Synteza i charakterystyka nanocząstek poli(beta-aminoestrów) obciążonych mRNA do celów szczepień

Protokół ten jest istotny, ponieważ pokazuje, jak przygotować nanocząstki polimerowe, kapsułkowane kwasy nukleinowe w jednym prostym kroku. Głównymi zaletami tej techniki jest wszechstronność, ponieważ można ją stosować do różnych kwasów nukleinowych i typów komórek. Zastosowanie prostych procedur przygotowania cząstek, takich jak pipetowanie w górę i w dół, oraz możliwość przedłużenia stabilności nanocząstek i warunków pracy bębna poprzez liofilizację.

Procedurę zademonstrują Laura Olmo, Coral Garcia-Fernandez, Maria Stampa Lopez-Pinto i Maria Navalon-Lopez, doktorantka naszego laboratorium oraz Marta Diaz-Caballero, adiunkt w naszym laboratorium. W celu wytworzenia polipleksów należy rozmrozić wcześniej przygotowane polimery, peptyd C6, estry poli beta aminowe i odwirować roztwór. Po pipetowaniu mieszaniny polimerów w górę i w dół, przygotuj 12,5 milimolowy roztwór w octanie sodu.

Zwiruj roztwór i odczekaj 10 minut. Następnie przygotuj mRNA w stężeniu 0,5 miligrama na mililitr i wymieszaj przez pipetowanie. Ponownie zawirować roztwór polimeru, a następnie wymieszać roztwór materiału genetycznego w roztworze polimeru w stosunku jeden do jednego w probówce z mikrowirówką i inkubować probówkę w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez 30 minut w termobloku.

Po inkubacji wytrącić mieszaninę jedną lub dwiema wodami wolnymi od RNaz, dodając próbkę do probówki mikrowirówki zawierającej wodę, a następnie, aby uwzględnić substancje pomocnicze, dodać 20-milimolową hałdę i 4% roztwór sacharozy w tej samej objętości, co mieszanina mRNA i poli beta estrów aminowych i wymieszać przez pipetowanie. W przypadku liofilizacji po zamrożeniu roztworu polipleksu w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza przez godzinę należy przeprowadzić suszenie wstępne, a następnie natychmiast przechowywać polipleksy w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, aby uniknąć ponownego nawodnienia. W celu ponownego zaparcia polipleksu usuń liofilizowane nanocząstki z zamrażarki o temperaturze minus 20 stopni Celsjusza i szybko dodaj odpowiednią ilość głęboko uwodornionej wody, aby ponownie zdyspergować ciało stałe i osiągnąć pożądane stężenie.

Delikatnie pipetować aż do całkowitego ponownego wymieszania, a po rozpuszczeniu energicznie pipetować w górę i w dół, unikając pęcherzyków. Po 24 godzinach od transfekcji w celu oceny jakościowej za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, umieść 96-dołkową płytkę zawierającą transfekowane komórki Hela na mikroskopie i rozpocznij wizualizację za pomocą 10-krotnego obiektywu. Najpierw zastosuj balans bieli, aby utworzyć odniesienie do tła dla oprogramowania, a następnie uzyskaj obraz, aby nałożyć go na obraz fluorescencyjny podczas analizy.

Zmień tryb mikroskopu na tryb odbicia i przesuń koło filtrów na niebieski laser, aby zobrazować EGFP. Następnie uzyskaj obrazy dla wszystkich warunków lub odwiertów przy użyciu tego samego czasu naświetlania. W celu oceny ilościowej za pomocą cytometrii przepływowej należy przemyć transfekowane komórki Hela na 96-dołkowej płytce przy użyciu 100 mikrolitrów PBS na studzienkę.

Po zasysaniu PBS w ilości 25 mikrolitrów trypsyny na studzienkę i inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut. Po odłączeniu komórek dodaj wcześniej odzyskane podłoże, aby dezaktywować trypsynę, a następnie utrwal komórki, dodając 31,25 mikrolitrów 10% formaliny na studzienkę i inkubując przez 20 minut. Następnie włącz cytometr przepływowy i oprogramowanie, a następnie ustaw odpowiednie warunki eksperymentu, w tym rodzaj płytki, objętość próbki i inne parametry, takie jak wstrząsanie i płukanie między próbkami.

Ustaw odpowiednie parametry, aby określić ilościowo procent dodatnio transfekowanych komórek, najpierw przeglądając dane dotyczące przepływu światła rozproszonego do przodu w porównaniu ze światłem rozproszonym bocznie, aby odróżnić komórki od szczątków. A następnie wykreślenie kolejnego wykresu rozrzutu, porównując amplitudę i wysokość, aby zdobyć bramkę i rozróżnić poszczególne komórki. Na dzień przed transfekcją umieść 10 000 komórek JAWS II na basenie na 96-dołkowej płytce do inkubacji przez noc.

Następnego dnia przetacz komórki 0,6 mikrograma mRNA na studzienkę i inkubuj płytkę przez 24 godziny w inkubatorze z suchym powietrzem w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Następnego dnia umyj komórki pozostałe w studzience 25 mikrolitrami PBS. Po zaaspirowaniu PBS w 25 mikrolitrach trypsyny i inkubacji płytki przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w celu odłączenia komórek.

Zatrzymaj reakcję trypsyny, dodając wcześniej odzyskane podłoże do dołka korespondenta. Następnie odwirować płytkę, odessać pożywkę i utrwalić komórki, dodając 50 mikrolitrów PBS i 2,5% formaliny na dołek, a następnie inkubować płytkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 20 minut, odwirować płytkę. Następnie dodaj 50 mikrolitrów PBS i 3% BSA na studzienkę i inkubator przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Po inkubacji ponownie odwirować płytkę, a następnie dodać 50 mikrolitrów przeciwciała przeciwko albuminie jaja kurzego myszy w PBS i 3% BSA i inkubować przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Powtórz etap wirowania, a następnie umyj komórki 50 mikrolitrami PBS. Po odessaniu PBS dodać przeciwciała drugorzędowe i inkubować przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Po inkubacji powtórzyć etapy wirowania i mycia. Następnie ponownie zawiesić komórki i 100 mikrolitrów PBS i 2,5% formaliny do analizy cytometrii przepływowej. Charakterystyka fizykochemiczna świeżych i liofilizowanych nanocząstek otaczających mRNA GFP nie wykazuje istotnych różnic w wielkości i wskaźniku dyspersyjności.

Transmisyjna mikroskopia elektronowa polipleksów potwierdza powstawanie sferycznych i mono rozproszonych nanocząstek o średnicy około 50 nanometrów. Dane dotyczące skuteczności enkapsulacji peptydu Lego i zmodyfikowanych poli beta-aminesterów zawierających GFP lub albuminę jaja kurzego nie wykazują istotnych różnic w zależności od rodzaju mRNA. Przedstawiono tutaj analizę jakościową ekspresji EGFP, 24 godziny po transakcji w linii komórkowej JAWS II.

Ilościowo w porównaniu z kontrolą ujemną. Odsetek komórek dodatnich GFP jest znacznie wyższy i porównywalny z kontrolą pozytywną wykonaną za pomocą klasycznego odczynnika do transfekcji. Oligopeptyd obciążony mRNA albuminy jaja kurzego i zmodyfikowane nanocząstki poli beta aminoestrów mogą aktywować komórki dendrytyczne, co widać po znacznie wyższej ekspresji markerów błonowych CD11b i CD86 w transfekowanych komórkach w porównaniu z komórkami nietransfekowanymi.

Nasza platforma szczepień oparta na wykorzystaniu mRNA jako substancji czynnej, a także nasze autorskie polimery mogą być przystosowane do stosowania w profilaktyce, a także w terapii nowotworów. Możemy wykorzystać naszą technologię, aby podkreślić ten wkład w immunoterapię nowotworów. ponieważ możemy zamknąć antygeny związane z nowotworem w naszych nanocząsteczkach i dokonać zmiany w leczeniu raka.