Zaprojektowanie i opracowanie modelu do badania wpływu dodatkowego tlenu na mikrobiom dróg oddechowych mukowiscydozy
3 sierpnia 2021
Celem tego protokołu jest opracowanie modelowego systemu dla wpływu hiperoksji na społeczności mikrobiologiczne dróg oddechowych mukowiscydozy. Sztuczna pożywka z plwociny naśladuje skład plwociny, a warunki hodowli hiperoksycznej modelują wpływ dodatkowego tlenu na społeczności drobnoustrojów płucnych.
Protokoły te mają na celu modelowanie wpływu in vitro dodatkowego stosowania tlenu na mikrobiom płuc pacjentów z mukowiscydozą. Ta receptura pożywki jest dostosowana tak, aby odzwierciedlała fizjologiczny skład plwociny u osób żyjących z mukowiscydozą. Proces iskrzenia wprowadza zdolność do hodowli w różnych warunkach tlenowych.
Zmiany w sztucznej pożywce z plwociny pozwalają jej naśladować inne przewlekłe choroby płuc i modelować społeczności drobnoustrojów w innych warunkach, takich jak różne stężenia glukozy u pacjentów z mukowiscydozą i cukrzycą. Przegląd etapów przygotowania sztucznej pożywki z plwociny pokazuje mieszanie przygotowanych ASCM, ASMM i ASBM. Bufor mopów służy do miareczkowania pH do 6,3, a sterylizacja filtra pożywki odbywa się w chłodni na wytrząsarce orbitalnej.
Na początek przygotuj sztuczną pożywkę z plwociny, dodając 250 mililitrów ASCM do litrowej butelki zawierającej ASMM. Następnie dodaj 250 mililitrów ASBM do pożywki butelki. Miareczkować podłoże zasadowym buforem do mopów molowych, aby osiągnąć pH 6,3 na bibułce pH.
Sztuczną pożywkę z plwociną przechowywać w lodówce w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu filtracji. Następnie, aby rozpocząć proces filtracji, przenieś 200 mililitrów niefiltrowanej sztucznej plwociny do systemu filtracji próżniowej z filtrem o wielkości porów 0,22 mikrometra. Po podłączeniu układu filtracji do pompy próżniowej należy włączyć pompę próżniową, a następnie umieścić komorę na wytrząsarce orbitalnej, wstrząsającej z prędkością 90 obrotów na minutę w chłodnym pomieszczeniu w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Wymień filtr po przefiltrowaniu 350 mililitrów medium, aby rozwiązać problem zatykania. Po przefiltrowaniu znacznej ilości, w dodatkowych 150 mililitrach pożywki do filtracji. Powtarzaj filtrację z dodatkowymi komorami, aż wszystkie media zostaną przefiltrowane.
Przegląd rozpryskiwania tlenu pokazujący dodanie plwociny pacjenta do sztucznej pożywki z plwociny w autoklalawowanej butelce z surowicą. Następnie spryskaj zamkniętą butelkę serum mieszaniną gazów. Na koniec butelka z surowicą jest inkubowana w celu uzyskania kultury Aleca Wattsa w odstępie 24 godzin w celu późniejszego sekwencjonowania metagenomiki.
Aby rozpocząć rozpryskiwanie kultur w butelkach z surowicą, oznacz 500-mililitrowe autoklawizowane butelki z surowicą identyfikatorami próbki, datą i godziną inokulacji oraz docelową zawartością tlenu. W kapturze biologicznym dodaj 24 mililitry sztucznej pożywki z plwociną do każdej ustawianej butelki surowicy. Aby uzyskać wystarczającą objętość próbki dla każdego warunku hodowli, w razie potrzeby rozcieńczyć próbkę sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem, a następnie homogenizowaną plwociną za pomocą igły o rozmiarze 18 i dodać jeden mililitr plwociny pacjenta do każdej butelki surowicy.
Następnie, za pomocą sterylnej pęsety, umieść autoklawowane gumowe korki na górze każdej butelki z serum, dociśnij gumowe korki, nie dotykając spodu korka. Po wyjęciu butelek z kaptura nałóż i zaciśnij aluminiowe uszczelki. Usuń środkową część uszczelek i przetrzyj górną część butelek chusteczką nasączoną alkoholem i przełóż uszczelkę butelki przez płomień palnika Bunsena.
Teraz przymocować sterylną igłę o rozmiarze 18 G do strzykawki z tłokiem z filtrem, najpierw włożyć dołączoną strzykawkę uwalniającą gaz do butelki. Teraz przymocuj sterylną igłę o rozmiarze 18 do wylotu gazu z systemu i włóż igłę odprowadzającą gaz również do butelki. Poprowadź złącza T ze zbiorników przez monitor tlenu.
Po zweryfikowaniu docelowego stężenia tlenu przepływającego przez system, należy dążyć do około pięciu litrów na minutę przepływu gazu. Przekieruj skrzyżowania T od zbiorników do wyjścia gazu. Gdy gaz zacznie przepływać przez butlę z serum, zwróć szczególną uwagę na manometr, a jeśli ciśnienie nieoczekiwanie wzrośnie, natychmiast wyłącz system.
Po uruchomieniu tlen przepływa przez butelkę z surowicą przez jedną minutę z prędkością pięciu litrów na minutę, ustawienia pozwalają na 10 wymian powietrza i zapewniają, że atmosfera wewnętrzna osiąga pożądane stężenie 100% tlenu. Usuń spust gazu, igłę o rozmiarze 18. Po dopuszczeniu, aby ciśnienie w butelce z surowicą wzrosło do jednej atmosfery, natychmiast wyjmij igłę odprowadzającą gaz.
Inkubować butelki z surowicą w wytrząsarce inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza z prędkością 150 obrotów na minutę w odstępach 3-24-godzinnych. Alec Watts jest pobierany w każdym 24-godzinnym odstępie czasu do dalszej analizy, a próbki są za każdym razem ponownie sparskanowane. Przykład tutaj pokazuje, jak może wyglądać kultura przed i po inkubacji.
Poziom tlenu i pH na wylocie mierzono w trakcie procesu hodowli dla próbek plwociny utrzymywanych w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Przy obu przerwach między iskrzeniami wynoszących 12 godzin i 24 godziny, stężenia tlenu utrzymywały się w przybliżeniu w czasie, z umiarkowanym spadkiem stężenia tlenu obserwowanym we wszystkich trzech warunkach. Zmierzone poziomy pH mieściły się w zakresie fizjologicznym bez istotnych zmian w czasie.
Porównanie obciążenia mikrobiologicznego, różnorodności i składu zbiorowiska między plwociną niehodowlaną a wyhodowaną wykazało 20-krotny wzrost obciążenia mikrobiologicznego w plwocinie hodowlanej. Wskaźniki różnorodności wskazywały na zachowanie składu społeczności przy minimalnych różnicach globalnych wprowadzonych przez proces kulturowy. Analizę porównawczą 120 gatunków drobnoustrojów w plwocinie hodowlanej i niehodowlanej przeprowadzono za pomocą sekwencjonowania metagenomowego.
46 z tych gatunków zidentyfikowano zarówno w próbkach niehodowlanych, jak i hodowlanych. Podczas gdy 35 zidentyfikowano wyłącznie w próbkach niehodowlanych, a 39 zidentyfikowano wyłącznie w próbkach hodowlanych. Krzywe wzrostu oparte na absorpcji uzyskano dla powszechnych patogenów płuc mukowiscydozy hodowanych w sztucznych podłożach plwociny z izolatów próbek pacjentów przy normalnym stężeniu tlenu 21%.
Brak zmian w czasie gęstości optycznej przy 600 nanometrach w ASM, tylko kontrola ujemna wskazywała na hodowlę wolną od zanieczyszczeń. Zaobserwowane typowe wzorce krzywych wzrostu wskazujące, że podłoże ASM może być używane do generowania krzywych wzrostu przy użyciu metod optycznych. Sekwencjonowanie metagenomiczne jest tutaj wykorzystywane do opisania składu społeczności drobnoustrojów.
Inne techniki, takie jak sekwencjonowanie metatranskryptomiczne, mogą być stosowane do oceny ekspresji genów lub metabolomika do oceny produkcji metabolitów.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje model systemu do badania wpływu hiperoksji na społeczności drobnoustrojów dróg oddechowych w mukowiskozie. Wykorzystuje on sztuczne podłoże plwocin w celu odwzorowania składu plwocin oraz warunki hiperoksyczne, aby symulować wpływ suplementacji tlenem na mikrobiom płuc.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrobiologia
- Zdrowie układu oddechowego
- Badania nad mukowiscydozą
Wprowadzenie
- Pacjenci z mukowiscydozą często wykazują zmiany w mikrobiomie płuc.
- Suplementaryjny tlen może wpływać na społeczności mikrobiologiczne w płucach.
- Sztuczne podłoże plwociny zostało opracowane tak, aby naśladować warunki fizjologiczne występujące w mukowiscydozie.
- Zrozumienie tych interakcji może pomóc w opracowaniu strategii terapeutycznych.
Cel badania
- Opracowanie modelu do badania wpływu hiperoksji na mikrobiom płuc.
- Wykorzystanie sztucznego medium plwociny do hodowli społeczności mikrobiologicznych.
- Zbadanie implikacji dla mukowiscydozy oraz innych przewlekłych chorób płuc.
Zastosowane metody
- Przygotowanie sztucznego medium plwocyńca (ASCM).
- Wprowadzenie różnych warunków natlenienia poprzez napowietrzanie.
- Miareczkowanie pH przy użyciu buforu MOPS w celu uzyskania optymalnych warunków.
- Sterylizacja medium przez filtrowanie w kontrolowanych warunkach.
Główne wyniki
- Skuteczne modelowanie społeczności mikrobiologicznych w warunkach hiperoksji.
- Wykazano przystosowalność sztucznego medium plwociny do różnych jednostek chorobowych.
- Zidentyfikowano potencjalne interakcje między poziomem glukozy a wzrostem mikroorganizmów.
- Stworzono ramy dla przyszłych badań nad mikrobiomem płuc.
Wnioski
- Model ten skutecznie symuluje wpływ dodatkowego tlenu na mikrobiomy płuc.
- Sztuczna pożywka imitująca plwocinę może być modyfikowana pod kątem różnych przewlekłych schorzeń płuc.
- Niniejsze badanie przyczynia się do zrozumienia dynamiki drobnoustrojów w mukowiscydozie.
Najczęściej zadawane pytania
Zastosowanie w przemyśle
Modelowanie wpływu dodatkowej tlenoterapii na mikrobiom dróg oddechowych w mukowiscydozie pozwala wypełnić istotną lukę w zrozumieniu, w jaki sposób warunki hiperoksyczne wpływają na dynamikę społeczności mikrobiologicznych. Zdolność ta umożliwia prognostyczną ocenę interwencji terapeutycznych i wspiera podejmowanie decyzji z uwzględnieniem ryzyka w procesach odkrywania leków stosowanych w chorobach układu oddechowego. Podejście to zwiększa ciągłość translacyjną, zapewniając fizjologicznie istotny system in vitro do mechanistycznego ograniczania ryzyka oraz walidacji celów terapeutycznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia badanie reakcji społeczności mikrobiologicznych na modulację poziomu tlenu w systemach istotnych dla przebiegu choroby.
- Wspiera mechanistyczną ocenę ryzyka poprzez wyjaśnienie wpływu hiperoksji na populacje patogenów i komensali.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celów dla interwencji mających na celu modulowanie mikrobioty dróg oddechowych.
Przesiewy i opracowanie testów
- Zapewnia zestandaryzowane sztuczne medium imitujące plwocinę dla powtarzalnych kultur drobnoustrojów w kontrolowanych warunkach natlenienia.
- Umożliwia generowanie ilościowych krzywych wzrostu dla powszechnych patogenów występujących w mukowiscydozie przy użyciu pomiarów gęstości optycznej.
- Wspiera przygotowanie testów do oceny wpływu związków na skład i obciążenie populacji drobnoustrojów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje wyniki uzyskane in vitro z klinicznymi profilami mikrobiomu dróg oddechowych poprzez porównawcze sekwencjonowanie metagenomiczne.
- Zapewnia istotność translacyjną poprzez zachowanie różnorodności i składu społeczności mikroorganizmów w warunkach normoksji i hiperoksji.
- Umożliwia dostosowany do ryzyka rozwój terapii modulujących mikrobiom poprzez modelowanie rzeczywistej ekspozycji na tlen suplementacyjny.
Integracja potoków i przepływów pracy
Ten system modelowy integruje się z kontinuum od etapu odkryć do badań przedklinicznych, umożliwiając prowadzenie studiów opartych na hipotezach dotyczących wpływu tlenu na mikrobiotę dróg oddechowych, co wspiera zarówno wczesne odkrycia, jak i badania translacyjne.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia testowanie hipotez dotyczących zmian mikrobiologicznych napędzanych przez tlen oraz ich implikacji mechanistycznych.
- Przesiewy: Dostarcza powtarzalne, ilościowe wyniki wzrostu drobnoustrojów i analizy społeczności.
- Analityka: Zapewnia odczyty metagenomiczne i gęstości optycznej do solidnego porównywania warunków.
- Badania translacyjne: Łączy dane in vitro i kliniczne dotyczące mikrobiomu w celu wyrównania i walidacji biomarkerów.
- Zastosowania przedsiębiorstw: Oferuje elastyczną platformę, którą można dostosować do innych modeli przewlekłych chorób płuc i stanów metabolicznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną interwencji ukierunkowanych na mikrobiom i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje warunki hodowli mikrobiologicznych i wspiera skalowalne, powtarzalne przepływy pracy.
- Wartość strategiczna: Uzasadnia decyzje dotyczące kontynuacji lub przerwania projektów (go/no-go) dla zasobów portfela dotyczących układu oddechowego poprzez modelowanie klinicznie istotnej ekspozycji na tlen.
- Wpływ na portfel: Umożliwia priorytetyzację kandydatów modulujących mikrobiom z uwzględnieniem ryzyka i wspiera integrację danych między programami.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w hodowli drobnoustrojów, metagenomice i modelowaniu chorób układu oddechowego.
- Wymagany jest dostęp do systemów kontrolowanego napowietrzania gazami, inkubatorów z wytrząsaniem oraz infrastruktury sekwencjonowania.
- Konieczna jest standaryzacja przygotowania sztucznej plwociny oraz protokołów modulacji poziomu tlenu pomiędzy zespołami.
- Metoda jest dostosowalna do modelowania innych przewlekłych chorób płuc lub chorób metabolicznych poprzez modyfikację składu pożywki.
- Ograniczenia obejmują konieczność starannego monitorowania poziomu tlenu i pH w celu zachowania istotności fizjologicznej.
