Pomiar strumienia substratu mitochondrialnego w rekombinowanych komórkach perfringolizyny O-permeabilizowanej

Ponieważ testuje strumień substratów mitochondriów, na które mogą wpływać różne patologie lub zabiegi. Na przykład, dzisiaj użyjemy go do ujawnienia odpowiedzi komórek rakowych na leczenie metforminą. Wymaga minimalnej liczby komórek, a jednocześnie wystarczającej liczby powtórzeń i odpowiedniej kontroli dla każdego odrębnego materiału.

Analizator jest przeznaczony wyłącznie do celów badawczych. Technika ta może identyfikować błędy w metabolizmie mitochondrialnym i może być stosowana do oceny leków wojowników wpływających na mitochondria. Procedurę zademonstruje Karolina Vaneckova, studentka studiów licencjackich i technik badawczy z mojego laboratorium.

Aby rozpocząć zasiewanie komórek A549 o gęstości 20 000 komórek na studzienkę w kolumnach, od dwóch do 11 mikropłytki do hodowli komórek konika morskiego XF 96. Pozostawienie kolumn 1 i 12 pustych jako studzienek tła. Wypełnij puste studzienki równą objętością pożywki do hodowli komórkowych, a następnie inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnym inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla do przyłączenia komórek.

Po trzech do czterech godzinach dodaj 100 mikrolitrów pożywki do hodowli komórkowych w studzienkach. Potraktuj kolumny grupy doświadczalnej od 7 do 11 jedną milimolową metforminą, a grupę kontrolną równą objętością sterylnej wody destylowanej, a następnie umieść płytkę z powrotem w inkubatorze. Aby nawodnić czujniki, należy odpipetować 200 mikrolitrów sterylnej wody na studzienkę do płytki użytkowej.

Następnie ostrożnie zwróć wkład czujnika, zanurzając go w wodzie. Inkubuj wkład w inkubatorze bez dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza do następnego dnia. Włączyć analizator i jednostkę sterującą.

Uruchom oprogramowanie do sterowania przyrządami i akwizycji danych, a następnie zaprojektuj protokół testu zgodnie z opisem w manuskrypcie. W ramach definicji grup utwórz cztery strategie iniekcji, w których port A różni się w zależności od wstrzykniętego substratu, i nazwij strategie po substratach lub skrótach. Przypisz oligomycynę do portu B, FCCP do portu C, a mieszaninę antymycyny rotenonowej A do portu D. Utwórz i nazwij osiem grup, pod mapą płytową przypisz grupy do odpowiednich studzienek.

Następnie zapisz protokół jako gotowy do użycia szablon. Pozostaw przełącznik analizatora włączony, aby temperatura ustabilizowała się przez noc. Następnego dnia wylej wodę z płytki użytkowej i dodaj 200 mikrolitrów wstępnie podgrzanego kalibru na studzienkę do płytki użytkowej.

Włożyć wkład z powrotem do inkubatora wolnego od dwutlenku węgla do czasu przeprowadzenia testu. Utrzymuj źródło wilgoci wewnątrz inkubatora i wyłącz lub zmniejsz prędkość wentylatora do minimum, aby uniknąć szybkiego parowania kalibru. Przygotować pięć mililitrów roztworu roboczego substratów i inhibitorów z podgrzanym dwukrotnie roztworem do testów mitochondrialnych, 5% BSA i sterylną wodą, jak opisano w manuskrypcie tekstowym.

Następnie załaduj porty wtryskiwaczy substratem i inhibitorami zgodnie z opisem w manuskrypcie podatkowym. Aby przeprowadzić kalibrację, na karcie testu przebiegowego kliknij przycisk rozpoczęcia testu, aby rozpocząć test. Włóż załadowany nabój cenzora i poczekaj na zakończenie kalibracji.

Przygotuj 20 mililitrów pożywki testowej, mieszając dwukrotnie roztwór do testów mitochondrialnych, sterylną wodę i 5% BSA w 50-mililitrowej probówce. Dodać dwa mikrolitry 10 mikromolowej rekombinowanej perfringolizyny O, aby uzyskać stężenie jednego nanomolowca. I ponownie zawiesić mieszaninę, delikatnie pipetując, unikając potrząsania i wirowania.

Inkubować probówkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza aż do użycia. Za pomocą pipety wielokanałowej umyj komórki i puste studzienki ślepej próby dwukrotnie, używając wstępnie podgrzanego roztworu PBS wolnego od wapnia i magnezu. Odrzucić PBS i dodać 180 mikrolitrów wstępnie podgrzanej pożywki testowej w celu przepuszczalności komórek.

Natychmiast po przepuszczalności należy wymienić płytkę użytkową skalibrowanego wkładu czujnika na płytkę ogniwa zawierającą przepuszczalne ogniwa i rozpocząć pomiar. W grupie leczonej stwierdzono wyższy wskaźnik oddychania wywołanego bursztynianem. Odpowiedź komórek A549 na leczenie metforminą była wyższa niż WZW G2. W przypadku oddychania indukowanego jabłczanem pirogronianu komórki A549 wykazały zwiększoną indukcję w porównaniu z komórkami WZW G2 w ciągu pięciu do 15 minut.

Podobne wyniki uzyskano dla oddychania indukowanego jabłczanem glutaminianu i oddychania indukowanego jabłczanem palmitoilokarnityny. Uzyskanie odpowiedniego stężenia substratu i inhibitorów. Odpowiedni wolumin musi być załadowany do odpowiedniego portu.

Po zidentyfikowaniu zmiany w szlaku metabolicznym określonego substratu konieczna będzie ocena funkcji enzymów i transporterów zaangażowanych w ten szlak.