Kwantyfikacja poziomów zmian morfologicznych i zwyrodnień neuronów dopaminergicznych u Caenorhabditis elegans
20 listopada 2021
W tym artykule pokazujemy, jak używać siedmiopunktowego systemu punktacji do konsekwentnego ilościowego określania zmian w morfologii dendrytów neuronów dopaminergicznych u C. elegans. System ten jest przeznaczony do analiz testów neurodegeneracji dopaminergicznej z wykorzystaniem genetycznych, chemicznych i opartych na wieku modeli zaburzeń neurodegeneracyjnych.
W tym filmie pokazujemy, jak wykorzystać siedmiopunktowy system punktacji do ilościowego określenia zmian w morfologii dendrytów neuronów dopaminergicznych u C. elegans. Obecnie istnieje duża różnorodność w metodach analitycznych ilościowego określania neurodegeneracji u robaków. Ponadto niektóre istniejące umiejętności skupiają się tylko na ciałach komórek i nie są wrażliwe na określone typy i poziomy obrażeń.
Celem wprowadzenia tego systemu punktacji jest zapewnienie możliwości uchwycenia kompleksowego obrazu neurodegeneracji na wszystkich poziomach uszkodzeń oraz zapewnienie uniwersalnego systemu wspierającego spójność w badaniach nad neurodegeneracją dopaminergiczną C. elegans. Tutaj pokażemy, jak obrazować neurony pod wpływem fluorescencji, przypisać wyniki do dendrytów tych neuronów oraz zobaczyć, jak wyświetlać i interpretować wyniki. Dla każdej grupy eksperymentalnej należy pipetować lub pobierać od 20 do 30 robaków na platformę obrazowania kompatybilną z mikroskopem obrazowym.
Najczęściej spotykane platformy to 2% podkładki agarozowe zamontowane na szkiełkach podstawowych z szkiełkiem nakrywkowym oraz płytki 96-dołkowe zawierające studzienki o objętości równej lub mniejszej niż 100 mikrolitrów ciekłego podłoża. Pozwól robakom całkowicie sparaliżować. Może to potrwać kilka minut.
Załaduj przygotowaną platformę obrazowania do mikroskopu obrazowego zdolnego do przechwytywania z-stack. Zlokalizuj obszar głowy robaka najpierw w jasnym polu, a następnie pod jednokolorową fluorescencją GFP za pomocą mikroskopu obrazowego. Robak jest pokazany tutaj w powiększeniu 400x.
Przewiń fokus, aby znaleźć górną i dolną granicę, w której dendryty są wyraźne. Ustaw je jako górne i dolne granice przechwytywania obrazu z-stack. Wybierz żądaną wysokość.
Tutaj używamy jednego mikrometra. Kliknij, aby przechwycić obrazy z-stack w kanale fluorescencji GFP. Dla każdego stosu z obrazem otwórz plik obrazu za pomocą oprogramowania mikroskopu lub zewnętrznego oprogramowania do analizy obrazu.
Załaduj stos do oprogramowania i skompresuj stos do jednego spłaszczonego obrazu. Wyrównywaj obrazy między grupami zabiegowymi i w ich obrębie ręcznie lub za pomocą oprogramowania do automatycznego nawijania. Pracuj z jednym obrazem neuronu na raz.
Wybierz jeden z czterech dendrytów, aby ocenić pod kątem pęcherzyków, pęknięć i nieregularności, w tym zagięć, załamań i krzywych. Zaleca się punktowanie od lewej do prawej, gdy nos znajduje się u góry obrazu, aby zapewnić powtarzalność punktacji. Korzystając z tych wskazówek, przypisz jedną wartość punktacji do każdego dendrytu.
Przyznać zero punktów dla dendrytów bez widocznych uszkodzeń, punktację 1 dla dendrytów z nierównościami, ale bez zagnieceń lub pęknięć, punktację dwa dla dendrytów z mniej niż pięcioma pęcherzykami, wynik trzy dla od pięciu do 10 pęcherzyków, wynik cztery dla ponad 10 pęcherzyków i/lub pęknięcie usuwające do 25% dendrytu, Wynik pięć za złamanie usuwające od 25 do 75% dendrytu i wynik sześć w przypadku braku więcej niż 75% dendrytu. Jeśli w ramach jednego dendrytu spełnionych jest wiele kryteriów, należy wziąć pod uwagę kryteria odpowiadające najwyższemu wynikowi. Te reprezentatywne obrazy punktacji, które znajdują się na rysunku 1 w artykule powiązanym z tym filmem, mogą być wykorzystane jako odniesienie.
Aby zademonstrować punktację, przejdziemy przez przypisywanie wyników do kilku przykładowych obrazów neuronów. Zacznij od dendrytu znajdującego się na samej górze, nie ma widocznych pęcherzyków, pęknięć ani nierówności. Przypisz wynik równy zero.
Drugi dendryt ma około 14 pęcherzyków i nie ma widocznych pęknięć. Przypisz wynik do czterech. Trzeci dendryt nie może być widziany w całości ze względu na nakładanie się na dendryt drugi i nie można go naciąć.
Najniższy dendryt ma około 11 pęcherzyków i kilka pęknięć. Przyznaj pięć punktów. Na tym zdjęciu tylko trzy dendryty są możliwe do przechwycenia, ponieważ jeden dendryt nie został w pełni uchwycony w uchwycie z-stack
.Na trzech widocznych dendrytach nie ma pęcherzyków. Więc to byłoby oceniane od góry do dołu jako zero, zero, a ze względu na załamanie tutaj, jedynka. Wreszcie, na tym obrazie, wszystkie cztery dendryty są utracone w ponad 75%.
Wszystkie dendryty otrzymują tutaj wynik sześciu. Zapisz wszystkie wyniki. W tym momencie wyniki mogą zostać odślepione.
Zastosowany tutaj szablon punktacji można znaleźć w plikach uzupełniających. Podziel wyniki neurodegeneracji przez całkowitą liczbę dendrytów uzyskanych w grupie leczonej. Przedstaw dane jako proporcję dendrytów w grupie leczonej przy każdym wyniku neurodegeneracji.
Nasz system punktacji został wykorzystany do oceny neurodegeneracji w stadium larwalnym L4 BY200 C.elegans po ekspozycji na rotenon. Dane są tutaj wyświetlane tak, jak w przypadku proporcji całkowitej liczby dendrytów przy każdej wartości punktowej dla każdej grupy eksperymentalnej. Uważamy, że każdy dendryt uzyskany jest jako n 1.
Na tym rysunku można docenić zależną od dawki odpowiedź neurodegeneracyjną na ekspozycję na rotenon, a konkretny podział rozkładu wyników jest wyraźnie przedstawiony. Te grupy eksperymentalne różniły się statystycznie zgodnie z testem chi-kwadrat dla niezależności uzupełnionym poprawką Bonferroniego dla wielokrotnych porównań. W tym filmie pokazaliśmy, jak używać siedmiopunktowej skali opracowanej w naszym laboratorium do ilościowego określania poziomów zmian morfologicznych i degeneracji neuronów dopaminergicznych u C. elegans.
Stosowanie metody punktacji sprzyja spójności analizy i pozwala na porównanie badań naukowych nad neurodegeneracją u robaków. Nasz system punktacji może być wykorzystany do analizy danych pochodzących z eksperymentów C.elegans, które wykorzystują specyficzne dla komórki reportery fluorescencyjne, takie jak gen transportera dopaminy dat-1, który pozwala na wizualizację neuronów dopaminergicznych. Teraz w materiałach uzupełniających do tego artykułu znajdziesz zestaw obrazów do ćwiczeń z komentarzem, które można wykorzystać do trenowania, kalibrowania i oceny spójności punktacji badaczy nowych w tej metodzie.
Przegląd
W niniejszym artykule zaprezentowano wdrożenie siedmiostopniowego systemu punktowego do ilościowego określania zmian w morfologii dendrytów neuronów dopaminergicznych u C. elegans. Celem jest standaryzacja analiz neurodegeneracji w różnych testach, co pozwoli na zwiększenie spójności badań nad zaburzeniami neurodegeneracyjnymi.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Neurodegeneracja
- Ocena morfologiczna
Wprowadzenie
- Obecne metody oceny neurodegeneracji u C. elegans znacznie się od siebie różnią.
- Istniejące techniki często skupiają się na ciałach komórkowych, a nie na uszkodzeniach dendrytycznych.
- Konieczny jest kompleksowy system punktowy, aby uzyskać pełniejszy obraz efektów neurodegeneracyjnych.
- System ten pozwala uchwycić stopień nasilenia uszkodzeń na wielu poziomach.
Cel badania
- Ustanowienie uniwersalnego systemu punktacji do analizy zmian dendrytycznych w neuronach dopaminergicznych.
- Umożliwienie spójnej oceny neurodegeneracji w różnych badaniach nad C. elegans.
- Umożliwienie badaczom porównywania wyników w różnych modelach genetycznych i chemicznych.
Zastosowane metody
- W badaniu wykorzystano mikroskop obrazujący do wykonania serii zdjęć (z-stack) neuronów.
- C. elegans jest kluczowym modelem biologicznym, z uwzględnieniem morfologii neuronów dopaminergicznych.
- Wyniki mieszczą się w zakresie od zera do sześciu i odnoszą się do różnych stopni uszkodzenia dendrytów.
- Metodyka obejmuje precyzyjne etapy obrazowania, utrwalanie obrazów oraz punktowanie dendrytów w celu zapewnienia spójności.
- Dane przedstawiono jako proporcję dendrytów dla każdego wyniku oceny neurodegeneracji.
Główne wyniki
- System punktacji skutecznie różnicuje stopnie zmian neurodegeneracyjnych w neuronach dopaminergicznych.
- Dane sugerują zależną od dawki odpowiedź neurodegeneracyjną na ekspozycję na rotenon.
- Analiza statystyczna wykazuje istotne różnice między grupami eksperymentalnymi.
- Ogólnie system ten umożliwia przejrzystą kwantyfikację i porównywanie wyników między badaniami.
Wnioski
- Niniejsze badanie umożliwia bardziej standaryzowaną analizę neurodegeneracji w modelach C. elegans.
- Zastosowana metoda oceny sprzyja spójności i pozwala na wyraźniejsze porównania w badaniach.
- Przyczynia się ona do zrozumienia mechanizmów degeneracji neuronów istotnych w kontekście schorzeń neurodegeneracyjnych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Znormalizowana kwantyfikacja morfologii neuronów dopaminergicznych u C. elegans wspiera walidację celów oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego w badaniach nad chorobami neurodegeneracyjnymi. Uniwersalny system punktacji umożliwia odtwarzalną, ilościową ocenę degeneracji dendrytów, co zwiększa pewność prognostyczną w modelach przedklinicznych. Ułatwia to porównywanie wyników między badaniami oraz selekcję projektów w programach dotyczących choroby Parkinsona i powiązanych procesów neurodegeneracji.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez ilościowe określanie zmian morfologicznych na poziomie dendrytów w neuronach dopaminergicznych.
- Wartość operacyjna: Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego dzięki standaryzowanej siedmiostopniowej skali, która pozwala uchwycić zmiany od subtelnych do ciężkich procesów neurodegeneracyjnych.
- Wartość prognostyczna: Zwiększa pewność co do wybranego celu terapeutycznego, dostarczając danych o odpowiedzi zależnej od dawki, takich jak efekty ekspozycji na rotenon, w celu walidacji mechanizmu działania.
Przesiewy i opracowanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie ilościowych danych dotyczących morfologii dendrytów, odpowiednich do standaryzacji testów oraz przygotowania do wysokoprzepustowych analiz obrazowych (high-content screening).
- Wartość operacyjna: Umożliwia tworzenie skalowalnych i powtarzalnych procesów obrazowania z wykorzystaniem fluorescencyjnej akwizycji stosu Z (z-stack) oraz automatycznego lub ręcznego oceniania dendrytów.
- Użyteczność testu: Pozwala na uzyskanie proporcjonalnych rozkładów wyników, co umożliwia statystyczne porównanie grup traktowanych z zastosowaniem testów chi-kwadrat z korektą Bonferroniego.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość translacyjna: Łączy modele neuronów dopaminergicznych C. elegans z ludzkimi szlakami neurodegeneracji poprzez konserwatywne punkty końcowe morfometryczne.
- Użyteczność przedkliniczna: Wspiera decyzje o przejściu do kolejnych etapów badań po dostosowaniu do ryzyka poprzez kwantyfikację postępu degeneracji w modelach genetycznych i chemicznych.
- Minimalizacja ryzyka mechanistycznego: Wyjaśnia zależności struktura-funkcja poprzez korelację uszkodzeń dendrytów (pęcherzyków, przerw, załamań) z funkcjonalną utratą neuronów.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta integruje się z wczesnymi etapami procesów odkrywania leków, wspierając identyfikację związków wiodących poprzez ilościowe fenotypowanie neurodegeneracji w modelach C. elegans.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia testowanie hipotez dotyczących związków neuroprotekcyjnych poprzez ocenę integralności dendrytycznej w neuronach wykazujących ekspresję dat-1::GFP.
- Przesiewanie: Generuje ustandaryzowane wyniki gotowe do analizy poprzez obrazowanie w stosie z (z-stack) i ocenę dendrytów w celu ewaluacji biblioteki związków.
- Analityka: Dostarcza ilościowe oceny neurodegeneracji (0–6), które wspierają analizę statystyczną i powtarzalność międzylaboratoryjną.
- Badania translacyjne: Łączy morfologię neurytów nicieni z patologią dendrytów ssaków, umożliwiając walidację celów zgodną z biomarkerami.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwach: Ustanawia skalowalny, transferowalny system oceny zapewniający spójną analizę neurodegeneracji w platformach odkrywczych opartych na C. elegans.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną poprzez rejestrację pełnego spektrum zmian dendrytów, od pęcherzyków po całkowitą utratę.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację i powtarzalność dzięki uniwersalnemu systemowi punktacji oraz zestawowi obrazów treningowych do kalibracji badaczy.
- Wartość strategiczna: Zwiększa efektywność kapitałową, umożliwiając wczesne podejmowanie decyzji go/no-go na podstawie ilościowych profili neurodegeneracji.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka, wykorzystując dane o zależności dawka-odpowiedź oraz istotność statystyczną z punktowanych populacji dendrytów.
Kwestie związane z implementacją
- Wymaga doświadczenia w zakresie mikroskopii fluorescencyjnej oraz neuroanatomii neuronów dopaminergicznych C. elegans.
- Zależy od infrastruktury obrazowania umożliwiającej wykonanie serii obrazów z-stack oraz spłaszczanie obrazu w celu wizualizacji dendrytów.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej poprzez szkolenie na zestawach obrazów z adnotacjami w celu zapewnienia spójności punktacji.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania skali przy zastosowaniu jej do różnych podtypów neuronów lub modeli chorobowych.
- Obejmuje ograniczenia praktyczne, takie jak zależność od kompletnego zapisu z-stack dla pełnej wizualizacji dendrytów oraz szkolenie oceniających w celu zminimalizowania zmienności międzyobserwacyjnej.
