Name: Synteza i charakterystyka nanocząstek poli(beta-aminoestrów) obciążonych mRNA do celów szczepień (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: Poznaj metodę syntezy nanocząstek poli(beta-aminoestrów) obciążonych mRNA do zastosowań szczepiennych. Technika ta umożliwia proste przygotowanie polipleksów z wysoką wydajnością enkapsulacji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wsparcie finansowe od MINECO/FEDER (granty SAF2015-64927-C2-2-R, RTI2018-094734-B-C22 i COV20/01100) jest potwierdzone. CGF przyznało jej stypendium doktoranckie IQS.

<ol><li>Chumakov, K., Benn, C. S., Aaby, P., Kottilil, S., Gallo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+existing+live+vaccines+prevent+COVID-19%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Can existing live vaccines prevent COVID-19.</a> Science. 368 (6496), 1187-1188 (2020).</li>
<li>Zhang, C., Maruggi, G., Shan, H., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+mRNA+vaccines+for+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Advances in mRNA vaccines for infectious diseases.</a> Frontiers in Immunology. 10, 1-13 (2019).</li>
<li>Wherry, E. J., Jaffee, E. M., Warren, N., D'Souza, G., Ribas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+did+we+get+a+COVID-19+vaccine+in+less+than+1+year%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">How did we get a COVID-19 vaccine in less than 1 year.</a> Clinical Cancer Research. 27 (8), 2136-2138 (2021).</li>
<li>Folegatti, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+and+immunogenicity+of+the+ChAdOx1+nCoV-19+vaccine+against+SARS-CoV-2%3A+a+preliminary+report+of+a+phase+1%2F2%2C+single-blind%2C+randomised+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Safety and immunogenicity of the ChAdOx1 nCoV-19 vaccine against SARS-CoV-2: a preliminary report of a phase 1/2, single-blind, randomised controlled trial.</a> The Lancet. 396 (10249), 467-478 (2020).</li>
<li>Geall, A. J., Mandl, C. W., Ulmer, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA%3A+The+new+revolution+in+nucleic+acid+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">RNA: The new revolution in nucleic acid vaccines.</a> Seminars in Immunology. 25 (2), 152-159 (2013).</li>
<li>Ulmer, J. B., Geall, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+innovations+in+mRNA+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Recent innovations in mRNA vaccines.</a> Current Opinion in Immunology. 41, 18-22 (2016).</li>
<li>Kranz, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+RNA+delivery+to+dendritic+cells+exploits+antiviral+defence+for+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Systemic RNA delivery to dendritic cells exploits antiviral defence for cancer immunotherapy.</a> Nature. 534 (7607), 396-401 (2016).</li>
<li>Milane, L., Amiji, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+approval+of+nanotechnology-based+SARS-CoV-2+mRNA+vaccines%3A+impact+on+translational+nanomedicine%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Delivery+and+Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Clinical approval of nanotechnology-based SARS-CoV-2 mRNA vaccines: impact on translational nanomedicine.</a> Drug Delivery and Translational Research. 1 (4), 3(2020).</li>
<li>Green, J. J., Langer, R., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+combinatorial+polymer+library+approach+yields+insight+into+nonviral+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">A combinatorial polymer library approach yields insight into nonviral gene delivery.</a> Accounts of Chemical Research. 41 (6), 749-759 (2008).</li>
<li>Guerrero-Cázares, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodegradable+polymeric+nanoparticles+show+high+efficacy+and+specificity+at+DNA+delivery+to+human+glioblastoma+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Biodegradable polymeric nanoparticles show high efficacy and specificity at DNA delivery to human glioblastoma in vitro and in vivo.</a> ACS Nano. 8 (5), 5141-5153 (2014).</li>
<li>Kozielski, K. L., Tzeng, S. Y., Hurtado De Mendoza, B. A., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioreducible+cationic+polymer-based+nanoparticles+for+efficient+and+environmentally+triggered+cytoplasmic+siRNA+delivery+to+primary+human+brain+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Bioreducible cationic polymer-based nanoparticles for efficient and environmentally triggered cytoplasmic siRNA delivery to primary human brain cancer cells.</a> ACS Nano. 8 (4), 3232-3241 (2014).</li>
<li>Segovia, N., Dosta, P., Cascante, A., Ramos, V., Borrós, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligopeptide-terminated+poly%28%CE%B2-amino+ester%29s+for+highly+efficient+gene+delivery+and+intracellular+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Oligopeptide-terminated poly(β-amino ester)s for highly efficient gene delivery and intracellular localization.</a> Acta Biomaterialia. 10 (5), 2147-2158 (2014).</li>
<li>Dosta, P., Segovia, N., Cascante, A., Ramos, V., Borrós, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+charge+tunability+as+a+powerful+strategy+to+control+electrostatic+interaction+for+high+efficiency+silencing%2C+using+tailored+oligopeptide-+modified+poly+%28beta-amino+ester%29s+%28PBAEs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Surface charge tunability as a powerful strategy to control electrostatic interaction for high efficiency silencing, using tailored oligopeptide- modified poly (beta-amino ester)s (PBAEs).</a> Acta Biomaterialia. 20, 82-93 (2015).</li>
<li>Fornaguera, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+delivery+system+for+targeting+antigen-presenting+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">mRNA delivery system for targeting antigen-presenting cells in vivo.</a> Advanced Healthcare Materials. 7 (17), 180033(2018).</li>
<li>Fornaguera, C., Castells-Sala, C., Lázaro, M. Á, Cascante, A., Borrós, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+optimized+freeze-drying+protocol+for+OM-PBAE+nucleic+acid+polyplexes%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Development of an optimized freeze-drying protocol for OM-PBAE nucleic acid polyplexes.</a> International Journal Pharmaceutics. 569, (2019).</li>
<li>Fornaguera, C., Solans, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+methods+to+characterize+and+purify+polymeric+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Polymer+Science%22%5BJournal%5D)">Analytical methods to characterize and purify polymeric nanoparticles.</a> International Journal of Polymer Science. , (2018).</li>
<li>Fornaguera, C., Solans, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+polymeric+nanoparticle+dispersions+for+biomedical+applications%3A+size%2C+surface+charge+and+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Characterization of polymeric nanoparticle dispersions for biomedical applications: size, surface charge and stability.</a> Pharmaceutical Nanotechnology. 6 (3), 147-164 (2018).</li>
<li>Sahin, U., Karikó, K., Türeci, Ö <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRNA-based+therapeutics-developing+a+new+class+of+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">MRNA-based therapeutics-developing a new class of drugs.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 13 (10), 759-780 (2014).</li>
<li>Fan, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cationic+lipid-assisted+nanoparticles+for+delivery+of+mRNA+cancer+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials+Science%22%5BJournal%5D)">Cationic lipid-assisted nanoparticles for delivery of mRNA cancer vaccine.</a> Biomaterials Science. 6 (11), 3009-3018 (2018).</li>
<li>Le Moignic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+evaluation+of+mRNA+trimannosylated+lipopolyplexes+as+therapeutic+cancer+vaccines+targeting+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Preclinical evaluation of mRNA trimannosylated lipopolyplexes as therapeutic cancer vaccines targeting dendritic cells.</a> Journal of Controlled Release. 278, 110-121 (2018).</li>
<li>Banerji, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+vaccines+to+prevent+COVID-19+disease+and+reported+allergic+reactions%3A+Current+evidence+and+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%3A+In+Practice%22%5BJournal%5D)">mRNA vaccines to prevent COVID-19 disease and reported allergic reactions: Current evidence and approach.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology: In Practice. 9 (4), 1423-1437 (2021).</li>
<li>Kaczmarek, J. C., Kowalski, P. S., Anderson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+delivery+of+RNA+therapeutics%3A+from+concept+to+clinical+reality%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Medicine%22%5BJournal%5D)">Advances in the delivery of RNA therapeutics: from concept to clinical reality.</a> Genome Medicine. 9 (1), 1-16 (2017).</li>
<li>Dosta, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+anti-microRNA-712+to+inflamed+endothelial+cells+using+poly%28%CE%B2-amino+ester%29+nanoparticles+conjugated+with+VCAM-1+targeting+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Delivery of anti-microRNA-712 to inflamed endothelial cells using poly(β-amino ester) nanoparticles conjugated with VCAM-1 targeting peptide.</a> Advanced Healthcare Materials. , 1-11 (2021).</li>
<li>Segovia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogel+doped+with+nanoparticles+for+local+sustained+release+of+siRNA+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Hydrogel doped with nanoparticles for local sustained release of siRNA in breast cancer.</a> Advanced Healthcare Materials. 4 (2), 271-280 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia ani nie pozostają w konflikcie interesów.

Po wybuchu pandemii Covid-19 w ubiegłym roku znaczenie szczepionek w zakresie kontroli chorób zakaźnych stało się kluczowym elementem8. Wysiłki naukowców z całego świata umożliwiły wprowadzenie na rynek wielu szczepionek. Po raz pierwszy w historii szczepionki mRNA wykazały swój wcześniej hipotetyczny sukces, dzięki szybkiemu projektowi ze względu na ich zdolność do adaptacji do każdego nowego antygenu w ciągu kilku miesięcy 5,6,21</s...

Choroby zakaźne stanowią poważne zagrożenie dla milionów ludzi na całym świecie i nadal są jedną z głównych przyczyn zgonów w niektórych krajach rozwijających się. Szczepienia profilaktyczne są jedną z najskuteczniejszych interwencji współczesnego społeczeństwa w celu zapobiegania i kontroli chorób zakaźnych1,2. Te kluczowe kamienie milowe nauki w XX-wiecznym znaczeniu zostały zauważone przez niedawną światową pandemię Covid-19 spowodowaną wirusem SARS-CoV-23. Uznając znaczenie posiadania skutecznych szczepionek w celu ograniczenia rozprzestrzeniania się choroby, wspólne wysiłki wszystkich społeczności biomedycznych z powodzeniem zaowocowały wieloma szczepionkami profilaktycznymi dostępnymi na rynku w czasie krótszym niż rok4.
Tradycyjnie, szczepionki składały się z atenuowanych (żywe, zmniejszone zjadliwości) lub inaktywowanych (cząstki śmierci) wirusów. Jednak w przypadku niektórych chorób, w przypadku których nie ma marginesu błędu bezpieczeństwa, cząsteczki wirusa nie są możliwe, a zamiast nich stosuje się podjednostki białkowe. Niemniej jednak podjednostki zwykle nie umożliwiają połączenia więcej niż jednego epitopu/antygenu, a adiuwanty są wymagane do zwiększenia siły działania szczepienia5,6. W związku z tym istnieje oczywiste zapotrzebowanie na nowe rodzaje szczepionek.
Jak wykazano podczas obecnej pandemii, nowe kandydatki na szczepionki oparte na kwasach nukleinowych mogą być korzystne pod względem unikania długich procesów rozwoju i zapewniania wysokiej wszechstronności, jednocześnie produkując niezbędną szczepionkę pacjenta. Tak jest w przypadku szczepionek mRNA, które początkowo zostały zaprojektowane jako eksperymentalne szczepionki przeciwnowotworowe. Dzięki ich naturalnej zdolności do wytwarzania odpowiedzi limfocytów T specyficznych dla antygenu3,5,6,7. Będąc mRNA, cząsteczką kodującą białko antygenowe, zmieniającą się tylko tak samo, szczepionka może być szybko dostosowana do uodparniania innych wariantów tego samego mikroorganizmu, różnych szczepów, innych zakaźnych mikroorganizmów, a nawet stać się leczeniem immunoterapeutycznym raka. Ponadto są korzystne pod względem kosztów produkcji na dużą skalę. Jednak mRNA ma poważną przeszkodę, która utrudnia ich nagie podawanie: jego stabilność i integralność są zagrożone w pożywkach fizjologicznych, pełnych nukleaz. Z tego powodu wymagane jest użycie nanometrycznego nośnika, który chroni go i wektoryzuje mRNA do komórek prezentujących antygen2,8.
W tym kontekście, poli(beta aminoestry) (pBAE) to klasa biokompatybilnych i biodegradowalnych polimerów, które wykazały niezwykłą zdolność do kompleksowania mRNA w nanometrycznych cząsteczkach, dzięki swoim ładunkom kationowym9,10,11. Polimery te składają się z wiązań estrowych, co ułatwia ich degradację przez esterazy w warunkach fizjologicznych. Wśród kandydatów do biblioteki pBAE, te funkcjonalizowane oligopeptydami kationowymi wykazały większą zdolność do tworzenia małych nanocząstek, aby skutecznie przenikać do komórek przez endocytozę i transfekować zamknięty w kapsułkach materiał genowy. Ponadto, dzięki ich zdolności buforowej, zakwaszenie przedziału endosomalnego umożliwia ucieczkę endosomalną12,13. Mianowicie, niedawno opublikowano specyficzny rodzaj pBAE, w tym hydrofobowe ugrupowania na ich szkielecie (tzw. C6 pBAE) w celu zwiększenia ich stabilności i kombinacji end-oligopeptyd (60% polimeru zmodyfikowanego trilizyną i 40% polimeru tri-histydyną), który selektywnie transfekuje komórki prezentujące antygen po podaniu pozajelitowym i wytwarza prezentację antygenu kodowaną przez mRNA, a następnie immunizację myszy14. Ponadto wykazano również, że preparaty te mogą obejść jeden z głównych etapów wąskiego gardła preparatów nanomedycznych: możliwość ich liofilizacji bez utraty ich funkcjonalności, co umożliwia długoterminową stabilność w środowiskach miękkich, suchych15.
W tym kontekście, celem obecnego protokołu jest udostępnienie społeczności naukowej procedury tworzenia nanocząsteczek mRNA poprzez podanie opisu krytycznych kroków w protokole i umożliwienie produkcji skutecznych szczepionek do zapobiegania chorobom zakaźnym i leczenia nowotworów.
Poniższy protokół opisuje kompletny trening syntezy oligopeptydów modyfikowanych na końcu poli(beta aminoestrów) - polimerów OM-pBAE, które będą dalej wykorzystywane do syntezy nanocząstek. W protokole uwzględniono również formułę nanocząstek. Ponadto zapewnione są kluczowe etapy dla powodzenia procedury i reprezentatywnych wyników, aby zapewnić, że otrzymane preparaty spełniają wymagane cechy charakterystyki kontroli jakości w celu określenia wyniku pozytywnego lub negatywnego. Protokół ten jest podsumowany w Rysunek 1.

<table><tbody><tr><td>Diakrylan 1,4-butanodiolu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>123048</td><td></td></tr><tr><td>1-heksyloamina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>219703</td><td></td></tr><tr><td>5-amino-1-pentanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>411744</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Panreac</td><td>141007</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało CD11b</td><td>Przeciwciało BD</td><td>550993</td><td></td></tr><tr><td>CD86</td><td>Bioligend</td><td>105007</td><td></td></tr><tr><td>Chlorohydroksyd</td><td>Panreac</td><td>181023</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform-d</td><td>Sigma Aldrich</td><td>151823</td><td></td></tr><tr><td>peptyd Cys-His-His-His</td><td>Ontores</td><td>Custom</td><td></td></tr><tr><td>Cys-Lys-Lys-Lys peptyd</td><td>Ontores Custom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>151882</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik DEPC do wody wolnej od rnazy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5758</td><td>Ten odczynnik jest ważny do uzdatniania wody MilliQ w celu usunięcia wszelkich RNaz z</td></tr><tr><td>Dietyl eter</td><td>Panreac</td><td>212770</td><td></td></tr><tr><td>dimetylosulfotlenek</td><td>Sigma Aldrich</td><td>276855</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>mRNA EGFP</td><td>TriLink Technologies</td><td>L-7601</td><td></td></tr><tr><td>mRNA OVA</td><td>TriLink Technologie</td><td>L-7610</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw RiboGreen</td><td>ThermoFisher</td><td>R11490</td><td></td></tr><tr><td>octan sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71196</td><td></td></tr><tr><td>sacharoza</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Kwas trifluorooctowy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>302031</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>11570626</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;- mysz Przeciwciało AlexaFluor488</td><td>Abcam</td><td>Ab450105</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanoparticle Tracking Analyzer</td><td>Malvern Panalytical</td><td>NanoSight NS300</td><td></td></tr><tr><td>Spektrometr magnetycznego rezonansu magnetycznego</td><td>Varian</td><td>400 MHz</td><td></td></tr><tr><td>ZetaSizer</td><td>Malvern Panalytical</td><td>Nano ZS</td><td>Dla potencjału zeta i hydrodynamiczne określanie rozmiaru</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoSight Oprogramowanie NTA</td><td>Malvern Panalytical</td><td>MAN0515-02-PL-00</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie NovoExpress</td><td>Agilent</td><td>Nie określono</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie ZetaSizer</td><td>Malvern Panalytical</td><td>DTS Aplikacja</td><td>Do analizy ładunku powierzchniowego i rozmiarów hydrodynamicznych</td></tr></tbody></table>

synteza i charakterystyka nanocząstek poli(beta-aminoestrów) obciążonych mrna do celów szczepień

Synthesis and Characterization of mRNA-Loaded Poly(Beta Aminoesters) Nanoparticles for Vaccination Purposes

Szczepienia są jednym z głównych sukcesów współczesnego społeczeństwa i są niezbędne w kontrolowaniu i zapobieganiu chorobom. Tradycyjne szczepionki składały się z całości lub frakcji czynnika zakaźnego. Nadal jednak istnieją wyzwania, a nowe technologie szczepionek są obowiązkowe. W tym kontekście stosowanie mRNA do celów uodparniających wykazało zwiększoną skuteczność, czego dowodem jest szybkie zatwierdzenie dwóch szczepionek mRNA zapobiegających zakażeniu SARS-CoV-2. Oprócz skuteczności w zapobieganiu infekcjom wirusowym, szczepionki mRNA mogą być również stosowane w leczeniu raka.
Niemniej jednak, niestabilność mRNA i jego szybkie usuwanie z organizmu spowodowane obecnością nukleaz uniemożliwia jego bezpośrednie dostarczanie. W tym kontekście nanoleki, a w szczególności nanocząstki polimerowe, są krytycznymi systemami dostarczania mRNA. W związku z tym celem niniejszego artykułu jest opisanie protokołu formulacji i testu kandydata na szczepionkę mRNA opartego na zastrzeżonych nanocząstkach polimerowych. W tym miejscu omówiona zostanie synteza i charakterystyka chemiczna zastosowanych polimerów poli(beta-aminoestrów), ich kompleksowanie z mRNA w celu wytworzenia nanocząstek oraz metodologia ich liofilizacji. Jest to kluczowy krok w kierunku obniżenia kosztów magazynowania i dystrybucji. Na koniec wskazane zostaną wymagane testy w celu wykazania ich zdolności do transfekcji in vitro i dojrzałych modelowych komórek dendrytycznych. Protokół ten przyniesie korzyści społeczności naukowej zajmującej się szczepieniami ze względu na jego dużą wszechstronność, która umożliwia tym szczepionkom zapobieganie lub leczenie wielu różnych chorób.

Synteza i charakterystyka polimeru 
Procedura syntezy OM-pBAE przedstawiona jest na Rysunku 2. Jak pokazuje Rysunek 2A, pierwszym krokiem w celu otrzymania OM-pBAE jest synteza C6-pBAE poprzez dodanie amin (1-heksyloaminy i 5-amino-1-pentanolu w stosunku 1:1) do diakrylanu (diakrylanu 1,4-butanodiolu). Reakcję tę przeprowadzono w temperaturze 90 °C przez 20 h przy stałym mieszaniu. Następnie do roztworu polimeru C6 otrzymanego w poprzedniej r...

Tutaj przedstawiono prosty protokół produkcji nanocząsteczek mRNA opartych na polimerach poli(beta aminoestrowych), który można łatwo dostosować poprzez zmianę kapsułkowanego mRNA. Opisano również przebieg syntezy polimerów, nanocząstek oraz ich niezbędną charakterystykę in vitro. Dodano również dowód słuszności koncepcji dotyczący szczepień.

Synteza i charakterystyka nanocząstek poli(beta-aminoestrów) obciążonych mRNA do celów szczepień

Vaccination has been one of the major successes of modern society and is indispensable in controlling and preventing disease. Traditional vaccines were ...

Protokół ten jest istotny, ponieważ pokazuje, jak przygotować nanocząstki polimerowe, kapsułkowane kwasy nukleinowe w jednym prostym kroku. Głównymi zaletami tej techniki jest wszechstronność, ponieważ można ją stosować do różnych kwasów nukleinowych i typów komórek. Zastosowanie prostych procedur przygotowania cząstek, takich jak pipetowanie w górę i w dół, oraz możliwość przedłużenia stabilności nanocząstek i warunków pracy bębna poprzez liofilizację.Procedurę zademonstrują Laura Olmo, Coral Garcia-Fernandez, Maria Stampa Lopez-Pinto i Maria Navalon-Lopez, doktorantka naszego laboratorium oraz Marta Diaz-Caballero, adiunkt w naszym laboratorium. W celu wytworzenia polipleksów należy rozmrozić wcześniej przygotowane polimery, peptyd C6, estry poli beta aminowe i odwirować roztwór. Po pipetowaniu mieszaniny polimerów w górę i w dół, przygotuj 12,5 milimolowy roztwór w octanie sodu.Zwiruj roztwór i odczekaj 10 minut. Następnie przygotuj mRNA w stężeniu 0,5 miligrama na mililitr i wymieszaj przez pipetowanie. Ponownie zawirować roztwór polimeru, a następnie wymieszać roztwór materiału genetycznego w roztworze polimeru w stosunku jeden do jednego w probówce z mikrowirówką i inkubować

synthesis-characterization-mrna-loaded-poly-beta-aminoesters

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Ten film demonstruje metodę generowania kandydata na szczepionkę mRNA przy użyciu nanocząsteczek polimerowych. Polimer kationowy oddziałuje z ujemnie naładowanym mRNA, tworząc polipleksy. Tworzenie polipleksów stabilizuje mRNA, co czyni je potencjalnym kandydatem na przyszłe szczepionki mRNA w zastosowaniach immunoterapeutycznych.

Formułowanie nanocząstek obciążonych mRNA do celów szczepień

Opisano protokół analizy śledzenia nanocząstek (NTA) i wysokoprzepustowej cytometrii przepływowej do oceny nanocząstek dostarczających geny polimerowe. NTA wykorzystuje się do scharakteryzowania rozkładu wielkości cząstek nanocząstek i rozkładu plazmidu na cząstkę. Wysokoprzepustowa cytometria przepływowa umożliwia ilościową ocenę skuteczności transfekcji dla biblioteki biomateriałów dostarczających geny.

Ocena nanocząstek dostarczających geny polimerowe za pomocą analizy śledzenia nanocząstek i wysokoprzepustowej cytometrii przepływowej

Nanomateriały zapewniają wszechstronne mechanizmy kontrolowanego dostarczania terapeutycznego zarówno dla nauk podstawowych, jak i zastosowań translacyjnych, ale ich wytwarzanie często wymaga specjalistycznej wiedzy, która jest niedostępna w większości laboratoriów biomedycznych. W tym miejscu przedstawiamy protokoły skalowalnego wytwarzania i ładowania terapeutycznego różnorodnych, samoorganizujących się nanonośników za pomocą nanoprecypitacji błyskawicznej.

Szybkie, skalowalne składanie i ładowanie bioaktywnych białek i immunostymulantów do różnych syntetycznych nanonośników za pomocą nanoprecypitacji błyskawicznej

Tutaj opisujemy protokół generowania kationowych nanoliposomów, który opiera się na metodzie suchego filmu i może być wykorzystany do bezpiecznego i efektywnego dostarczania transkrybowanego in vitro informacyjnego RNA.

Wytwarzanie kationowych nanoliposomów w celu efektywnego dostarczania transkrybowanego in vitro informacyjnego RNA

Szczegółowa metoda jest tutaj opisana jako oczyszczanie, ponowne fałdowanie i charakterystyka samoorganizujących się nanocząstek białkowych (SAPN) do wykorzystania w opracowywaniu szczepionek.

Wytwarzanie samoorganizujących się nanocząstek białkowych z ekspresją E. coli do szczepionek wymagających prezentacji epitopów trymerycznych

Obecny protokół opisuje bioinżynierię pęcherzyków błony zewnętrznej jako platformę szczepionki typu "Plug-and-Display", obejmującą produkcję, oczyszczanie, biokoniugację i charakterystykę.

Platforma szczepionkowa nanocząsteczkowa typu "plug-and-display" oparta na pęcherzykach błony zewnętrznej wykazujących domenę wiążącą receptor SARS-CoV-2

Samoorganizująca się nanocząstka peptydu-poloksaminy (PP-sNp) jest rozwijana przy użyciu mikroprzepływowego urządzenia mieszającego do kapsułkowania i dostarczania in vitro transkrybowanego informacyjnego RNA. Opisane mRNA/PP-sNp może skutecznie transfekować hodowane komórki in vitro.

Wydajna transfekcja transkrybowanego mRNA in vitro w hodowanych komórkach przy użyciu nanocząstek peptydowo-poloksaminowych

Tutaj prezentujemy szczegółowe metody przygotowania i oceny nosowej samoorganizującej się szczepionki przeciwnowotworowej z nanoemulsji in vitro i in vivo.

Przygotowanie, charakterystyka, toksyczność i skuteczność oceny samoorganizującej się szczepionki przeciwnowotworowej z nanoemulsją do nosa in vitro i in vivo

Ta metoda opisuje enkapsulację antygenu wścieklizny w biodegradowalne mikrocząstki polimerowe o właściwościach strukturalnych i materiałowych, które umożliwiają pulsacyjne uwalnianie po określonym opóźnieniu. Test immunoenzymatyczny (ELISA) oceny antygenu pobranego z rdzenia cząstki potwierdza obecność nienaruszonej glikoproteiny wirusa wścieklizny trimerycznej w wyniku wytwarzania cząstek.

Wytwarzanie pulsacyjnych mikrocząstek polimerowych zamykających antygen wścieklizny

Obecny protokół przygotowuje i ocenia właściwości fizyczne, odpowiedź immunologiczną i efekt ochronny in vivo nowej szczepionki z adiuwantem nanoemulsyjnym.

Ocena odpowiedzi immunologicznej szczepionki z adiuwantem nanoemulsyjnym przeciwko zakażeniu gronkowcem złocistym opornym na metycylinę (MRSA)

Poznaj metodę syntezy nanocząstek poli(beta-aminoestrów) obciążonych mRNA do zastosowań szczepiennych. Technika ta umożliwia proste przygotowanie polipleksów z wysoką wydajnością enkapsulacji.

Synteza i charakterystyka nanocząstek poli(beta-aminoestrów) obciążonych mRNA do celów szczepień

Przeglądaj więcej filmów