Name: Przygotowanie mykobakteryjnego zapalenia błony naczyniowej oka (PMU) jako model poinfekcyjnego zapalenia błony naczyniowej oka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Poznaj metodę indukcji zapalenia błony naczyniowej oka u myszy za pomocą zabitych ciepłem prątków. Model PMU umożliwia badanie mechanizmów przewlekłego zapalenia oka i testowanie nowych terapii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest wspierana przez fundusze z National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, Stany Zjednoczone (KP) K08EY0123998, (KP) R01EY030431, (KP) R21 EY02939, UW vision research core grant (NEI P30EY01730), dary od Mark Daily, MD Research Fund oraz Christopher and Alida Latham Research Fund, nieograniczony grant wydziałowy od Research to Prevent Blindness, oraz nagrodę za rozwój kariery od Research to Prevent Blindness (KP). Prace przeprowadzone w Bristolu były wspierane przez dodatkowe fundusze z Sight Research UK i The Underwood Trust.

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów finansowych.

Modele zwierzęce zapalenia błony naczyniowej oka odegrały zasadniczą rolę w zrozumieniu mechanizmów zapalenia i homeostazy oka, a także umożliwiły przedkliniczną ocenę terapii medycznych i chirurgicznych u pacjentów z zapaleniem błony naczyniowej oka37. Zarówno królicze, jak i szczurze warianty modelu PMU wykazały swoją wartość w terapii przedklinicznej poprzez badania potwierdzające słuszność koncepcji 38,39,40. Ze względu na dostępność różnorodnej gamy szczepów transgenicznych u myszy, ustanowienie mysiego systemu modelowego PMU pozwala teraz na bardziej szczegółowe badania mechanistyczne w celu zidentyfikowania określonych typów komórek, szlaków i genów, które przyczyniają się do patologii tej choroby.
Modele zwierzęce zapalenia błony naczyniowej oka mogą wykazywać zmienność między zwierzętami w zakresie występowania i intensywności stanu zapalnego41. W mysim szczepie C57BL/6 PMU jest niezawodnie generowany przy użyciu opisanego tutaj protokołu. Specyficzne dla szczepu różnice w przebiegu i nasileniu zapalenia błony naczyniowej oka odnotowano zarówno dla EAU, jak i EIU42,43. Chociaż wpływ specyficzny dla szczepu na nasilenie i przebieg PMU nie został zmierzony eksperymentalnie, model ten został wykorzystany u C57BL / 6J typu dzikiego, a także u myszy albinosów (B6 (Cg) -Tyrc-2J / J) i wywołał podobne reakcje zapalne. Podczas generowania modelu PMU, kontrolowanie poniższych zagadnień może pomóc nowym badaczom ograniczyć zmienność i uzyskać najbardziej spójne i powtarzalne zapalenie błony naczyniowej oka.
Zapewnić spójność wstrzyknięć podskórnych: Aby zapewnić równomierne wstrzyknięcie podskórne, należy upewnić się, że wszystkie pęcherzyki powietrza zostały usunięte z emulsji. Należy wziąć pod uwagę krótką wirówkę (30 s przy 400 x g) gotowej emulsji przed załadowaniem strzykawki. Spowoduje to usunięcie powietrza uwięzionego w emulsji. Również podczas ładowania strzykawki należy okresowo odwracać (przechylać do góry) i postukać w strzykawkę, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza. Podczas wstrzykiwania nie należy umieszczać strzykawki zbyt głęboko, aby uniknąć wstrzyknięcia domięśniowego. I odwrotnie, płytkie (śródskórne) wstrzyknięcie może spowodować erozję emulsji przez skórę. Należy pamiętać o krótkiej przerwie przed wyjęciem strzykawki z miejsca wstrzyknięcia, aby zapewnić całkowite wstrzyknięcie gęstej, lepkiej emulsji i zapobiec refluksowi ze skóry.
Siedem dni po wstrzyknięciu podskórnym należy potwierdzić obecność wyczuwalnych guzków po obu stronach tylnych nóg. Jeśli nie można zidentyfikować żadnych guzków, możliwe, że wstrzyknięto powietrze, a nie emulsję. W takim przypadku ostry stan zapalny może nie być tak silny, a przewlekły stan zapalny może się nie rozwinąć.
Zapobiegaj rozwojowi zakaźnego zapalenia wnętrza gałki ocznej: Bakteryjne lub grzybicze zapalenie wnętrza gałki ocznej wygeneruje zmienną zakłócającą, jeśli nie zostanie zapobieżone44. Aby zapobiec bakteryjnemu zapaleniu wnętrza gałki ocznej, zawsze stosuj dobrą technikę aseptyczną podczas sporządzania zawiesiny doszklistkowej, obsługi i czyszczenia wszystkich narzędzi wielokrotnego użytku, które będą miały kontakt z okiem. Ważne jest używanie sterylnych przedmiotów jednorazowego użytku, autoklawowanie lub czyszczenie myjkami lub chusteczkami nasączonymi 95% alkoholem. Odpowiednie stosowanie betadyny nakładanej na powierzchnię oka, powieki i sierść wokół oka pomoże również zapobiec zapaleniu wnętrza gałki ocznej45. Łatwo jest rozpoznać oko z infekcją, ponieważ struktury oka zostaną zniszczone przez ekstremalny stan zapalny podczas kursu po wstrzyknięciu. Nie jest to typowe dla PMU. Obecność krwawienia wewnątrzgałkowego może również sugerować zapalenie wnętrza gałki ocznej lub uraz spowodowany wstrzyknięciem. W takich przypadkach należy wykluczyć te zwierzęta z badania.
Zapewnić spójność iniekcji do ciała szklistego: Iniekcja doszklistkowa jest kluczowym krokiem w indukcji wiarygodnego i powtarzalnego stanu zapalnego w PMU. Zapewnienie stałej ilości zawiesiny Mtb przy każdym wstrzyknięciu, unikanie urazów i zapobieganie refluksowi zawiesiny to czynniki, które należy wziąć pod uwagę podczas wykonywania zastrzyków. Aby zapewnić stałą zawiesinę, po rozmrożeniu i przed załadowaniem do strzykawki należy dokładnie wymieszać zawiesinę zapasów. Ponieważ ten zastosowany ekstrakt Mtb nie tworzy roztworu, zawiesina może z czasem ulegać sedymentacji. Aby zapewnić równomierne stężenie ekstraktu Mtb w każdym wstrzyknięciu, należy użyć lub usunąć i ponownie załadować strzykawkę w ciągu 15 minut od jej włożenia. Fenylefryna jest stosowana do rozszerzania w celu zapewnienia większego pola widzenia do tylnego oka i zmniejszenia ryzyka urazu oka podczas wstrzyknięcia. Kropla ta powoduje naturalne cofnięcie powieki i lekką wytrzeszcz gałki ziemskiej, co pozwala na dobrą wizualizację obszaru 1-2 mm za rąbkiem bez konieczności chwytania oka kleszczami. Używanie kleszczy do krępowania oka może spowodować potencjalny uraz i przejściowo zwiększyć ciśnienie wewnątrzgałkowe oraz ryzyko refluksu zawiesiny Mtb. Uraz może być również spowodowany próbą wstrzyknięcia zbyt dużej objętości do oka. Objętość wstrzyknięcia jest ograniczona do 2 μl, aby zapobiec znacznemu i długotrwałemu wzrostowi ciśnienia wewnątrzgałkowego i urazowi oka. Dodatkowo młodsze zwierzęta będą miały oczy mniejsze niż dorosłe myszy. Zazwyczaj myszy w wieku 6-8 tygodni (20-25 g) zapewniają jednolity rozmiar oczu i zapewniają większą spójność stanu zapalnego po wstrzyknięciu Mtb. Większą częstość refluksu zawiesiny prątków po wstrzyknięciu zaobserwowano u mniejszych myszy. To z kolei prowadzi do mniej niż oczekiwano ostrego stanu zapalnego. Rozcieńczony roztwór fluoresceiny służy do zapewnienia początkującemu wstrzykiwaczowi wizualnej informacji zwrotnej na temat powodzenia jego techniki wstrzykiwania. Dylatacja w momencie iniekcji pozwoli na bezpośrednią wizualizację wstrzykniętego materiału w jamie ciała szklistego i możliwość odnotowania wszelkich dowodów uszkodzenia soczewki. W przypadku urazu soczewki może to spowodować zmianę jasności soczewki, która spowoduje zaćmę, którą można uwidocznić na OCT. W przypadku urazu oka oczy muszą zostać wykluczone z badania ze względu na możliwość zapalenia błony naczyniowej oka46 wywołanego soczewką. Zalecamy przerwę na 10 sekund przed wyjęciem strzykawki z oka, aby umożliwić rozproszenie zawiesiny Mtb w oku i zmniejszyć refluks.
Model PMU można zmodyfikować w celu zmiany intensywności ostrego stanu zapalnego poprzez zmianę stężenia Mtb w iniekcji doszklistkowej. Różne dawki w zakresie od 2,5 μg/μL do 15 μg/μL zostały wcześniej przetestowane w naszym laboratorium. Stwierdzono jednak, że dawki wyższe niż 10 μg/μl powodują poważne uszkodzenie oczu, w tym spontaniczne pęknięcie soczewki, ciężki obrzęk i bliznowacenie rogówki oraz strzępkę. Ten stopień nasilenia nie jest typowy dla pacjentów z poinfekcyjnym zapaleniem błony naczyniowej oka, dlatego te stężenia nie są zalecane. Stwierdzono, że dawka 5 μg/μl niezawodnie wywołuje łagodne do umiarkowanego ostre zapalenie i łagodne przewlekłe zapalenie błony naczyniowej oka; Dawka 10 μg/μl powoduje niezawodnie umiarkowaną do ciężkiej ostrą chorobę i bardziej zauważalną chorobę przewlekłą. W związku z tym zmiana stężenia w ciele szklistym może zapewnić alternatywne nasilenie choroby do zastosowania w razie potrzeby w oparciu o pytanie eksperymentalne. Należy tak dobrać grupy kontrolne, aby upewnić się, że wyniki wynikają z odpowiedzi na mTB, a nie z urazu związanego z wstrzyknięciami podskórnymi lub doszklistkowymi. W kontrolach pozorowanych wstrzyknięć PBS może być stosowany zamiast ekstraktu mTB. W przypadku porównań ze zwierzętami nienarażonymi na działanie promieni słonecznych należy wziąć pod uwagę prawdziwe naiwne próbki, ponieważ inne oczy nie zawsze są równoważne.
Ze względu na mały rozmiar oka myszy, OCT może być bardziej czułym testem do wykrywania stanu zapalnego w komorze przedniej niż bezpośrednia wizualizacja lub mikroskopowa fotografia w jasnym polu. Wcześniejsze prace z PMU u szczurów25 wykazały, że więcej komórek można wykryć za pomocą histologii niż za pomocą OCT, ale istnieje dobra korelacja między tymi dwiema modalnościami. OCT ma tę dodatkową zaletę, że może być stosowany do wzdłużnego monitorowania stanu zapalnego u tego samego zwierzęcia. Inne główne mysie modele zapalenia błony naczyniowej oka, takie jak EAU i EIU, również wykorzystały OCT do analizy ilościowej 12,47,48. W modelu PMU myszy komórki przedniej komory są widoczne tylko w OCT i nie można ich zobaczyć w badaniach klinicznych, chyba że występuje duża hipopiona. Zapalenie ciała szklistego (zapalenie ciała szklistego) można zaobserwować za pomocą obrazowania dna oka koloru, ale wykrycie zmiany ilościowej jest możliwe tylko za pomocą obrazowania OCT. Inne aspekty modelu, takie jak zapalenie naczyń krwionośnych siatkówki i uszkodzenie siatkówki, można łatwo zidentyfikować za pomocą OCT i mikroskopowej fotografii dna oka w jasnym polu.
Podczas korzystania z OCT ważne jest, aby rozważyć, w jaki sposób na obrazowanie miejscowe mogą wpływać regionalne różnice w stopniu zapalenia. Wcześniejsze doniesienia zidentyfikowały nierównomierne rozmieszczenie komórek w przedniej komorze człowieka, przy czym więcej komórek znajduje się niżejniż 49. U myszy podobna predyspozycja jest powszechna. W związku z tym skanowanie pionowe lub promieniowe przez AC pomoże zapewnić obrazy, które uchwycą zakres stanu zapalnego. Dodatkowo, wykonanie obrazowania w tym samym miejscu zapewni również spójność obrazów zebranych w tym samym oku wzdłużnie. Aby uzyskać obrazy w tej samej części oka, użyj stabilnych punktów orientacyjnych i systematycznego podejścia. W przypadku obrazów komory przedniej obraz jest wyśrodkowany bezpośrednio przylegający do wierzchołka rogówki i zorientowany pionowo, tak aby można było wykryć obecność hipopionu pod kątem dolnym. W przypadku obrazów tylnego odcinka obraz jest wyśrodkowany na nerwie wzrokowym. Zaleca się rozważenie użycia co najmniej 3 skanów liniowych do oceniania, aby zapewnić uchwycenie zmienności regionalnej. W przypadkach, gdy stan zapalny jest ograniczony do lokalizacji peryferyjnych, pomocne może być uzyskanie skanów woluminów. Zbieranie skanów woluminów może również pomóc w uchwyceniu różnic regionalnych, ale zwiększy wymagania dotyczące przechowywania danych.
Inne testy in vivo, które można wykorzystać do scharakteryzowania stanu zapalnego w mysim modelu PMU, obejmują obrazowanie bioluminescencyjne13,35. Testy pośmiertne, takie jak wieloparametrowa analiza cytometrii przepływowej, można przeprowadzić w celu identyfikacji i ilościowego określenia naciekających populacji komórek odpornościowych w komorze wodnej i tylnej oka12,26. W modelu PMU ostry stan zapalny charakteryzuje się wrodzoną odpowiedzią z dominującym naciekiem neutrofili, po której następuje przewlekła i trwała odpowiedź z dominacją adaptacyjną limfocytów T, która utrzymuje się przez ponad miesiąc35. Inne testy funkcji immunologicznej, które można wykonać na tkankach pośmiertnych, obejmują analizę cytokin płynu ocznego. Ponadto inne dalsze testy, takie jak sekwencjonowanie mRNA i obrazowanie immunofluorescencyjne, mogą być stosowane do oceny wzorców ekspresji genów i białek w populacjach komórek odpornościowych siatkówki w zapaleniu błony naczyniowej oka50,51.
Model PMU można powielić w innych systemach gryzoni przy użyciu adaptacji odpowiednich dla różnych gatunków. Model PMU był wcześniej stosowany u szczurów i królików 38,39,40. U szczurów ostre zapalenie błony naczyniowej rozwija się po wstrzyknięciu do ciała szklistego, które ustępuje samoistnie w ciągu 14 dni bez wystąpienia objawów przewlekłego stanu zapalnego w badaniu histologicznym24. U królików indukcja zapalenia błony naczyniowej oka wykorzystuje dwie rundy wstrzyknięcia podskórnego przed wstrzyknięciem do ciała szklistego, ale generuje również silne zapalenie błony naczyniowej oka. Jedną z zalet korzystania z modelu mysiego jest łatwa dostępność licznych szczepów transgenicznych i nokautujących, które mogą pomóc w zrozumieniu podstawowego mechanizmu zapalenia błony naczyniowej oka52. Wszystkie modele gryzoni mogą być wykorzystywane do badań przedklinicznych terapii, jeśli środek jest podawany ogólnoustrojowo lub w postaci kropli miejscowej. Jednak ze względu na ich większe rozmiary, oczy szczurów i królików są lepszymi modelami do wykorzystania w badaniach przedklinicznych nad wszczepialnymi lub miejscowymi iniekcjami w przypadku zapalenia błony naczyniowej oka.
Podsumowując, protokół ten zapewnia naukowcom zainteresowanym badaniem mechanizmów przewlekłego zapalenia oczu nowe narzędzie, które nie jest zależne od wcześniejszej immunizacji antygenami oka.

Termin 'zapalenie błony naczyniowej oka' opisuje niejednorodny zestaw stanów, z których wszystkie charakteryzują się zapaleniem wewnątrzgałkowym1. Zwierzęce modele zapalenia błony naczyniowej oka są ważne dla zrozumienia mechanizmów choroby i badań przedklinicznych nowych terapii. Stworzono wiele zwierzęcych modeli zapalenia błony naczyniowej oka2. Dwa, które zostały najszerzej zbadane, to eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie błony naczyniowej oka (lub zapalenie błony naczyniowej oka; EAU) i zapalenie błony naczyniowej oka wywołane endotoksynami (EIU). EAU jest zwykle generowany przez immunizację antygenami oka lub może wystąpić spontanicznie, gdy centralna tolerancja jest zakłócona przy braku genu AIRE 3,4. Od tego czasu opracowano inne warianty modelu5,6,7, aby uwzględnić różne peptydy uveitogenne; Zostały one szczegółowo sprawdzone8,9,10. EAU jest podstawowym modelem dla form autoimmunologicznego zapalenia błony naczyniowej oka zależnego od limfocytów T, takich jak choroba Vogta-Koyanagi-Harada i zapalenie błony śluzowej u ludzi. EIU jest generowany przez ogólnoustrojowe lub miejscowe wstrzyknięcie bakteryjnego lipopolisacharydu (LPS)10,11. EIU został wykorzystany jako model ostrego zapalenia błony naczyniowej oka generowanego przez aktywację wrodzonych immunologicznych szlaków sygnałowych12. Oba modele odegrały zasadniczą rolę w obecnym zrozumieniu immunologii oka, ale żaden z nich nie jest skutecznym modelem dla poinfekcyjnego przewlekłego zapalenia błony naczyniowej oka. Niedawno opracowany u myszy, model Primed Mycobacterial Uveitis (PMU) zapewnia teraz podejście do badania i oceny klinicznych i komórkowych aspektów tej postaci zapalenia błony naczyniowej oka13.
Na całym świecie występuje wysoka częstość występowania infekcji prątkami, z ponad 10 milionami nowych przypadków i ponad 1,4 miliona zgonów zgłoszonych przez Światową Organizację Zdrowia w 2019 roku14. Pozapłucna manifestacja czynnej gruźlicy (TB) obejmuje zapalenie błony naczyniowej oka i jest dobrze znaną przyczyną zakaźnego zapalenia błony naczyniowej oka15,16. Objawy zapalenia błony naczyniowej oka związanego z gruźlicą są proteuszowe, co prawdopodobnie odzwierciedla wiele odrębnych mechanizmów choroby, w tym bezpośrednią infekcję oka, a także mniej dobrze poznane zapalenie o podłożu immunologicznym17,18,19. Proponowane mechanizmy tych następstw poinfekcyjnych obejmują przewlekłą reakcję zapalną stymulowaną przez utrzymywanie się infekcji pauc-bakillary w nabłonku barwnikowym siatkówki (RPE), przewlekłą reakcję zapalną stymulowaną przez obecność szczątkowych wzorców molekularnych związanych z patogenem (PAMP) z pomyślnie usuniętej infekcji oka oraz niewłaściwą aktywację adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej przeciwko antygenom ocznym poprzez proces mimikry molekularnej lub antygenu rozprzestrzenianie się spowodowane ogólnoustrojowym zakażeniem gruźlicą20,21,22,23.
W celu lepszego zrozumienia przewlekłego poinfekcyjnego zapalenia błony naczyniowej oka i zbadania roli antygenów mykobakteryjnych w inicjacji choroby, opracowano model PMU do użytku u myszy13,24. W związku z tym, aby wywołać stan zapalny, mysz najpierw otrzymuje podskórne wstrzyknięcie antygenu z zabitego termicznie szczepu Mycobacterium tuberculosis H37Ra w celu naśladowania infekcji ogólnoustrojowej, a następnie siedem dni później wstrzyknięcie doszklistkowe tego samego antygenu podawanego do lewego lub prawego oka w celu naśladowania miejscowej infekcji oka. Intensywność i czas trwania wynikającego z tego zapalenia błony naczyniowej oka są monitorowane za pomocą podłużnej optycznej koherentnej tomografii in vivo (OCT) i obrazowania dna oka25. PMU charakteryzuje się ostrym, zdominowanym przez szpik zapaleniem błony naczyniowej oka, które przekształca się w przewlekłe zapalenie tylnego błony naczyniowej oka z dominacją limfocytów T z zapaleniem ciała żywotnego, okołonaczyniowym zapaleniem siatkówki i ogniskowymi obszarami zewnętrznego uszkodzenia siatkówki26. Obecność ziarniniakowego zapalenia w tylnym segmencie oka sugeruje, że model PMU może być wykorzystany do badania niektórych form przedniego (ziarniniakowego i nieziarniniakowego) i pośredniego zapalenia błony naczyniowej oka, obserwowanego u pacjentów z immunologicznymi dowodami przebytego zakażenia Mtb27. Dodatkowo, zasugerowano, że składniki zabijanego termicznie Mtb stosowane w modelu PMU wyzwalają odpowiedzi immunologiczne leżące u podstaw aspektów nawracającego zapalenia błony naczyniowej oka u pacjentów z gruźlicą oka, którzy reagują na terapię przeciwgruźliczą (ATT)28. Ze względu na różnice w inicjacji choroby i przebiegu stanu zapalnego w porównaniu z EAU i EIU, PMU stanowi nowy zwierzęcy model zapalenia błony naczyniowej oka, który nie jest zależny od immunizacji antygenami oka i może pomóc w wyjaśnieniu mechanizmów choroby u pacjentów z przewlekłym zapaleniem błony naczyniowej oka. Protokół ten określa metody generowania PMU, monitorowania klinicznego przebiegu stanu zapalnego oraz pobierania próbek z oka do analizy pośmiertnej za pomocą cytometrii przepływowej.

<table><tbody><tr><td>AK-FLUOR</td><td>Akorn Pharmaceuticals, IL, USA</td><td></td><td>10% Fluoresceina sodowa 100 mg/ml w fiolce 5 ml</td></tr><tr><td>AnaSed</td><td>Akorn Animal Health, IL, USA</td><td>NDC 59399-110-20</td><td>Ksylazyna 20 mg/ml</td></tr><tr><td>Betadine 5% sterylny roztwór do przygotowania okulistycznego</td><td>Alcon, TX, USA</td><td>8007-1</td><td></td></tr><tr><td>BD Precyzyjne igły ślizgowe -25 g</td><td>Becton, Dickinson and Company, NJ, USA</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>Igła B-D Precision Glide -30-G</td><td>Becton, Dickinson and Company, NJ, Stany</td><td>Zjednoczone 305106</td><td></td></tr><tr><td>Bond MAX, Bond Rx</td><td>Leica Biosystems, IL, USA</td><td></td><td>Zautomatyzowany system barwienia IHC</td></tr><tr><td>Maść chloramfenikolowa</td><td>Martindale Pharma, Romford, Wielka Brytania</td><td></td><td>1% w/w Chloramfenikolu</td></tr><tr><td>EG1150H</td><td>Leica Biosystems, IL, USA</td><td></td><td>Osadzanie tkanek</td></tr><tr><td>Envisu R2300</td><td>Bioptigen/Leica</td><td></td><td>OCT Machine</td></tr><tr><td>Niekompletny adiuwant Freunda</td><td>BD Difco, NJ, USA</td><td>263910</td><td></td></tr><tr><td>GenTeal lubrykantowa maść do oczu</td><td>Alcon, TX, USA</td><td></td><td></td></tr>---<tr><td>GenTeal lubrykant żel pod oczy</td><td>Alcon, TX, USA</td><td></td><td></td></tr>---<tr><td>H37Ra liofilizowany ekstrakt z prątków</td><td>BD Difco, NJ, USA</td><td>231141</td><td></td></tr><tr><td>Igła Hamilton RN ( 33/12/2)S</td><td>Hamilton, Reno, NV</td><td>7803-05(33/12/2)</td><td>33 G</td></tr><tr><td>Strzykawka Hamilton</td><td>Hamilton, Reno, NV</td><td>CAL7633-01</td><td>5 &micro; L</td></tr><tr><td>Igła do insuliny</td><td>Exel International, USA</td><td>26029</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ketaset</td><td>Zoetis, USA</td><td>377341</td><td>Ketamina HCL 100 mg / ml</td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa do mikroiniekcji i Micro4Controller</td><td>World Precision Instruments, FL, USA</td><td>UMP3</td><td></td></tr><tr><td>Micron IV</td><td>Phoenix Research Laboratories, Pleasanton, CA</td><td></td><td>Alternatywna maszyna do obrazowania/OCT</td></tr><tr><td>Nanofil 10 i micro; L strzykawka</td><td>World Precision Instruments, FL, USA</td><td>NANOFIL</td><td></td></tr><tr><td>Nanofil Zestaw do wstrzykiwań wewnątrzgałkowych</td><td>World Precision Instruments, FL, USA</td><td>IO-KIT</td><td></td></tr><tr><td>Olympus SZX10</td><td>Olympus</td><td></td><td>Luneta do dysparacji</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek fenylefryny Roztwór okulistyczny USP 2,5% sterylny 15 ml</td><td>Akorn Pharmaceuticals, IL, USA</td><td></td><td></td>17478020115</tr><tr><td>RM2255</td><td>Leica Biosystems, IL, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka do cięcia tkanek gruźlicy</td><td>Becton, Dickinson and Company, NJ, USA</td><td>309602</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>tetrakainy 0,5%</td> <td>Alcon, TX, USA</td><td>1041544</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Tek VIP seria</td><td>Sakura Finetek USA, Inc., CA.</td><td></td><td>Histologia Przetwarzanie tkanek</td></tr><tr><td>Tropikamid 1%</td> <td>Chauvin Pharmaceuticals, Romford, Wielka Brytania</td><td></td><td>Minims</td></tr><tr><td>Tylenol</td><td>Johnson & Johnson Consumer Inc, PA, USA</td><td>NDC 50580-614-01</td><td>Paracetamol</td></tr><tr><td>Viscotears</td><td>Novartis Pharmaceuticals, Camberley, Wielka Brytania</td><td></td><td>Żel pod oczy Carbomer 0,2% w/w</td></tr></tbody></table>

przygotowanie mykobakteryjnego zapalenia błony naczyniowej oka (pmu) jako model poinfekcyjnego zapalenia błony naczyniowej oka

Primed Mycobacterial Uveitis (PMU) as a Model for Post-Infectious Uveitis

Termin 'zapalenie błony naczyniowej oka' opisuje niejednorodny zestaw stanów, z których wszystkie charakteryzują się zapaleniem wewnątrzgałkowym. Ogólnie rzecz biorąc, zapalenie błony naczyniowej oka definiuje się na podstawie etiologii: infekcji lub autoimmunizacji. Zakaźne zapalenie błony naczyniowej oka wymaga leczenia odpowiednimi środkami przeciwdrobnoustrojowymi, podczas gdy autoimmunologiczne zapalenie błony naczyniowej oka wymaga leczenia kortykosteroidami lub innymi środkami immunosupresyjnymi. Poinfekcyjne zapalenie błony naczyniowej oka jest formą przewlekłego zapalenia błony naczyniowej oka, która wymaga kortykosteroidów w celu kontrolowania następstw immunologicznych po początkowej infekcji. Zapalenie błony naczyniowej oka związane z zakażeniem Mycobacterium tuberculosis (Mtb) jest dobrze rozpoznaną formą poinfekcyjnego zapalenia błony naczyniowej oka, ale mechanizmy choroby nie są w pełni poznane. Aby zrozumieć rolę, jaką antygeny mykobakteryjne i wrodzone ligandy odgrywają w stymulowaniu przewlekłego zapalenia oczu po zakażeniu gruźlicą mTB, opracowano model Primed Mycobacterial Uveitis (PMU) do stosowania u myszy. W artykule przedstawiono metody generowania PMU i monitorowania klinicznego przebiegu stanu zapalnego za pomocą obrazowania dna oka i optycznej koherentnej tomografii (OCT). PMU jest indukowany przez immunizację ekstraktem z prątków zabitych termicznie, a następnie wstrzyknięcie tego samego ekstraktu do ciała szklistego do jednego oka siedem dni później. Zapalenie oka jest monitorowane podłużnie za pomocą obrazowania in vivo, a następnie pobiera się próbki do szerokiego zakresu testów, w tym histologii, cytometrii przepływowej, analizy cytokin, qPCR lub sekwencjonowania mRNA. Mysi model PMU jest użytecznym nowym narzędziem do badania odpowiedzi oczu na gruźlicę, mechanizmu przewlekłego zapalenia błony naczyniowej oka, oraz do przedklinicznych testów skuteczności nowych terapii przeciwzapalnych.

Ten protokół opisuje kroki do wywołania Primed Mycobacterial Uveitis (PMU) u myszy. Ta metoda przedstawia kroki, które pomogą w wytworzeniu niezawodnego i solidnego zapalenia oka w systemie modelu mysiego. Korzystając z tego protokołu, wygenerowaliśmy oczy błony naczyniowej oka i nieobjęte stanem zapalnym inne oczy od pojedynczych zwierząt w celu dalszej oceny za pomocą testów immunologicznych, transkryptomicznych i proteomicznych.

Przygotowanie mykobakteryjnego zapalenia błony naczyniowej oka (PMU) jako model poinfekcyjnego zapalenia błony naczyniowej oka

The term 'uveitis' describes a heterogeneous set of conditions that all feature intraocular inflammation. Broadly, uveitis is defined by etiology:  ...

Protokół ten określa kroki mające na celu wywołanie niezawodnego i solidnego zapalenia oka przy użyciu zabitych termicznie prątków w modelu mysim. Ten model prątkowego zapalenia błony naczyniowej oka może pomóc w badaniu mechanizmów przewlekłego zapalenia oka o podłożu immunologicznym, które rozwija się po infekcji prątkami. Ten model przewlekłego zapalenia błony naczyniowej oka nie wymaga stosowania specyficznych szczepów myszy ani immunizacji antygenami ocznymi.Model ten ułatwia wykorzystanie linii transgenicznych i myszy z nokautem genowym w badaniach mechanistycznych patogenezy zapalenia oka. Ten model PMU będzie pomocny w badaniach testujących nowe terapie zapalenia oczu lub zapalenia błony naczyniowej oka u ludzi. Terapie, takie jak nowe krople do oczu lub ogólnoustrojowo podawane środki modulujące układ odpornościowy, mogą być testowane pod kątem skuteczności tego modelu.Model ten ułatwi badanie, w jaki sposób zabite termicznie antygeny mykobakteryjne zmieniają mikrośrodowisko narządu uprzywilejowanego immunologicznie, takiego jak oko. Wyniki te mogą również dostarczyć informacji na temat tego, jak inne rodzaje infekcji oczu wpływają na oko lub jak miejsca uprzywilejowane immunologicznie, takie jak mózg, reagują na antygeny mikrobakteryjne. Aby rozpocząć, odkręć clamp korpus konwertera Sonicator i wyczyść sondę wacikiem nasączonym 70% alkoholem.Następnie włącz Sonicator i ustaw moc na cztery, obracając pokrętło regulacji mocy. Następnie, aby wytworzyć drobną zawiesinę drobnodrobnoustroju gruźlicy H37Ra w PBS, zanurz końcówkę sondy w proszku mikrobakteryjnym zawierającym PBS. Sonikować mieszaninę na lodzie przez 30 sekund, następnie zatrzymać się na 30 sekund i powtarzać w sumie przez pięć minut, aby w pełni rozproszyć proszek do równomiernej zawiesiny bez podgrzewania płynu.Następnie dodaj 2,5 mililitra niekompletnego adiuwanta Freunda do mieszaniny i powtarzaj proces sonikacji na lodzie, aż emulsja utworzy konsystencję przypominającą pastę do zębów. Do wstrzyknięcia podskórnego należy załadować od 200 do 300 mikrolitrów emulsji mikrobakteryjnej do jednomililitrowej strzykawki. Usunąć powietrze ze strzykawki i kontynuować napełnianie strzykawki z przerywanym odwracaniem i stukaniem, aż do napełnienia.Następnie należy umieścić zastrzyki podskórne na grzbietowej powierzchni bioder lub na brzusznej powierzchni nóg proksymalnie do okolicy pachwinowych węzłów chłonnych 6-tygodniowej znieczulonej czarnej myszy C57 6J. Ostrożnie wprowadzić igłę, uważając, aby nie przeniknąć do mięśnia, i wstrzyknąć 50 mikrolitrów emulsji w przestrzeń podskórną. Nie należy natychmiast wyjmować igły, aby umożliwić pełne wstrzyknięcie gęstej emulsji.Aby przygotować zapas antygenu do wstrzyknięcia do ciała szklistego, należy poddać sonifikacji H37Ra w roztworze PBS, jak wykazano wcześniej, a następnie podwielokrotnić roztwór w objętościach 100 mikrolitrów i przechowywać w temperaturze 20 stopni Celsjusza. W dniu wstrzyknięcia, po potwierdzeniu głębokości znieczulenia ogólnego, znieczulić rogówkę jedną kroplą 0,5% tetrakainy i rozszerzyć źrenicę jedną kroplą 2,5% fenylefryny. Po zetarciu nadmiaru płynu dodaj jedną kroplę 5%Betadine na powierzchnię oka i otaczające włosy, aby zmniejszyć ryzyko zapalenia wnętrza gałki ocznej.Po dwóch do trzech minutach usuń Betadine i przykryj oko 0,3% żelem hypromelozowym, aby zapobiec wysuszeniu pod narkozą i powstawaniu zaćmy. Następnie załaduj strzykawkę o pojemności 10 mikrolitrów z mieszanką antygenu i fluoresceiny, a następnie umieść mysz w pozycji leżącej na platformie i użyj prawego i lewego paska usznego, aby zamocować głowę myszy. Ustaw i ustaw mysz pod lunetą tak, aby widoczna była górna część nosowa prawego oka.Następnie za pomocą igły o rozmiarze 30 przesuń rzęsy, odsłoń twardówkę i uwidocznij rąbek i promieniowe naczynie krwionośne. Następnie, za pomocą sterylnej igły o rozmiarze 30, wykonaj otwór prowadzący w twardówce od jednego do dwóch milimetrów za rąbkiem. Następnie należy wprowadzić igłę o rozmiarze 34 przymocowaną do uchwytu do wstrzykiwań do oka, przez otwór prowadzący, pod kątem, który pozwoli uniknąć soczewki, ale umieścić końcówkę igły w jamie ciała szklistego.Za pomocą sterownika pompy mikrostrzykawkowej ostrożnie wstrzyknąć jeden mikrolitr ekstraktu z M. tuberculosis do jamy ciała szklistego. W przypadku stałego refluksu należy zwiększyć objętość wstrzyknięcia do 1,5 mikrolitra, aby zapewnić odpowiednie podanie dawki. Potwierdź umieszczenie w ciele szklistym, wizualizując zielonkawy odruch w oku, a po 10 sekundach wyjmij igłę z oka.Po znieczuleniu myszy rozszerz źrenicę jedną kroplą 2,5% fenylefryny, unikając przedostawania się nadmiaru kropelek do nosa lub ust. Po dwóch, trzech minutach zetrzyj nadmiar płynu i przykryj oko 0,3% żelem hypromelozowym. Następnie owiń mysz warstwą gazy chirurgicznej, aby utrzymać ciepło ciała, a następnie umieść mysz na kasecie ze zwierzętami i ustaw głowę z prętem gryzącym.Aby uzyskać obrazy optycznej koherentnej tomografii lub OCT, włącz system obrazowania OCT i otwórz oprogramowanie do obrazowania. W przypadku obrazowania w komorze tylnej należy zbliżyć OCT do powierzchni oka, uważając, aby powierzchnia soczewki nie stykała się z okiem. Po prawidłowym ustawieniu oka zatrzymaj szybkie skanowanie, wybierz protokół skanowania woluminu i aktywuj skanowanie za pomocą opcji Celowanie.W przypadku obrazów tylnego segmentu dostosuj, aż nerw wzrokowy zostanie wyśrodkowany na obrazie wyrównania poziomego skanu B, a siatkówka zostanie wyrównana z pionową osią wyrównania. W przypadku obrazów przedniego segmentu dostosuj pozycję, aby wyśrodkować wierzchołek rogówki zarówno na obrazie wyrównania B-skan, jak i na obrazie wyrównania B-skanu w pionie. Na koniec kliknij Migawka, aby przechwycić obraz skanowania woluminu, a następnie kliknij Zapisz.24 godziny po wstrzyknięciu do ciała szklistego widoczne są komórki zapalne w roztworze wodnym i szklistym. Obrzęk rogówki, hipopion, i wiele swobodnie pływających komórek zapalnych są widoczne w komorze przedniej, a zapalenie ciała szklistego w komorze tylnej. Stopień zapalenia oka można ocenić na tych obrazach OCT.Łączne wyniki większe od zera, ale mniejsze niż 2,5 reprezentują łagodny stan zapalny. Wyniki większe niż 2,5, ale mniejsze niż 4,5. reprezentują umiarkowany stan zapalny, a wyniki większe niż 4,5 identyfikują ciężkie zapalenie.Oceny stanu zapalnego można również określić za pomocą pięciu cech widocznych w skrawkach barwienia hematoksyliną i eozyną. Ocenę nasilenia określa się poprzez zliczenie liczby komórek zapalnych w roztworze wodnym i szklistym. Obrazowanie dna oka w jasnym polu może również zidentyfikować zapalenie siatkówki i okołonaczyniowe.Oczy z ciężkim stanem zapalnym wykazują liczne białe nacieki w siatkówce i krętość naczyń krwionośnych w obrazowaniu dna oka, a także gęste zapalenie ciała szklistego i obrzęk siatkówki w OCT w drugim dniu. Oczy z łagodnym stanem zapalnym wykazują mniej i bardziej dyskretne zmiany liniowe w dnie oka oraz szereg komórek naciekających w przestrzeni ciała szklistego. Zapewnienie spójności podczas iniekcji podskórnych i doszklistkowych oraz podjęcie odpowiednich środków w celu zapobiegania rozwojowi zakaźnego zapalenia wnętrza gałki ocznej to kluczowe kroki, które pomagają w pomyślnym odtworzeniu tego modelu.Obrazowanie bioluminescencyjne in vivo można wykorzystać do scharakteryzowania stanu zapalnego, podczas gdy testy pośmiertne, takie jak wieloparametrowa analiza cytometryczna przepływowa, mogą być wykonywane w celu identyfikacji i ilościowego określenia infiltrujących populacji komórek odpornościowych. Analiza cytokin, sekwencjonowanie mRNA i obrazowanie immunofluorescencyjne mogą być wykorzystywane do oceny wzorców ekspresji genów i białek lub identyfikacji populacji komórek odpornościowych siatkówki w zapaleniu błony naczyniowej oka. Protokół ten pokazuje, jak wykonywać powtarzalne, aseptyczne i minimalnie traumatyczne zastrzyki, które pomogą przyszłym badaczom uzyskać dostęp do przestrzeni wewnątrzszklistkowej u myszy.OCT będzie również odgrywać ważną rolę w wykrywaniu zapalenia oka, które w przeciwnym razie mogłoby zostać pominięte podczas wizualnego badania oczu małych zwierząt doświadczalnych.

primed-mycobacterial-uveitis-pmu-as-model-for-post-infectious

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film opisuje metodę generowania modelu myszy, który naśladuje bakteryjne zapalenie wnętrza gałki ocznej - infekcję wewnątrzgałkową wynikającą z inwazji bakterii do jamy ciała szklistego oka - poprzez doszklistkowe wstrzyknięcie zawiesiny bakteryjnej do oka. Ten mysi model pomaga badać mechanizm choroby i oceniać terapie dla niej.

Mysi model bakteryjnego zapalenia wnętrza gałki ocznej: metoda generowania bakteryjnego zapalenia wnętrza gałki ocznej poprzez doszklistkowe wstrzyknięcie zawiesiny bakteryjnej do oka myszy

Ten film pokazuje indukcję ogólnoustrojowego stanu zapalnego u znieczulonej myszy. Wstrzyknięcie zapasów antygenu prątkowego z adiuwantem wyzwala uwalnianie cytokin i miejscowy stan zapalny. Naczynia limfatyczne otwierają się, umożliwiając wnikanie komórek odpornościowych do węzłów chłonnych i aktywację limfocytów T, które uwalniają cytokiny prozapalne, prowadząc do rozległego stanu zapalnego.

Podskórne wstrzyknięcie antygenu bakteryjnego w celu wywołania ogólnoustrojowego stanu zapalnego w modelu mysim

Ten film demonstruje metodę generowania mysiego modelu mysiego zapalenia błony naczyniowej oka (PMU) do badania poinfekcyjnego zapalenia błony naczyniowej oka. Po indukcji PMU przez wstrzyknięcie do ciała szklistego zabitych termicznie Mycobacterium tuberculosis u myszy uprzednio uodpornionej tym samym immunogenem, postęp przewlekłego stanu zapalnego w oku jest analizowany za pomocą obrazowania i badania...

Mysi model prątkowego zapalenia błony naczyniowej oka do badania poinfekcyjnego zapalenia błony naczyniowej oka

Ten film demonstruje technikę obrazowania in vivo do wykrywania i ilościowego określania stanu zapalnego oka w mysim modelu poinfekcyjnego zapalenia błony naczyniowej oka. Technika ta, znana jako optyczna tomografia koherentna (OCT), generuje obrazy przekroju poprzecznego oka o wysokiej rozdzielczości w celu oceny postępu choroby.

Obrazowanie optycznej koherentnej tomografii do oceny zapalenia błony naczyniowej oka w modelu mysim

Opisujemy tutaj metodę iniekcji doszklistkowej i późniejszej oceny ilościowej bakterii w mysim modelu bakteryjnego zapalenia wnętrza gałki ocznej. Protokół ten można rozszerzyć o pomiar odpowiedzi immunologicznej gospodarza oraz ekspresji genów bakteryjnych i gospodarza.

Iniekcja doszklistkowa i ocena ilościowa parametrów infekcji w mysim modelu bakteryjnego zapalenia wnętrza gałki ocznej

W tym raporcie prezentujemy protokół, który pozwala badaczowi na wygenerowanie mysiego modelu wewnątrzgałkowego zapalenia błony naczyniowej oka. Ten uznany model, częściej określany jako eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie błony naczyniowej oka (EAU), obejmuje wiele aspektów chorób u ludzi. W tym miejscu opiszemy, jak indukować i monitorować postęp choroby za pomocą kilku odczytów.

Eksperymentalne autoimmunologiczne zapalenie błony naczyniowej oka: wewnątrzgałkowy model zapalny myszy

Tutaj prezentujemy protokół z wykorzystaniem mikroskopii 2-fotonowej u szczurów z Monachium Wistar Fromter z powierzchniowymi kłębuszkami nerkowymi w celu ilościowego określenia wpływu przedłużonej niedrożności moczowodu na dynamikę i funkcję kłębuszków nerkowych.

Wykorzystanie mikroskopii 2-fotonowej do ilościowego określenia wpływu przewlekłej jednostronnej niedrożności moczowodu na procesy kłębuszkowe

Niniejszy protokół opisuje implantację i ocenę czerniaka w mysim naczyniówce za pomocą optycznej koherentnej tomografii.

Implantacja i ocena czerniaka w mysim naczyniówce za pomocą optycznej koherentnej tomografii

Podczas procesu infekcji kluczowym etapem jest adhezja patogenów do komórek gospodarza. W większości przypadków etap adhezji ten zachodzi w obecności stresu mechanicznego generowanego przez przepływającą ciecz. Opisujemy technikę, która wprowadza naprężenie ścinające jako istotny parametr w badaniu adhezji bakteryjnej.

Wprowadzenie naprężenia ścinającego w badaniach nad adhezją bakteryjną

Opisano doustną i wewnątrzhemokoliczną infekcję larw mchowca dużego Galleria mellonella. Owad ten może być wykorzystywany do badania czynników wirulencji bakterii entomopatogennych, a także oportunistycznych bakterii ssaków. Opisano hodowlę owadów, metody infekcji oraz przykłady analiz in vivo.

Owad Galleria mellonella jako potężny model infekcji do badania patogenezy bakteryjnej

Poznaj metodę indukcji zapalenia błony naczyniowej oka u myszy za pomocą zabitych ciepłem prątków. Model PMU umożliwia badanie mechanizmów przewlekłego zapalenia oka i testowanie nowych terapii.

Przygotowanie mykobakteryjnego zapalenia błony naczyniowej oka (PMU) jako model poinfekcyjnego zapalenia błony naczyniowej oka

Przeglądaj więcej filmów