Zaprojektowanie i opracowanie modelu do badania wpływu dodatkowego tlenu na mikrobiom dróg oddechowych mukowiscydozy
August 3rd, 2021
Celem tego protokołu jest opracowanie modelowego systemu dla wpływu hiperoksji na społeczności mikrobiologiczne dróg oddechowych mukowiscydozy. Sztuczna pożywka z plwociny naśladuje skład plwociny, a warunki hodowli hiperoksycznej modelują wpływ dodatkowego tlenu na społeczności drobnoustrojów płucnych.
Protokoły te mają na celu modelowanie wpływu in vitro dodatkowego stosowania tlenu na mikrobiom płuc pacjentów z mukowiscydozą. Ta receptura pożywki jest dostosowana tak, aby odzwierciedlała fizjologiczny skład plwociny u osób żyjących z mukowiscydozą. Proces iskrzenia wprowadza zdolność do hodowli w różnych warunkach tlenowych.
Zmiany w sztucznej pożywce z plwociny pozwalają jej naśladować inne przewlekłe choroby płuc i modelować społeczności drobnoustrojów w innych warunkach, takich jak różne stężenia glukozy u pacjentów z mukowiscydozą i cukrzycą. Przegląd etapów przygotowania sztucznej pożywki z plwociny pokazuje mieszanie przygotowanych ASCM, ASMM i ASBM. Bufor mopów służy do miareczkowania pH do 6,3, a sterylizacja filtra pożywki odbywa się w chłodni na wytrząsarce orbitalnej.
Na początek przygotuj sztuczną pożywkę z plwociny, dodając 250 mililitrów ASCM do litrowej butelki zawierającej ASMM. Następnie dodaj 250 mililitrów ASBM do pożywki butelki. Miareczkować podłoże zasadowym buforem do mopów molowych, aby osiągnąć pH 6,3 na bibułce pH.
Sztuczną pożywkę z plwociną przechowywać w lodówce w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu filtracji. Następnie, aby rozpocząć proces filtracji, przenieś 200 mililitrów niefiltrowanej sztucznej plwociny do systemu filtracji próżniowej z filtrem o wielkości porów 0,22 mikrometra. Po podłączeniu układu filtracji do pompy próżniowej należy włączyć pompę próżniową, a następnie umieścić komorę na wytrząsarce orbitalnej, wstrząsającej z prędkością 90 obrotów na minutę w chłodnym pomieszczeniu w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Wymień filtr po przefiltrowaniu 350 mililitrów medium, aby rozwiązać problem zatykania. Po przefiltrowaniu znacznej ilości, w dodatkowych 150 mililitrach pożywki do filtracji. Powtarzaj filtrację z dodatkowymi komorami, aż wszystkie media zostaną przefiltrowane.
Przegląd rozpryskiwania tlenu pokazujący dodanie plwociny pacjenta do sztucznej pożywki z plwociny w autoklalawowanej butelce z surowicą. Następnie spryskaj zamkniętą butelkę serum mieszaniną gazów. Na koniec butelka z surowicą jest inkubowana w celu uzyskania kultury Aleca Wattsa w odstępie 24 godzin w celu późniejszego sekwencjonowania metagenomiki.
Aby rozpocząć rozpryskiwanie kultur w butelkach z surowicą, oznacz 500-mililitrowe autoklawizowane butelki z surowicą identyfikatorami próbki, datą i godziną inokulacji oraz docelową zawartością tlenu. W kapturze biologicznym dodaj 24 mililitry sztucznej pożywki z plwociną do każdej ustawianej butelki surowicy. Aby uzyskać wystarczającą objętość próbki dla każdego warunku hodowli, w razie potrzeby rozcieńczyć próbkę sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem, a następnie homogenizowaną plwociną za pomocą igły o rozmiarze 18 i dodać jeden mililitr plwociny pacjenta do każdej butelki surowicy.
Następnie, za pomocą sterylnej pęsety, umieść autoklawowane gumowe korki na górze każdej butelki z serum, dociśnij gumowe korki, nie dotykając spodu korka. Po wyjęciu butelek z kaptura nałóż i zaciśnij aluminiowe uszczelki. Usuń środkową część uszczelek i przetrzyj górną część butelek chusteczką nasączoną alkoholem i przełóż uszczelkę butelki przez płomień palnika Bunsena.
Teraz przymocować sterylną igłę o rozmiarze 18 G do strzykawki z tłokiem z filtrem, najpierw włożyć dołączoną strzykawkę uwalniającą gaz do butelki. Teraz przymocuj sterylną igłę o rozmiarze 18 do wylotu gazu z systemu i włóż igłę odprowadzającą gaz również do butelki. Poprowadź złącza T ze zbiorników przez monitor tlenu.
Po zweryfikowaniu docelowego stężenia tlenu przepływającego przez system, należy dążyć do około pięciu litrów na minutę przepływu gazu. Przekieruj skrzyżowania T od zbiorników do wyjścia gazu. Gdy gaz zacznie przepływać przez butlę z serum, zwróć szczególną uwagę na manometr, a jeśli ciśnienie nieoczekiwanie wzrośnie, natychmiast wyłącz system.
Po uruchomieniu tlen przepływa przez butelkę z surowicą przez jedną minutę z prędkością pięciu litrów na minutę, ustawienia pozwalają na 10 wymian powietrza i zapewniają, że atmosfera wewnętrzna osiąga pożądane stężenie 100% tlenu. Usuń spust gazu, igłę o rozmiarze 18. Po dopuszczeniu, aby ciśnienie w butelce z surowicą wzrosło do jednej atmosfery, natychmiast wyjmij igłę odprowadzającą gaz.
Inkubować butelki z surowicą w wytrząsarce inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza z prędkością 150 obrotów na minutę w odstępach 3-24-godzinnych. Alec Watts jest pobierany w każdym 24-godzinnym odstępie czasu do dalszej analizy, a próbki są za każdym razem ponownie sparskanowane. Przykład tutaj pokazuje, jak może wyglądać kultura przed i po inkubacji.
Poziom tlenu i pH na wylocie mierzono w trakcie procesu hodowli dla próbek plwociny utrzymywanych w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Przy obu przerwach między iskrzeniami wynoszących 12 godzin i 24 godziny, stężenia tlenu utrzymywały się w przybliżeniu w czasie, z umiarkowanym spadkiem stężenia tlenu obserwowanym we wszystkich trzech warunkach. Zmierzone poziomy pH mieściły się w zakresie fizjologicznym bez istotnych zmian w czasie.
Porównanie obciążenia mikrobiologicznego, różnorodności i składu zbiorowiska między plwociną niehodowlaną a wyhodowaną wykazało 20-krotny wzrost obciążenia mikrobiologicznego w plwocinie hodowlanej. Wskaźniki różnorodności wskazywały na zachowanie składu społeczności przy minimalnych różnicach globalnych wprowadzonych przez proces kulturowy. Analizę porównawczą 120 gatunków drobnoustrojów w plwocinie hodowlanej i niehodowlanej przeprowadzono za pomocą sekwencjonowania metagenomowego.
46 z tych gatunków zidentyfikowano zarówno w próbkach niehodowlanych, jak i hodowlanych. Podczas gdy 35 zidentyfikowano wyłącznie w próbkach niehodowlanych, a 39 zidentyfikowano wyłącznie w próbkach hodowlanych. Krzywe wzrostu oparte na absorpcji uzyskano dla powszechnych patogenów płuc mukowiscydozy hodowanych w sztucznych podłożach plwociny z izolatów próbek pacjentów przy normalnym stężeniu tlenu 21%.
Brak zmian w czasie gęstości optycznej przy 600 nanometrach w ASM, tylko kontrola ujemna wskazywała na hodowlę wolną od zanieczyszczeń. Zaobserwowane typowe wzorce krzywych wzrostu wskazujące, że podłoże ASM może być używane do generowania krzywych wzrostu przy użyciu metod optycznych. Sekwencjonowanie metagenomiczne jest tutaj wykorzystywane do opisania składu społeczności drobnoustrojów.
Inne techniki, takie jak sekwencjonowanie metatranskryptomiczne, mogą być stosowane do oceny ekspresji genów lub metabolomika do oceny produkcji metabolitów.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół opisuje model systemu do badania wpływu hiperoksji na mikrośrodowiska drobnoustrojów dróg oddechowych u osób z mukowiscydozą. Wykorzystuje sztuczne medium śluzowe, aby odtworzyć skład śluzu i warunki hiperoksyczne, aby symulować wpływ tlenu uzupełniającego na mikrobiomy płuc.
Kluczowe Składowe Badania
Obszar Nauki
- Mikrobiologia
- Zdrowie Układu Oddechowego
- Badania nad Mukowiscydozą
Tło
- Pacjenci z mukowiscydozą często doświadczają zaburzeń mikrobiomu płuc.
- Tlen uzupełniający może wpływać na społeczności mikroorganizmów w płucach.
- Sztuczne medium śluzowe jest zaprojektowane, aby naśladować warunki fizjologiczne mukowiscydozy.
- Zrozumienie tych interakcji może poinformować strategie leczenia.
Cel Badania
- Opracowanie modelu do badania wpływu hiperoksji na mikrobiomy płuc.
- Wykorzystanie sztucznego medium śluzowego do hodowli społeczności mikroorganizmów.
- Zbadanie implikacji dla mukowiscydozy i innych przewlekłych chorób płuc.
Wykorzystane Metody
- Przygotowanie sztucznego medium śluzowego (ASCM).
- Wprowadzenie różnych warunków tlenowych poprzez napowietrzanie.
- Tytrowanie pH za pomocą buforu mops w celu uzyskania optymalnych warunków.
- Sterylizacja medium przez filtrację w kontrolowanych środowiskach.
Główne Wyniki
- Pomyślne modelowanie społeczności mikroorganizmów w warunkach hiperoksycznych.
- Wykazano adaptacyjność sztucznego medium śluzowego dla różnych chorób.
- Zidentyfikowano potencjalne interakcje między poziomami glukozy a wzrostem mikroorganizmów.
- Dostarczono ramy dla przyszłych badań nad mikrobiomami płuc.
Wnioski
- Model skutecznie symuluje wpływ tlenu uzupełniającego na mikrobiomy płuc.
- Sztuczne medium śluzowe można modyfikować dla różnych przewlekłych chorób płuc.
- Badania te przyczyniają się do zrozumienia dynamiki mikroorganizmów w mukowiscydozie.
Często Zadawane Pytania
Executive Industry Relevance
Modeling the impact of supplemental oxygen on the cystic fibrosis airway microbiome addresses a critical gap in understanding how hyperoxic conditions influence microbial community dynamics. This capability enables predictive assessment of therapeutic interventions and supports risk-adjusted decisions in respiratory drug discovery pipelines. The approach enhances translational continuity by providing a physiologically relevant in vitro system for mechanistic de-risking and target validation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of microbial community responses to oxygen modulation in disease-relevant systems.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying the effects of hyperoxia on pathogen and commensal populations.
- Facilitates functional target validation for interventions aimed at modulating airway microbiota.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized artificial sputum medium for reproducible microbial culture under controlled oxygen conditions.
- Enables quantitative growth curve generation for common cystic fibrosis pathogens using optical density measurements.
- Supports assay readiness for evaluating compound effects on microbial community composition and load.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro findings with clinical airway microbiome profiles through metagenomic sequencing comparisons.
- Maintains translational relevance by preserving community diversity and composition under normoxic and hyperoxic conditions.
- Enables risk-adjusted advancement of microbiome-modulating therapies by modeling real-world supplemental oxygen exposure.
Pipeline & Workflow Integration
This model system integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis-driven studies of oxygen effects on airway microbiota, supporting both early discovery and translational research.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing on oxygen-driven microbial shifts and their mechanistic implications.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for microbial growth and community analysis.
- Analytics: Provides metagenomic and optical density readouts for robust condition comparisons.
- Translational Research: Bridges in vitro and clinical microbiome data for biomarker alignment and validation.
- Enterprise Reuse: Offers a flexible platform adaptable to other chronic lung disease models and metabolic conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in microbiome-targeted interventions and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardizes microbial culture conditions and supports scalable, reproducible workflows.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions for respiratory portfolio assets by modeling clinically relevant oxygen exposures.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of microbiome-modulating candidates and supports cross-program data integration.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microbial culture, metagenomics, and respiratory disease modeling.
- Needs access to controlled gas sparging systems, incubator shakers, and sequencing infrastructure.
- Demands cross-team standardization of artificial sputum medium preparation and oxygen modulation protocols.
- Adaptable to model other chronic lung diseases or metabolic comorbidities by modifying medium composition.
- Limitations include the need for careful oxygen and pH monitoring to maintain physiological relevance.
