Obrazowanie mitochondrialnego wychwytu Ca²⁺ w astrocytach i neuronach przy użyciu genetycznie kodowanych wskaźników Ca²⁺ (GECI)

Procedurę zademonstrują doktorant Zhe Zhang, specjalista ds. badań Nannan Zhang, profesorowie Illker Ozden i Shinghua Ding. Ogólnym celem tej procedury jest opracowanie specyficznej dla typu komórki pary astrocytów i neuronów oraz metody celowania w mitochondria do obrazowania mitochondriów in vitro i in vivo przy użyciu genetycznie kodowanego wskaźnika wapniowego, GCaMP5G i 6s. Do obrazowania in vitro lub in vivo skonstruujemy plazmidy DNA zawierające promotory specyficzne dla astrocytów lub neuronów gfaABC1D lub CaMKII oraz genetycznie kodowane wskaźniki wapnia, GCaMP5G/6s z mitochondrialnymi sekwencjami docelowymi.

Do obrazowania mitochondriów wapnia in vitro transfekowaliśmy neurony astrocytów hodowane na szkiełkach nakrywkowych z wyżej wymienionymi plazmidami DNA metodą lipofekctaminy. Obrazowanie można rozpocząć od jednego do dwóch dni po transfekcji, przenosząc szkiełka szklanej pokrywy do komory profuzyjnej pod mikroskopem epifluorescencyjnym lub dwufotonowym. Oto przykłady sygnałów fluorescencyjnych z mitochondriów i astrocytów wyrażających GCaMP6 po lewej stronie oraz dla mitochondriów w neuronie, wyrażających GCaMP5G po prawej.

Do obrazowania in vivo przygotowaliśmy adenowirusa związanego z serotypem 5 do ekspresji mito-GCaMP5G w astrocytach i adenowirusa związanego z serotypem 9 do ekspresji mito-GCaMP6 w neuronach. W przypadku stereotaktycznych operacji wstrzykiwania wirusa najpierw znieczuliliśmy mysz 3% izofluranem. W dalszej części zabiegu poziom izofluranu zmniejsza się do 2%Po osiągnięciu odpowiedniego poziomu znieczulenia, włosy na skórze głowy są golone, a mysz jest umieszczana na stereopodatkowym narzędziu chirurgicznym.

Na oczy nakłada się maść okulistyczną w celu ich ochrony podczas zabiegu. Operacje iniekcyjne są wykonywane przy użyciu procedur aseptycznych, w tym sterylnych narzędzi i technik aseptycznych. Narzędzia chirurgiczne są sterylizowane w autoklawie lub za pomocą sterylizatora gorących kulek.

Po zamontowaniu myszy na stereotaksie, skóra głowy jest trzykrotnie czyszczona betadyną i 70% etanolem. Następnie poszycie jest rozcinane wzdłuż osi Bregma Lambda, a pion jest wykonywany za pomocą wiertła szybkoobrotowego nad miejscem docelowym. W tej pracy skupiliśmy się albo na korze ruchowej, albo na korze paracyjnej.

Strzykawka Hamiltona o rozmiarze 33 zawierająca powiązany wektor adenowirusa jest wprowadzana przez otwór do mózgu, a wektory są wstrzykiwane w obszar docelowy. W przypadku dostarczania korowego wstrzykujemy roztwór wirusa na dwie głębokości w wielu krokach. Najpierw wprowadzamy igłę na głębokość jednego milimetra do kory mózgowej.

Po odczekaniu pięciu minut, aby mózg się zregenerował, przesuwamy igłę na głębokość do 700 mikrometrów, wstrzykujemy 500 nanolitrów roztworu wirusa. Po zakończeniu wstrzykiwania czekamy pięć minut, aby wirus mógł rozprzestrzenić się w mózgu. Następnie przesuwamy igłę do drugiego miejsca wstrzyknięcia na głębokości 300 mikrometrów.

Tutaj wstrzykujemy kolejne 500 nano litrów roztworu wirusa. Po zakończeniu iniekcji czekamy 10 minut, aby wirus mógł się rozproszyć, a następnie wyjmujemy igłę z mózgu i zamykamy otwór w zadziorach woskiem kostnym lub Kwik-Sil. Na koniec skóra jest zszywana za pomocą Vetbond, a mysz jest odzyskiwana na poduszce grzewczej przed wysłaniem z powrotem do zakładu dla zwierząt.

Mysz będzie gotowa do użycia do obrazowania in vivo w ciągu co najmniej trzech tygodni, czyli w czasie, w którym dojrzewa ekspresja GCaMP. Operacje implantacji okienka czaszkowego są również wykonywane w warunkach aseptycznych, jak opisano dla operacji iniekcyjnych. Zabiegi chirurgiczne okna czaszkowego są identyczne z zabiegami chirurgicznymi iniekcyjnymi aż do momentu odsłonięcia czaszki.

Po odsłonięciu czaszki, ćwiartki kraniotomii o średnicy 2-3 mm nad obszarem, w którym wstrzyknięto wirusa, są oznaczane czterema płytkimi otworami wykonanymi za pomocą szybkoobrotowego wiertła przymocowanego do manipulatora. Następnie przekrój czaszki w wąwozach kraniotomii jest przerzedzany przez ostrożne i powolne wiercenie kości wokół koła, łącząc te cztery otwory. Gdy czaszka na granicach jest wystarczająco cienka, kość podnosi się ostrymi pęsetami i usuwa.

Odsłonięta opona twarda może zostać usunięta lub pozostawiona w stanie nienaruszonym w celu implantacji okna czaszki. Nasze okno czaszki składa się ze szklanego szkiełka nakrywkowego o średnicy 3-5 milimetrów, tworzącego silikonowy dysk o grubości około 300 mikronów w środku. Montaż okna czaszki odbywa się poprzez umieszczenie go nad kraniotomią.

Kawałek wykałaczki przymocowany do manipulatora służy do delikatnego dociśnięcia okienka czaszkowego do powierzchni mózgu. Następnie krawędź okna czaszki jest uszczelniana niewielką ilością kleju silikonowego Kwik-Sil. Na koniec okienko czaszki mocuje się w krawędziach czaszki za pomocą akrylu dentystycznego.

Należy zachować ostrożność przy nakładaniu akrylu dentystycznego lekko na krawędzie okna czaszki w celu silnego wiązania. Jak wiele innych grup badawczych wdrożyło w przeszłości, 1,2% żel agarozowy może być stosowany między szkłem nakrywkowym a mózgiem jako alternatywa dla silikonowego dysku. Po bezpiecznym zainstalowaniu okna czaszkowego do czaszki mocuje się metalową płytkę.

Płytka ta będzie służyła do mocowania głowy myszy na stoliku mikroskopu dwufotonowego podczas sesji obrazowania. Mitochondrialny wychwyt wapnia w astrocytach może być wywołany przez aplikację ATD, podczas gdy mitochondrialny wychwyt wapnia w neuronach może być wywołany przez zastosowanie glicyny glutaminianu w sztucznym płynie mózgowo-rdzeniowym, z grawitacją przez system perfuzyjny. Można wtedy zaobserwować wychwyt wapnia w poszczególnych mitochondriach w astrocytach i neuronach.

Poniższe filmy pokazują mitochondrialny wychwyt wapnia w astrocytach wywołanych przez ATP po lewej stronie oraz w neuronie wywołanym przez glutaminian i glicynę po prawej. Obrazowanie odbywa się poprzez zbieranie poklatkowych dwufotonowych obrazów in vivo mitochondrialnych sygnałów fluorescencyjnych w astrocytach i neuronach za pomocą systemu mikroskopii dwufotonowej Ultima firmy Prairie Technologies, który jest wyposażony w milion Ti Sapphire Ultra one laser firmy Coherent. Używamy długości fal wzbudzenia od 880 do 910 nanometrów, które są optymalne do obrazowania in vivo za pomocą GCaMP5G i 6s.

Astrocyty i specyficzna dla neuronów ekspresja mito-GCaMP5G i 6s i potwierdzone przez kolokalizację specyficznego dla astrocytów znakowania SR101 lub specyficznego dla neuronu markera NeuN. Spontaniczny mitochondrialny wychwyt wapnia w astrocytach i neuronach in vivo można zaobserwować za pomocą obrazowania poklatkowego przy użyciu mikroskopii dwufotonowej. Obrazy pokazują spontaniczny wzrost stężenia wapnia w poszczególnych mitochondriach w astrocytach po lewej stronie i neuronach po prawej.

Nasze podejścia są przydatne do obrazowania mitochondriów wapnia specyficznego dla typu komórki in vitro i in vivo. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak obrazować mitochondrialny wychwyt wapnia w astrocytach i neuronach.