Selektywne czyszczenie dzikich nicieni Caenorhabditis w celu wzbogacenia o bakterie mikrobiomu jelitowego

Metoda ta została opracowana w celu ułatwienia wzbogacenia i identyfikacji nowego interesującego mikroorganizmu występującego w dzikich nicieniach Caenorhabditis, co umożliwi dalsze badania interakcji między mikroorganizmami gospodarza. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona naukowcom wzbogacenie o patogeny i bakterie mikrobiomu, które nie są hodowlane, bezpośrednio w jelicie dzikich nicieni. Zacznij od uzyskania dzikiego szczepu nicieni Caenorhabditis z nienadającym się do hodowli mikrobem i hodowania robaków na standardowym pożywce do wzrostu nicieni lub płytkach NGM zawierających OP51 Escherichia coli jako źródło pożywienia.

Inkubuj nicienie przez cztery do pięciu dni w temperaturze 20 stopni Celsjusza, aż wszystkie Escherichia coli OP51 zostaną zużyte, a większość robaków osiągnie stadium Dauera. Aby umyć nicienie na etapie Dauera, dodaj pięć mililitrów pożywki z minimalnymi solami M9 do sześciocentymetrowej płytki z wygłodzonymi robakami i użyj sterylnej szklanej pipety i bańki, aby odpipetować pożywkę M9 i robaki z płytki i przenieś je do sterylnej 15-mililitrowej probówki wirówkowej. Odwiruj robaki w temperaturze 1 000 razy G przez 30 sekund w temperaturze pokojowej, a następnie usuń i wyrzuć supernatant M9 nad osadem robaków za pomocą sterylnej pipety o pojemności 15 mililitrów, nie naruszając żywych robaków, pozostawiając około 50 mikrolitrów M9 nad robakami.

Do tej samej probówki wirówkowej dodaj 10 mililitrów pożywki M9 zawierającej 0,05% Triton X-100 i odpowiednio dokręć nakrętkę probówki przed umieszczeniem probówki na nutatorze w temperaturze pokojowej w celu usunięcia zewnętrznych drobnoustrojów. Po 20 minutach inkubacji na nutatorze, odwirować robaki w temperaturze 1000 razy G przez 30 sekund w temperaturze pokojowej, a następnie usunąć i wyrzucić supernatant M9, jak pokazano, i powtórzyć procedurę mycia trzy razy z pożywką M9 zawierającą 0,05% Triton X-100. Następnie inkubuj probówkę zawierającą nicienie przez noc na nutatorze w temperaturze pokojowej, dodając świeżo przygotowany roztwór antybiotyku i SDS.

Po podaniu antybiotyku należy odwirowywać robaki w probówce w ilości 1000 razy G przez jedną minutę w temperaturze pokojowej. Usuń supernatant przed dodaniem 10 mililitrów M9 zawierającego 0,05% Triton X-100 i odpowiednio dokręć nakrętkę, aby inkubować probówkę na nutatorze przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu obracaj robaki z prędkością 1 000 razy G przez jedną minutę i powtórz tę procedurę trzy razy.

Po czwartym przemyciu M9 zawierającym 0,05% Triton X-100, pozostaw osad robaka w spokoju w 100 mikrolitrach roztworu, a resztę wyrzuć. Przenieś 100 mikrolitrów supernatantu i osadu na środek 10-centymetrowej płytki NGM wysianej OP51 Escherichia coli. Pozostaw płytkę do wyschnięcia bez zakłóceń, podczas gdy Dauers wypełzają ze środka i przechodzą przez trawnik OP51 przez 5 do 10 minut.

Ostrożnie podnieś jeden pojedynczy Dauer i umieść go na sześciocentymetrowej płytce NGM wysianej OP51. W ten sam sposób należy umieścić co najmniej 10 Dauerów na pojedynczych sześciocentymetrowych płytkach NGM wysianych OP51. Inkubuj płytki przez cztery do pięciu dni w temperaturze 20 stopni Celsjusza, aż Dauery wyrosną, a następne pokolenie F1 osiągnie stadium dorosłe, a następnie sprawdź wzrokowo, czy na wszystkich płytkach nie ma zanieczyszczeń.

Dla każdej czystej płytki sprawdź propagację interesującego drobnoustroju za pomocą mikroskopii Nomarskiego lub fluorescencyjnej, w zależności od fenotypu będącego przedmiotem zainteresowania. Aby zagłodzić robaki i zmniejszyć liczbę bakterii OP51, wysiaduj nicienie w temperaturze 20 stopni Celsjusza przez trzy do czterech dni. Dodaj pięć mililitrów pożywki M9 do płytki z niedawno zagłodzonymi robakami, a następnie przenieś pożywkę M9 i robaki do sterylnej 15-milimetrowej probówki wirówkowej, aby wirować z prędkością 1000 razy G przez 30 sekund w temperaturze pokojowej.

Usuń sklarowany osad przed pięciokrotnym umyciem robaków 10 mililitrami M9 zawierającego 0,05% Triton X-100 na nutatorze przez 20 minut. Po ostatnim przemyciu usunąć supernatant bez naruszania osadu w 100 mikrolitrach roztworu i przenieść M9 i robaki na niezasiewaną sześciocentymetrową płytkę NGM. Pozostaw płytkę do wyschnięcia, podczas gdy robaki pełzają przez 20 minut, aby pomóc usunąć OP51 z naskórka i jelita.

Gdy płytka wyschnie, powtórz procedurę, dodając 250 mikrolitrów M9 i przenosząc robaki na nową, nieobsianą sześciocentymetrową płytkę NGM, aby umożliwić robakom czołganie się, gdy płytka wysycha. Po 20 minutach dodaj 250 mikrolitrów M9 do płytki i przenieś 100 mikrolitrów M9 wraz z robakami do czystego szkła zegarkowego, a następnie odetnij nicienie za pomocą igły strzykawkowej o rozmiarze 26, przytrzymując robaka kolejną igłą strzykawkową o rozmiarze 26. Po ścięciu głowy jelito, ziarnista masa i przezroczysta gonada w naturalny sposób odwrócą się od ciała nicienia, a następnie odetną kawałek odsłoniętego jelita i przeniosą pojedyncze wypreparowane jelito do 0,5 mililitrowej probówki PCR zawierającej 10 mikrolitrów sterylnej wody.

Powtórz procedurę, aby pobrać jelita od co najmniej pięciu różnych zwierząt w probówkach PCR. Zamrozić probówki PCR w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza na co najmniej pięć minut. Rozmrozić próbki jelit przed przystąpieniem do PCR i sekwencjonowania w celu identyfikacji.

Stwierdzono, że dziki szczep Caenorhabditis tropicalis JU1848 zawiera cienkie drobnoustroje, które kolonizują światło jelita w sposób kierunkowy. Dziki szczep JU1848 rozmnożył zauważalny wzrost drobnoustrojów na standardowych sześciocentymetrowych płytkach NGM obsianych bakteriami Escherichia coli OP51. Po oczyszczeniu płytka z potomstwem F1 z jednego Dauera nie wykazała widocznego zanieczyszczenia mikrobiologicznego po czterech dniach inkubacji.

Na obrazie Nomarskiego przedstawiającym odcięte głowy zwierzę JU1848 bakterie kolonizujące były widoczne w świetle fragmentu jelita, który znajduje się poza ciałem nicienia. Niektóre gatunki Caenorhabditis mogą wymagać niższego stężenia SDS, aby zapobiec śmierci Dauera. Aby rozmnażać czysty szczep nicieni, wybierz Dauers, który czołgał się najdalej od środka, ponieważ pełzanie pomaga usunąć ocalałe zanieczyszczenia.