Kwantyfikacja poziomów zmian morfologicznych i zwyrodnień neuronów dopaminergicznych u Caenorhabditis elegans
November 20th, 2021
W tym artykule pokazujemy, jak używać siedmiopunktowego systemu punktacji do konsekwentnego ilościowego określania zmian w morfologii dendrytów neuronów dopaminergicznych u C. elegans. System ten jest przeznaczony do analiz testów neurodegeneracji dopaminergicznej z wykorzystaniem genetycznych, chemicznych i opartych na wieku modeli zaburzeń neurodegeneracyjnych.
W tym filmie pokazujemy, jak wykorzystać siedmiopunktowy system punktacji do ilościowego określenia zmian w morfologii dendrytów neuronów dopaminergicznych u C. elegans. Obecnie istnieje duża różnorodność w metodach analitycznych ilościowego określania neurodegeneracji u robaków. Ponadto niektóre istniejące umiejętności skupiają się tylko na ciałach komórek i nie są wrażliwe na określone typy i poziomy obrażeń.
Celem wprowadzenia tego systemu punktacji jest zapewnienie możliwości uchwycenia kompleksowego obrazu neurodegeneracji na wszystkich poziomach uszkodzeń oraz zapewnienie uniwersalnego systemu wspierającego spójność w badaniach nad neurodegeneracją dopaminergiczną C. elegans. Tutaj pokażemy, jak obrazować neurony pod wpływem fluorescencji, przypisać wyniki do dendrytów tych neuronów oraz zobaczyć, jak wyświetlać i interpretować wyniki. Dla każdej grupy eksperymentalnej należy pipetować lub pobierać od 20 do 30 robaków na platformę obrazowania kompatybilną z mikroskopem obrazowym.
Najczęściej spotykane platformy to 2% podkładki agarozowe zamontowane na szkiełkach podstawowych z szkiełkiem nakrywkowym oraz płytki 96-dołkowe zawierające studzienki o objętości równej lub mniejszej niż 100 mikrolitrów ciekłego podłoża. Pozwól robakom całkowicie sparaliżować. Może to potrwać kilka minut.
Załaduj przygotowaną platformę obrazowania do mikroskopu obrazowego zdolnego do przechwytywania z-stack. Zlokalizuj obszar głowy robaka najpierw w jasnym polu, a następnie pod jednokolorową fluorescencją GFP za pomocą mikroskopu obrazowego. Robak jest pokazany tutaj w powiększeniu 400x.
Przewiń fokus, aby znaleźć górną i dolną granicę, w której dendryty są wyraźne. Ustaw je jako górne i dolne granice przechwytywania obrazu z-stack. Wybierz żądaną wysokość.
Tutaj używamy jednego mikrometra. Kliknij, aby przechwycić obrazy z-stack w kanale fluorescencji GFP. Dla każdego stosu z obrazem otwórz plik obrazu za pomocą oprogramowania mikroskopu lub zewnętrznego oprogramowania do analizy obrazu.
Załaduj stos do oprogramowania i skompresuj stos do jednego spłaszczonego obrazu. Wyrównywaj obrazy między grupami zabiegowymi i w ich obrębie ręcznie lub za pomocą oprogramowania do automatycznego nawijania. Pracuj z jednym obrazem neuronu na raz.
Wybierz jeden z czterech dendrytów, aby ocenić pod kątem pęcherzyków, pęknięć i nieregularności, w tym zagięć, załamań i krzywych. Zaleca się punktowanie od lewej do prawej, gdy nos znajduje się u góry obrazu, aby zapewnić powtarzalność punktacji. Korzystając z tych wskazówek, przypisz jedną wartość punktacji do każdego dendrytu.
Przyznać zero punktów dla dendrytów bez widocznych uszkodzeń, punktację 1 dla dendrytów z nierównościami, ale bez zagnieceń lub pęknięć, punktację dwa dla dendrytów z mniej niż pięcioma pęcherzykami, wynik trzy dla od pięciu do 10 pęcherzyków, wynik cztery dla ponad 10 pęcherzyków i/lub pęknięcie usuwające do 25% dendrytu, Wynik pięć za złamanie usuwające od 25 do 75% dendrytu i wynik sześć w przypadku braku więcej niż 75% dendrytu. Jeśli w ramach jednego dendrytu spełnionych jest wiele kryteriów, należy wziąć pod uwagę kryteria odpowiadające najwyższemu wynikowi. Te reprezentatywne obrazy punktacji, które znajdują się na rysunku 1 w artykule powiązanym z tym filmem, mogą być wykorzystane jako odniesienie.
Aby zademonstrować punktację, przejdziemy przez przypisywanie wyników do kilku przykładowych obrazów neuronów. Zacznij od dendrytu znajdującego się na samej górze, nie ma widocznych pęcherzyków, pęknięć ani nierówności. Przypisz wynik równy zero.
Drugi dendryt ma około 14 pęcherzyków i nie ma widocznych pęknięć. Przypisz wynik do czterech. Trzeci dendryt nie może być widziany w całości ze względu na nakładanie się na dendryt drugi i nie można go naciąć.
Najniższy dendryt ma około 11 pęcherzyków i kilka pęknięć. Przyznaj pięć punktów. Na tym zdjęciu tylko trzy dendryty są możliwe do przechwycenia, ponieważ jeden dendryt nie został w pełni uchwycony w uchwycie z-stack
.Na trzech widocznych dendrytach nie ma pęcherzyków. Więc to byłoby oceniane od góry do dołu jako zero, zero, a ze względu na załamanie tutaj, jedynka. Wreszcie, na tym obrazie, wszystkie cztery dendryty są utracone w ponad 75%.
Wszystkie dendryty otrzymują tutaj wynik sześciu. Zapisz wszystkie wyniki. W tym momencie wyniki mogą zostać odślepione.
Zastosowany tutaj szablon punktacji można znaleźć w plikach uzupełniających. Podziel wyniki neurodegeneracji przez całkowitą liczbę dendrytów uzyskanych w grupie leczonej. Przedstaw dane jako proporcję dendrytów w grupie leczonej przy każdym wyniku neurodegeneracji.
Nasz system punktacji został wykorzystany do oceny neurodegeneracji w stadium larwalnym L4 BY200 C.elegans po ekspozycji na rotenon. Dane są tutaj wyświetlane tak, jak w przypadku proporcji całkowitej liczby dendrytów przy każdej wartości punktowej dla każdej grupy eksperymentalnej. Uważamy, że każdy dendryt uzyskany jest jako n 1.
Na tym rysunku można docenić zależną od dawki odpowiedź neurodegeneracyjną na ekspozycję na rotenon, a konkretny podział rozkładu wyników jest wyraźnie przedstawiony. Te grupy eksperymentalne różniły się statystycznie zgodnie z testem chi-kwadrat dla niezależności uzupełnionym poprawką Bonferroniego dla wielokrotnych porównań. W tym filmie pokazaliśmy, jak używać siedmiopunktowej skali opracowanej w naszym laboratorium do ilościowego określania poziomów zmian morfologicznych i degeneracji neuronów dopaminergicznych u C. elegans.
Stosowanie metody punktacji sprzyja spójności analizy i pozwala na porównanie badań naukowych nad neurodegeneracją u robaków. Nasz system punktacji może być wykorzystany do analizy danych pochodzących z eksperymentów C.elegans, które wykorzystują specyficzne dla komórki reportery fluorescencyjne, takie jak gen transportera dopaminy dat-1, który pozwala na wizualizację neuronów dopaminergicznych. Teraz w materiałach uzupełniających do tego artykułu znajdziesz zestaw obrazów do ćwiczeń z komentarzem, które można wykorzystać do trenowania, kalibrowania i oceny spójności punktacji badaczy nowych w tej metodzie.
Przegląd
Ten artykuł pokazuje implementację siedmiopunktowego systemu punktacji w celu ilościowego określenia zmian morfologii dendrytów w neuronach dopaminergicznych C. elegans. Celem jest standaryzacja analiz neurodegeneracji w różnych badaniach, poprawiając spójność w badaniu zaburzeń neurodegeneracyjnych.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Neurodegeneracja
- Ocena morfologiczna
Tło
- Obecne metody oceny neurodegeneracji w C. elegans różnią się znacznie.
- Istniejące techniki często koncentrują się na ciałach komórkowych, a nie na uszkodzeniach dendrytów.
- Potrzebny jest kompleksowy system punktacji, aby zapewnić pełniejszy obraz efektów neurodegeneracji.
- System ten rejestruje poważność uszkodzeń na wielu poziomach.
Cel badania
- Ustanowić uniwersalny system punktacji do analizy zmian dendrytów w neuronach dopaminergicznych.
- Umożliwić spójne oceny neurodegeneracji w różnych badaniach C. elegans.
- Zezwolić naukowcom na porównywanie wyników w różnych modelach genetycznych i chemicznych.
Zastosowane metody
- Badanie wykorzystuje mikroskop do obrazowania z uchwytem z-stack obrazów neuronów.
- C. elegans jest kluczowym modelem biologicznym, koncentrując się na morfologii neuronów dopaminergicznych.
- Punkty zawierają się w zakresie od zera do sześciu, dotycząc różnych poziomów uszkodzeń dendrytów.
- Metodyka obejmuje precyzyjne kroki obrazowania, rejestrowanie i punktowanie dendrytów dla spójności.
- Dane są przedstawiane jako proporcja dendrytów na każdym poziomie skali neurodegeneracji.
Główne wyniki
- System punktacji skutecznie rozróżnia poziomy zmian neurodegeneracyjnych w neuronach dopaminergicznych.
- Dane sugerują dawkowo zależną odpowiedź neurodegeneracji na ekspozycję na rotenon.
- Analiza statystyczna pokazuje istotne różnice między grupami eksperymentalnymi.
- Ogólnie rzecz biorąc, system umożliwia jasne ilościowe określenie i porównanie w badaniach.
Wnioski
- To badanie umożliwia bardziej standaryzowaną analizę neurodegeneracji w modelach C. elegans.
- Metoda punktacji promuje spójność i umożliwia jaśniejsze porównania w badaniach.
- Przyczynia się do zrozumienia mechanizmów neurodegeneracji istotnych dla zaburzeń neurodegeneracyjnych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Standardized quantification of dopaminergic neuron morphology in C. elegans supports target validation and mechanistic de-risking in neurodegenerative disease research. A universal scoring system enables reproducible, quantitative assessment of dendrite degeneration, improving predictive confidence in preclinical models. This facilitates cross-study comparison and portfolio triage for Parkinson's disease and related neurodegeneration programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying dendrite-level morphological changes in dopaminergic neurons.
- Operational Value: Supports biological de-risking through a standardized seven-point scale that captures subtle to severe neurodegeneration.
- Predictive Value: Enhances target confidence by providing dose-dependent response data, such as rotenone exposure effects, for mechanism-of-action validation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative dendrite morphology data suitable for assay standardization and high-content screening readiness.
- Operational Value: Enables scalable, reproducible imaging workflows using z-stack fluorescence capture and automated or manual dendrite scoring.
- Assay Utility: Produces proportional score distributions that allow statistical comparison across treatment groups using Chi-squared tests with Bonferroni correction.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Links C. elegans dopaminergic neuron models to human neurodegeneration pathways through conserved morphometric endpoints.
- Preclinical Utility: Supports risk-adjusted advancement decisions by quantifying degeneration progression across genetic and chemical models.
- Mechanistic De-risking: Clarifies structure-function relationships by correlating dendrite damage (blebs, breaks, kinks) with functional neuronal loss.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows, supporting lead identification through quantitative neurodegeneration phenotyping in C. elegans models.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of neuroprotective compounds by scoring dendrite integrity in dat-1::GFP-expressing neurons.
- Screening: Produces assay-ready, standardized outputs via z-stack imaging and dendrite scoring for compound library evaluation.
- Analytics: Delivers quantitative neurodegeneration scores (0–6) that support statistical analysis and inter-laboratory reproducibility.
- Translational Research: Connects worm neurite morphology to mammalian dendrite pathology, enabling biomarker-aligned target validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, transferable scoring framework for consistent neurodegeneration assessment across C. elegans-based discovery platforms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by capturing full spectrum of dendrite alterations, from blebs to complete loss.
- Operational Value: Improves standardization and reproducibility through a universal scoring system and practice image set for researcher calibration.
- Strategic Value: Increases capital efficiency by enabling early go/no-go decisions based on quantitative neurodegeneration profiles.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets using dose-response and statistical significance data from scored dendrite populations.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy and neuroanatomy of C. elegans dopaminergic neurons.
- Depends on imaging infrastructure capable of z-stack capture and image flattening for dendrite visualization.
- Necessitates cross-team standardization via training with annotated image sets to ensure scoring consistency.
- Involves adaptation considerations when applying the scale to different neuronal subtypes or disease models.
- Includes practical limitations such as dependence on intact z-stack capture for full dendrite visualization and scorer training to minimize inter-observer variability.
