Przygotowanie próbki za pomocą korelacyjnego mielenia wiązki jonów w 3D do tomografii krioelektronowej o wysokiej rozdzielczości

Mielenie FIB z korelacją 3D sprawia, że specyficzne, a nawet rzadkie zdarzenia komórkowe są dostępne dla Cryo-TEM. Pozwalając na ujawnienie ultra struktury tego wydarzenia bezpośrednio w rodzimym środowisku. Korelacyjny przepływ pracy poprawia wskaźnik sukcesu w celowaniu w rzadkie struktury komórkowe i pomaga je jednoznacznie zidentyfikować w zatłoczonym środowisku komórkowym.

Procedurę zademonstrują Anna Bieber i Christina Capitanio, ekspertki w dziedzinie korelacyjnej krioelektronowej tomografii. Rozpocznij mikroskopię kriofluorescencyjną siatek zasianych komórkami, uzyskując szeroki przegląd pola w trybie fluorescencji i odbicia. Następnie wybierz odpowiednie kwadraty siatki z sygnałem fluorescencyjnym.

Po upewnieniu się, że komórki i koraliki są równomiernie rozmieszczone w kierunku środka każdego kwadratu, wybierz kwadraty na 200 siatkach, które są dostępne zarówno dla instrumentu FIB-SEM, jak i TEM i są oddalone od krawędzi siatki o co najmniej trzy kwadraty. Na każdym z wybranych kwadratów siatki zdobądź stos fluorescencyjny z odpowiednim skupionym krokiem. Należy stosować obiektywy o dużej aperturze numerycznej, aby zwiększyć liczbę fotonów i dokładność lokalizacji.

Na mikroskopie konfokalnym z obiektywem o aperturze numerycznej 0,9 uzyskaj stosy o wielkości kroku 300 nanometrów i nadpróbkuj wartość Nyquista. Nagrywaj wiele stosów kolorów i przechowuj siatki pod ciekłym azotem do dalszego użycia. Użyj znaczników wycięcia lub orientacji, aby zapewnić prawidłową orientację siatki do późniejszego umieszczenia w TEM.

Załaduj siatki do instrumentu kriogenicznego FIB-SEM. Upewnij się, że kierunek frezowania jest prostopadły do osi nachylenia TEM. Aby pokryć kratki ochronną warstwą metaloorganiczną, należy użyć kodera plazmowego i systemu wtrysku gazu w pozycjach stopnia predefiniowanych przez konfigurację FIB-SEM.

Następnie nagraj przegląd siatki SEM i wykonaj korelację 2D z przeglądami FLM. Znajdź kwadraty siatki, ręcznie sprawdzając zarejestrowane przeglądy siatki lub korzystając z pakietu oprogramowania. Zaznacz i zaznacz cztery odpowiadające im pozycje kwadratów w przeglądzie siatki FLM i SEM i oblicz transformację między zaznaczonymi punktami dla korelacji FLM-SEM.

Następnie umieść znaczniki w środku odpowiednich kwadratów siatki, dla których uzyskano stosy FLM, zanim przewidzisz ich położenie w widoku SEM. Dla każdego skorelowanego kwadratu siatki wykonaj obraz wiązki jonów o niskim natężeniu prądu pod wybranym kątem frezowania FIB i wybierz pole view o żądanej pozycji i powiększeniu, które pasują do danych fluorescencji. W przypadku siatek 200 należy uzyskać dane FIB-SEM, które zawierają pojedyncze kwadraty siatki, w tym paski siatki.

Następnie wykonaj obraz SEM tego samego kwadratu, aby pomóc w identyfikacji odpowiadających im koralików w widoku fluorescencji i wiązki jonów. Wykonaj rejestrację surowego lub zdekonwolucjonowanego stosu FLM 3D i widoku wiązki jonów 2D dla każdej pozycji za pomocą zestawu narzędzi do korelacji 3D, 3D CT, ładując odpowiedni ponownie pocięty stos FLM 3D i widok wiązki jonów w 3D CT.In danych fluorescencji, wybierz cztery koraliki odniesienia i kliknij prawym przyciskiem myszy listę pozycji, aby określić pozycję 3D koralików za pomocą dopasowania Gaussa sygnału w X, Y i Z. Następnie wybierz odpowiednie koraliki na obrazie wiązki jonów, aby wykonać początkową korelację 3D. Podobnie dodaj więcej koralików do pasowania, aby sprawdzić dokładność korelacji.

Pomiń niektóre koraliki referencyjne wyraźnie rozpoznawalne zarówno we fluorescencji, jak i wiązce jonów, sprawdzając ich przewidywaną i rzeczywistą lokalizację na obrazie wiązki jonów. W 3D CT można wyświetlić błąd średniokwadratowy lub wartości RMSE w celu oceny spójności korelacji. Upewnij się, że wartości RMSE są małe i zgodne z dokładnością lokalizacji.

Następnie wybierz docelowe sygnały komórkowe i dopasuj pozycję 3D do stosu FLM przed zastosowaniem transformacji w celu przewidzenia pozycji docelowych w widoku wiązki jonów. Dla każdego skorelowanego kwadratu przenieś przewidywane pozycje interesujących cech do instrumentu FIB-SEM, aby umieścić wzory frezowania lamel. Jeśli w jednej komórce znajduje się wiele sygnałów, umieść wzory tak, aby zawierały jak najwięcej punktów zainteresowania w tej samej blaszce.

Zgrubne frezowanie lameli, a następnie dokładne mielenie, aby uzyskać ostateczną grubość od 150 do 250 nanometrów. Upewnij się, że orientacja lameli jest prostopadła do osi przechyłu podczas ładowania siatek do transmisyjnego mikroskopu elektronowego. Uzyskaj montaż siatki i przeglądy dla każdego kwadratu siatki zawierającego lamele z odpowiednim powiększeniem i czasem naświetlania, aby uwidocznić koraliki odniesienia na obrazach TEM bez znacznego zwiększania całkowitej dawki elektronów.

Zdobądź mapy TEM w wysokiej rozdzielczości dla każdej lameli. Rejestr i 3D-2D korelują stos FLM z kwadratem siatki TEM i przeglądami lameli w 3D CT. Wykonaj korelację między FLM i TEM od małego do dużego powiększenia w TEM. Po przeniesieniu pozycji, ustaw i uruchom serię pochylenia w skorelowanych pozycjach", a następnie użyj odpowiedniego powiększenia, rozmycia i dawki całkowitej, aby rozpocząć akwizycję obrazu przy wstępnym pochyleniu określonym przez lamelę przy użyciu schematu symetrycznego pochylenia dawki.

Postępuj zgodnie z ręcznym lub wsadowym pozyskiwaniem obrazów. W analizie reprezentatywnej pokazano, że przegląd TEM miejsca mielenia w małym powiększeniu lokalizuje interesujące cechy biologiczne. Później widok w większym powiększeniu został skorelowany z projekcją maksymalnej intensywności FLM i ustawiono pozycje do akwizycji tomogramu.

Na uzyskanych obrazach złoże białka endocytarnego można było uwidocznić w jego naturalnym środowisku. Optymalizacja próbki jest bardzo ważna. Przygotowanie siatki powinno być zoptymalizowane, aby mieć dobry rozkład komórek do mielenia i dużą liczbę widocznych koralików odwodzących w większości kwadratów siatki.

Mielenie korelacyjne 3D pomogło ujawnić ultrastrukturę różnych procesów komórkowych, takich jak postęp autofagii krok po kroku w każdej komórce, i jest wykorzystywane do uchwycenia nowego przedziału oddzielonego fazowo.