Name: Kwantyfikacja poziomów zmian morfologicznych i zwyrodnień neuronów dopaminergicznych u Caenorhabditis elegans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: Poznaj siedmiopunktowy system oceny zmian morfologicznych dendrytów neuronów dopaminergicznych u Caenorhabditis elegans. Ta metoda standaryzuje analizę neurodegeneracji i umożliwia porównywanie wyników badań.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pragniemy podziękować Ianowi T. Ryde'owi za wkład w rozwój skali punktacji i za jego wsparcie podczas tworzenia tego manuskryptu. Prace te były wspierane przez National Institutes of Health (T32ES021432 wspierały KSM, a P42ES010356 do JNM).

1. Przygotowanie robaków do obrazowania
UWAGA: Zobacz powiązany artykuł wideo JoVe31: https://www.jove.com/v/835/ 
<ol>
	<li>Dla każdej grupy eksperymentalnej należy pipetować lub pobierać od 20 do 30 robaków na platformę obrazowania kompatybilną z mikroskopem obrazowym. Najpopularniejsze platformy obejmują 2% wkładki z żelu agarozowego zamontowane na szkiełkach podstawowych z szkiełkiem nakrywkowym31 oraz płytki 96-dołkowe zawierające studzienki o objętości równej lub mniejszej niż 100 μl ciekłego podłoża.</li>
	<li>Sparaliżuj robaki, dodając do robaków 30-90 mM azydku sodu (NaN3), 2,5-8,5 mM lewamizolu HCl lub innego środka paraliżującego. W przypadku paraliżowania w płynie należy użyć wyższego stężenia środka paraliżującego niż w przypadku paraliżowania na podkładkach agarozowych. Delikatnie dotknij platformy obrazowania, aby wymieszać.</li>
	<li>Pozwól robakom całkowicie sparaliżować. 
	UWAGA: Może to potrwać kilka minut.</li>
</ol>
2. Obraz Neurony dopaminergiczne
<ol>
	<li>Zlokalizuj obszary głowy robaków pod jednokolorową fluorescencją GFP za pomocą mikroskopu obrazowego zdolnego do pobierania stosów z.
	<ol>
		<li>Zwracaj uwagę na ustawienia ekspozycji i przysłony; unikaj prześwietlenia dendrytów i utrzymuj spójne ustawienia we wszystkich próbach. Spraw, aby dendryty były tak jasne, jak to konieczne, aby uzyskać wyraźną wizualizację; Zazwyczaj prowadzi to do prześwietlenia SOMA. 
		UWAGA: Obrazy zawarte w tym protokole zostały zarejestrowane przy użyciu 400-krotnego powiększenia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przewiń fokus, aby znaleźć górną i dolną granicę, w której dendryty są wyraźne. Ustaw je jako górną i dolną granicę przechwytywania obrazu z-stack</li>.
	<li>Kliknij, aby przechwycić obrazy z-stack dla każdego robaka. 
	UWAGA: Wszystkie poniższe kroki można wykonać w dowolnym momencie.</li>
</ol>
3. Przygotowanie obrazów neuronów dopaminergicznych do oceny punktowej
<ol>
	<li>Dla każdego stosu z otwórz plik obrazu za pomocą oprogramowania mikroskopu lub zewnętrznego oprogramowania do analizy obrazu, załaduj stos do oprogramowania i skompresuj stos do jednego spłaszczonego obrazu.</li>
	<li>Ślepe obrazy między grupami terapeutycznymi i w ich obrębie ręcznie lub za pomocą oprogramowania do automatycznego zaślepiania.</li>
</ol>
4. Wynik dendrytów neuronów dopaminergicznych
<ol>
	<li>Pracuj z jednym obrazem neuronu na raz. Wybierz jeden z czterech dendrytów, aby ocenić pod kątem pęcherzyków, pęknięć i nieregularności, w tym zagięć, załamań i krzywych. Punktacja od lewej do prawej, gdy nos znajduje się u góry obrazu, jest zalecana, aby zapewnić powtarzalność punktacji.</li>
	<li>Korzystając z poniższych wskazówek, przypisz jedną wartość punktacji do dendrytu. Zobacz Rysunek 1 dla reprezentatywnych przykładów obrazów punktacji. 
	0- brak uszkodzeń, "idealne" neurony 
	1- nieregularne (załamania, krzywizny itp.) 
	2- <5 pęcherzyków 
	3- 5-10 pęcherzyków 
	4->10 pęcherzyków i/lub pęknięć usuwających <25% całkowitego dendrytu 
	5- Pęknięcie, 25-75% usuniętego dendrytu 
	6- Złamanie, > 75% usunięto dendryt
	<ol>
		<li>Jeśli w obrębie jednego dendrytu spełnionych jest wiele kryteriów (tj. załamania i pęcherzyki), przypisz najwyższy odpowiedni wynik.</li>
		<li>Nie nacinaj dendrytów, które nie są wyraźnie widoczne, ze względu na problemy z przechwytywaniem obrazu, nakładanie się na inne dendryty itp. W przypadku powiększania spłaszczonego obrazu stosu Z należy pamiętać o powiększonych pikselach przypominających fałszywe pęcherze.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Powtórz te czynności dla każdego dendrytu. Powtórz te czynności dla wszystkich obrazów.</li>
	<li>Zapisz wszystkie wyniki. W tym momencie wyniki mogą być odślepione.</li>
</ol>
5. Przygotowanie i prezentacja danych
<ol>
	<li>Oblicz całkowitą liczbę dendrytów w każdej grupie terapeutycznej przypisanej do każdego wyniku neurodegeneracji. Oblicz całkowitą liczbę dendrytów z nacięciem w każdej grupie badanej.</li>
	<li>Podziel wyniki neurodegeneracji przez całkowitą liczbę dendrytów uzyskanych w grupie leczonej. Przedstaw dane jako proporcję dendrytów w grupie leczonej przy każdym wyniku neurodegeneracji.</li>
</ol>
6. Wykonaj analizę statystyczną
<ol>
	<li>Za pomocą oprogramowania do programowania lub ręcznie uruchom test chi-kwadrat w celu uzyskania niezależności między wszystkimi parami grup leczenia, które mają być porównane. W stosownych przypadkach zastosować poprawkę Bonferroniego wartości p w zależności od liczby porównywanych grup doświadczalnych w celu uwzględnienia wielokrotnych porównań. 
	UWAGA: Ten test określi znaczące różnice między dwiema grupami, ale szczegóły dotyczące rodzaju różnicy muszą być kwalifikowane na oko.
	<ol>
		<li>Wybierz porównania między grupami eksperymentalnymi. Będzie się to różnić w zależności od projektu eksperymentalnego. 
		UWAGA: W naszych eksperymentach zazwyczaj grupy kontrolne są porównywane z odpowiednimi grupami leczenia, wszystkie kontrole są porównywane i wszystkie terapie są porównywane.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Ćwicz punktację z zestawem ćwiczeń obrazów neuronów dopaminergicznych
<ol>
	<li>Zobacz Plik Uzupełniający 1, aby zapoznać się z zestawem obrazów neuronów prezentujących pełen zakres naszego systemu punktacji wraz z komentarzem i kluczem punktacji. Ten zestaw ćwiczeń ma na celu przeszkolenie badaczy, którzy nie znają tej metody, i zapewnienie wiarygodności między oceniającymi.</li>
</ol>
8. Rozważ alternatywne opcje protokołu
<ol>
	<li>Zamiast przechwytywać stosy z, wykonaj nacinanie pod mikroskopem, bez zapisywania lub układania obrazów. 
	UWAGA: Ta opcja zmniejsza wymagania dotyczące możliwości technologicznych, ale usuwa opcję tworzenia archiwum obrazów neuronów, do których można wrócić w późniejszym czasie, wymaga ręcznego zaślepienia i zezwala na zaślepienie tylko między grupami leczonymi, a nie w ich obrębie.</li>
	<li>Zamiast tworzyć pojedynczy skompresowany obraz na stos, zakończ ocenianie, przewijając obrazy każdego z-stack. 
	UWAGA: Ta opcja może być łatwiejsza dla niektórych oceniających i zmniejsza ryzyko zobaczenia fałszywych pęcherzyków na robakach, które poruszały się podczas obrazowania i pozwala na ocenę nakładających się dendrytów, ale wymaga ręcznego zaślepienia i pozwala na zaślepienie tylko między grupami leczonymi, a nie w ich obrębie.</li>
</ol>

<ol><li>Maulik, M., Mitra, S., Bult-Ito, A., Taylor, B. E., Vayndorf, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+Phenotyping+and+Pathological+Indicators+of+Parkinson%27s+Disease+in+C.+elegans+Models%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Behavioral Phenotyping and Pathological Indicators of Parkinson's Disease in C. elegans Models.</a> Frontiers in Genetics. 8 (77), (2017).</li>
<li>Hayes, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+Disease+and+Parkinsonism.+Review%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Parkinson's Disease and Parkinsonism. Review.</a> The American Journal of Medicine. 132 (7), 802-807 (2019).</li>
<li>Pouchieu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pesticide+use+in+agriculture+and+Parkinson%27s+disease+in+the+AGRICAN+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Epidemiology%22%5BJournal%5D)">Pesticide use in agriculture and Parkinson's disease in the AGRICAN cohort study.</a> International Journal of Epidemiology. 47 (1), 299-310 (2018).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The Genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71-94 (1973).</li>
<li>Nass, R., Hall, D. H., Miller, D. M., Blakely, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotoxin-induced+degeneration+of+dopamine+neurons+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Neurotoxin-induced degeneration of dopamine neurons in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (5), 3264-3269 (2002).</li>
<li>Wu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+of+hop-1+and+pink-1+attenuates+vulnerability+of+neurotoxicity+in+C.+elegans%3A+the+role+of+mitochondria-associated+membrane+proteins+in+Parkinsonism%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Mutation of hop-1 and pink-1 attenuates vulnerability of neurotoxicity in C. elegans: the role of mitochondria-associated membrane proteins in Parkinsonism.</a> Experimental Neurology. 309, 67-78 (2018).</li>
<li>Chikka, M. R., Anbalagan, C., Dvorak, K., Dombeck, K., Prahlad, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mitochondria-Regulated+Immune+Pathway+Activated+in+the+C.+elegans+Intestine+Is+Neuroprotective%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">The Mitochondria-Regulated Immune Pathway Activated in the C. elegans Intestine Is Neuroprotective.</a> Cell Reports. 16 (9), 2399-2414 (2016).</li>
<li>Nass, R., Miller, D. M., Blakely, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-elegans%3A+a+novel+pharmacogenetic+model+to+study+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Parkinsonism+Relat+D%22%5BJournal%5D)">C-elegans: a novel pharmacogenetic model to study Parkinson's disease.</a> Parkinsonism Relat D. 7 (3), 185-191 (2001).</li>
<li>Benedetto, A., Au, C., Aschner, M., Nass, R. Manganese and C. elegans in Parkinson's disease. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBenedetto%2C+A+%22Parkinson%27s+Disease%3A+Pathogenic+and+Therapeutic+Insights+from+Toxin+and+Genetic+Models.%2C+Life+Science%22">Parkinson's Disease: Pathogenic and Therapeutic Insights from Toxin and Genetic Models., Life Science</a>. Nass, R., Przedborski, S. , Elsevier Inc. (2008).</li>
<li>Harrington, A. J., Hamamichi, S., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+as+a+Model+Organism+to+Investigate+Molecular+Pathways+Involved+with+Parkinson%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">C. elegans as a Model Organism to Investigate Molecular Pathways Involved with Parkinson's Disease.</a> Developmental Dynamics. 239 (5), 1282-1295 (2010).</li>
<li>Cooper, J. F., Van Raamsdonk, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Parkinson%27s+Disease+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Parkinson%27s+Disease%22%5BJournal%5D)">Modeling Parkinson's Disease in C. elegans.</a> Journal of Parkinson's Disease. 8 (1), 17-32 (2018).</li>
<li>Chege, P. M., McColl, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans%3A+a+model+to+investigate+oxidative+stress+and+metal+dyshomeostasis+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+AGING+NEUROSCIENCE%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans: a model to investigate oxidative stress and metal dyshomeostasis in Parkinson's disease.</a> Frontiers in AGING NEUROSCIENCE. 6, 89(2014).</li>
<li>Lu, C. L., Svoboda, K. R., Lenz, K. A., Pattison, C., Ma, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxicity+interactions+between+manganese+%28Mn%29+and+lead+%28Pb%29+or+cadmium+%28Cd%29+in+a+model+organism+the+nematode+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+and+Pollution+Research%22%5BJournal%5D)">Toxicity interactions between manganese (Mn) and lead (Pb) or cadmium (Cd) in a model organism the nematode C. elegans.</a> Environmental Science and Pollution Research. 25 (16), 15378-15389 (2018).</li>
<li>Negga, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+to+Mn%2FZn+ethylene-bis-dithiocarbamate+and+glyphosate+pesticides+leads+to+neurodegeneration+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">Exposure to Mn/Zn ethylene-bis-dithiocarbamate and glyphosate pesticides leads to neurodegeneration in Caenorhabditis elegans.</a> Neurotoxicology. 32 (3), 331-341 (2011).</li>
<li>Nagarajan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+degeneration+of+dopaminergic+neurons+through+TRP+channel-induced+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Progressive degeneration of dopaminergic neurons through TRP channel-induced cell death.</a> Journal of Neuroscience. 34 (17), 5738-5746 (2014).</li>
<li>Salim, C., Rajini, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose-rich+diet+aggravates+monocrotophos-induced+dopaminergic+neuronal+dysfunction+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Glucose-rich diet aggravates monocrotophos-induced dopaminergic neuronal dysfunction in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Applied Toxicology. 37 (6), 772-780 (2017).</li>
<li>Ved, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Similar+patterns+of+mitochondrial+vulnerability+and+rescue+induced+by+genetic+modification+of+alpha-synuclein%2C+parkin%2C+and+DJ-1+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Similar patterns of mitochondrial vulnerability and rescue induced by genetic modification of alpha-synuclein, parkin, and DJ-1 in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (52), 42655-42668 (2005).</li>
<li>Yao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRK2-mediated+neurodegeneration+and+dysfunction+of+dopaminergic+neurons+in+a+Caenorhabditis+elegans+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">LRRK2-mediated neurodegeneration and dysfunction of dopaminergic neurons in a Caenorhabditis elegans model of Parkinson's disease.</a> Neurobiology of Disease. 40 (1), 73-81 (2010).</li>
<li>Pivtoraiko, V. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-dose+bafilomycin+attenuates+neuronal+cell+death+associated+with+autophagy-lysosome+pathway+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Low-dose bafilomycin attenuates neuronal cell death associated with autophagy-lysosome pathway dysfunction.</a> Journal of Neurochemistry. 114 (4), 1193-1204 (2010).</li>
<li>Civelek, M., Mehrkens, J. F., Carstens, N. M., Fitzenberger, E., Wenzel, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+mitophagy+decreases+survival+of+Caenorhabditis+elegans+by+increasing+protein+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Inhibition of mitophagy decreases survival of Caenorhabditis elegans by increasing protein aggregation.</a> Molecular and Cellular Biochemistry. 452 (1-2), 123-131 (2019).</li>
<li>Van Pelt, K. M., Truttmann, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+as+a+model+system+for+studying+aging-associated+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Medicine+of+Aging%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans as a model system for studying aging-associated neurodegenerative diseases.</a> Translational Medicine of Aging. 4, 60-72 (2020).</li>
<li>Youssef, K., Tandon, A., Rezai, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+Parkinson%27s+disease+using+Caenorhabditis+elegans+models+in+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">Studying Parkinson's disease using Caenorhabditis elegans models in microfluidic devices.</a> Integrative Biology. 11 (5), 186-207 (2019).</li>
<li>Lesage, S., Brice, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease%3A+from+monogenic+forms+to+genetic+susceptibility+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease: from monogenic forms to genetic susceptibility factors.</a> Human Molecular Genetics. 18, 48-59 (2009).</li>
<li>Gasser, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Usefulness+of+Genetic+Testing+in+PD+and+PD+Trials%3A+A+Balanced+Review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Parkinson%27s+Disease%22%5BJournal%5D)">Usefulness of Genetic Testing in PD and PD Trials: A Balanced Review.</a> Journal of Parkinson's Disease. 5 (2), 209-215 (2015).</li>
<li>Bronstein, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meeting+report%3A+consensus+statement-Parkinson%27s+disease+and+the+environment%3A+collaborative+on+health+and+the+environment+and+Parkinson%27s+Action+Network+%28CHE+PAN%29+conference+26-28+June+2007%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Health+Perspectives%22%5BJournal%5D)">Meeting report: consensus statement-Parkinson's disease and the environment: collaborative on health and the environment and Parkinson's Action Network (CHE PAN) conference 26-28 June 2007.</a> Environmental Health Perspectives. 117 (1), 117-121 (2009).</li>
<li>Migliore, L., Coppede, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics%2C+environmental+factors+and+the+emerging+role+of+epigenetics+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">Genetics, environmental factors and the emerging role of epigenetics in neurodegenerative diseases.</a> Mutation Research. 667 (1-2), 82-97 (2009).</li>
<li>Schapira, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+in+the+aetiology+and+pathogenesis+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurology%22%5BJournal%5D)">Mitochondria in the aetiology and pathogenesis of Parkinson's disease.</a> Lancet Neurology. 7 (1), 97-109 (2008).</li>
<li>Lill, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Probes%22%5BJournal%5D)">Genetics of Parkinson's disease.</a> Molecular and Cellular Probes. 30 (6), 386-396 (2016).</li>
<li>Smith, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strengths+and+limitations+of+morphological+and+behavioral+analyses+in+detecting+dopaminergic+deficiency+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">Strengths and limitations of morphological and behavioral analyses in detecting dopaminergic deficiency in Caenorhabditis elegans.</a> Neurotoxicology. 74, 209-220 (2019).</li>
<li>Hindle, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ageing%2C+neurodegeneration+and+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Age+and+Ageing%22%5BJournal%5D)">Ageing, neurodegeneration and Parkinson's disease.</a> Age and Ageing. 39, 156-161 (2010).</li>
<li>Luo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+nigral+dopaminergic+neurodegeneration+and+%CE%B1-synuclein+accumulation+in+RGS6-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Age-dependent nigral dopaminergic neurodegeneration and α-synuclein accumulation in RGS6-deficient mice.</a> JCI Insight. 4 (13), 126769(2018).</li>
<li>Berkowitz, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Video+Article%3A+Application+of+a+C.+elegans+Dopamine+Neuron+Degeneration+Assay+for+the+Validation+of+Potential+Parkinson%27s+Disease+Genes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Video Article: Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes.</a> Journal of Visualized Experiments. (17), e835(2008).</li>
<li>Tucci, M. L., Harrington, A. J., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Dopamine+Neuron+Degeneration+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Modeling Dopamine Neuron Degeneration in Caenorhabditis elegans.</a> Methods in Molecular Biology. 793 (19), 129-148 (2011).</li>
<li>Hartman, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+Defects+in+Mitochondrial+Dynamics+in+Caenorhabditis+elegans+Impact+Ultraviolet+C+Radiation-+and+6-hydroxydopamine-Induced+Neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Genetic Defects in Mitochondrial Dynamics in Caenorhabditis elegans Impact Ultraviolet C Radiation- and 6-hydroxydopamine-Induced Neurodegeneration.</a> International Journal of Molecular Sciences. 20 (3202), (2019).</li>
<li>Caldwell, K. A., Wilicott, C. W., Caldwell, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+neurodegeneration+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Modeling neurodegeneration in Caenorhabditis elegans.</a> Disease Models & Mechanisms. 13, (2020).</li>
<li>Cothren, S. D., Meyer, J. N., Hartman, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blinded+Visual+Scoring+of+Images+Using+the+Freely-available+Software+Blinder%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Protocols%22%5BJournal%5D)">Blinded Visual Scoring of Images Using the Freely-available Software Blinder.</a> Biological Protocols. 8 (23), (2018).</li>
<li>National Center for Biotechnology Information. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PubChem+Compound+Summary+for+CID+6758%2C+Rotenone%5BTitle%5D)+AND+%22PubChem%22%5BJournal%5D)">PubChem Compound Summary for CID 6758, Rotenone.</a> PubChem. , (2021).</li>
<li>Heinz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+Investigations+of+the+Mitochondrial+Complex+I+Inhibitor+Rotenone+in+the+Context+of+Pharmacological+and+Safety+Evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Mechanistic Investigations of the Mitochondrial Complex I Inhibitor Rotenone in the Context of Pharmacological and Safety Evaluation.</a> Scientific Reports. 7 (45465), (2017).</li>
<li>Lewis, J. A., Fleming, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+culture+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Basic culture methods.</a> Methods in Cell Biology. 48 (1), 3-29 (1995).</li>
<li>Boyd, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+a+Mathematical+Model+to+Describe+the+Effects+of+Chlorpyrifos+on+Caenorhabditis+elegans+Development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Application of a Mathematical Model to Describe the Effects of Chlorpyrifos on Caenorhabditis elegans Development.</a> PLoS ONE. 4 (9), 7024(2009).</li>
</ol>

Autorzy nie ujawnili żadnych informacji.

Protokół ten pokazuje, jak wykorzystać siedmiopunktową skalę opracowaną w naszym laboratorium do ilościowego określenia poziomów zmian morfologicznych i degeneracji neuronów dopaminergicznych u C. elegans. Stworzyliśmy i udostępniliśmy tę skalę jako narzędzie do standaryzacji analizy pracy neurodegeneracji dopaminergicznej u robaków. Uznając znaczenie badania szlaków zaangażowanych w wysoce rozpowszechnione choroby neurodegeneracyjne, wielu badaczy wykorzystuje przydatność modelu C. elegans do wizualizacji neurobiologicznej do badania neurodegeneracji 29,31,32,33. Jednak nie podjęto jeszcze wysiłku, aby zmniejszyć dużą zmienność w sposobie ilościowego oznaczania uszkodzeń neuronów w badaniach nad neurodegeneracją u robaków. Przedstawiony tu system punktacji ma zatem na celu promowanie spójności analiz i umożliwienie porównania między badaniami.
Nasz system punktacji może być wykorzystany do analizy danych pochodzących z eksperymentów C . elegans, które wykorzystują specyficzne dla komórki reportery fluorescencyjne, które pozwalają na wizualizację neuronów dopaminergicznych - w szczególności dendrytów. W szczególności szczepy oznaczone genem dat-1 do wizualizacji GFP neuronów dopaminergicznych są zgodne z tym protokołem punktacji, chociaż istnieje wiele innych powiązanych transgenicznych modeli PD. Możliwe, że ten system punktacji byłby również przydatny w przypadku tych modeli; Należy to jednak zweryfikować przed ich użyciem. W szczególności możliwe jest (ale nie przetestowane zgodnie z naszą wiedzą), że szczepy z mCherry mogą nie być dobrze przystosowane do tego protokołu, ponieważ agregacja mCherry może być nie do odróżnienia od pęcherzyków lub prowadzić do stresu komórkowego. Zamiast przedstawiać komentarz do wszystkich konkretnych modeli choroby Parkinsona i powiązanych zaburzeń neurodegeneracyjnych, skupiamy się na samej ocenie danych dotyczących neurodegeneracji. Ponadto protokół ten koncentruje się tylko na morfologii neuronów i nie uwzględnia poziomów fluorescencji somy. Testy neurodegeneracji mogą być wykonywane równolegle z testami behawioralnymi istotnymi dla chorób neurodegeneracyjnych, takich jak eksperymenty dotyczące lokomocji, długości życia i długości zdrowia. Poziomy zwyrodnienia w ustalonych chemicznych, opartych na wieku i genetycznych modelach PD można również potwierdzić i uszczegółowić za pomocą tego systemu punktacji. Modele pomiarowe, czynniki przyczyniające się i szlaki związane z chorobą Parkinsona i innymi chorobami neurodegeneracyjnymi mogą wzbogacić wiedzę naukową na temat tych zaburzeń i wskazać, jak radzić sobie z rosnącą populacją osób dotkniętych chorobą. Uzyskanie porównywalnych wyników neurodegeneracji w całej literaturze jest kluczem do osiągnięcia tego celu.
Aby zinterpretować wyniki uzyskane z tego systemu punktacji, proponujemy rozważenie każdego ocenionyego dendrytu jako n = 1, ponieważ różne neurony w tym samym robaku często reagują inaczej na leczenie. Może to wynikać z faktu, że tylko neurony CEPD są bezpośrednio narażone na działanie pseudocelomicznego płynu ustrojowego. W związku z tym pozwala to na przedstawienie rozkładu wyników grup eksperymentalnych jako proporcji całkowitej liczby dendrytów zdobytych w każdej grupie. Ta metoda, zastosowana w przypadku reprezentatywnych wyników pokazanych tutaj, pozwala na łatwe porównanie między grupami leczenia, uwzględnia zróżnicowane odpowiedzi w obrębie tego samego robaka i jest łatwa do analizy za pomocą testu chi-kwadrat uzupełnionego poprawką Bonferroniego dla wielokrotnych porównań. Przykładowy szablon do rejestrowania wyników neuronów i obliczania wartości procentowych można znaleźć w pliku uzupełniającym 2. Rozważyliśmy dwie alternatywne metody analizy danych i zidentyfikowaliśmy błędy w każdej z nich. Pierwszą opcją jest uśrednienie wyników czterech neuronów dla każdego robaka. To parametryzuje dane; Zakłada jednak liniową zależność ze wzrostem wyniku i traci informacje o wszelkich zmianach w odpowiedzi na leczenie w obrębie tego samego robaka. Drugą opcją jest zsumowanie wyników wszystkich czterech neuronów dla każdego robaka, co również parametryzuje dane. Zakłada to nadal liniową zależność między wynikami, jednak bardziej kompetentnie uwzględnia różnice w obrębie każdego robaka niż uśrednione wyniki, rozszerzając parametry możliwych wyników. Niezależnie od tego, czy poszczególni badacze zdecydują się wyświetlić swoje dane, wyniki powinny być brane pod uwagę wraz ze zmiennymi eksperymentalnymi, takimi jak szczep i wiek robaków; Na przykład starsze robaki mają wyższy oczekiwany wyjściowy poziom zwyrodnienia.
Podczas interpretacji wyników oceny neurodegeneracji, badacze powinni również zdawać sobie sprawę z kilku zastrzeżeń i ograniczeń metody punktacji. Po pierwsze, konieczne są pewne wymagania technologiczne, aby uchwycić obrazy nadające się do punktacji. Mikroskop obrazowy musi obsługiwać kanały fluorescencyjne oraz ustawienia powiększenia i ekspozycji, które pozwalają na wyraźną wizualizację dendrytów. Jak zauważono w protokole, wymagania technologiczne mogą zostać zmniejszone poprzez dostosowanie protokołu, takie jak ocenianie obrazów na żywo przez pole mikroskopowe, zamiast przechwytywania obrazów w celu zarchiwizowania i oceny w późniejszym czasie. Po drugie, możliwe metody analizy statystycznej dla tych danych są ograniczone, ponieważ dane są nieparametryczne. Zakłada się, że skala punktacji jest progresywna, ale nie można jej uznać za liczbową, ponieważ istnieją dyskretne opcje punktacji, a wzrost punktacji niekoniecznie jest proporcjonalny do siebie w odniesieniu do funkcji biologicznej. Z tych powodów testy niezależności chi-kwadrat najlepiej nadają się do tego typu danych, co oznacza, że analiza statystyczna zależy od obserwatora w celu określenia kierunku dowolnej istotności statystycznej. Warto zauważyć, że test chi-kwadrat analizuje również tylko różnice w rozkładzie wyników i nie jest w stanie dostarczyć dowodów na różnice w określonych kategoriach punktacji. Wreszcie, funkcjonalne znaczenie zmian morfologicznych określonych ilościowo przez ten system punktacji nie zostało jeszcze zbadane.
Przyszłe kierunki rozwoju tego systemu punktacji obejmują określenie podstaw biologicznych i korelacji z indywidualnymi wynikami neuronów. Badanie znaczenia funkcjonalnego (np. sygnalizacji neuronalnej, zachowania robaków) wszystkich punktów na skali punktacji dostarczy informacji, w jaki sposób lepiej przełożyć wyniki na wnioski mające zastosowanie do zrozumienia przyczyn i konsekwencji chorób neurodegeneracyjnych oraz opracowania opcji profilaktyki i leczenia. Przyszłe badania nad neurodegeneracją u robaków powinny mieć na celu odkrycie powiązań z innymi morfologiami, takimi jak kształt i rozmiar robaków. Ponadto badania nad neurodegeneracją mogą być wspierane przez badanie innych reporterowych szczepów C. elegans w celu pomiaru punktów końcowych, takich jak bioenergetyka, produkcja reaktywnych form tlenu i morfologia mitochondriów.

Choroba Parkinsona (PD) jest coraz powszechniejszą chorobą neurodegeneracyjną, dotykającą do 10 milionów osób na całym świecie1. Mężczyźni i osoby starsze są bardziej narażone na rozwój choroby Parkinsona; średni wiek zachorowania wynosi 60 lat, a częstość występowania PD wzrasta z 0,3% częstości występowania w populacji ogólnej do 3% u osób powyżej 80 roku życia1,2. Chociaż szczegóły patologii PD nie są w pełni zrozumiałe, to postępujące zaburzenie wiąże się z utratą neuronów dopaminergicznych w obszarze istoty czarnej śródmózgowia. Przypuszczalne mechanizmy tej utraty neuronów obejmują dysfunkcję mitochondriów, stres oksydacyjny i stan zapalny2. Przyczyny i czynniki ryzyka choroby są nadal badane, ale obejmują kombinację czynników środowiskowych i genetycznych1. Na przykład badania wykazały pozytywne powiązania między stosowaniem pestycydów przez całe życie a chorobą Parkinsona, a także genetyczną podatnością na rodzinną chorobę Parkinsona < klasa = "xref">1,< klasa sup = "xref">3.
System modelowy C. elegans, pierwotnie opracowany częściowo do badań neurobiologicznych4, dobrze nadaje się do oceny utraty neuronów dopaminergicznych in vivo. Nass i jego współpracownicy byli pionierami w stosowaniu C. elegans w neurodegeneracji dopaminergicznej5, a od tego czasu wiele grup przyjęło robaka jako udany model PD i dysfunkcji dopaminergicznej6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. C. elegans są dobrymi modelami chorób neurodegeneracyjnych z wielu tych samych powodów, dla których są tak popularnym organizmem modelowym dla innych dziedzin biologii; Ich przezroczystość pozwala na badanie in vivo procesów komórkowych, manipulacja genetyczna u robaków jest stosunkowo szybka i łatwa, mają krótki czas generacji wynoszący około trzech dni i są łatwe w utrzymaniu21. Większość modeli robaków PD należy do jednej z trzech kategorii: modele oparte na wieku, modele chemiczne i modele genetyczne. Zdolność do synchronizacji populacji robaków pozwala na badanie neurodegeneracji związanej z wiekiem dla opartego na wieku modelu chorób neurodegeneracyjnych związanych ze starzeniem się, takiego jak PD22. Ekspozycje chemiczne indukujące defekty neuronalne podobne do PD zostały ustalone przy użyciu różnych substancji chemicznych, w tym 6-hydroksydopaminy (6-OHDA), rotenonu i 1-metylo-4-fenylo-1,2,3,6-tetrahydropirydyny (MPTP)22. Robaki są również z powodzeniem stosowane jako modele genetyczne choroby Parkinsona; Szczepy z wybranymi nokautami genów neuronalnych mogą modelować różne choroby neurodegeneracyjne<klasa SUP="xref">1,<klasa SUP="XREF">4. Kombinacje czynników genetycznych i środowiskowych lub "interakcji gen-środowisko", które prawdopodobnie odgrywają główną rolę w PD2,17,23,24,25,26,27,28, zostały zbadane przez kilka grup przy użyciu C. elegans. Wreszcie, zaobserwowano również neurodegenerację dopaminergiczną związaną z wiekiem29,30. W przypadku użycia odpowiedniego transgenicznego szczepu neuronalnego w obrazowaniu fluorescencyjnym, każdy z tych modeli robaków PD może być wykorzystany do badania neurodegeneracji dopaminergicznej.
Kwantyfikacja zmian w morfologii neuronów jest kluczowym elementem badań neurodegeneracyjnych. U C. elegans wiele fluorescencyjnych szczepów reporterowych wykorzystano do wizualizacji zmian morfologicznych i utraty neuronów. Szczepy nadające się do obrazowania neuronów zawierają białko fluorescencyjne związane z promotorami specyficznymi dla komórki. Do testów neurodegeneracji dopaminergicznej nasze laboratorium wykorzystało szczep BY200 [vtIs1 (dat-1p::GFP, rol-6)], który ma znacznik białka zielonej fluorescencji (GFP) w genie dat-1, ulegający ekspresji w neuronach dopaminergicznych. Należy pamiętać, że fenotyp rolki BY200 ma bardzo niską penetrację i jest rzadko obserwowany. Inne popularne szczepy używane do tego typu obrazowania to BY250 [dat-1p::GFP], BY273 [baEx18[dat-1p::GFP+dat-1p::WT α-syn]], BZ555 [egIs1 [dat-1p::GFP]] i kilka innych dostępnych w Caenorhabditis Genetics Center (CGC) lub na żądanie w określonych laboratoriach1,21,22,29. Szczepy te zazwyczaj pozwalają na wizualizację wszystkich trzech klas neuronów dopaminergicznych: neuronów głowowych (), przednich deirydowych (ADE) i postdeirydowych (PDE). C. elegans nie ulega naturalnej ekspresji białka alfa synukleiny, ale szczepy takie jak BY273 zostały zaprojektowane do jego ekspresji. Zauważamy jednak, że prezentowany przez nas system punktacji został opracowany przy użyciu BY200, który nie wyraża alfa synukleiny i musiałby zostać zweryfikowany z tym szczepem (lub jakimkolwiek innym nowym szczepem) przed użyciem. Dodatkowe neurony dopaminergiczne są obecne u samców, ale rzadko są brane pod uwagę, ponieważ samce zwykle stanowią <1% populacji C. elegans. Tutaj skupimy się na czterech neuronach dopaminergicznych znajdujących się w okolicy głowy C. elegans. Ten zestaw neuronów jest łatwo zlokalizowany pod mikroskopią fluorescencyjną, jest obecny zarówno u robaków hermafrodytowych, jak i męskich, zwykle nie pokrywa się z innymi obszarami autofluorescencji i jest powszechnie opisywany w badaniach na robakach. Warto zauważyć, że chociaż neurony te nie są mielinizowane, neurony grzbietowe (CEPD) są bezpośrednio wystawione na działanie pseudocelomicznego płynu ustrojowego, podczas gdy neurony brzuszne nie są. Zdrowy zestaw dendrytów jest zwykle wyświetlany jako stosunkowo proste, nieprzerwane linie. Zdegenerowane dendryty mogą wykazywać dowolną kombinację nieregularności i oznak uszkodzenia, w tym wyraźne kropki zwane pęcherzykami wzdłuż linii dendrytu i pęknięcia w linii dendrytu. Przykłady neuronów na różnych poziomach degeneracji można zobaczyć na Rysunek 1.
Chociaż neurodegeneracja dopaminergiczna jest badana przez coraz większą liczbę laboratoriów C. elegans, istnieje duża różnorodność w metodach analitycznych ilościowego określania uszkodzeń neuronów dopaminergicznych29,31,32,33,34. Wiele opublikowanych badań donosiło o obecności lub braku somy z binarnym systemem punktacji neuronów zwyrodnieniowych w porównaniu z neuronami typowymi lub dzikimi31,32. Te metody punktacji mogą zidentyfikować pewne stresory, które indukują neurodegenerację, ale nie mogą określić ilościowo szczegółów progresji bardziej subtelnych uszkodzeń neuronów ani łatwo wykryć różnic między neurodegeneracją wywołaną przez unikalne substancje chemiczne lub inne zmienne. Ponadto systemy punktacji skoncentrowane na ciałach komórek mogą nie być wrażliwe na mniej poważne poziomy uszkodzeń lub na uszkodzenia neuronów wpływające tylko na część komórki, taką jak dendryt. Ponieważ dendryt wydaje się mieć największy zakres konsekwentnie wykrywalnych zmian morfologicznych w odpowiedzi na stresory chemiczne, wybraliśmy je jako podstawę naszej analizy. Prezentowany przez nas system punktacji został zmodyfikowany z wielopunktowych skal opartych na morfologii dendrytów, które były wcześniej używane w naszym lab29,33. System ten rozszerza te pięcio- i sześciopunktowe skale do siedmiopunktowej, aby uwzględnić zmiany morfologiczne związane z wiekiem, takie jak wyższa oczekiwana liczba załamań u dendrytów u starszych dorosłych, oraz rozróżnić między poważnymi uszkodzeniami a całkowitą utratą dendrytów. Celem wprowadzenia tego systemu punktacji jest zapewnienie możliwości uchwycenia kompleksowego obrazu neurodegeneracji na wszystkich poziomach uszkodzenia neuronów i zapewnienie uniwersalnego systemu wspierającego spójność w badaniach nad neurodegeneracją dopaminergiczną C. elegan. Ponieważ punktacja jest z natury subiektywna, bardzo ważne jest, aby zmaksymalizować spójność między osobami oceniającymi i zaślepić osobę oceniającą na tożsamość obrazów za pomocą ręcznego zaślepiania lub automatycznego programu do zaślepiania35. Aby poprawić spójność, prezentujemy serię obrazów szkoleniowych i wykorzystujemy możliwości wideo JoVE, aby szczegółowo zademonstrować nasz system punktacji. Zalecamy korzystanie z systemu, który zarówno pozwala na automatyczną ślepą punktację, jak i pozwala osobie oceniającej na ilościowe określenie swojej spójności punktacji poprzez ponowną ocenę podzbioru obrazów. Jest to szczególnie ważne w przypadku łączenia lub porównywania danych pochodzących od wielu naukowców lub szkolenia naukowców, którzy nie mają doświadczenia w ocenianiu.

<table><tbody><tr><td>Płytka 96-dołkowa</td><td>VWR</td><td>29442-056</td><td>Do obrazowania w studzienkach</td></tr><tr><td>Blinder</td><td>Solibyte Solutions LLC</td><td></td><td>Darmowe oprogramowanie, które żaluzji między i w obrębie przesłanych zestawów plików graficznych</td></tr><tr><td>BY200 [vtIs1 (dat-1p::GFP, rol-6)]</td><td>Aschner Lab</td><td></td><td>C. elegans szczep odpowiedni do obrazowania fluorescencyjnego neuronów dopaminergicznych. Może być zastępowany przez inne szczepy z fluorescencyjnym reporterem napędzanym przez specyficzne dla komórek promotory Dostępne na życzenie w laboratorium Meyera</td></tr><tr><td>kompletne K-medium</td><td></td><td></td><td>51 mM chlorek sodu, 32 mM chlorek potasu, 3 mM chlorek wapnia, 3 mM siarczan magnezu, 13 mM cholesterol</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe 22x22mm, szkło nr 1</td><td>VWR VistaVision</td><td>48366-067</td><td>Do obrazowania na szkiełkach</td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>472301</td><td>Rozpuszczalnik do ekspozycji na rotenon</td></tr><tr><td>ImageJ</td>, <td>National Institutes of Health</td><td>ImageJ 1.5e lub nowszy. Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https:// imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016.</td><td>Sotware do manipulacji obrazem</td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny Keyence BZ-X All-in-one</td><td>Keyence</td><td></td><td>Służy do fluorescencyjnego przechwytywania obrazów neuronów dopaminergicznych. Może być zastąpiony przez inne mikroskopy nadające się do obrazowania fluorescencyjnego o wysokiej rozdzielczości</td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe 3x1"</td><td>VWR VistaVision</td><td>16004-420</td><td>Do obrazowania na szkiełkach</td></tr><tr><td>Rotenon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td>Inhibitor kompleksu łańcucha transportu elektronów I</td></tr><tr><td>Azydek sodu (NaN_3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td>Paralityczny</td></tr><tr><td>wodorotlenek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2770</td><td>Do lizy wybielacza</td></tr><tr><td>Podchloryn sodu</td><td>VWR</td><td>RC7495.5-32</td><td>Do lizy wybielacza</td></tr><tr><td>Chlorowodorek tetramizolu (lewamizolu) (HCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9756</td><td>Paralityk</td></tr></tbody></table>

kwantyfikacja poziomów zmian morfologicznych i zwyrodnień neuronów dopaminergicznych u caenorhabditis elegans

Quantifying Levels of Dopaminergic Neuron Morphological Alteration and Degeneration in Caenorhabditis elegans

Utrata neuronów dopaminowych jest związana z patologią choroby Parkinsona (PD), bardzo rozpowszechnionej choroby neurodegeneracyjnej, która dotyka ponad 10 milionów ludzi na całym świecie. Ponieważ wiele szczegółów na temat etiologii choroby Parkinsona pozostaje nieznanych, potrzebne są badania badające genetyczne i środowiskowe czynniki przyczyniające się do choroby Parkinsona, aby odkryć metody zapobiegania, zarządzania i leczenia. Właściwa charakterystyka utraty neuronów dopaminergicznych może być istotna nie tylko dla badań nad chorobą Parkinsona, ale także dla innych coraz bardziej rozpowszechnionych zaburzeń neurodegeneracyjnych.
Istnieją potwierdzone genetyczne i chemiczne modele neurodegeneracji dopaminergicznej w systemie modelowym Caenorhabditis elegans, z łatwą wizualizacją neurobiologii, wspieraną przezroczystością nicieni i niezmienną architekturą neuronalną. W szczególności zmiany morfologiczne neuronów dopaminergicznych Hermafrodytycznego C. elegans można uwidocznić za pomocą szczepów z fluorescencyjnymi reporterami napędzanymi przez promotory specyficzne dla komórki, takie jak gen transportera dopaminy dat-1, który ulega ekspresji wyłącznie w ich ośmiu neuronach dopaminergicznych.
Dzięki możliwościom tego systemu modelowego i odpowiedniej technologii, wiele laboratoriów badało neurodegenerację dopaminergiczną. Jednak sposób analizy danych jest niespójny, a większość obecnej literatury wykorzystuje binarne analizy punktowe, które wychwytują obecność zwyrodnienia, ale nie zawierają pełnych szczegółów progresji utraty neuronów. W tym miejscu wprowadzamy uniwersalny system punktacji do oceny zmian morfologicznych i zwyrodnień dendrytów neuronów głowowych C. elegans. Ta siedmiopunktowa skala pozwala na analizę pełnego zakresu morfologii dendrytów, od zdrowych neuronów do całkowitej utraty dendrytów, oraz z uwzględnieniem szczegółów morfologicznych, w tym załamań, rozgałęzień, pęcherzyków i pęknięć. Dzięki temu systemowi punktacji naukowcy mogą określić ilościowo subtelne zmiany związane z wiekiem, a także bardziej dramatyczne zmiany wywołane chemikaliami. Na koniec udostępniamy praktyczny zestaw obrazów z komentarzem, które można wykorzystać do trenowania, kalibrowania i oceny spójności punktacji badaczy nowych w tej metodzie. Powinno to poprawić spójność w obrębie laboratorium i między nimi, zwiększając rygor i odtwarzalność.

Opisany tutaj system punktacji został wykorzystany do oceny neurodegeneracji w L4 stadium larwalnym C. elegans szczepu BY200 [vtIs1 (dat-1p::GFP, rol-6)] po ekspozycji na rotenon. Wyniki tego eksperymentu przedstawiono na Rysunku 2; obrazują one zdolność naszego systemu punktacji do wykrywania i ilościowego określania zmiennych poziomów uszkodzeń neuronów dopaminergicznych. Rotenon jest naturalnie występującym inhibitorem kompleksu I łańcucha transportu elektronów, stosowanym w niektórych pestycydach, piscydach i insektycydach36,37. Należy pamiętać, że praca z toksycznymi subst migraines, takimi jak rotenon, jest z natury niebezpieczna i wszystkie laboratoria powinny przestrzegać wszelkich przepisów dotyczących stosowania i utylizacji określonych przez ich instytucje. W tym eksperymencie ekspozycję na płynny rotenon w dwóch dawkach, 0,03 µM i 0,5 µM, wraz z grupą kontrolną, rozpoczęto bezpośrednio po lizie w 0,5 M wodorotlenku sodu/1% podchlorynu sodu w celu zebrania jaj38. Jaja wykluwały się w pełnym medium K33,39 z 0,25% dimetylosulfotlenkiem (DMSO), a nicienie pozostawały w cieczy przez ok. 48 godzin aż do połowy stadium larwalnego L4, po czym zostały usunięte z ekspozycji chemicznej, przygotowane, obrazowane i, z wykorzystaniem Rysunku 1 jako punktu odniesienia, ocenione zgodnie z powyższymi krokami protokołu. W przypadku wyższej dawki rotenonu (0,5 µM), jaja zebrano z 24-godzinnym wyprzedzeniem, aby uwzględnić wywołane przez rotenon opóźnienie rozwojowe i zapewnić synchronizację stadiów wszystkich nicieni w momencie obrazowania.
Rysunek 2 dodatkowo demonstruje sposób, w jaki w naszym laboratorium wizualizuje się dane zebrane przy użyciu tego systemu punktacji. Na tym rysunku można zaobserwować zależną od dawki odpowiedź neurodegeneracyjną, a szczegółowy rozkład punktacji jest przedstawiony w sposób przejrzysty. Te konkretne wyniki pokazują, że uszkodzenia neuronalne mogą manifestować się na różne sposoby. Na przykład grupa eksponowana na 0,03 µM rotenonu wykazuje zmniejszony odsetek zdrowych neuronów z wynikiem 0 w porównaniu z grupą kontrolną, a jednocześnie mniejszy odsetek wyników 5. Wykrycie tej różnicy w rozkładzie punktacji między grupami doświadczalnymi podkreśla czułość naszego siedmiostopniowego systemu punktacji. Dane te zostały poddane analizie istotności statystycznej zgodnie z protokołem, z zastosowaniem testu niezależności chi-kwadrat z korektą Bonferroniego.
<img alt="Schemat mikroskopii fluorescencyjnej pokazujący ścieżki sygnałów neuronalnych u C. elegans z zaznaczonymi neuronami." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62894/62894fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Reprezentatywne obrazy systemu oceny zmian morfologicznych i degeneracji neuronów dopaminergicznych. Ten zbiorczy schemat zawiera przykłady neuronów dla każdego stopnia oceny i ma służyć jako punkt odniesienia podczas punktacji. W tym przypadku każdy przypisany stopień oceny odpowiada najbardziej uszkodzonemu dendrytowi u każdego nicienia, co wskazano strzałką na poszczególnych panelach. Obrazy te zostały wykonane zgodnie z protokołem opisanym w niniejszej pracy przy użyciu szczepu BY200 C. elegans. Zestaw obrazów z oceną i komentarzem, przeznaczony do szkolenia osób nieznających tej metody oceny, znajduje się w Pliku uzupełniającym 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62894/62894fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wyniki oceny neuronów dopaminergicznych w stadium L4; wykres słupkowy; wpływ rotenonu na morfologię i degenerację; test chi-kwadrat." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62894/62894fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Wyniki oceny morfologii i degeneracji neuronów dopaminergicznych BY200 w stadium L4 po ekspozycji na rotenon. Na rysunku przedstawiono reprezentatywne wyniki przeanalizowane przy użyciu opisanych tutaj metod oceny. Wizualizowany większy odsetek uszkodzonych neuronów dopaminergicznych przy wyższych stężeniach ekspozycji na rotenon został poddany analizie statystycznej z użyciem testów niezależności chi-kwadrat. W obu grupach traktowanych rotenonem uzyskano statystycznie istotne wartości p w porównaniu z grupą kontrolną. Różne litery oznaczają różnicę statystyczną. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62894/62894fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Plik uzupełniający 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62894/Supplemental_Training_Set_KM_V5.docx" target="_blank">Aby pobrać ten plik, kliknij tutaj.</a>
Plik uzupełniający 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62894/SupplementaryFile2.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

W tym artykule pokazujemy, jak używać siedmiopunktowego systemu punktacji do konsekwentnego ilościowego określania zmian w morfologii dendrytów neuronów dopaminergicznych u C. elegans. System ten jest przeznaczony do analiz testów neurodegeneracji dopaminergicznej z wykorzystaniem genetycznych, chemicznych i opartych na wieku modeli zaburzeń neurodegeneracyjnych.

Kwantyfikacja poziomów zmian morfologicznych i zwyrodnień neuronów dopaminergicznych u Caenorhabditis elegans

Dopamine neuron loss is involved in the pathology of Parkinson&#39;s Disease (PD), a highly prevalent neurodegenerative disorder affecting over 10 million ...

W tym filmie pokazujemy, jak wykorzystać siedmiopunktowy system punktacji do ilościowego określenia zmian w morfologii dendrytów neuronów dopaminergicznych u C. elegans. Obecnie istnieje duża różnorodność w metodach analitycznych ilościowego określania neurodegeneracji u robaków. Ponadto niektóre istniejące umiejętności skupiają się tylko na ciałach komórek i nie są wrażliwe na określone typy i poziomy obrażeń.Celem wprowadzenia tego systemu punktacji jest zapewnienie możliwości uchwycenia kompleksowego obrazu neurodegeneracji na wszystkich poziomach uszkodzeń oraz zapewnienie uniwersalnego systemu wspierającego spójność w badaniach nad neurodegeneracją dopaminergiczną C. elegans. Tutaj pokażemy, jak obrazować neurony pod wpływem fluorescencji, przypisać wyniki do dendrytów tych neuronów oraz zobaczyć, jak wyświetlać i interpretować wyniki. Dla każdej grupy eksperymentalnej należy pipetować lub pobierać od 20 do 30 robaków na platformę obrazowania kompatybilną z mikroskopem obrazowym.Najczęściej spotykane platformy to 2% podkładki agarozowe zamontowane na szkiełkach podstawowych z szkiełkiem nakrywkowym oraz płytki 96-dołkowe zawierające studzienki o objętości równej lub mniejszej niż 100 mikrolitrów ciekłego podłoża. Pozwól robakom całkowicie sparaliżować. Może to potrwać kilka minut.Załaduj przygotowaną platformę obrazowania do mikroskopu obrazowego zdolnego do przechwytywania z-stack. Zlokalizuj obszar głowy robaka najpierw w jasnym polu, a następnie pod jednokolorową fluorescencją GFP za pomocą mikroskopu obrazowego. Robak jest pokazany tutaj w powiększeniu 400x.Przewiń fokus, aby znaleźć górną i dolną granicę, w której dendryty są wyraźne. Ustaw je jako górne i dolne granice przechwytywania obrazu z-stack. Wybierz żądaną wysokość.Tutaj używamy jednego mikrometra. Kliknij, aby przechwycić obrazy z-stack w kanale fluorescencji GFP. Dla każdego stosu z obrazem otwórz plik obrazu za pomocą oprogramowania mikroskopu lub zewnętrznego oprogramowania do analizy obrazu.Załaduj stos do oprogramowania i skompresuj stos do jednego spłaszczonego obrazu. Wyrównywaj obrazy między grupami zabiegowymi i w ich obrębie ręcznie lub za pomocą oprogramowania do automatycznego nawijania. Pracuj z jednym obrazem neuronu na raz.Wybierz jeden z czterech dendrytów, aby ocenić pod kątem pęcherzyków, pęknięć i nieregularności, w tym zagięć, załamań i krzywych. Zaleca się punktowanie od lewej do prawej, gdy nos znajduje się u góry obrazu, aby zapewnić powtarzalność punktacji. Korzystając z tych wskazówek, przypisz jedną wartość punktacji do każdego dendrytu.Przyznać zero punktów dla dendrytów bez widocznych uszkodzeń, punktację 1 dla dendrytów z nierównościami, ale bez zagnieceń lub pęknięć, punktację dwa dla dendrytów z mniej niż pięcioma pęcherzykami, wynik trzy dla od pięciu do 10 pęcherzyków, wynik cztery dla ponad 10 pęcherzyków i/lub pęknięcie usuwające do 25% dendrytu, Wynik pięć za złamanie usuwające od 25 do 75% dendrytu i wynik sześć w przypadku braku więcej niż 75% dendrytu. Jeśli w ramach jednego dendrytu spełnionych jest wiele kryteriów, należy wziąć pod uwagę kryteria odpowiadające najwyższemu wynikowi. Te reprezentatywne obrazy punktacji, które znajdują się na rysunku 1 w artykule powiązanym z tym filmem, mogą być wykorzystane jako odniesienie.Aby zademonstrować punktację, przejdziemy przez przypisywanie wyników do kilku przykładowych obrazów neuronów. Zacznij od dendrytu znajdującego się na samej górze, nie ma widocznych pęcherzyków, pęknięć ani nierówności. Przypisz wynik równy zero.Drugi dendryt ma około 14 pęcherzyków i nie ma widocznych pęknięć. Przypisz wynik do czterech. Trzeci dendryt nie może być widziany w całości ze względu na nakładanie się na dendryt drugi i nie można go naciąć.Najniższy dendryt ma około 11 pęcherzyków i kilka pęknięć. Przyznaj pięć punktów. Na tym zdjęciu tylko trzy dendryty są możliwe do przechwycenia, ponieważ jeden dendryt nie został w pełni uchwycony w uchwycie z-stack.Na trzech widocznych dendrytach nie ma pęcherzyków. Więc to byłoby oceniane od góry do dołu jako zero, zero, a ze względu na załamanie tutaj, jedynka. Wreszcie, na tym obrazie, wszystkie cztery dendryty są utracone w ponad 75%.Wszystkie dendryty otrzymują tutaj wynik sześciu. Zapisz wszystkie wyniki. W tym momencie wyniki mogą zostać odślepione.Zastosowany tutaj szablon punktacji można znaleźć w plikach uzupełniających. Podziel wyniki neurodegeneracji przez całkowitą liczbę dendrytów uzyskanych w grupie leczonej. Przedstaw dane jako proporcję dendrytów w grupie leczonej przy każdym wyniku neurodegeneracji.Nasz system punktacji został wykorzystany do oceny neurodegeneracji w stadium larwalnym L4 BY200 C.elegans po ekspozycji na rotenon. Dane są tutaj wyświetlane tak, jak w przypadku proporcji całkowitej liczby dendrytów przy każdej wartości punktowej dla każdej grupy eksperymentalnej. Uważamy, że każdy dendryt uzyskany jest jako n 1.Na tym rysunku można docenić zależną od dawki odpowiedź neurodegeneracyjną na ekspozycję na rotenon, a konkretny podział rozkładu wyników jest wyraźnie przedstawiony. Te grupy eksperymentalne różniły się statystycznie zgodnie z testem chi-kwadrat dla niezależności uzupełnionym poprawką Bonferroniego dla wielokrotnych porównań. W tym filmie pokazaliśmy, jak używać siedmiopunktowej skali opracowanej w naszym laboratorium do ilościowego określania poziomów zmian morfologicznych i degeneracji neuronów dopaminergicznych u C. elegans.Stosowanie metody punktacji sprzyja spójności analizy i pozwala na porównanie badań naukowych nad neurodegeneracją u robaków. Nasz system punktacji może być wykorzystany do analizy danych pochodzących z eksperymentów C.elegans, które wykorzystują specyficzne dla komórki reportery fluorescencyjne, takie jak gen transportera dopaminy dat-1, który pozwala na wizualizację neuronów dopaminergicznych. Teraz w materiałach uzupełniających do tego artykułu znajdziesz zestaw obrazów do ćwiczeń z komentarzem, które można wykorzystać do trenowania, kalibrowania i oceny spójności punktacji badaczy nowych w tej metodzie.

quantifying-levels-dopaminergic-neuron-morphological-alteration

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

W niniejszym filmie zaprezentowano sposób wykorzystania C. elegans do oceny neurodegeneracji neuronów dopaminergicznych jako modelu choroby Parkinsona. Ponadto zastosowano przesiewy genetyczne w celu zidentyfikowania czynników, które albo nasilają degenerację, albo wykazują działanie neuroprotekcyjne.

Zastosowanie testu degeneracji neuronów dopaminergicznych u C. elegans w celu walidacji potencjalnych genów choroby Parkinsona

Ten film demonstruje ocenę neurodegeneracyjnego wpływu badanej substancji chemicznej na Caenorhabditis elegans z fluorescencyjnie oznaczonymi neuronami. Normalne neurony wykazują jasną fluorescencję nienaruszonej somy i procesów, podczas gdy zmniejszona fluorescencja, obrzęk somy i przerywane procesy wskazują na neurodegenerację.

Badanie wpływu pestycydów na neurony Caenorhabditis elegans

Opisujemy metody badania aspektów amylopatii u robaka C. elegans. Pokazujemy, jak konstruować robaki wyrażające ludzkie Aβ42 w neuronach i jak testować ich funkcję w testach behawioralnych. Dalej pokazujemy, jak uzyskać pierwotne hodowle neuronów, które można wykorzystać do badań farmakologicznych.

System modelowy Caenorhabditis elegans do badania amylopatii

Drosophila jest powszechnie używana jako system modelowy do badania neurodegeneracji. Protokół ten opisuje metodę, za pomocą której można określić ilościowo zwyrodnienie, określone przez tworzenie się wakuoli w mózgu. Minimalizuje również efekty wynikające z procedury eksperymentalnej poprzez przetwarzanie i dzielenie much kontrolnych i eksperymentalnych jako jednej próbki.

Masowa histologia w celu ilościowego określenia neurodegeneracji u Drosophila

To badanie przedstawia ilościowe pomiary wielkości i lokalizacji synaptycznej, morfologii mięśni i kształtu mitochondriów u C. elegans przy użyciu swobodnie dostępnych narzędzi do przetwarzania obrazów. Takie podejście pozwala przyszłym badaniom nad C. elegans na ilościowe porównanie zakresu zmian strukturalnych tkanek i organelli w wyniku mutacji genetycznych.

Ilościowe podejścia do badania struktur komórkowych i morfologii organelli u Caenorhabditis elegans

Spadek proteostazy jest cechą charakterystyczną starzenia się, ułatwiając wystąpienie chorób neurodegeneracyjnych. Przedstawiamy protokół do ilościowego pomiaru proteostazy w dwóch różnych tkankach Caenorhabditis elegans poprzez heterologiczną ekspresję powtórzeń poliglutaminy połączonych z fluorescencyjnym reporterem. Model ten umożliwia szybką analizę genetyczną proteostazy in vivo.

Kwantyfikacja swoistego dla tkanki spadku proteostazy u Caenorhabditis elegans

Tutaj przedstawiamy i opisujemy szeroko dostępne metodologie wykorzystujące niektóre wszechstronne modele nicieni, w tym nekrozę wywołaną hiperaktywowanym kanałem jonowym i neurotoksyczność wywołaną agregatem białkowym, do monitorowania i analizowania komórkowych i molekularnych podstaw chorób neurodegeneracyjnych związanych z wiekiem.

Modelowanie chorób neurodegeneracyjnych związanych z wiekiem w Caenorhabditis elegans

Prezentowany tutaj jest protokół monitorowania degradacji białka huntingtyny połączonego z fotokonwertowalnym fluoroforem Dendra2.

Kwantyfikacja in vivo obrotu białek w starzejących się C. elegans przy użyciu fotokonwertowalnego Dendra2

Młode dorosłe nicienie Caenorhabditis elegans są narażone na różne stężenia komercyjnych pestycydów lub innych substancji toksycznych przez 2-24 godziny. Następnie można wizualizować różne neurony za pomocą szczepów wykazujących ekspresję fluorescencyjną. W artykule pokazano, w jaki sposób można wystawić nicienie na działanie pestycydów i ocenić uszkodzenia neuronów.

Ten protokół zapewnia ustandaryzowane podejście do obrazowania morfologii mitochondriów w wielu tkankach C. elegans podczas starzenia.

Obrazowanie i ilościowe określanie morfologii mitochondriów u C. elegans podczas starzenia

Poznaj siedmiopunktowy system oceny zmian morfologicznych dendrytów neuronów dopaminergicznych u Caenorhabditis elegans. Ta metoda standaryzuje analizę neurodegeneracji i umożliwia porównywanie wyników badań.

Kwantyfikacja poziomów zmian morfologicznych i zwyrodnień neuronów dopaminergicznych u Caenorhabditis elegans

Przeglądaj więcej filmów