Name: Pomiar strumienia substratu mitochondrialnego w rekombinowanych komórkach perfringolizyny O-permeabilizowanej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-13T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: Poznaj metodę pomiaru strumienia substratów mitochondrialnych w komórkach nowotworowych A549 i Hep G2 z wykorzystaniem rekombinowanej perfringolizyny O. Technika ta pozwala ocenić wpływ metforminy na oddychanie mitochondrialne w badaniach onkologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują pracownikom Zakładu Fizjologii na Wydziale Lekarskim w Hradcu Králové oraz Zakładu Patofizjologii Trzeciego Wydziału Lekarskiego za pomoc w przygotowaniu chemikaliów i próbek. Prace te były wspierane przez programy grantowe Uniwersytetu Karola PROGRES Q40/02, grant czeskiego Ministerstwa Zdrowia NU21-01-00259, grant Czeskiej Fundacji Nauki 18-10144 oraz projekt INOMED CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_069/0010046 finansowany przez Ministerstwo Edukacji, Młodzieży i Sportu Republiki Czeskiej oraz przez Unię Europejską.

1. Dzień przed testem
<ol>
	<li>Przygotowanie odczynników i substratów.
	<ol>
		<li>Roztwór do oznaczania mitochondriów (MAS): Przygotować roztwory podstawowe wszystkich odczynników, jak opisano w Tabeli 1. Podgrzać zapasy mannitolu i sacharozy do temperatury 37 °C do całkowitego rozpuszczenia. Wymieszać odczynniki, aby przygotować 2x MAS, a następnie ogrzać mieszaninę do 37 °C. Dostosować pH za pomocą 5N KOH do 7,4 (~7 mL), następnie dodać wodę, aby zwiększyć objętość do 1 L. Przefiltrować-wysterylizować i przechowywać podwielokrotności w temperaturze -20 °C do dnia pomiaru.</li>
		<li>Albumina surowicy bydlęcej (5% BSA): Rozpuścić 5 g BSA w 90 ml podgrzanej sterylnej wody na mieszadle magnetycznym i unikać wstrząsania. Dostosuj pH do 7,4 za pomocą 5 N KOH, a następnie dodaj wodę, aby zwiększyć objętość do 100 ml. Przefiltrować-wysterylizować i przechowywać podwielokrotności w temperaturze -20 °C do dnia pomiaru.</li>
		<li>Substraty mitochondrialne: Przygotować 1 M roztwory podstawowe bursztynianu sodu, pirogronianu sodu i glutaminianu sodu w sterylnej wodzie. Przygotować 100 mM roztwór podstawowy jabłczanu sodu w sterylnej wodzie i użyć wstępnie podgrzanej sterylnej wody do przygotowania 10 mM roztworu podstawowego palmitoilokarinityny. Dostosować pH każdego roztworu do 7,4 na 5 N KOH i przeprowadzić sterylizację filtracyjną. Podłoża przechowywać w temperaturze 2-8 °C. W momencie użycia podgrzej palmitoilokarnitynę do temperatury 37 °C, aby rozpuścić wszelkie osady. Do późniejszego wykorzystania należy przechowywać podwielokrotności wszystkich substratów z wyjątkiem pirogronianu w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Inhibitory mitochondrialne: Użyj dimetylosulfotlenku (DMSO) do przygotowania roztworów podstawowych 25 mM oligomycyny, 50 mM 4-(trifluorometoksy)fenylohydrazonu karbonylu cyjanku karbonylu (FCCP), 20 mM rotenonu i 20 mM antymycyny A. Przechowywać podwielokrotności w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wysiewanie i traktowanie komórek: Jak pokazano w Rysunek 2, zasiej komórki w kolumnach 2-11. Kolumny 1 i 12 muszą pozostać puste, aby służyły jako studzienki tła. W tej pracy wykorzystano komórki HepG2 i A549.
	<ol>
		<li>Zasiej komórki o gęstości 20 000 komórek na dołek. Do wysiewu użyj 50-80 μl pożywki do hodowli komórkowych.</li>
		<li>Wypełnić ślepe studzienki równą objętością pożywki do hodowli komórkowych i inkubować komórki w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze z 5% CO2 . Pozwól komórkom przyłączyć się przez 3-4 godziny, a następnie dodaj 100 μl pożywki do hodowli komórkowych do wszystkich studzienek.</li>
		<li>Po dodaniu tej ostatniej pożywki zastosować zabieg w kolumnach 7–11. W tej pracy grupa eksperymentalna była traktowana 1 mM chlorowodorkiem metforminy przez 16 godzin, a grupa kontrolna była traktowana równą objętością sterylnej wody destylowanej jako kontrola nośnika.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Nawodnienie czujników: Odpipetować 200 μl sterylnej wody na studzienkę do płytki użytkowej, a następnie ostrożnie włożyć wkład czujnika, zanurzając czujniki w wodzie. Inkubować wkład w inkubatorze wolnym od CO2 w temperaturze 37 °C do następnego dnia.</li>
	<li>Wzór protokołu testu: Włączyć analizator (patrz tabela materiałów) i jednostkę sterującą. Uruchom oprogramowanie do sterowania przyrządem i akwizycji danych, a następnie zaprojektuj protokół testu zgodnie z opisem w tabeli 2. W obszarze Definicje grup utwórz cztery strategie wstrzykiwania, w których port A różni się w zależności od wstrzykniętego substratu (Rysunek 3). Nazwij strategie po podłożach lub ich skrótach.</li>
	<li>Do portów B, C i D przypisz odpowiednio związki oligomycyny, FCCP i rotenonu/antymycyny A. Utwórz osiem grup i nazwij je tak, jak pokazano na rysunku Rysunek 4. W obszarze Mapa tablic przypisz grupy do odpowiednich studni, a następnie zapisz protokół jako gotowy do użycia szablon. Pozostaw analizator włączony, aby temperatura ustabilizowała się przez noc. Przechowuj analizator w miejscu o stabilnej temperaturze, aby uniknąć nagłych zmian temperatury.</li>
</ol>
2. Dzień próby
<ol>
	<li>Wymiana wody na kaliber: Wylej wodę z tabliczki narzędziowej i odpipetuj 200 μl wstępnie podgrzanego kalibru na studzienkę do płytki użytkowej. Włożyć wkład z powrotem do inkubatora wolnego od CO2 do czasu przeprowadzenia testu. Aby uniknąć szybkiego parowania kalibru, utrzymuj źródło wilgoci wewnątrz inkubatora i wyłącz lub zmniejsz prędkość wentylatora do minimum.</li>
	<li>Przygotowanie roztworów roboczych: Zacznij od podgrzania 2x MAS, 5% BSA i sterylnej wody do 37 °C. W międzyczasie pozwól zapasom inhibitorów osiągnąć temperaturę pokojową. Użyj ciepłych 2x MAS i sterylnej wody destylowanej, aby przygotować 5 ml stężenia roboczego substratów i inhibitorów, jak opisano w Tabeli 3.</li>
	<li>Ładowanie portów iniekcyjnych: Jak pokazano na Rysunek 3, załaduj 20 μl substratów do portu A. Załaduj mieszaninę bursztynianu/rotenonu do portu A w wierszach A i B. Załaduj mieszaninę pirogronianu/jabłczanu do portu A w wierszach C i D. Załaduj mieszaninę glutaminianu/jabłczanu do portu A w wierszach E i F. Załaduj mieszaninę palmitoilokarnityny/jabłczanu do portu A w wierszach G i H. Na całą płytkę załaduj port B 22 μl preparatu oligomycyny, port C 25 μl preparatu FCCP, a port D 27 μl mieszaniny rotenonu/antymycyny A.</li>
	<li>Rozpoczęcie etapu kalibracji: Na karcie Uruchom test kliknij przycisk Rozpocznij uruchamianie, aby rozpocząć test. Włóż załadowany wkład czujnika i rozpocznij etap kalibracji. Poczekaj na zakończenie kalibracji przed przejściem do następnego kroku.</li>
	<li>Przygotowanie pożywki testowej (MAS-BSA-rPFO): Aby przygotować 20 ml pożywki testowej, wymieszaj 10 ml 2x MAS, 9,2 ml sterylnej wody i 0,8 ml 5% BSA w probówce o pojemności 50 ml. Dodać 2 μl 10 μM rPFO do uzyskania stężenia 1 nM i ponownie zawiesić mieszaninę za pomocą delikatnego pipetowania. Unikaj wstrząsania i nie używaj miksera wirowego do mieszania. Inkubować probówkę w temperaturze 37 °C aż do momentu użycia.</li>
	<li>Mycie komórek: Umyj komórki i puste studzienki ślepej próby dwukrotnie wstępnie podgrzaną solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS) bez wapnia i magnezu za pomocą pipety wielokanałowej. Należy unikać ponownego użycia tych samych końcówek w celu odrzucenia pożywki do hodowli komórkowych i dodania PBS. Wykonaj ten krok poza przepływem laminarnym, aby chronić komórki przed wysychaniem przez przepływ powietrza.</li>
	<li>Przepuszczalność komórek w pożywce testowej: Za pomocą pipety wielokanałowej wyrzuć PBS i zastąp go 180 μl wstępnie podgrzanego podłoża testowego (MAS-BSA-rPFO).</li>
	<li>Rozpoczęcie pomiaru: Natychmiast po przepuszczalności należy wymienić tabliczkę użytkową skalibrowanego wkładu czujnika na płytkę ogniwa i rozpocząć pomiar.</li>
</ol>

<ol><li>Gerencser, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+microplate-based+respirometry+with+correction+for+oxygen+diffusion%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion.</a> Analytical Chemistry. 81 (16), 6868-6878 (2009).</li>
<li>Murphy, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+function%2C+biology%2C+and+role+in+disease%3A+A+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial function, biology, and role in disease: A scientific statement from the American Heart Association.</a> Circulation Research. 118 (12), 1960-1991 (2016).</li>
<li>Owen, O. E., Kalhan, S. C., Hanson, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+key+role+of+anaplerosis+and+cataplerosis+for+citric+acid+cycle+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The key role of anaplerosis and cataplerosis for citric acid cycle function.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (34), 30409-30412 (2002).</li>
<li>Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNicholls%2C+DG+%22Bioenergetics+3%22">Bioenergetics 3</a>. , Academic press. London. (2002).</li>
<li>Brand, M. D., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+mitochondrial+dysfunction+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).</li>
<li>Staňková, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+of+mitochondrial+substrate+flux+in+a+mouse+model+of+nonalcoholic+fatty+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Adaptation of mitochondrial substrate flux in a mouse model of nonalcoholic fatty liver disease.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 1101(2020).</li>
<li>Salabei, J. K., Gibb, A. A., Hill, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+measurement+of+respiratory+activity+in+permeabilized+cells+using+extracellular+flux+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Comprehensive measurement of respiratory activity in permeabilized cells using extracellular flux analysis.</a> Nature Protocols. 9 (2), 421-438 (2014).</li>
<li>Divakaruni, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiazolidinediones+are+acute%2C+specific+inhibitors+of+the+mitochondrial+pyruvate+carrier%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2011).</li>
<li>Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+mitochondrial+function+in+permeabilized+cells+using+the+seahorse+XF+analyzer+or+a+Clark-type+oxygen+electrode%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the seahorse XF analyzer or a Clark-type oxygen electrode.</a> Current Protocols in Toxicology. 60, 1-16 (2014).</li>
<li>Elkalaf, M., Tůma, P., Weiszenstein, M., Polák, J., Trnka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+probe+Methyltriphenylphosphonium+%28TPMP%29+inhibits+the+Krebs+cycle+enzyme+2-Oxoglutarate+dehydrogenase%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial probe Methyltriphenylphosphonium (TPMP) inhibits the Krebs cycle enzyme 2-Oxoglutarate dehydrogenase.</a> PLoS One. 11 (8), 0161413(2016).</li>
<li>Rogers, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+microplate+respiratory+measurements+using+minimal+quantities+of+isolated+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria.</a> PLoS One. 6 (7), 21746(2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Protokół ten jest modyfikacją wcześniej opublikowanych badań 7,8,9,10 oraz podręcznika użytkownika produktu. W przeciwieństwie do protokołu producenta, zamiast 3x MAS stosuje się 2x MAS, ponieważ 2× MAS jest łatwiejszy do rozpuszczenia i nie tworzy osadów po zamrożeniu. Zamrożone 2 porcje MAS mogą być przechowywane do sześciu miesięcy i wykazują spójne wyniki. Kolejną różnicą jest uwzględnienie...

Respirometria oparta na mikropłytkach zrewolucjonizowała badania mitochondrialne, umożliwiając badanie oddychania komórkowego na małej próbie1. Oddychanie komórkowe jest ogólnie uważane za wskaźnik funkcji mitochondriów lub "dysfunkcji", pomimo faktu, że zakres funkcji mitochondriów wykracza poza produkcję energii2. W warunkach tlenowych mitochondria wydobywają energię zmagazynowaną w różnych substratach poprzez rozkład i przekształcanie tych substratów w produkty pośrednie metaboliczne, które mogą napędzać cykl kwasu cytrynowego3 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Ciągły przepływ substratów jest niezbędny dla przepływu cyklu kwasu cytrynowego w celu wytworzenia wysokoenergetycznych "donorów elektronów", które dostarczają elektrony do łańcucha transportu elektronów, który generuje gradient protonów przez wewnętrzną błonę mitochondrialną, umożliwiając syntazie ATP fosforylację ADP do ATP4. Dlatego projekt eksperymentalny do oznaczania oddychania mitochondrialnego musi obejmować charakter próbki (nienaruszone komórki, komórki przepuszczalne lub izolowane mitochondria) i substraty mitochondrialne.
Komórki przechowują rodzime substraty5, a mitochondria utleniają jednocześnie kilka typów substratów6, co komplikuje interpretację wyników uzyskanych z eksperymentów przeprowadzonych na nienaruszonych komórkach. Powszechnym podejściem do badania zdolności mitochondriów do utleniania wybranego substratu jest wyizolowanie mitochondriów lub przepuszczalność badanych komórek5. Chociaż izolowane mitochondria są idealne do badań ilościowych, proces izolacji jest pracochłonny. Napotyka trudności techniczne, takie jak potrzeba dużej wielkości próby, czystość plonu i powtarzalność techniki5. Przepuszczalne komórki stanowią rozwiązanie dla wad izolacji mitochondrialnej; Jednak rutynowe środki przepuszczalne o charakterze detergentowym nie są specyficzne i mogą uszkadzać błony mitochondrialne<klasa SUP="xref">5.
Rekombinowana perfringolizyna O (rPFO) była oferowana jako selektywny środek przepuszczalny błony komórkowej7, i była z powodzeniem stosowana w połączeniu z analizatorem strumienia zewnątrzkomórkowego w kilku badaniach7,8,9,10. Zmodyfikowaliśmy protokół wykorzystujący rPFO do badania przesiewowego strumienia substratu mitochondrialnego za pomocą analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego XFe96. W tym protokole porównano cztery różne szlaki utleniania substratów w dwóch fenotypach komórkowych, przy jednoczesnym zapewnieniu wystarczającej liczby powtórzeń i właściwej kontroli dla każdego badanego materiału.

<table><tbody><tr><td>Sól monopotasowa adenozyny 5&prime; -difosforan dwuwodny</td><td>Merck</td><td>A5285</td><td>przechowywać w temperaturze -20 & deg; C</td></tr><tr><td>Antymycyna A</td><td></td><td>Merck A8674</td><td>sklep pod -20 & deg; C</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Merck</td><td>A3803</td><td>przechowywać w 2 - 8 & deg; C</td></tr><tr><td>4-(trifluorometoksy)fenylohydrazon cyjanku karbonylu</td><td>Merck</td><td>C2920</td><td>przechowywać w temperaturze -20 stopni; C</td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek</td><td>Merck</td><td>D8418</td><td>sklep w RT</td></tr><tr><td>D-Mannitol</td><td>Merck</td><td>63559</td><td>sklep w RT</td></tr><tr><td>Dulbecco's sól fizjologiczna buforowana fosforanem</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>sklep w RT</td></tr><tr><td>Kwas glikolu etylenowego-bis(2-aminoetylo)-N,N,N&prime;,N&prime;-tetraoctowy</td><td>Merck</td><td>03777</td><td>sklep w RT</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Merck</td><td>H7523</td><td>przechowywać w RT</td></tr><tr><td>Sól disodowa kwasu L(-)jabłkowego</td><td>Merck</td><td>M9138</td><td>przechowywać w RT</td></tr><tr><td>Kwas L-glutaminowy sól sodowa hydrat Merck</td><td></td><td>G5889</td><td>przechowywać w RT</td></tr><tr><td>Sześciowodny chlorek magnezu</td><td>Merck</td><td>M2670</td><td>przechowywać w RT</td></tr><tr><td>Oligomycyna</td><td>Merck</td><td>O4876</td><td>przechowywać w -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Chlorek palmitoilo-DL-karnityny</td><td>Merck</td><td>P4509</td><td>przechowywać w temperaturze -20 & deg; C</td></tr><tr><td>Wodorotlenek potasu</td><td>Merck</td><td>484016</td><td>przechowywać w RT</td></tr><tr><td>Fosforan potasu jednozasadowy</td><td>Merck</td><td>P5655</td><td>przechowywać w RT</td></tr><tr><td>Rotenon</td><td>Merck</td><td>R8875</td><td>przechowywać w temperaturze -20 stopni; C</td></tr><tr><td>Oprogramowanie komputerowe Seahorse Wave</td><td>Technologie</td><td></td> Agilent <td>Pobierz z www.agilent.com</td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 Analyzer</td><td>Technologie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agilent Seahorse XFe96 FluxPak</td><td>Agilent technologies</td><td>102416-100</td><td>Wkłady z czujnikiem XFe96 i mikropłytki do hodowli komórkowych XF96</td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Merck</td><td>P2256</td><td>przechowywać w temperaturze 2 - 8 stopni; C</td></tr><tr><td>Bursztynian sodu dwuzasadowy sześciowodny</td><td>Merck</td><td>S2378</td><td>sklep w RT</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Merck</td><td>S7903</td><td>sklep w RT</td></tr><tr><td>Water</td><td>Merck</td><td>W3500</td><td>sklep w RT</td></tr><tr><td>XF calibrant</td><td>Agilent technologies</td><td>100840-000</td><td>sklep w RT</td></tr><tr><td>XF Permeabilizer błony plazmatycznej</td><td>Agilent technologies</td><td>102504-100</td><td>Rekombinowana perfringolizyna O (rPFO) - Podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20 & deg; Z</td></tr></tbody></table>

pomiar strumienia substratu mitochondrialnego w rekombinowanych komórkach perfringolizyny o-permeabilizowanej

Measuring Mitochondrial Substrate Flux in Recombinant Perfringolysin O-Permeabilized Cells

Strumień substratu mitochondrialnego jest cechą wyróżniającą każdy typ komórki, a zmiany w jej składnikach, takich jak transportery, kanały czy enzymy, są zaangażowane w patogenezę wielu chorób. Strumień substratu mitochondrialnego można badać przy użyciu nienaruszonych komórek, komórek przepuszczalnych lub izolowanych mitochondriów. Badanie nienaruszonych komórek napotyka na kilka problemów związanych z jednoczesnym utlenianiem różnych substratów. Poza tym kilka typów komórek zawiera wewnętrzne magazyny różnych substratów, które komplikują interpretację wyników. Metody takie jak izolacja mitochondriów lub stosowanie środków przepuszczalnych nie są łatwe do odtworzenia. Izolowanie czystych mitochondriów z nienaruszonymi błonami w wystarczających ilościach z małych próbek jest problematyczne. Stosowanie nieselektywnych permeabilizatorów powoduje różne stopnie nieuniknionego uszkodzenia błony mitochondrialnej. Rekombinowana perfringolizyna O (rPFO) została zaoferowana jako bardziej odpowiedni przepuszczalny permeabilizator, dzięki jego zdolności do selektywnej przepuszczalności błony plazmatycznej bez wpływu na integralność mitochondriów. W połączeniu z respirometrią mikropłytek umożliwia badanie strumienia kilku substratów mitochondrialnych z wystarczającą liczbą powtórzeń w jednym eksperymencie przy użyciu minimalnej liczby komórek. W tej pracy protokół opisuje metodę porównywania strumienia substratów mitochondrialnych dwóch różnych fenotypów komórkowych lub genotypów i może być dostosowany do testowania różnych substratów mitochondrialnych lub inhibitorów.

Proces należy rozpocząć od normalizacji wyników względem drugiego pomiaru oddychania podstawowego, aby przedstawić wartości jako procent szybkości zużycia tlenu (OCR%). Wyniki analizy przedstawiono w Rycina 5, Rysunek 6, Rycina 7, i Rysunek 8Ważne jest, aby przypisać odpowiednie dołki kontrolne (tło) dla każdej grupy i dezaktywować dołki kontrolne pozostałych grup. <str...

W tej pracy opisujemy zmodyfikowany protokół badania strumienia mitochondrialnego substratu oddechowego za pomocą rekombinowanej perfringolizyny O w połączeniu z respirometrią opartą na mikropłytkach. Dzięki temu protokołowi pokazujemy, jak metformina wpływa na oddychanie mitochondrialne dwóch różnych linii komórek nowotworowych.

Pomiar strumienia substratu mitochondrialnego w rekombinowanych komórkach perfringolizyny O-permeabilizowanej

Mitochondrial substrate flux is a distinguishing characteristic of each cell type, and changes in its components such as transporters, channels, or ...

Ponieważ testuje strumień substratów mitochondriów, na które mogą wpływać różne patologie lub zabiegi. Na przykład, dzisiaj użyjemy go do ujawnienia odpowiedzi komórek rakowych na leczenie metforminą. Wymaga minimalnej liczby komórek, a jednocześnie wystarczającej liczby powtórzeń i odpowiedniej kontroli dla każdego odrębnego materiału.Analizator jest przeznaczony wyłącznie do celów badawczych. Technika ta może identyfikować błędy w metabolizmie mitochondrialnym i może być stosowana do oceny leków wojowników wpływających na mitochondria. Procedurę zademonstruje Karolina Vaneckova, studentka studiów licencjackich i technik badawczy z mojego laboratorium.Aby rozpocząć zasiewanie komórek A549 o gęstości 20 000 komórek na studzienkę w kolumnach, od dwóch do 11 mikropłytki do hodowli komórek konika morskiego XF 96. Pozostawienie kolumn 1 i 12 pustych jako studzienek tła. Wypełnij puste studzienki równą objętością pożywki do hodowli komórkowych, a następnie inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnym inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla do przyłączenia komórek.Po trzech do czterech godzinach dodaj 100 mikrolitrów pożywki do hodowli komórkowych w studzienkach. Potraktuj kolumny grupy doświadczalnej od 7 do 11 jedną milimolową metforminą, a grupę kontrolną równą objętością sterylnej wody destylowanej, a następnie umieść płytkę z powrotem w inkubatorze. Aby nawodnić czujniki, należy odpipetować 200 mikrolitrów sterylnej wody na studzienkę do płytki użytkowej.Następnie ostrożnie zwróć wkład czujnika, zanurzając go w wodzie. Inkubuj wkład w inkubatorze bez dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza do następnego dnia. Włączyć analizator i jednostkę sterującą.Uruchom oprogramowanie do sterowania przyrządami i akwizycji danych, a następnie zaprojektuj protokół testu zgodnie z opisem w manuskrypcie. W ramach definicji grup utwórz cztery strategie iniekcji, w których port A różni się w zależności od wstrzykniętego substratu, i nazwij strategie po substratach lub skrótach. Przypisz oligomycynę do portu B, FCCP do portu C, a mieszaninę antymycyny rotenonowej A do portu D. Utwórz i nazwij osiem grup, pod mapą płytową przypisz grupy do odpowiednich studzienek.Następnie zapisz protokół jako gotowy do użycia szablon. Pozostaw przełącznik analizatora włączony, aby temperatura ustabilizowała się przez noc. Następnego dnia wylej wodę z płytki użytkowej i dodaj 200 mikrolitrów wstępnie podgrzanego kalibru na studzienkę do płytki użytkowej.Włożyć wkład z powrotem do inkubatora wolnego od dwutlenku węgla do czasu przeprowadzenia testu. Utrzymuj źródło wilgoci wewnątrz inkubatora i wyłącz lub zmniejsz prędkość wentylatora do minimum, aby uniknąć szybkiego parowania kalibru. Przygotować pięć mililitrów roztworu roboczego substratów i inhibitorów z podgrzanym dwukrotnie roztworem do testów mitochondrialnych, 5% BSA i sterylną wodą, jak opisano w manuskrypcie tekstowym.Następnie załaduj porty wtryskiwaczy substratem i inhibitorami zgodnie z opisem w manuskrypcie podatkowym. Aby przeprowadzić kalibrację, na karcie testu przebiegowego kliknij przycisk rozpoczęcia testu, aby rozpocząć test. Włóż załadowany nabój cenzora i poczekaj na zakończenie kalibracji.Przygotuj 20 mililitrów pożywki testowej, mieszając dwukrotnie roztwór do testów mitochondrialnych, sterylną wodę i 5% BSA w 50-mililitrowej probówce. Dodać dwa mikrolitry 10 mikromolowej rekombinowanej perfringolizyny O, aby uzyskać stężenie jednego nanomolowca. I ponownie zawiesić mieszaninę, delikatnie pipetując, unikając potrząsania i wirowania.Inkubować probówkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza aż do użycia. Za pomocą pipety wielokanałowej umyj komórki i puste studzienki ślepej próby dwukrotnie, używając wstępnie podgrzanego roztworu PBS wolnego od wapnia i magnezu. Odrzucić PBS i dodać 180 mikrolitrów wstępnie podgrzanej pożywki testowej w celu przepuszczalności komórek.Natychmiast po przepuszczalności należy wymienić płytkę użytkową skalibrowanego wkładu czujnika na płytkę ogniwa zawierającą przepuszczalne ogniwa i rozpocząć pomiar. W grupie leczonej stwierdzono wyższy wskaźnik oddychania wywołanego bursztynianem. Odpowiedź komórek A549 na leczenie metforminą była wyższa niż WZW G2. W przypadku oddychania indukowanego jabłczanem pirogronianu komórki A549 wykazały zwiększoną indukcję w porównaniu z komórkami WZW G2 w ciągu pięciu do 15 minut.Podobne wyniki uzyskano dla oddychania indukowanego jabłczanem glutaminianu i oddychania indukowanego jabłczanem palmitoilokarnityny. Uzyskanie odpowiedniego stężenia substratu i inhibitorów. Odpowiedni wolumin musi być załadowany do odpowiedniego portu.Po zidentyfikowaniu zmiany w szlaku metabolicznym określonego substratu konieczna będzie ocena funkcji enzymów i transporterów zaangażowanych w ten szlak.

measuring-mitochondrial-substrate-flux-recombinant-perfringolysin-o

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W niniejszym opracowaniu przedstawiono protokół spektrofluorometryczny do pomiaru otwarcia mitochondrialnego poru przejścia przepuszczalności w izolowanych mitochondriach serca myszy. Analiza obejmuje jednoczesny pomiar gospodarki Ca2+ w mitochondriach, potencjału błony mitochondrialnej oraz objętości mitochondriów. Opisano również procedurę pozyskiwania wysokiej jakości funkcjonalnych mitochondriów serca.

Wieloparametryczny pomiar otwierania poru przejścia przepuszczalności w izolowanych mitochondriach serca myszy

Źródło:Elettra Leo1, Luiza H.D. Cardoso1, Sabine Schmitt1, Erich Gnaiger11Instrumenty OroborosTen film wyjaśnia, w jaki sposób strumień tlenu jest wykorzystywany do oceny oddychania mitochondrialnego w żywych i przepuszczalnych komórkach ssaków. Demonstruje sekwencyjne zastosowanie digitoniny, substratów metabolicznych, ADP, rozprzęgacza i inhibitora w celu scharakteryzowania różnych stanów oddechowych. Uzyskany w ten sposób profil strumienia tlenu ujawnia funkcję mitochondriów i wydajność...

Pomiary strumienia tlenu w celu oceny oddychania mitochondrialnego w żywych i przepuszczalnych komórkach

Przedstawione metody dostarczają instrukcji krok po kroku do wykonania zbioru testów respirometrycznych opartych na mikropłytkach przy użyciu izolowanych mitochondriów z minimalnych ilości mięśni szkieletowych myszy. Testy te są w stanie zmierzyć mechanistyczne zmiany/adaptacje w mitochondrialnym zużyciu tlenu w powszechnie używanym modelu zwierzęcym.

Wykorzystanie izolowanych mitochondriów z minimalnych ilości mięśni szkieletowych myszy do wysokoprzepustowych pomiarów oddechowych na mikropłytkach

Wysokiej rozdzielczości respirometria służy do określania zużycia tlenu w mitochondriach. Jest to prosta technika określania częstości oddechów mitochondrialnych kompleksów łańcucha oddechowego (I-IV), maksymalnej pojemności mitochondrialnego systemu transportu elektronów i integralności mitochondrialnej błony zewnętrznej.

Respirometria o wysokiej rozdzielczości do oceny funkcji mitochondriów w przepuszczalnych i nienaruszonych komórkach

W tym artykule opisana jest metoda pomiaru zużycia tlenu za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości w permeabilizowanych piersiach Drosophila. Technika ta wymaga minimalnej ilości tkanki w porównaniu z klasyczną techniką izolacji mitochondriów, a uzyskane wyniki są bardziej istotne fizjologicznie.

Pomiar mitochondrialnego zużycia tlenu w przepuszczalnych włóknach Drosophila przy użyciu minimalnych ilości tkanki

Te protokoły pomogą użytkownikom badać metabolizm energii mitochondrialnej w sferoidach 3D pochodzących z linii komórek rakowych za pomocą analizy strumienia zewnątrzkomórkowego Seahorse.

Badanie metabolizmu energii mitochondrialnej pojedynczych sferoid mikrotkankowych 3D za pomocą analizy strumienia zewnątrzkomórkowego

Wysokorozdzielcza respirometria sprzężona z czujnikami fluorescencyjnymi określa zużycie tlenu w mitochondriach i generowanie reaktywnych form tlenu (ROS). Niniejszy protokół opisuje technikę oceny częstości oddechów mitochondriów i produkcji ROS w przepuszczalnym nerwie kulszowym.

Ocena funkcji mitochondriów w nerwie kulszowym za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości

Opisujemy stopniowe protokoły mierzące oddychanie mitochondrialne mysich i ludzkich neutrofili oraz komórek HL60 za pomocą analizatora metabolicznego przepływu zewnątrzkomórkowego.

Pomiar w czasie rzeczywistym mitochondrialnego profilu bioenergetycznego neutrofili

Tutaj prezentujemy kompilację testów do bezpośredniego pomiaru funkcji mitochondriów w komórkach ssaków, niezależnie od ich zdolności do zużywania tlenu cząsteczkowego.

Testy niezależne od tlenu do pomiaru funkcji mitochondriów u ssaków

Tutaj opisujemy kompleksową metodę pomiaru mitochondrialnej fosforylacji oksydacyjnej w świeżych, przepuszczalnych włóknach mięśni szkieletowych z mięśni ludzkich lub myszy. Metoda ta pozwala na ilościowe określenie oddychania mitochondriów w czasie rzeczywistym oraz ocenę preferencji paliwowych i elastyczności metabolicznej przy jednoczesnym zachowaniu istniejących sieci mitochondrialnych i integralności błony.

Pomiar oddychania mitochondrialnego we włóknach mięśni szkieletowych ludzi i myszy za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości

Metody badania bioenergetyki mitochondriów pod fizjologicznie istotnymi stężeniami substratów w komórkach odpornościowych są ograniczone. Zapewniamy szczegółowy protokół, który wykorzystuje fluorespirometrię o wysokiej rozdzielczości do oceny zmian w odpowiedzi potencjału błony mitochondrialnej na zapotrzebowanie na energię w ludzkich limfocytach T, monocytach i obwodowych komórkach jednojądrzastych.

Fluorespirometria o wysokiej rozdzielczości do oceny dynamicznych zmian potencjału błony mitochondrialnej w ludzkich komórkach odpornościowych

Poznaj metodę pomiaru strumienia substratów mitochondrialnych w komórkach nowotworowych A549 i Hep G2 z wykorzystaniem rekombinowanej perfringolizyny O. Technika ta pozwala ocenić wpływ metforminy na oddychanie mitochondrialne w badaniach onkologicznych.

Pomiar strumienia substratu mitochondrialnego w rekombinowanych komórkach perfringolizyny O-permeabilizowanej

Przeglądaj więcej filmów