoznawalne zarówno we fluorescencji, jak i wiązce jonów, sprawdzając ich przewidywaną i rzeczywistą lokalizację na obrazie wiązki jonów. W 3D CT można wyświetlić błąd średniokwadratowy lub wartości RMSE w celu oceny spójności korelacji. Upewnij się, że wartości RMSE są małe i zgodne z dokładnością lokalizacji.Następnie wybierz docelowe sygnały komórkowe i dopasuj pozycję 3D do stosu FLM przed zastosowaniem transformacji w celu przewidzenia pozycji docelowych w widoku wiązki jonów. Dla każdego skorelowanego kwadratu przenieś przewidywane pozycje interesujących cech do instrumentu FIB-SEM, aby umieścić wzory frezowania lamel. Jeśli w jednej komórce znajduje się wiele sygnałów, umieść wzory tak, aby zawierały jak najwięcej punktów zainteresowania w tej samej blaszce.Zgrubne frezowanie lameli, a następnie dokładne mielenie, aby uzyskać ostateczną grubość od 150 do 250 nanometrów. Upewnij się, że orientacja lameli jest prostopadła do osi przechyłu podczas ładowania siatek do transmisyjnego mikroskopu elektronowego. Uzyskaj montaż siatki i przeglądy dla każdego kwadratu siatki zawierającego lamele z odpowiednim powiększeniem i czasem naświetlania, aby uwidocznić koraliki odniesienia na obrazach TEM bez znacznego zwiększania całkowitej dawki elektronów.Zdobądź mapy TEM w wysokiej rozdzielczości dla każdej lameli. Rejestr i 3D-2D korelują stos FLM z kwadratem siatki TEM i przeglądami lameli w 3D CT. Wykonaj korelację między FLM i TEM od małego do dużego powiększenia w TEM. Po przeniesieniu pozycji, ustaw i uruchom serię pochylenia w skorelowanych pozycjach", a następnie użyj odpowiedniego powiększenia, rozmycia i dawki całkowitej, aby rozpocząć akwizycję obrazu przy wstępnym pochyleniu określonym przez lamelę przy użyciu schematu symetrycznego pochylenia dawki.Postępuj zgodnie z ręcznym lub wsadowym pozyskiwaniem obrazów. W analizie reprezentatywnej pokazano, że przegląd TEM miejsca mielenia w małym powiększeniu lokalizuje interesujące cechy biologiczne. Później widok w większym powiększeniu został skorelowany z projekcją maksymalnej intensywności FLM i ustawiono pozycje do akwizycji tomogramu.Na uzyskanych obrazach złoże białka endocytarnego można było uwidocznić w jego naturalnym środowisku. Optymalizacja próbki jest bardzo ważna. Przygotowanie siatki powinno być zoptymalizowane, aby mieć dobry rozkład komórek do mielenia i dużą liczbę widocznych koralików odwodzących w większości kwadratów siatki.Mielenie korelacyjne 3D pomogło ujawnić ultrastrukturę różnych procesów komórkowych, takich jak postęp autofagii krok po kroku w każdej komórce, i jest wykorzystywane do uchwycenia nowego przedziału oddzielonego fazowo.

sample-preparation-3d-correlative-focused-ion-beam-milling-for-high

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisujemy metodę mikroskopii korelcyjnej, która łączy szybką mikroskopię 3D z żywymi komórkami fluorescencyjnymi i tomografię krioelektronową o wysokiej rozdzielczości. Wykazujemy możliwości metody korelacyjnej poprzez obrazowanie dynamicznych, małych cząstek HIV-1 oddziałujących z komórkami HeLa gospodarza.

Mikroskopia korelacyjna do analizy statyczno-wytrzymałościowej 3D oddziaływań dynamicznych

Kriomikroskopy elektronowe, zarówno skaningowe (SEM), jak i transmisyjne (TEM), są szeroko stosowane do charakteryzowania próbek biologicznych lub innych materiałów o wysokiej zawartości wody1. SEM/Focused Ion Beam (FIB) służy do identyfikacji interesujących cech próbek i ekstrakcji cienkiej, przezroczystej dla elektronów blaszki w celu przeniesienia do krio-TEM.

Przygotowanie próbki do mikroskopii krioelektronowej za pomocą skupionej wiązki jonów

Ten artykuł opisuje metodologię mikroskopii krioelektronowej, która jest używana do uzyskiwania wysokiej jakości mikroskopowych obrazów makrocząsteczek w ich stanie zbliżonym do natywnego. Metoda ta pozwala uzyskać obrazy nadające się do dalszego przetwarzania komputerowego przy użyciu podejścia pojedynczej cząstki, opracowanego w celu wygenerowania rekonstrukcji 3D makrocząsteczki.

Co robić, a czego nie robić w mikroskopii krioelektronowej: podstawa przygotowania próbek i gromadzenia wysokiej jakości danych do makromolekularnej rekonstrukcji 3D

Tutaj prezentujemy protokół łączenia dwóch technik przetwarzania próbek, zamrażania wysokociśnieniowego i przetwarzania próbek wspomaganego mikrofalami, a następnie minimalnego zatapiania żywicy w celu pozyskiwania danych za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego z skupioną wiązką jonów (FIB-SEM). Wykazano to przy użyciu próbki nerwu piszczelowego myszy i Caenorhabditis elegans.

Przygotowanie próbki biologicznej poprzez zamrażanie pod wysokim ciśnieniem, wspomagane mikrofalami wzmocnienie kontrastu i minimalne zatapianie żywicy w celu obrazowania objętościowego

Tutaj przedstawiono protokół opisujący etapy przygotowania próbki i zbierania danych wymagane w kriogenicznej tomografii rentgenowskiej (SXT) do obrazowania ultrastruktury całych komórek kriokonserwowanych w rozdzielczości połowy tonu 25 nm.

Kartograficzny opis 3D komórki za pomocą kriomiękkiej tomografii rentgenowskiej

Używanie mielenia skupionej wiązki jonów do produkcji szklistych blaszek na siatce z zamrożonych próbek biologicznych do krioelektronowej tomografii.

Przygotowanie blaszek z szklistych próbek biologicznych przy użyciu dwuwiązkowego skaningowego mikroskopu elektronowego do kriotomografii elektronowej

Prezentujemy protokół przygotowania lameli zamrożonych próbek biologicznych metodą kriogenicznej mikroobróbki wiązki jonów do wysokorozdzielczych badań strukturalnych makrocząsteczek in situ za pomocą krioelektronowej tomografii. Przedstawiony protokół zawiera wytyczne do przygotowania wysokiej jakości blaszek o wysokiej odtwarzalności do charakterystyki strukturalnej makrocząsteczek wewnątrz Saccharomyces cerevisiae.

Przygotowanie i mikroobróbka Cryo-FIB Saccharomyces cerevisiae do krioelektronowej tomografii

Rosnące zapotrzebowanie na gromadzenie danych na dużą skalę w kriogenicznej tomografii elektronowej wymaga wysokoprzepustowych procedur akwizycji obrazów. Opisano tutaj protokół, który wdraża najnowsze osiągnięcia zaawansowanych strategii akwizycji mających na celu maksymalizację efektywności czasowej i przepustowości gromadzenia danych tomograficznych.

Strategie optymalizacji pozyskiwania danych z kriogenicznej tomografii elektronowej

Obecny protokół opisuje zdalne pozyskiwanie danych za pomocą tomografii krioelektronowej o wysokiej rozdzielczości za pomocą Tomo5 oraz późniejsze przetwarzanie danych i uśrednianie subtomogramowe za pomocą emClarity. Apoferrytyna jest używana jako przykład do zilustrowania szczegółowych procesów krok po kroku w celu uzyskania struktury krio-ET o rozdzielczości 2,86 A.

Tomografia krioelektronowa: zdalne zbieranie danych i uśrednianie subtomogramu

Ten proces umożliwia produkcję lamelli, ukierunkowaną na fluorescencyjne struktury biologiczne, które są małe (&lt;1 μm w zasięgu osiowym) i rzadkie (1 kopia na komórkę) przy użyciu kriogenicznej platformy obrazowania trójkokocyklnego. Ta platforma integruje mikroskopię fluorescencyjną, frezowanie wiązką jonową skupioną oraz skaningową mikroskopię elektronową w jednej pozycji ogniskowej, umożliwiając jednoczesną mikroskopię fluorescencyjną podczas frezowania.

Workflow z wykorzystaniem kriogenicznego mikroskopu fluorescencyjnego, elektronowo-jonowego do ukierunkowanego frezowania komórek

Protokół ten standaryzuje tomografię krioelektronową (cryo-ET) dla grubych tkanek poprzez integrację zamrażania pod wysokim ciśnieniem (HPF) z metodą gofrową, wyciąganie kriogenicznej wiązki jonowej (krio-FIB) oraz równoległe pobieranie pod względem dawki, co daje jednolicie cienkie lamele i próbki zwitryfikowane do powtarzalnej analizy in situ w hipokampie myszy.

Workflow tomografii krioelektronowej dla grubych tkanek wykazany u hipokampa myszy

Poznaj metodę korelacyjnego mielenia wiązki jonów w 3D do tomografii krioelektronowej. Technika ta umożliwia precyzyjne lokalizowanie fluorescencyjnie znakowanych białek w komórkach ssaków, drożdży i bakterii, poprawiając wskazywanie rzadkich struktur komórkowych.

Przygotowanie próbki za pomocą korelacyjnego mielenia wiązki jonów w 3D do tomografii krioelektronowej o wysokiej rozdzielczości (Wideo) | JoVE Journal

Przygotowanie próbki za pomocą korelacyjnego mielenia wiązki jonów w 3D do tomografii krioelektronowej o wysokiej rozdzielczości

Przeglądaj więcej filmów