Przygotowanie mykobakteryjnego zapalenia błony naczyniowej oka (PMU) jako model poinfekcyjnego zapalenia błony naczyniowej oka

Protokół ten określa kroki mające na celu wywołanie niezawodnego i solidnego zapalenia oka przy użyciu zabitych termicznie prątków w modelu mysim. Ten model prątkowego zapalenia błony naczyniowej oka może pomóc w badaniu mechanizmów przewlekłego zapalenia oka o podłożu immunologicznym, które rozwija się po infekcji prątkami. Ten model przewlekłego zapalenia błony naczyniowej oka nie wymaga stosowania specyficznych szczepów myszy ani immunizacji antygenami ocznymi.

Model ten ułatwia wykorzystanie linii transgenicznych i myszy z nokautem genowym w badaniach mechanistycznych patogenezy zapalenia oka. Ten model PMU będzie pomocny w badaniach testujących nowe terapie zapalenia oczu lub zapalenia błony naczyniowej oka u ludzi. Terapie, takie jak nowe krople do oczu lub ogólnoustrojowo podawane środki modulujące układ odpornościowy, mogą być testowane pod kątem skuteczności tego modelu.

Model ten ułatwi badanie, w jaki sposób zabite termicznie antygeny mykobakteryjne zmieniają mikrośrodowisko narządu uprzywilejowanego immunologicznie, takiego jak oko. Wyniki te mogą również dostarczyć informacji na temat tego, jak inne rodzaje infekcji oczu wpływają na oko lub jak miejsca uprzywilejowane immunologicznie, takie jak mózg, reagują na antygeny mikrobakteryjne. Aby rozpocząć, odkręć clamp korpus konwertera Sonicator i wyczyść sondę wacikiem nasączonym 70% alkoholem.

Następnie włącz Sonicator i ustaw moc na cztery, obracając pokrętło regulacji mocy. Następnie, aby wytworzyć drobną zawiesinę drobnodrobnoustroju gruźlicy H37Ra w PBS, zanurz końcówkę sondy w proszku mikrobakteryjnym zawierającym PBS. Sonikować mieszaninę na lodzie przez 30 sekund, następnie zatrzymać się na 30 sekund i powtarzać w sumie przez pięć minut, aby w pełni rozproszyć proszek do równomiernej zawiesiny bez podgrzewania płynu.

Następnie dodaj 2,5 mililitra niekompletnego adiuwanta Freunda do mieszaniny i powtarzaj proces sonikacji na lodzie, aż emulsja utworzy konsystencję przypominającą pastę do zębów. Do wstrzyknięcia podskórnego należy załadować od 200 do 300 mikrolitrów emulsji mikrobakteryjnej do jednomililitrowej strzykawki. Usunąć powietrze ze strzykawki i kontynuować napełnianie strzykawki z przerywanym odwracaniem i stukaniem, aż do napełnienia.

Następnie należy umieścić zastrzyki podskórne na grzbietowej powierzchni bioder lub na brzusznej powierzchni nóg proksymalnie do okolicy pachwinowych węzłów chłonnych 6-tygodniowej znieczulonej czarnej myszy C57 6J. Ostrożnie wprowadzić igłę, uważając, aby nie przeniknąć do mięśnia, i wstrzyknąć 50 mikrolitrów emulsji w przestrzeń podskórną. Nie należy natychmiast wyjmować igły, aby umożliwić pełne wstrzyknięcie gęstej emulsji.

Aby przygotować zapas antygenu do wstrzyknięcia do ciała szklistego, należy poddać sonifikacji H37Ra w roztworze PBS, jak wykazano wcześniej, a następnie podwielokrotnić roztwór w objętościach 100 mikrolitrów i przechowywać w temperaturze 20 stopni Celsjusza. W dniu wstrzyknięcia, po potwierdzeniu głębokości znieczulenia ogólnego, znieczulić rogówkę jedną kroplą 0,5% tetrakainy i rozszerzyć źrenicę jedną kroplą 2,5% fenylefryny. Po zetarciu nadmiaru płynu dodaj jedną kroplę 5%Betadine na powierzchnię oka i otaczające włosy, aby zmniejszyć ryzyko zapalenia wnętrza gałki ocznej.

Po dwóch do trzech minutach usuń Betadine i przykryj oko 0,3% żelem hypromelozowym, aby zapobiec wysuszeniu pod narkozą i powstawaniu zaćmy. Następnie załaduj strzykawkę o pojemności 10 mikrolitrów z mieszanką antygenu i fluoresceiny, a następnie umieść mysz w pozycji leżącej na platformie i użyj prawego i lewego paska usznego, aby zamocować głowę myszy. Ustaw i ustaw mysz pod lunetą tak, aby widoczna była górna część nosowa prawego oka.

Następnie za pomocą igły o rozmiarze 30 przesuń rzęsy, odsłoń twardówkę i uwidocznij rąbek i promieniowe naczynie krwionośne. Następnie, za pomocą sterylnej igły o rozmiarze 30, wykonaj otwór prowadzący w twardówce od jednego do dwóch milimetrów za rąbkiem. Następnie należy wprowadzić igłę o rozmiarze 34 przymocowaną do uchwytu do wstrzykiwań do oka, przez otwór prowadzący, pod kątem, który pozwoli uniknąć soczewki, ale umieścić końcówkę igły w jamie ciała szklistego.

Za pomocą sterownika pompy mikrostrzykawkowej ostrożnie wstrzyknąć jeden mikrolitr ekstraktu z M. tuberculosis do jamy ciała szklistego. W przypadku stałego refluksu należy zwiększyć objętość wstrzyknięcia do 1,5 mikrolitra, aby zapewnić odpowiednie podanie dawki. Potwierdź umieszczenie w ciele szklistym, wizualizując zielonkawy odruch w oku, a po 10 sekundach wyjmij igłę z oka.

Po znieczuleniu myszy rozszerz źrenicę jedną kroplą 2,5% fenylefryny, unikając przedostawania się nadmiaru kropelek do nosa lub ust. Po dwóch, trzech minutach zetrzyj nadmiar płynu i przykryj oko 0,3% żelem hypromelozowym. Następnie owiń mysz warstwą gazy chirurgicznej, aby utrzymać ciepło ciała, a następnie umieść mysz na kasecie ze zwierzętami i ustaw głowę z prętem gryzącym.

Aby uzyskać obrazy optycznej koherentnej tomografii lub OCT, włącz system obrazowania OCT i otwórz oprogramowanie do obrazowania. W przypadku obrazowania w komorze tylnej należy zbliżyć OCT do powierzchni oka, uważając, aby powierzchnia soczewki nie stykała się z okiem. Po prawidłowym ustawieniu oka zatrzymaj szybkie skanowanie, wybierz protokół skanowania woluminu i aktywuj skanowanie za pomocą opcji Celowanie.

W przypadku obrazów tylnego segmentu dostosuj, aż nerw wzrokowy zostanie wyśrodkowany na obrazie wyrównania poziomego skanu B, a siatkówka zostanie wyrównana z pionową osią wyrównania. W przypadku obrazów przedniego segmentu dostosuj pozycję, aby wyśrodkować wierzchołek rogówki zarówno na obrazie wyrównania B-skan, jak i na obrazie wyrównania B-skanu w pionie. Na koniec kliknij Migawka, aby przechwycić obraz skanowania woluminu, a następnie kliknij Zapisz.

24 godziny po wstrzyknięciu do ciała szklistego widoczne są komórki zapalne w roztworze wodnym i szklistym. Obrzęk rogówki, hipopion, i wiele swobodnie pływających komórek zapalnych są widoczne w komorze przedniej, a zapalenie ciała szklistego w komorze tylnej. Stopień zapalenia oka można ocenić na tych obrazach OCT.

Łączne wyniki większe od zera, ale mniejsze niż 2,5 reprezentują łagodny stan zapalny. Wyniki większe niż 2,5, ale mniejsze niż 4,5. reprezentują umiarkowany stan zapalny, a wyniki większe niż 4,5 identyfikują ciężkie zapalenie.

Oceny stanu zapalnego można również określić za pomocą pięciu cech widocznych w skrawkach barwienia hematoksyliną i eozyną. Ocenę nasilenia określa się poprzez zliczenie liczby komórek zapalnych w roztworze wodnym i szklistym. Obrazowanie dna oka w jasnym polu może również zidentyfikować zapalenie siatkówki i okołonaczyniowe.

Oczy z ciężkim stanem zapalnym wykazują liczne białe nacieki w siatkówce i krętość naczyń krwionośnych w obrazowaniu dna oka, a także gęste zapalenie ciała szklistego i obrzęk siatkówki w OCT w drugim dniu. Oczy z łagodnym stanem zapalnym wykazują mniej i bardziej dyskretne zmiany liniowe w dnie oka oraz szereg komórek naciekających w przestrzeni ciała szklistego. Zapewnienie spójności podczas iniekcji podskórnych i doszklistkowych oraz podjęcie odpowiednich środków w celu zapobiegania rozwojowi zakaźnego zapalenia wnętrza gałki ocznej to kluczowe kroki, które pomagają w pomyślnym odtworzeniu tego modelu.

Obrazowanie bioluminescencyjne in vivo można wykorzystać do scharakteryzowania stanu zapalnego, podczas gdy testy pośmiertne, takie jak wieloparametrowa analiza cytometryczna przepływowa, mogą być wykonywane w celu identyfikacji i ilościowego określenia infiltrujących populacji komórek odpornościowych. Analiza cytokin, sekwencjonowanie mRNA i obrazowanie immunofluorescencyjne mogą być wykorzystywane do oceny wzorców ekspresji genów i białek lub identyfikacji populacji komórek odpornościowych siatkówki w zapaleniu błony naczyniowej oka. Protokół ten pokazuje, jak wykonywać powtarzalne, aseptyczne i minimalnie traumatyczne zastrzyki, które pomogą przyszłym badaczom uzyskać dostęp do przestrzeni wewnątrzszklistkowej u myszy.

OCT będzie również odgrywać ważną rolę w wykrywaniu zapalenia oka, które w przeciwnym razie mogłoby zostać pominięte podczas wizualnego badania oczu małych zwierząt doświadczalnych.