Ulepszony test ochrony enzymatycznej do badania internalizacji Staphylococcus aureus i wewnątrzkomórkowej skuteczności związków przeciwdrobnoustrojowych

Test ochrony enzymatycznej umożliwia zbadanie stopnia internalizacji gronkowca złocistego i jego zdolności do przetrwania w przylegających komórkach, a także skuteczności związku przeciwdrobnoustrojowego. Ulepszony test ochrony enzymatycznej znacznie upraszcza obsługę techniczną i umożliwia odzyskanie zinternalizowanych bakterii ze słabo przylegających komórek i komórek w zawiesinie. Procedurę zademonstruje Josselin Rigaill, lekarz medycyny i doktorant z mojego laboratorium.

Dwa dni przed testem infekcji wysiewaj komórki nabłonkowe A549 o gęstości 2,0 razy 10 do piątych komórek na mililitr na studzienkę 24-dołkowej płytki i inkubuj komórki przez 48 godzin w temperaturze 36 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla, aż osiągną 100% konfluencji. W dniu testu należy usunąć i wyrzucić zużytą pożywkę hodowlaną z trzech studzienek przeznaczonych do liczenia komórek A549 i dodać jeden mililitr kompletnej pożywki infekcyjnej zawierającej pięć mikrogramów na mililitr Hoechst 33342 i jeden mikrogram na mililitr jodku propidyny. Inkubuj komórki przez 30 minut, a następnie, za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego o szerokim polu, policz liczbę komórek i oblicz żywotność komórek.

Aby przygotować zawiesinę bakteryjną, należy dozować 25 mililitrów kompletnej pożywki infekcyjnej do probówki i podgrzać ją w temperaturze 36 stopni Celsjusza. Następnie dostosuj zawiesinę Staphylococcus aureus do OD 0,5 w kompletnym pożywce infekcyjnej za pomocą miernika gęstości komórek, a następnie przygotuj 20 mililitrów zawiesiny bakteryjnej do inokulacji komórek, rozcieńczając kulturę w kompletnej pożywce infekcyjnej, aby osiągnąć MOI jeden w zależności od liczby komórek w basenie. Następnie, za pomocą automatycznej płytki spiralnej, określ obciążenie Staphylococcus aureus rozcieńczonej zawiesiny bakteryjnej, która ma być użyta do etapu inokulacji komórek, i inkubuj płytki agarowe przez 18 do 24 godzin w temperaturze 36 stopni Celsjusza.

Następnego dnia policz liczbę kolonii za pomocą licznika kolonii, aby obliczyć dokładny MOI dla każdego testowanego szczepu. Przed inokulacją komórek obserwuj każdą studzienkę 24-dołkowej płytki za pomocą mikroskopii w małym powiększeniu, aby upewnić się, że komórki są zdrowe i rosną zgodnie z oczekiwaniami, a następnie usuń i wyrzuć zużytą pożywkę do hodowli komórek z płytki 24-dołkowej i dodaj 500 mikrolitrów zawiesiny bakteryjnej do każdej studzienki zawierającej 100% zlewających się komórek. Inkubuj komórki przez dwie godziny w temperaturze 36 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla.

Aby określić ilościowo bakterie wewnątrzkomórkowe za pomocą ulepszonego testu ochrony enzymatycznej, przygotuj 4-krotny bufor do lizy, 2% Triton X-100, trypsynę-EDTA i lizostafinę w roztworach roboczych, jak wspomniano w manuskrypcie tekstowym. Następnie przygotuj 6,25 mililitra kompletnej pożywki infekcyjnej uzupełnionej lizostafiną, dodając sześć mililitrów kompletnej pożywki infekcyjnej do 250 mikrolitrów roztworu roboczego lizostafiny. Następnie dodaj 250 mikrolitrów kompletnej pożywki infekcyjnej uzupełnionej lizostafiną do każdej studzienki i delikatnie porusz płytkę, obracając ją ręcznie.

Aby lizostafin mógł zabić bakterie zewnątrzkomórkowe, inkubuj komórki przez godzinę w temperaturze 36 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla, a następnie dezaktywuj lizostafinę, dodając 10 mikrolitrów proteinazy K w stężeniu 20 mikrogramów na mililitr do każdej studzienki i inkubując komórki przez dwie minuty w temperaturze pokojowej. Następnie dodaj 250 mikrolitrów 4x buforu do lizy lizy, aby zlizować komórki przez szok osmotyczny i inkubować komórki przez 10 minut w temperaturze 36 stopni Celsjusza. Po inkubacji kilkakrotnie odpipetować lizat komórek w górę iw dół, aby upewnić się, że komórki są w pełni zlizowane i homogenizowane, a następnie użyć automatycznej spiralnej płytki, aby określić obciążenie Staphylococcus aureus w każdej studzience i inkubować płytki agarowe przez 18 do 24 godzin w temperaturze 36 stopni Celsjusza.

Następnego dnia policz liczbę kolonii za pomocą licznika kolonii, aby obliczyć wewnątrzkomórkowe obciążenie Staphylococcus aureus każdej studzienki. Przedstawiono tutaj internalizację dwóch szczepów Staphylococcus aureus przez komórki nabłonkowe A549. Stosując test ochrony enzymatycznej, który obejmuje płukanie w celu usunięcia lizostafiny, średnie ładunki wewnątrzkomórkowe wynosiły 4,46 i 0,49 log cfu na mililitr dla typu dzikiego SF8300 i izogenicznego mutanta pozbawionego odpowiednio genów fnbA i B.

Korzystając z ulepszonego testu ochrony enzymatycznej, który wykorzystuje proteinazę K do inaktywacji lizostafiny, ładunki wynosiły odpowiednio 4,53 i 0,56 log cfu na mililitr. Poniżej przedstawiono wewnątrzkomórkową aktywność wankomycyny, ryfampicyny i lewofloksacyny wobec Staphylococcus aureus mierzoną za pomocą testu ochrony enzymatycznej. Średnie obciążenia wewnątrzkomórkowe wynosiły 4,57 log cfu na mililitr dla kontroli, 4,51 dla wankomycyny, 3,03 dla ryfampicyny i 2,91 dla lewofloksacyny.

Intensywne płukanie w celu usunięcia enzymu ma tendencję do odrywania najbardziej zainfekowanych komórek, co może dawać niedokładne wyniki i wspierać stosowanie ulepszonego protokołu. Ulepszony test ochrony enzymatycznej ułatwia badanie internalizacji gronkowca złocistego za pomocą organoidów i można go łatwo dostosować do systemu badań przesiewowych o wysokiej zawartości, który jest używany przez umieszczenie