Name: Rekonstrukcja aktywności ekstrakcji Msp1 z w pełni oczyszczonymi składnikami (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 52 s
Description: Poznaj protokół rekonstrukcji aktywności ekstrakcji Msp1 z w pełni oczyszczonymi składnikami w zdefiniowanych proteoliposomach. Ta metoda upraszcza badanie AAA-ATPaz w kontroli jakości białek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

MLW opracował część tego protokołu podczas swoich studiów podoktoranckich u dr Roberta Keenana na Uniwersytecie w Chicago.
Ta praca jest finansowana z grantu NIH 1R35GM137904-01 dla MLW.

Prawidłowe funkcjonowanie mitochondriów zależy od solidnego systemu kontroli jakości białek. Ze względu na nieodłączne ograniczenia w wierności szlaków docelowych białka TA, błędnie zlokalizowane białka TA są stałym źródłem stresu dla mitochondriów. Kluczowym elementem sieci proteostazy mitochondrialnej jest Msp1, która jest ATPazą AAA + zakotwiczoną w błonie, która usuwa nieprawidłowo zlokalizowane białka TA z OMM. W tym miejscu opisaliśmy, jak przygotować proteoliposomy, odtworzyć Msp1 i modelowe białko TA oraz przepro...

Prawidłowe funkcjonowanie komórki zależy od procesu zwanego proteostazą, który zapewnia, że funkcjonalne białka mają prawidłowe stężenie i lokalizację komórkową1. Zaburzenia proteostazy prowadzą do upośledzenia funkcji organelli i są związane z wieloma chorobami neurodegeneracyjnymi2,3,4. Białka błonowe stanowią wyjątkowe wyzwanie dla sieci proteostazy, ponieważ muszą być ukierunkowane na właściwą błonę, unikając agregacji z hydrofobowych domen transbłonowych (TMDs)5. W związku z tym wyewoluowały wyspecjalizowane maszyny, które chronią hydrofobowy TMD przed cytozolem i ułatwiają celowanie i wprowadzanie do właściwej błony komórkowej6,7,8,9,10,11,12,13,14,15.
Mitochondria są centrum metabolicznym komórki i biorą udział w wielu istotnych procesach komórkowych, takich jak: fosforylacja oksydacyjna, tworzenie klastrów żelazowo-siarkowych i regulacja apoptozy16,17. Te endosymbiotyczne organelle zawierają dwie błony, określane jako wewnętrzna błona mitochondrialna (IMM) i zewnętrzna błona mitochondrialna (OMM). Ponad 99% z 1500 ludzkich białek mitochondrialnych jest zakodowanych w genomie jądrowym i musi zostać przemieszczonych przez jedną lub dwie różne błony18,19. Prawidłowa funkcja mitochondriów zależy zatem od solidnej sieci proteostazy, która koryguje wszelkie błędy w celowaniu lub translokacji białek.
Nasze laboratorium skupia się na podzbiorze białek błony mitochondrialnej zwanych białkami zakotwiczonymi w ogonie (TA), które mają pojedynczą domenę transbłonową na samym C-końcu20,21,22,23,24. Białka TA biorą udział w wielu istotnych procesach, takich jak apoptoza, transport pęcherzyków i translokacja białek25. Unikalna topologia białek TA wymaga insercji potranslacyjnej, która zachodzi w retikulum endoplazmatycznym (ER) poprzez kierowane wejście szlaków EMC (Tail-anchored of tail-anchored (GET) lub Endoplasmic reticulum Membrane Complex (EMC) lub do OMM przez słabo scharakteryzowaną ścieżkę20,26,27,28. Właściwości biofizyczne TMD są niezbędne i wystarczające, aby skierować białka TA do właściwej błony29. Rozpoznawanie cech biofizycznych, a nie zdefiniowanego motywu sekwencji, ogranicza wierność szlaków docelowych5. Tak więc błędna lokalizacja białek TA jest częstym stresem dla sieci proteostazy. Stres komórkowy, taki jak hamowanie szlaku GET, powoduje wzrost błędnej lokalizacji białek do OMM i dysfunkcję mitochondriów, chyba że białka te zostaną natychmiast usunięte30,31.
Częstym tematem w proteostazie błony jest użycie białek AAA+ (ATPazy Azwiązanej z komórkowymi aktywnościami A) do usuwania starych, uszkodzonych lub błędnie zlokalizowanych białek z dwuwarstwy lipidowej1,32,33,34,35,36,37,38. Białka AAA+ to silniki molekularne, które tworzą pierścienie heksameryczne i podlegają ruchom zależnym od ATP w celu przebudowy substratu, często przez translokację przez wąski por osiowy39,40. Chociaż wiele wysiłku włożono w badanie ekstrakcji białek błonowych przez ATPazy AAA+, rekonstytucje są złożone lub obejmują mieszaninę lipidów i detergentów41,42, co ogranicza moc eksperymentalną do zbadania mechanizmu ekstrakcji substratu z dwuwarstwy lipidowej.
Msp1 to wysoce konserwatywna ATPaza AAA+ zakotwiczona w OMM i peroksysomach, która odgrywa kluczową rolę w proteostazie błony poprzez usuwanie błędnie zlokalizowanych białek TA43,44,45,46,47. Niedawno wykazano również, że Msp1 łagodzi stres związany z importem białek mitochondrialnych poprzez usuwanie białek błonowych, które zatrzymują się podczas translokacji w klasie OMM<sup="xref">48. Utrata Msp1 lub ludzkiego homologu ATAD1 powoduje fragmentację mitochondriów, niepowodzenia w fosforylacji oksydacyjnej, drgawki, zwiększone obrażenia po udarze i przedwczesną śmierć31,49,50,51,52,53,54,55,56.
Pokazaliśmy, że możliwe jest współodtwarzanie białek TA z Msp1 i wykrywanie ekstrakcji z dwuwarstwy lipidowej57. Ten uproszczony system wykorzystuje w pełni oczyszczone białka odtworzone w zdefiniowanych liposomach, które naśladują OMM (<silna klasa="xfig">Rysunek 1)58,59. Ten poziom kontroli eksperymentalnej może rozwiązać szczegółowe problemy mechanistyczne ekstrakcji substratu, które są eksperymentalnie trudne do rozwiązania przy bardziej złożonych rekonstytucjach z udziałem innych białek AAA+. W tym miejscu przedstawiamy protokoły eksperymentalne szczegółowo opisujące nasze metody przygotowania liposomów, rekonstytucji białek błonowych i testu ekstrakcji. Mamy nadzieję, że te szczegóły eksperymentalne ułatwią dalsze badania nad istotnym, ale słabo poznanym procesem proteostazy błonowej.

<table><tbody><tr><td>Biokulki</td><td>Bio-Rad</td><td>1523920</td><td></td></tr><tr><td>Wątroba bydlęca fosfatydyloinozytol</td><td>Avanti</td><td>840042C</td><td>PI</td></tr><tr><td>Jajo kurze fosfatydylocholina</td><td>Avanti</td><td>840051C</td><td>PC</td></tr><tr><td>Jajo kurze fosfatydyloetanoloamina</td><td>Avanti</td><td>840021C</td><td>PE</td></tr><tr><td>ECL Select western blotting detection reagent</td><td>GE</td><td>RPN2235</td><td></td></tr><tr><td>Wsporniki filtrów</td><td>Avanti</td><td>610014</td><td></td></tr><tr><td>Fiolka szklana</td><td>VWR</td><td>60910L-1</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna wirowa z glutationem</td><td>Thermo Fisher</td><td>PI16103</td><td></td></tr><tr><td>Koza anty-królik</td><td>Thermo Fisher</td><td>NC1050917</td><td></td></tr><tr><td>Mini-ekstruder</td><td>Avanti</td><td>610020</td><td></td></tr><tr><td>Membrana poliwęglanowa</td><td>Avanti</td><td>610006</td><td>200 nM</td></tr><tr><td>Membrana PVDF</td><td>Thermo Fisher</td><td>88518</td><td>45 &micro; M</td></tr><tr><td>Rabbit anti-FLAG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7245</td><td></td></tr><tr><td>Syntetyczna 1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfo-L-seryna</td><td>Avanti</td><td>840035C</td><td>DOPS</td></tr><tr><td>Syntetyczna 1',3'-bis[1,2-dioleoilo-sn-glicero-3-fosfo]-glicerol</td><td>Avanti</td><td>710335C</td><td>TOCL</td></tr><tr><td>Strzykawka, 1 ml</td><td>Norm-Ject</td><td>53548-001</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka, 1 mL, gazoszczelna</td><td>Avanti</td><td>610017</td><td></td></tr></tbody></table>

rekonstrukcja aktywności ekstrakcji msp1 z w pełni oczyszczonymi składnikami

Reconstitution of Msp1 Extraction Activity with Fully Purified Components

Jako centrum fosforylacji oksydacyjnej i regulacji apoptozy, mitochondria odgrywają istotną rolę w zdrowiu człowieka. Prawidłowe funkcjonowanie mitochondriów zależy od solidnego systemu kontroli jakości w celu utrzymania homeostazy białek (proteostazy). Spadek proteostazy mitochondriów wiąże się z rakiem, starzeniem się, neurodegeneracją i wieloma innymi chorobami. Msp1 to ATPaza AAA + zakotwiczona w zewnętrznej błonie mitochondrialnej, która utrzymuje proteostazę poprzez usuwanie nieprawidłowo zlokalizowanych białek zakotwiczonych w ogonie. Używając oczyszczonych składników odtworzonych do proteoliposomów, wykazaliśmy, że Msp1 jest niezbędny i wystarczający do ekstrakcji modelowego białka zakotwiczonego w ogonie z dwuwarstwy lipidowej. Nasz uproszczony, odtworzony system pokonuje kilka barier technicznych, które utrudniały szczegółowe badania nad ekstrakcją białek błonowych. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowe metody generowania liposomów, rekonstytucji białek błonowych i testu ekstrakcji Msp1.

Aby poprawnie zinterpretować wyniki, żel bez plam i western blot muszą być oglądane razem. Bezplamny żel zapewnia równomierne obciążenie wszystkich próbek. Podczas przeglądania żelu bez plam, białka opiekuńcze (GST-kalmodulina i GST-SGTA) będą widoczne na pasach INPUT (I) i ELUTE (E). Dokładnie sprawdź, czy intensywność tych pasm jest jednolita we wszystkich próbkach wejściowych. Podobnie, należy upewnić się, że intensywność jest jednolita we wszystkich próbkach ELUTE. ELUTE jest 5x bardziej skoncentrowany niż INPUT i ta...

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół rekonstytucji aktywności ekstrakcji Msp1 z w pełni oczyszczonymi składnikami w zdefiniowanych proteoliposomach.

Rekonstrukcja aktywności ekstrakcji Msp1 z w pełni oczyszczonymi składnikami

As the center for oxidative phosphorylation and apoptotic regulation, mitochondria play a vital role in human health. Proper mitochondrial function ...

Zastosowanie AAA-ATPaz do usuwania białek z dwuwarstwy lipidowej jest częstym tematem w kontroli jakości białek. Mechanistyczne zrozumienie tego istotnego procesu wymaga zrekonstruowanego systemu. Wcześniejsze rekonstytucje za pomocą AAA-ATPaz były złożone i niejednorodne.Nasz system jest prosty i w pełni zdefiniowany. To pozwala nam manipulować AAA-ATPazą Msp1, substratem i środowiskiem lipidowym. Na początek dodaj wcześniej przygotowany bufor do rozpuszczenia, oczyszczone białka Msp1 i TA oraz liposomy w probówce PCR, a następnie inkubuj mieszaninę na lodzie przez 10 minut.Podczas inkubacji przyciąć końcówkę końcówki pipety P200 do średnicy około 1/8 cala. Następnie dokładnie zmieszaj probówkę zawierającą BioBeads, aby uzyskać jednolitą mieszankę. Następnie szybko zdejmij pokrywkę i za pomocą przeciętej końcówki pipety P200 przenieś odpowiednią objętość kulek do pustej probówki PCR.Po zakończeniu 10-minutowej inkubacji w celu rozpuszczenia, za pomocą nieodciętej końcówki pipety, usuń cały płyn z BioBeads. Następnie przenieś 100 mikrolitrów rozpuszczonej substancji do probówki z BioBeads i pozwól jej obracać się na kole przez 16 godzin. Następnego dnia odwiruj probówkę w PicoFuge, aby granulować kulki, a następnie przenieś odtworzony materiał do czystej probówki do PCR i trzymaj probówkę na lodzie.W celu usunięcia białek, które nie uległy rekonstytucji w liposomach, należy zrównoważyć kolumny wirowe glutationu buforem ekstrakcyjnym, co zwykle obejmuje trzy rundy przemywania 400 mikrolitrami buforu, a następnie odwirowanie w celu usunięcia buforu. Następnie dodaj pięć mikromoli każdego białka opiekuńczego do odtworzonego materiału, a następnie 100 mikrolitrów buforu ekstrakcyjnego, zwiększając objętość do 200 mikrolitrów. Dodaj tę mieszaninę do zrównoważonych kolumn wirujących glutationu, a następnie zatkaj kolumny wirujące i obracaj je przez 30 minut, pozwalając opiekuńczym związać się z żywicą.Po obróceniu krótko obróć kolumny. Zebrać przepływ, który jest wstępnie oczyszczonym materiałem pozbawionym zagregowanych białek. Umieść go na lodzie i bezpośrednio przejdź do testu ekstrakcji.Przygotuj probówki do analizy SDS-PAGE. Dodaj 45 mikrolitrów podwójnie destylowanej wody do rurki wejściowej, 40 mikrolitrów wody do rurki przepływowej i 16,6 mikrolitrów bufora ładującego 4X SDS-PAGE do każdej probówki. Do testu ekstrakcji należy przygotować reakcję ekstrakcji i zwiększyć końcową objętość do 200 mikrolitrów za pomocą buforu ekstrakcyjnego.Następnie podgrzej test ekstrakcyjny w bloku grzewczym o temperaturze 30 stopni Celsjusza przez dwie minuty. Aby rozpocząć test, dodaj ATP do końcowego stężenia dwóch milimoli. Obracaj probówkę przez pięć sekund w PicoFuge i inkubuj ją w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 30 minut.Podczas inkubacji należy pobrać pięciomikrolitrową próbkę reakcji i dodać ją do probówki wejściowej. Należy również zrównoważyć jedną kolumnę wirową glutationu dla każdej próbki w teście ekstrakcji, jak wykazano wcześniej. Po zakończeniu 30-minutowej inkubacji dodaj 200 mikrolitrów buforu ekstrakcyjnego do probówki, zwiększając całkowitą objętość do 400 mikrolitrów.Następnie dodaj tę reakcję do zrównoważonej żywicy glutationowej i pozwól jej obracać się przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po obróceniu obróć kolumny, aby zebrać przepływ, a następnie pobierz 10-mikrolitrową próbkę do rurki przepływowej. Przemyć żywicę dwukrotnie 400 mikrolitrami buforu ekstrakcyjnego, odrzucając przepływ po każdym płukaniu.Po trzecim praniu utrzymuj przepływ i pobierz próbkę o pojemności 50 mikrolitrów do rurki myjącej. Następnie przygotuj pięć mililitrów buforu elucyjnego, dodając zredukowany glutation do końcowego stężenia pięciu milimoli w buforze ekstrakcyjnym. Dodać 200 mikrolitrów buforu elucyjnego do kolumny wirowej i inkubować przez pięć minut.Następnie odwirować kolumnę i zebrać przepływ. Powtórz etap elucji jeszcze raz. Po drugiej elucji pobrać 50-mikrolitrową porcję z próbki elucji i dodać ją do probówki elucyjnej.Po uruchomieniu western blot wydajność ekstrakcji można określić, porównując ilość substratu we frakcji eluowanej z frakcją wejściową. Sygnał w przepływie wykazuje pewną zmienność, ale jest na ogół podobny do frakcji wejściowej, a we frakcji płuczącej nie ma sygnału. Zazwyczaj skuteczność ekstrakcji wynosi około 10% w przypadku kontroli dodatniej i od 1 do 2% skuteczności ekstrakcji w przypadku kontroli ujemnej.Gdy warunki rekonstytucji nie są zoptymalizowane, poziomy ekstrakcji są porównywalne między próbkami dodatnimi i ujemnymi. Technika ta pozwoliła naszemu laboratorium przetestować właściwości biofizyczne substratu wpływającego na rozpoznawanie przez Msp1.

reconstitution-msp1-extraction-activity-with-fully-purified

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

W niniejszej pracy opisujemy protokół oczyszczania wysoce aktywnego białka Hsp104, heksamerycznego białka AAA+ z drożdży, które sprzęga hydrolizę ATP z disagregacją białek. Schemat ten wykorzystuje konstrukt z oznakowaniem His6 do oczyszczania powinowactwa z E. coli, a następnie chromatografię wymiany anionowej, usunięcie znacznika His6 za pomocą proteazy TEV oraz chromatografię wykluczania cząsteczkowego.

Oczyszczanie Hsp104, białkowej dysagregazy

Nanodyski to małe dyskoidalne cząstki, które zawierają białka błonowe w małym fragmencie dwuwarstwy fosfolipidowej.  Udostępniamy protokół wizualny, który pokazuje krok po kroku wbudowywanie transportera MalFGK2 w dysk.

Metoda krok po kroku rekonstytucji transportera ABC w cząsteczkach lipidowych Nanodisc

Ten film demonstruje protokół in vitro do badania za pośrednictwem Msp1 usuwania błędnie zlokalizowanych białek TA zintegrowanych z dwuwarstwą lipidową liposomów. Białka Msp1 i TA są odtwarzane w liposomach, a zależna od ATP translokacja białek TA jest potwierdzana poprzez oczyszczanie powinowactwa.

Test ekstrakcji Msp1 w celu zbadania usuwania błędnie zlokalizowanych białek TA

Białko nukleoidowe mitochondrialne drożdży, Mgm101, jest białkiem rekombinacyjnym typu Rad52, które tworzy duże pierścienie oligomeryczne. Opisano protokół przygotowania rozpuszczalnego rekombinowanego Mgm101 przy użyciu strategii znakowania białka wiążącego maltozę (MBP) w połączeniu z chromatografią wymiany kationów i wykluczania wielkości.

Przygotowanie białka rekombinacji Mgm101 za pomocą strategii znakowania opartej na MBP

Opisano metodę skutecznego oczyszczania białek fuzyjnych znakowanych podwójnie Strep-Strep-i ich specyficznych kompleksów na zmodyfikowanej żywicy streptawidyny (Strep-Tactin) kowalencyjnie usieciowanej z suberianem bis(sulfosukcynimidylu) (BS3). Zaletą metody jest duża szybkość, dobry odzysk białka docelowego i wysoka czystość, a także jest kompatybilna z późniejszą analizą za pomocą spektrometrii mas.

Jednoetapowe oczyszczanie białek znakowanych podwójnymi paciorkowcami i ich kompleksów na żywicy Strep-Tactin usieciowanej suberatrynem bis(sulfosukcynimidylu) (BS3)

Wiele białek spełnia swoją funkcję, gdy są przyczepione do powierzchni błony. Wiązanie białek zewnętrznych na błonach nanodysków można pośrednio zobrazować za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Pokazujemy, że charakterystyczne układanie (rouleau) nanodysków indukowane przez fosforungmian sodu o ujemnym barwieniu jest zapobiegane przez wiązanie białka zewnętrznego.

Metoda wizualizacji i analizy białek oddziałujących z błoną za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Udostępniamy protokół do testów samoorganizacji MinD i MinE in vitro na podpartej dwuwarstwie lipidowej w otwartej komorze. Dodatkowo opisujemy, jak zamknąć test w mikrokompartmentach PDMS pokrytych lipidami, aby naśladować warunki in vivo poprzez uwięzienie reakcji.

In vitro Rekonstrukcja samoorganizujących się wzorców białkowych na podpartych dwuwarstwach lipidowych

Kotranslacyjna insercja do wstępnie uformowanych nanodysków umożliwia badanie bezkomórkowych syntetyzowanych białek błonowych w określonych środowiskach lipidowych bez kontaktu z detergentami. Protokół ten opisuje przygotowanie podstawowych komponentów systemu oraz parametry krytyczne dla poprawy wydajności odciągania i jakości próbki.

Kotranslacyjna insercja białek błonowych do wstępnie uformowanych nanodysków

Ten protokół szczegółowo opisuje wzbogacanie natywnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych prątków (mEV) z aksonicznych kultur Mycobacterium smegmatis (Msm) oraz jak można projektować i wzbogacać rekombinowane MsmEV zawierające mCherry (czerwony fluorescencyjny reporter). Na koniec zweryfikowano nowatorskie podejście polegające na wzbogaceniu MsmEV zawierających białko EsxA Mycobacterium tuberculosis.

Wzbogacanie natywnych i rekombinowanych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych prątków

W artykule opisano metodologię nadekspresji rekombinowanej Nsp15, toksycznej nukleazy, w systemie ekspresji C41(DE3), a następnie oczyszczania znakowanego białka za pomocą chromatografii wykluczania powinowactwa i wielkości. Protokoły te można dostosować do innych trudnych toksycznych białek.

Nadekspresja i oczyszczanie toksycznej nukleazy z Escherichia coli

Niniejsze badanie opisuje procedurę rekonstrukcji błonowego białka TWIK, kanału K+ wrażliwego na kwasy 2 (Zadanie 2) w nanodyski. Pomyślny montaż potwierdzono za pomocą mikroskopii krio-elektronowej z pojedynczą cząstką, która dała dobrze określone dwuwymiarowe średnie klasowe.

Technika stabilizacji białek błonowych w nanodyskach

Poznaj protokół rekonstrukcji aktywności ekstrakcji Msp1 z w pełni oczyszczonymi składnikami w zdefiniowanych proteoliposomach. Ta metoda upraszcza badanie AAA-ATPaz w kontroli jakości białek.

Rekonstrukcja aktywności ekstrakcji Msp1 z w pełni oczyszczonymi składnikami

Przeglądaj więcej filmów