Name: Obrazowanie mitochondrialnego wychwytu Ca2+ w astrocytach i neuronach przy użyciu genetycznie kodowanych wskaźników Ca2+ (GECI) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Poznaj metodę obrazowania mitochondrialnego wychwytu wapnia w astrocytach i neuronach przy użyciu genetycznie kodowanych wskaźników GCaMP5G i GCaMP6s. Technika ta umożliwia badanie dynamiki sygnałów wapniowych w mitochondriach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez National Institute of Health, National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS), przyznając R01NS069726 i R01NS094539 SD. Dziękujemy Erice DeMers za nagranie audio.

Procedury dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie Missouri-Columbia.
1. Budowa plazmidów DNA
UWAGA: Do obrazowania in vitro i in vivo konstruowane są plazmidy DNA kodujące GCaMP5G/6s z promotorami specyficznymi dla astrocytów i neuronów oraz sekwencjami ukierunkowanymi na mitochondria.
<ol>
	<li>Wstaw sekwencję ukierunkowaną na macierz mitochondrialną (MM) (mito-) ATGT CCGTCCTGAC GCCGCTGCTG CTGCGGGGCT TGACAGGCTC GGCCCGGGGGG CTCCCAGTGC CGCGCGCCAA GATCCATTCG TTG17 do miejsc klonowania EcoRI i BamHI w szkielecie plazmidu wirusa związanego z adenowirusem (AAV) pZac2.1, aby uzyskać plazmidy zawierające promotor astrocytów gfaABC1D lub neuronalny promotor CaMKII18,19,20.</li>
	<li>Subklonuj GCaMP5G/6s do miejsc klonowania BamH I i Not 1 w powyższych plazmidach, aby uzyskać nowe plazmidy pZac-gfaABC1D-mito-GCaMP5G/6s i pZac-CaMKII-mito-GCaMP5G/6s, które są ukierunkowane na ekspresję transgenu w mitochondriach w astrocytach i neuronach20,21 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A).</li>
	<li>Przygotować plazmidy DNA pZac-gfaABC1D-mito-GCaMP5G i pZac-CaMKII-mito-GCaMP6s do transfekcji do badania in vitro (sekcja 2). Opracowanie wektorów AAV o serotypie 5 dla astrocytów i serotypie 9 dla neuronów do badania in vivo18 (Sekcja 3).</li>
</ol>
2. Obrazowanie in vitro mitochondrialnego Ca2+ w astrocytach i neuronach
<ol>
	<li>Przygotuj pierwszorzędowe astrocyty z kory noworodków myszy P1 i pierwotne neurony z kory zarodków E15-1618,22,23,24, i hoduj je na szklanych szkiełkach nakrywkowych o średnicy 12 mm na 24-dołkowych płytkach przy użyciu zmodyfikowanego podłoża Dulbecco Eagle (DMEM) zawierającego 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i neuronalnej pożywki podstawowej (NBM) zawierającej 2% witaminy B27, odpowiednio.</li>
	<li>Transfekcja dojrzałych astrocytów i neuronów za pomocą plazmidów pZac-gfaABC1D-GCaMP6s i pZac-CaMKII-GCaMP5G przy użyciu odczynnika transfekcji na bazie lipidów do ekspresji GCaMP6 w mitochondriach astrocytów i GCaMP5G w mitochondriach neuronów18,20,21. Przetransfekuj komórki w każdym dołku 0,5 μg DNA i zmień pożywkę 6 godzin później. 
	UWAGA: Astrocyty i neurony są gotowe do obrazowania 1-2 dni po transfekcji.</li>
	<li>Wykonaj obrazowanie mitochondrialne Ca2+ in vitro 1-2 dni po transfekcji.
	<ol>
		<li>Przenieś szklane szkiełka nakrywkowe wyhodowane z astrocytami lub neuronami do komory perfuzyjnej PH-1 pod mikroskopem epifluorescencyjnym lub dwufotonowym.</li>
		<li>Stymuluj astrocytarny mitochondrialny wychwyt Ca2+ za pomocą 100 μM ATP w ACSF lub stymuluj mitochondria neuronalne za pomocą 100 μM glutaminianu/10 μM glicyny20,25 (Rysunek 2 i <silna klasa="xfig">Rysunek 3). 
		UWAGA: Zmiany roztworu z ACSF na ACSF zawierające ATP i glutaminian/glicynę są kontrolowane przez system perfuzji ALA-VM821. Szybkość zmiany roztworu jest kontrolowana na poziomie 1-2 ml/min poprzez regulację zaworu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Obrazowanie in vivo mitochondrialnegoCa2+ w astrocytach i neuronach
<ol>
	<li>Preparaty AAV.
	<ol>
		<li>Przygotować następujące wektory rekombinowanego wirusa związanego z adenowirusem (rAAV) przy użyciu plazmidów DNA przygotowanych w sekcji 1: wektory rAAV2/5-gfaABC1D-mito-GCaMP5G i rAAV2/9-CaMKII-mito-GCaMP6s. 
		UWAGA: W tym eksperymencie wektory rAAV serotypu 5 przygotowano do ekspresji GCaMP5G w mitochondriach w astrocytach, a wektory rAAV serotypu 9 przygotowano do ekspresji GCaMP6 w mitochondriach w neuronach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Stereotaktyczny wtrysk AAV.
	<ol>
		<li>Znieczulij mysz 3% izofluranem. 
		UWAGA: W dalszej części zabiegu poziom izofluranu zmniejsza się do 2%.</li>
		<li>Po tym, jak mysz osiągnie chirurgiczny poziom znieczulenia, określony przez uszczypnięcie ogona i palca u nóg, ogol włosy nad miejscem operacji, korą ruchową lub somatosensoryczną za pomocą trymera do włosów.</li>
		<li>Umieść mysz na urządzeniu stereotaktycznym myszy i przymocuj głowę za pomocą pasków nausznych. Nałóż maść okulistyczną na oczy, aby chronić je podczas zabiegu. Użyj poduszki grzewczej, aby utrzymać temperaturę ciała myszy na poziomie 37 °C przez cały czas trwania zabiegu. 
		UWAGA: Operację należy wykonywać przy użyciu procedur aseptycznych. Wszystkie narzędzia chirurgiczne muszą być sterylizowane w autoklawie lub za pomocą sterylizatora gorących kulek.</li>
		<li>Po zamontowaniu myszy na urządzeniu stereotaktycznym trzykrotnie wysterylizuj skórę głowy naprzemiennym peelingiem na bazie jodu i 70% etanolem. Wykonaj nacięcie w linii środkowej skóry głowy, aby odsłonić miejsce wstrzyknięcia.</li>
		<li>Rozciąć skórę w osi bregma-lamda i utworzyć otwór na zadziory o średnicy ~1 mm za pomocą wiertła o dużej prędkości w zamierzonym miejscu wstrzyknięcia silnika lub kory somatosensorycznej.</li>
		<li>Za pomocą strzykawki Hamiltona o gramaturze 33 G zawierającej wirusa związanego z adenowirusem (wektory rAAV2/5-gfaABC1D-mito-GCaMP5G [1 x10 11 GC] lub wektory rAAV2/9-CaMKII-mito-GCaMP6s [1 x 1011 GC]) wstrzyknąć do 1 μl wirusa w obszar docelowy. 
		UWAGA: Na przykład, w celu dostarczenia wirusa do kory mózgowej, wstrzyknij roztwór wirusa na dwie głębokości w wielu krokach. Najpierw wbij igłę na głębokość 1 mm od opony twardej i odczekaj 5 minut, aż mózg dojdzie do siebie. Następnie przesunąć igłę na głębokość ~700 μm i wstrzyknąć 500 nL roztworu wirusa z prędkością wstrzyknięcia 10 nL/s za pomocą strzykawki Hamilton sterowanej przez sterownik pompy mikrostrzykawkowej. Po zakończeniu wstrzyknięcia należy odczekać 5 minut, aby wirus mógł dyfundować do mózgu. Następnie przesunąć igłę do miejsca drugiego wstrzyknięcia na głębokości 300 μm. W tym miejscu wstrzyknij dodatkowe 500 nl roztworu wirusa. Odczekaj 10 minut, aby wirus mógł dyfundować do mózgu.</li>
		<li>Zamknij skórę głowy i skórę za pomocą kleju tkankowego. Pozwól myszom dojść do siebie na poduszce grzewczej. Po wyzdrowieniu wyślij myszy z powrotem do ośrodka dla zwierząt.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ininstalacja w oknie czaszkowym i obrazowanie in vivo dwufotonowe (2-P) mitochondrialnych sygnałów Ca2+. 
	UWAGA: Wszczepienie okna czaszkowego wykonuje się 3 tygodnie po wstrzyknięciu AAV przez korę ruchową lub somatosensoryczną26,27,28,29. Karprofen (10 mg/kg) jest wstrzykiwany podskórnie w celu złagodzenia potencjalnego bólu przed operacją. Zabiegi chirurgiczne okna czaszkowego są identyczne z zabiegami chirurgicznymi z użyciem iniekcji AAV i są wykonywane w warunkach aseptycznych.
	<ol>
		<li>Znieczulij mysz 3% izofluranem. 
		UWAGA: Jest to dawka początkowa i zmniejszona do 2% na późniejszą operację. Podczas obrazowania do znieczulenia stosuje się wstrzyknięcie dootrzewnowe (IP) 130 mg ketaminy/10 mg ksylazyny/kg masy ciała rozpuszczonej w ACSF.</li>
		<li>Umieść mysz na urządzeniu stereotaktycznym myszy i przymocuj głowę za pomocą pasków nausznych. Nałóż maść okulistyczną na oczy. Użyj poduszki grzewczej, aby utrzymać temperaturę ciała myszy na poziomie 37 °C przez cały czas trwania zabiegu. 
		UWAGA: Wszystkie narzędzia chirurgiczne muszą być wysterylizowane.</li>
		<li>Wykonaj nacięcie o długości 5-8 mm w linii środkowej skóry głowy i usuń płat skóry za pomocą nożyczek.</li>
		<li>Po odsłonięciu czaszki należy wykonać kraniotomię o średnicy 2,0-3,0 mm za pomocą szybkiego wiertła nad obszarem, w który wstrzyknięto wirusa (tj. kora ruchowa lub kora somatosensoryczna, <silna klasa = "xfig">Ryc. 1B). Najpierw wykonaj cztery małe otwory, a następnie wywierć wzdłuż okręgu łączącego otwory. Następnie podnieś i usuń kość ostrymi nożyczkami i usuń. Odsłonięta opona twarda może zostać usunięta lub pozostawiona w stanie nienaruszonym w celu zaklinowania okna czaszki.</li>
		<li>Umieść szklane szkiełko nakrywkowe o średnicy 3-5 mm z przezroczystym silikonem na kraniotomii. Użyj wykałaczki, aby delikatnie wepchnąć okienko czaszki na powierzchnię mózgu. Następnie uszczelnij krawędź niewielką ilością kleju silikonowego. 
		UWAGI: Alternatywnie, zamiast dysku silikonowego, między szkłem nakrywkowym a tkanką mózgową można zastosować 1,2% żel agarozowy o niskiej temperaturze topnienia.</li>
		<li>Na koniec uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego cementem dentystycznym. Uważaj, aby nałożyć cement lekko na krawędzi okna czaszki, aby uzyskać mocne wiązanie. Przymocuj wykonaną na zamówienie metalową płytkę głowy do czaszki za pomocą cementu dentystycznego. 
		UWAGA: Metalowa płytka służy do mocowania głowy myszy do stolika mikroskopu 2-P podczas sesji obrazowania (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1C).</li>
		<li>Dodaj 0,5 ml roztworu ACSF na szkiełko nakrywkowe na okienku czaszki w celu zanurzenia w wodzie podczas obrazowania.</li>
		<li>Wykonaj obrazowanie poklatkowe in vivo 2-P mito-GCaMP5G w astrocytach i mito-GCaMP6 w neuronach o długości fali 910 nm przez okno czaszki (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C)18,20,27. 
		UWAGA: Podczas obrazowania myszy znajdują się na poduszce grzewczej, aby utrzymać temperaturę fizjologiczną. Myszy zostaną złożone w ofierze natychmiast po zakończeniu sesji obrazowania.</li>
		<li>Oznacz astrocyty in vivo sulforodaminą 101 (SR101), gdy konieczne jest określenie kolokalizacji.
		<ol>
			<li>Na końcu kroku 3.3.4 nanieść 100 μl 100 μM SR101 w ACSF na powierzchnię kory mózgowej na 1-5 minut.</li>
			<li>Spłucz powierzchnię ACSF, aby zmyć niezwiązany SR101. Korzystając z obrazowania 2-P, wspólne znakowanie mito-GCaMP5G i SR101 w astrocytach można zaobserwować 45-60 minut później (<silna klasa = "xfig">Figura 4A).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Griffiths, E. J., Rutter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+calcium+as+a+key+regulator+of+mitochondrial+ATP+production+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial calcium as a key regulator of mitochondrial ATP production in mammalian cells.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1787 (11), 1324-1333 (2009).</li>
<li>Pizzo, P., Drago, I., Filadi, R., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Ca2%2B+homeostasis%3A+mechanism%2C+role%2C+and+tissue+specificities%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archiv+-+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Ca2+ homeostasis: mechanism, role, and tissue specificities.</a> Pflugers Archiv - European Journal of Physiology. 464 (1), 3-17 (2012).</li>
<li>Llorente-Folch, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-regulation+of+mitochondrial+respiration+maintains+ATP+homeostasis+and+requires+ARALAR%2FAGC1-malate+aspartate+shuttle+in+intact+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Calcium-regulation of mitochondrial respiration maintains ATP homeostasis and requires ARALAR/AGC1-malate aspartate shuttle in intact cortical neurons.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (35), 13957-13971 (2013).</li>
<li>Burkeen, J. F., Womac, A. D., Earnest, D. J., Zoran, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+calcium+signaling+mediates+rhythmic+extracellular+ATP+accumulation+in+suprachiasmatic+nucleus+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial calcium signaling mediates rhythmic extracellular ATP accumulation in suprachiasmatic nucleus astrocytes.</a> The Journal of Neuroscience. 31 (23), 8432-8440 (2011).</li>
<li>Duchen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%2C+calcium-dependent+neuronal+death+and+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archiv+-+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mitochondria, calcium-dependent neuronal death and neurodegenerative disease.</a> Pflugers Archiv - European Journal of Physiology. 464 (1), 111-121 (2012).</li>
<li>Gouriou, Y., Demaurex, N., Bijlenga, P., De Marchi, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+calcium+handling+during+ischemia-induced+cell+death+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial calcium handling during ischemia-induced cell death in neurons.</a> Biochimie. 93 (12), 2060-2067 (2011).</li>
<li>Qiu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+calcium+uniporter+Mcu+controls+excitotoxicity+and+is+transcriptionally+repressed+by+neuroprotective+nuclear+calcium+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial calcium uniporter Mcu controls excitotoxicity and is transcriptionally repressed by neuroprotective nuclear calcium signals.</a> Nature Communications. 4, 2034(2013).</li>
<li>Filadi, R., Greotti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+yin+and+yang+of+mitochondrial+Ca2%2B+signaling+in+cell+physiology+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">The yin and yang of mitochondrial Ca2+ signaling in cell physiology and pathology.</a> Cell Calcium. 93, 102321(2021).</li>
<li>Finkel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ins+and+outs+of+mitochondrial+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">The ins and outs of mitochondrial calcium.</a> Circulation Research. 116 (11), 1810-1819 (2015).</li>
<li>Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Chemical calcium indicators.</a> Methods. 46 (3), 143-151 (2008).</li>
<li>Contreras, L., Drago, I., Zampese, E., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%3A+The+calcium+connection%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%22%5BJournal%5D)">Mitochondria: The calcium connection.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA. 1797 (6-7), 607-618 (2010).</li>
<li>Tian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+activity+in+worms%2C+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).</li>
<li>Yamada, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+comparison+of+genetically+encoded+Ca2%2B+indicators+in+cortical+pyramidal+cells+and+cerebellar+Purkinje+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Quantitative comparison of genetically encoded Ca2+ indicators in cortical pyramidal cells and cerebellar Purkinje cells.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 5, 18(2011).</li>
<li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+GCaMP+Calcium+Indicator+for+Neural+Activity+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Optimization of a GCaMP Calcium Indicator for Neural Activity Imaging.</a> The Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).</li>
<li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li>
<li>Dana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+calcium+sensors+for+imaging+activity+in+neuronal+populations+and+microcompartments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments.</a> Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).</li>
<li>Rizzuto, R., Brini, M., Pizzo, P., Murgia, M., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+green+fluorescent+protein+as+a+tool+for+visualizing+subcellular+organelles+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Chimeric green fluorescent protein as a tool for visualizing subcellular organelles in living cells.</a> Current Biology: CB. 5 (6), 635-642 (1995).</li>
<li>Xie, Y., Wang, T., Sun, G. Y., Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+disruption+of+astrocytic+Ca2%2B+signaling+pathway+in+vivo+by+adeno-associated+viral+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Specific disruption of astrocytic Ca2+ signaling pathway in vivo by adeno-associated viral transduction.</a> Neuroscience. 170 (4), 992-1003 (2010).</li>
<li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GFAP+promoter+elements+required+for+region-specific+and+astrocyte-specific+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">GFAP promoter elements required for region-specific and astrocyte-specific expression.</a> Glia. 56 (5), 481-493 (2008).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+mitochondrial+Ca2%2B+dynamics+in+astrocytes+using+cell-specific+mitochondria-targeted+GCaMP5G%2F6s%3A+Mitochondrial+Ca2%2B+uptake+and+cytosolic+Ca2%2B+availability+via+the+endoplasmic+reticulum+store%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Imaging of mitochondrial Ca2+ dynamics in astrocytes using cell-specific mitochondria-targeted GCaMP5G/6s: Mitochondrial Ca2+ uptake and cytosolic Ca2+ availability via the endoplasmic reticulum store.</a> Cell Calcium. 56 (6), 457-466 (2014).</li>
<li>Zhang, N., Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+mitochondrial+and+cytosolic+Ca2%2B+signals+in+cultured+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Imaging of mitochondrial and cytosolic Ca2+ signals in cultured astrocytes.</a> Current Protocols in Neuroscience. 82, 1-11 (2018).</li>
<li>Bi, J., Li, H., Ye, S. Q., Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-B-cell+colony-enhancing+factor+exerts+a+neuronal+protection+through+its+enzymatic+activity+and+the+reduction+of+mitochondrial+dysfunction+in+in+vitro+ischemic+models%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Pre-B-cell colony-enhancing factor exerts a neuronal protection through its enzymatic activity and the reduction of mitochondrial dysfunction in in vitro ischemic models.</a> Journal of Neurochemistry. 120 (2), 334-346 (2012).</li>
<li>Wang, X., Li, H., Ding, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-B-cell+colony-enhancing+factor+protects+against+apoptotic+neuronal+death+and+mitochondrial+damage+in+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Pre-B-cell colony-enhancing factor protects against apoptotic neuronal death and mitochondrial damage in ischemia.</a> Scientific Reports. 6, 32416(2016).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+NAMPT-mediated+NAD%2B+salvage+pathways+and+their+roles+in+bioenergetics+and+neuronal+protection+after+ischemic+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Subcellular NAMPT-mediated NAD+ salvage pathways and their roles in bioenergetics and neuronal protection after ischemic injury.</a> Journal of Neurochemistry. 151 (6), 732-748 (2019).</li>
<li>Xie, Y., Chen, S., Wu, Y., Murphy, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+deficits+in+parvalbumin+neuron+stimulation-evoked+network+activity+despite+recovery+of+dendritic+structure+and+excitability+in+the+somatosensory+cortex+following+global+ischemia+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Prolonged deficits in parvalbumin neuron stimulation-evoked network activity despite recovery of dendritic structure and excitability in the somatosensory cortex following global ischemia in mice.</a> The Journal of Neuroscience. 34 (45), 14890-14900 (2014).</li>
<li>Ding, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDing%2C+S+%22In+vivo+imaging+of+Ca2%2B+signaling+in+astrocytes+using+two-photon+laser+scanning+fluorescent+microscopy+in+Astrocytes%22">In vivo imaging of Ca2+ signaling in astrocytes using two-photon laser scanning fluorescent microscopy in Astrocytes</a>. Milner, R. , Humana Press. 545-554 (2012).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+IP3R2-mediated+Ca2%2B+signaling+pathway+in+astrocytes+ameliorates+neuronal+death+and+brain+damage+while+reducing+behavioral+deficits+after+focal+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Disruption of IP3R2-mediated Ca2+ signaling pathway in astrocytes ameliorates neuronal death and brain damage while reducing behavioral deficits after focal ischemic stroke.</a> Cell Calcium. 58 (6), 565-576 (2015).</li>
<li>Ding, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photothrombosis+ischemia+stimulates+a+sustained+astrocytic+Ca2%2B+signaling+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Photothrombosis ischemia stimulates a sustained astrocytic Ca2+ signaling in vivo.</a> Glia. 57 (7), 767-776 (2009).</li>
<li>Ding, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+astrocytic+Ca2%2B+signals+contribute+to+neuronal+excitotoxicity+after+status+epilepticus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Enhanced astrocytic Ca2+ signals contribute to neuronal excitotoxicity after status epilepticus.</a> The Journal of Neuroscience. 27 (40), 10674-10684 (2007).</li>
<li>Gobel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria-endoplasmic+reticulum+contacts+in+reactive+astrocytes+promote+vascular+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Mitochondria-endoplasmic reticulum contacts in reactive astrocytes promote vascular remodeling.</a> Cell Metabolism. 31 (4), 791-808 (2020).</li>
<li>Diaz-Garcia, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distinct+roles+of+calcium+in+rapid+control+of+neuronal+glycolysis+and+the+tricarboxylic+acid+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">The distinct roles of calcium in rapid control of neuronal glycolysis and the tricarboxylic acid cycle.</a> eLife. 10, 64821(2021).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym artykule przedstawiamy metodę i protokół obrazowania mitochondrialnych sygnałów Ca2+ w astrocytach i neuronach. Wdrożyliśmy strategie ukierunkowane na mitochondria i specyficzne dla typu komórki w celu ekspresji GECI GCaMP5G/6s. Aby celować w GCaMP5G/6s w mitochondriach, włączyliśmy sekwencję ukierunkowaną na mitochondria do plazmidów. Aby wyrazić GCaMP5G / 6s w astrocytach i neuronach in vivo, wprowadziliśmy do plazmidów promotor specyficzny dla astrocytów gfaABC1D i specyficzny dla neuronów pr...

Mitochondria są dynamicznymi organellami subkomórkowymi i są uważane za elektrownie komórkowe do produkcji energii. Z drugiej strony mitochondria mogą pobierać Ca2+ do macierzy w odpowiedzi na miejscowy lub cytozolowy wzrost Ca2+. Mitochondrialny wychwytCa2+ wpływa na funkcję mitochondriów, w tym na procesy metaboliczne, takie jak reakcje w cyklu kwasu trikarboksylowego (TCA) i fosforylacja oksydacyjna, oraz reguluje białka wrażliwe na Ca2+ w warunkach fizjologicznych1,2,3,4. Przeciążenie mitochondriów Ca2+ jest również wyznacznikiem śmierci komórki, w tym martwicy i apoptozy w różnych zaburzeniach mózgu5,6,7. Powoduje otwarcie mitochondrialnych porów przejściowych przepuszczalności (mPTP) i uwolnienie kofaktora kaspazy, który inicjuje apoptotyczną śmierć komórki. Dlatego ważne jest, aby badać dynamikę mitochondriów Ca2 + i obchodzenie się z nim w żywych komórkach, aby lepiej zrozumieć fizjologię i patologię komórkową.
Mitochondria utrzymują homeostazę macierzy Ca2+ poprzez równowagę między wychwytem Ca2+ a odpływem. Wychwyt mitochondrialnego Ca2 + jest głównie pośredniczony przez mitochondrialne uniportery Ca2 + (MCU), podczas gdy mitochondrialny wypływ Ca2 + jest mediowany przez wymienniki Na+-Ca2+-Li+ (NCLXs) i wymienniki H+/Ca2+ (mHCXs) 8. Równowaga może zostać zaburzona poprzez stymulację receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR)9. Na homeostazę mitochondriówCa2+ wpływa również buforowanie mitochondriów poprzez tworzenie nierozpuszczalnych kompleksów xCa2+-xPO4x-xOH8.
Wewnątrzkomórkowe i mitochondrialne zmiany w stężeniu Ca2+ ([Ca2+]) mogą być oceniane za pomocą fluorescencyjnych lub luminescencyjnych wskaźników Ca2+. Wiązanie Ca2+ ze wskaźnikami powoduje modyfikacje spektralne, co pozwala na rejestrację wolnych komórek [Ca2+] w czasie rzeczywistym w żywych komórkach. Obecnie dostępne są dwa rodzaje sond do monitorowania zmian Ca2+ w komórkach: organiczne wskaźniki chemiczne i genetycznie kodowane wskaźniki Ca2 + (GECI). Ogólnie rzecz biorąc, dla badanych pytań biologicznych dostępne są różne warianty o różnym powinowactwie do Ca2+ (w oparciu o Kd), właściwościach spektralnych (długości fal wzbudzenia i emisji), zakresach dynamicznych i czułościach. Chociaż wiele syntetycznych organicznych wskaźników Ca2 + zostało wykorzystanych do cytozolowego obrazowania Ca2 +, tylko kilka można selektywnie załadować do macierzy mitochondrialnej do mitochondrialnego obrazowania Ca2 +, przy czym Rhod-2 jest najczęściej stosowany (aby zapoznać się z przeglądami, patrz10,11). Jednak Rhod-2 ma poważną wadę polegającą na wyciekaniu podczas długotrwałych eksperymentów; Ponadto jest podzielony między mitochondria, inne organelle i cytozol, co utrudnia pomiary bezwzględne w różnych podprzedziałach. W przeciwieństwie do tego, dzięki zastosowaniu promotorów specyficznych dla typu komórki i sekwencji ukierunkowanych na przedziały subkomórkowe, GECI mogą ulegać ekspresji w różnych typach komórek i przedziałach subkomórkowych do obrazowania Ca2+ specyficznego dla komórki i przedziału in vitro lub in vivo. Wskaźniki GCaMP Ca2+ oparte na intensywności fluorescencji o pojedynczej długości fali pojawiły się ostatnio jako główne GECIs12,13,14,15,16. W tym artykule przedstawiamy protokół ukierunkowany na mitochondria i specyficzną dla typu komórki ekspresję GCaMP5G i GCaMP6s (GCaMP5G / 6s) w astrocytach i neuronach oraz obrazowanie mitochondrialnego wychwytu Ca2 + w tych typach komórek. Za pomocą tego protokołu można ujawnić ekspresję GCaMP6G/6s w poszczególnych mitochondriach, a wychwyt Ca2 + w pojedynczej rozdzielczości mitochondrialnej można osiągnąć w astrocytach i neuronach in vitro i in vivo.

<table><tbody><tr><td>Maść na sztuczne łzy</td><td>Rugby</td><td>NDC-0536-6550-91</td><td>83% biała wazelina</td></tr><tr><td>Klej cyjanoakrylowy</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td>3M Vetbond Klej</td></tr><tr><td>preparacyjny stereoskop</td><td>Nikon</td><td>SMZ 2B</td><td>Chirurgia</td></tr><tr><td>Dumont z cienką końcówką</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td>do usuwania opony twardej</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe, Grubość 0,13-0,17 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542A</td><td>do osłony okna czaszki</td></tr><tr><td>Szybkoobrotowe mikrowiertło</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-17</td><td>z wiertłem do polerowania kości</td></tr><tr><td>Strzykawka iniekcyjna</td><td>Hamilton</td><td>2,5 ml</td><td>do wstrzykiwań wirusowych</td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>VEDCO</td><td>NDC-50989-996-06</td><td>100 mg/kg masy ciała</td></tr><tr><td>Agaroza o niskiej temperaturze topnienia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9793</td><td>redukująca artefakty ruchu</td></tr><tr><td>Metalowa rama</td><td>Wykonana na zamówienie</td><td>, patrz rys. 1</td><td>dla mocowania mózgu do stolika mikroskopu</td></tr><tr><td>Sterownik pompy mikrostrzykawkowej</td><td>World Precision Instruments</td><td>UMP3</td><td>Regulator prędkości wtrysku</td></tr><tr><td>Mysz stereotaktyczna</td><td>Stoelting</td><td>51725</td><td>do trzymania myszy</td></tr><tr><td>Komora perfuzyjna</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0284</td><td></td></tr><tr><td>System persfuzyjny</td><td>ALA Scientific Instruments</td><td>ALA-VM8</td><td></td></tr><tr><td>Samoregulująca poduszka grzewcza</td><td>Fine Science Tools</td><td>21061</td><td>zapobiegająca hipotermii myszy</td></tr><tr><td>Sulforodamina 101</td><td>Invitrogen</td><td>S-359</td><td>czerwony barwnik fluorescencyjny do oznaczania astrocytów</td></tr><tr><td>Nożyczki chirurgiczne, 12 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>14002-12</td><td>do preparacji</td></tr><tr><td>Trephine</td><td>Fine Science Tools</td><td>18004-23</td><td>do oczyszczania materiału</td></tr><tr><td>Ksylazyna</td><td>VEDCO</td><td>NDC-50989-234-11</td><td>10 mg/kg masy ciała</td></tr></tbody></table>

obrazowanie mitochondrialnego wychwytu ca2+ w astrocytach i neuronach przy użyciu genetycznie kodowanych wskaźników ca2+ (geci)

Imaging Mitochondrial Ca2+ Uptake in Astrocytes and Neurons using Genetically Encoded Ca2+ Indicators (GECIs)

Mitochondrialny Ca2+ odgrywa kluczową rolę w kontrolowaniu cytozolowego buforowania Ca2+, metabolizmu energetycznego i transdukcji sygnału komórkowego. Przeciążenie mitochondriówCa2+ przyczynia się do różnych stanów patologicznych, w tym neurodegeneracji i apoptotycznej śmierci komórek w chorobach neurologicznych. Tutaj przedstawiamy podejście molekularne specyficzne dla typu komórki i ukierunkowane na mitochondria do obrazowania mitochondrialnego Ca2 + w astrocytach i neuronach in vitro i in vivo. Skonstruowaliśmy plazmidy DNA kodujące genetycznie kodowane wskaźniki Ca2 + (GECI) GCaMP5G lub GCaMP6 (GCaMP5G / 6s) z promotorami specyficznymi dla astrocytów i neuronów gfaABC1D i CaMKII oraz sekwencją ukierunkowaną na mitochondria (mito-). W przypadku obrazowania mitochondrialnego Ca2 + in vitro plazmidy transfekowano w hodowanych astrocytach i neuronach w celu ekspresji GCaMP5G / 6s. Do obrazowania mitochondrialnego Ca2 + in vivo przygotowano wektory wirusowe związane z adenowirusem (AAV) i wstrzyknięto je do mózgów myszy w celu ekspresji GCaMP5G/6s w mitochondriach w astrocytach i neuronach. Nasze podejście zapewnia użyteczny sposób obrazowania dynamiki mitochondrialnego Ca2 + w astrocytach i neuronach w celu zbadania związku między cytozolową i mitochondrialną sygnalizacją Ca2 +, a także interakcjami astrocytów - neuronów.

Celem niniejszego badania było opracowanie metodologii obrazowania sygnałów mitochondrialnego Ca2+ przy użyciu GECI w astrocytach i neuronach in vitro oraz in vivo. W niniejszym materiale przedstawiono wyniki obrazowania mitochondrialnego Ca2+ zarówno in vitro, jak i in vivo.
In vitro sygnalizacja Ca2+ w mitochondriach hodowanych astrocytów i neuronów</strong...

Ten proctocol ma na celu dostarczenie metody obrazowania in vitro i in vivo mitochondrialnego Ca2+ w astrocytach i neuronach.

Obrazowanie mitochondrialnego wychwytu Ca2+ w astrocytach i neuronach przy użyciu genetycznie kodowanych wskaźników Ca2+ (GECI)

Mitochondrial Ca2+ plays a critical role in controlling cytosolic Ca2+ buffering, energy metabolism, and cellular signal transduction. Overloading of ...

Procedurę zademonstrują doktorant Zhe Zhang, specjalista ds. badań Nannan Zhang, profesorowie Illker Ozden i Shinghua Ding. Ogólnym celem tej procedury jest opracowanie specyficznej dla typu komórki pary astrocytów i neuronów oraz metody celowania w mitochondria do obrazowania mitochondriów in vitro i in vivo przy użyciu genetycznie kodowanego wskaźnika wapniowego, GCaMP5G i 6s. Do obrazowania in vitro lub in vivo skonstruujemy plazmidy DNA zawierające promotory specyficzne dla astrocytów lub neuronów gfaABC1D lub CaMKII oraz genetycznie kodowane wskaźniki wapnia, GCaMP5G/6s z mitochondrialnymi sekwencjami docelowymi.Do obrazowania mitochondriów wapnia in vitro transfekowaliśmy neurony astrocytów hodowane na szkiełkach nakrywkowych z wyżej wymienionymi plazmidami DNA metodą lipofekctaminy. Obrazowanie można rozpocząć od jednego do dwóch dni po transfekcji, przenosząc szkiełka szklanej pokrywy do komory profuzyjnej pod mikroskopem epifluorescencyjnym lub dwufotonowym. Oto przykłady sygnałów fluorescencyjnych z mitochondriów i astrocytów wyrażających GCaMP6 po lewej stronie oraz dla mitochondriów w neuronie, wyrażających GCaMP5G po prawej.Do obrazowania in vivo przygotowaliśmy adenowirusa związanego z serotypem 5 do ekspresji mito-GCaMP5G w astrocytach i adenowirusa związanego z serotypem 9 do ekspresji mito-GCaMP6 w neuronach. W przypadku stereotaktycznych operacji wstrzykiwania wirusa najpierw znieczuliliśmy mysz 3% izofluranem. W dalszej części zabiegu poziom izofluranu zmniejsza się do 2%Po osiągnięciu odpowiedniego poziomu znieczulenia, włosy na skórze głowy są golone, a mysz jest umieszczana na stereopodatkowym narzędziu chirurgicznym.Na oczy nakłada się maść okulistyczną w celu ich ochrony podczas zabiegu. Operacje iniekcyjne są wykonywane przy użyciu procedur aseptycznych, w tym sterylnych narzędzi i technik aseptycznych. Narzędzia chirurgiczne są sterylizowane w autoklawie lub za pomocą sterylizatora gorących kulek.Po zamontowaniu myszy na stereotaksie, skóra głowy jest trzykrotnie czyszczona betadyną i 70% etanolem. Następnie poszycie jest rozcinane wzdłuż osi Bregma Lambda, a pion jest wykonywany za pomocą wiertła szybkoobrotowego nad miejscem docelowym. W tej pracy skupiliśmy się albo na korze ruchowej, albo na korze paracyjnej.Strzykawka Hamiltona o rozmiarze 33 zawierająca powiązany wektor adenowirusa jest wprowadzana przez otwór do mózgu, a wektory są wstrzykiwane w obszar docelowy. W przypadku dostarczania korowego wstrzykujemy roztwór wirusa na dwie głębokości w wielu krokach. Najpierw wprowadzamy igłę na głębokość jednego milimetra do kory mózgowej.Po odczekaniu pięciu minut, aby mózg się zregenerował, przesuwamy igłę na głębokość do 700 mikrometrów, wstrzykujemy 500 nanolitrów roztworu wirusa. Po zakończeniu wstrzykiwania czekamy pięć minut, aby wirus mógł rozprzestrzenić się w mózgu. Następnie przesuwamy igłę do drugiego miejsca wstrzyknięcia na głębokości 300 mikrometrów.Tutaj wstrzykujemy kolejne 500 nano litrów roztworu wirusa. Po zakończeniu iniekcji czekamy 10 minut, aby wirus mógł się rozproszyć, a następnie wyjmujemy igłę z mózgu i zamykamy otwór w zadziorach woskiem kostnym lub Kwik-Sil. Na koniec skóra jest zszywana za pomocą Vetbond, a mysz jest odzyskiwana na poduszce grzewczej przed wysłaniem z powrotem do zakładu dla zwierząt.Mysz będzie gotowa do użycia do obrazowania in vivo w ciągu co najmniej trzech tygodni, czyli w czasie, w którym dojrzewa ekspresja GCaMP. Operacje implantacji okienka czaszkowego są również wykonywane w warunkach aseptycznych, jak opisano dla operacji iniekcyjnych. Zabiegi chirurgiczne okna czaszkowego są identyczne z zabiegami chirurgicznymi iniekcyjnymi aż do momentu odsłonięcia czaszki.Po odsłonięciu czaszki, ćwiartki kraniotomii o średnicy 2-3 mm nad obszarem, w którym wstrzyknięto wirusa, są oznaczane czterema płytkimi otworami wykonanymi za pomocą szybkoobrotowego wiertła przymocowanego do manipulatora. Następnie przekrój czaszki w wąwozach kraniotomii jest przerzedzany przez ostrożne i powolne wiercenie kości wokół koła, łącząc te cztery otwory. Gdy czaszka na granicach jest wystarczająco cienka, kość podnosi się ostrymi pęsetami i usuwa.Odsłonięta opona twarda może zostać usunięta lub pozostawiona w stanie nienaruszonym w celu implantacji okna czaszki. Nasze okno czaszki składa się ze szklanego szkiełka nakrywkowego o średnicy 3-5 milimetrów, tworzącego silikonowy dysk o grubości około 300 mikronów w środku. Montaż okna czaszki odbywa się poprzez umieszczenie go nad kraniotomią.Kawałek wykałaczki przymocowany do manipulatora służy do delikatnego dociśnięcia okienka czaszkowego do powierzchni mózgu. Następnie krawędź okna czaszki jest uszczelniana niewielką ilością kleju silikonowego Kwik-Sil. Na koniec okienko czaszki mocuje się w krawędziach czaszki za pomocą akrylu dentystycznego.Należy zachować ostrożność przy nakładaniu akrylu dentystycznego lekko na krawędzie okna czaszki w celu silnego wiązania. Jak wiele innych grup badawczych wdrożyło w przeszłości, 1,2% żel agarozowy może być stosowany między szkłem nakrywkowym a mózgiem jako alternatywa dla silikonowego dysku. Po bezpiecznym zainstalowaniu okna czaszkowego do czaszki mocuje się metalową płytkę.Płytka ta będzie służyła do mocowania głowy myszy na stoliku mikroskopu dwufotonowego podczas sesji obrazowania. Mitochondrialny wychwyt wapnia w astrocytach może być wywołany przez aplikację ATD, podczas gdy mitochondrialny wychwyt wapnia w neuronach może być wywołany przez zastosowanie glicyny glutaminianu w sztucznym płynie mózgowo-rdzeniowym, z grawitacją przez system perfuzyjny. Można wtedy zaobserwować wychwyt wapnia w poszczególnych mitochondriach w astrocytach i neuronach.Poniższe filmy pokazują mitochondrialny wychwyt wapnia w astrocytach wywołanych przez ATP po lewej stronie oraz w neuronie wywołanym przez glutaminian i glicynę po prawej. Obrazowanie odbywa się poprzez zbieranie poklatkowych dwufotonowych obrazów in vivo mitochondrialnych sygnałów fluorescencyjnych w astrocytach i neuronach za pomocą systemu mikroskopii dwufotonowej Ultima firmy Prairie Technologies, który jest wyposażony w milion Ti Sapphire Ultra one laser firmy Coherent. Używamy długości fal wzbudzenia od 880 do 910 nanometrów, które są optymalne do obrazowania in vivo za pomocą GCaMP5G i 6s.Astrocyty i specyficzna dla neuronów ekspresja mito-GCaMP5G i 6s i potwierdzone przez kolokalizację specyficznego dla astrocytów znakowania SR101 lub specyficznego dla neuronu markera NeuN. Spontaniczny mitochondrialny wychwyt wapnia w astrocytach i neuronach in vivo można zaobserwować za pomocą obrazowania poklatkowego przy użyciu mikroskopii dwufotonowej. Obrazy pokazują spontaniczny wzrost stężenia wapnia w poszczególnych mitochondriach w astrocytach po lewej stronie i neuronach po prawej.Nasze podejścia są przydatne do obrazowania mitochondriów wapnia specyficznego dla typu komórki in vitro i in vivo. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak obrazować mitochondrialny wychwyt wapnia w astrocytach i neuronach.

imaging-mitochondrial-ca2-uptake-astrocytes-neurons-using-genetically

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Opisano metodę wprowadzania barwników wskaźnikowych wapnia do komórek strefy podkomorowej (SVZ) w celu rejestracji aktywności wapniowej. Potnatalna SVZ zawiera gęsto upakowane komórki, w tym komórki progenitorowe neuronów oraz neuroblasty. Zamiast ładowania metodą kąpielową, barwnik wstrzykiwano pod ciśnieniem bezpośrednio do tkanki, co pozwoliło na lepszą dyfuzję barwnika.

Przygotowanie ostrych skrawków strefy podkomorowej do obrazowania wapnia

W niniejszym protokole aktualizujemy opis ostatnich postępów w obrazowaniu sygnałów Ca2+ w neuronach znakowanych GFP w skrawkach tkanki mózgowej z wykorzystaniem czerwonego fluorescencyjnego wskaźnika Ca2+.

Obrazowanie odpowiedzi wapniowych w neuronach z etykietą GFP w skrawkach mózgu myszy z obszaru podwzgórza

Ten film opisuje test oparty na obrazowaniu opartym na mikroskopii konfokalnej, mierzący pobieranie wapnia przez mitochondria w hodowanych komórkach. Test wykorzystuje wrażliwy na wapń barwnik fluorescencyjny Rhod-2/AM do pomiaru mitochondrialnego wapnia w permeabilizowanych komórkach hodowlanych.

Test napływu wapnia w celu pomiaru mitochondrialnego wychwytu wapnia w hodowanych komórkach

Tutaj opisujemy adaptację protokołów używanych do indukowania plastyczności homeostatycznej w neuronach do badania plastyczności receptorów sprzężonych z białkiem G astrocytów. Metoda ta, ostatnio wykorzystana do badania zmian w mGluR grupy astrocytarnej I u młodych myszy, może być stosowana do pomiaru skalowania różnych astrocytarnych GPCR w tkance dorosłych myszy in situ i in vivo oraz do lepszego zrozumienia wrażliwości receptorów astrocytarnych na zmiany aktywności neuronalnej.

Indukowanie plastyczności receptorów astrocytarnych poprzez manipulację szybkością odpalania neuronów

Właściwości i funkcje wewnątrzkomórkowych sygnałów Ca2+ astrocytów w prążkowiu pozostają niew pełni zbadane. Opisujemy metody ekspresji genetycznie kodowanych wskaźników wapnia w astrocytach prążkowia przy użyciu wirusów związanych z adenowirusami serotypu 2/5 (AAV2/5), a także procedury wiarygodnego obrazowania sygnałów Ca2 + w astrocytach prążkowia in situ.

Obrazowanie wewnątrzkomórkowych sygnałów Ca2+ w astrocytach prążkowia od dorosłych myszy przy użyciu genetycznie kodowanych wskaźników wapnia

Tutaj prezentujemy dwa protokoły pomiaru napływu mitochondrialnego Ca2+ w izolowanych mitochondriach i hodowanych komórkach. W przypadku izolowanych mitochondriów szczegółowo opisujemy test importu Ca2 + oparty na czytniku płytek przy użyciu wrażliwego barwnika Ca2 + zieleni wapniowej-5N. W przypadku hodowanych komórek opisujemy metodę mikroskopii konfokalnej z użyciem barwnika Ca2+ Rhod-2/AM.

Analizy napływu wapnia w mitochondriach w izolowanych mitochondriach i hodowanych komórkach

Genetycznie kodowane wskaźniki Ca2+ (GECI) radykalnie zmieniły sposób wykonywania obrazowania in situ Ca2+. Aby zmaksymalizować odzysk danych z takich nagrań, wymagana jest odpowiednia analiza sygnałów Ca2+. Protokoły przedstawione w tym artykule ułatwiają kwantyfikację sygnałów Ca2+ zarejestrowanych in situ przy użyciu mapowania czasoprzestrzennego i analizy opartej na cząstkach.

Zastosowania technik mapowania czasoprzestrzennego i analizy cząstek do ilościowego określania wewnątrzkomórkowej sygnalizacji Ca2+ in situ

Ten artykuł opisuje protokół do określania różnic w podstawowym stanie redoks i redoks odpowiedzi na ostre perturbacje w pierwotnych neuronach hipokampa i kory mózgowej za pomocą konfokalnej mikroskopii na żywo. Protokół może być stosowany do innych typów komórek i mikroskopów przy minimalnych modyfikacjach.

Obrazowanie na żywo mitochondrialnego stanu redoks glutationu w neuronach pierwotnych przy użyciu wskaźnika ratiometrycznego

Obecne metody opisują nieratiometryczne podejście do wysokorozdzielczego, subkompartmentowego obrazowania wapnia in vivo u Caenorhabditis elegans przy użyciu łatwo dostępnych genetycznie kodowanych wskaźników wapnia.

Subkomórkowe obrazowanie neuronalnej obsługi wapnia in vivo

Protokół ten opisuje obrazowanie wapnia in vivo GCaMP nienaruszonych neuronów zwoju trójdzielnego (TG). Opis ten obejmuje chirurgię ekspozycji na TG, obrazowanie neuronów TG za pomocą mikroskopii konfokalnej in vivo , zastosowanie bodźców somatycznych podczas obrazowania mikroskopowego neuronów TG oraz analizę danych obrazowania wapnia GCaMP in vivo .

In vivo (in vivo ) Obrazowanie wapniowe zespołów neuronalnych w sieciach pierwotnych neuronów czuciowych w nienaruszonych zwojach nerwu trójdzielnego

Ten protokół dostarcza kompleksowego opisu metody jednoczesnego rejestrowania sygnałów wapniowych z neuronów i astrocytów w wielu obszarach mózgu związanych z pamięcią i demonstruje jej zastosowanie w paradygmacie zachowania uczenia się i pamięci.

Metoda fotometrii światłowodowej dwukolorowej do rejestracji aktywności astrocytów-neuronów w wielu regionach mózgu podczas nauki i zachowań pamięciowych

Poznaj metodę obrazowania mitochondrialnego wychwytu wapnia w astrocytach i neuronach przy użyciu genetycznie kodowanych wskaźników GCaMP5G i GCaMP6s. Technika ta umożliwia badanie dynamiki sygnałów wapniowych w mitochondriach.

Obrazowanie mitochondrialnego wychwytu Ca²⁺ w astrocytach i neuronach przy użyciu genetycznie kodowanych wskaźników Ca²⁺ (GECI)

Przeglądaj więcej filmów