Mikroprzepływowe wytwarzanie mikrokapsułek typu core-shell zawierających sferoidy ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Obszar ten jest uważany za interesujący kulturami 3D ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych ze względu na poprawę pluripotencji i potencjału różnicowania, które ta hodowla utworzyła. Opisaliśmy naszą strategię enkapsulacji, która prowadzi do powtarzalnego tworzenia sferoid ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych. Po zamknięciu te sferoidy komórek macierzystych są podatne na hodowlę, zarówno na płytkach wielodołkowych, jak i w bioreaktorach z mieszadłem.

Nasza strategia enkapsulacji polega na optymalizacji przeżywalności zarazy i wysokiej efektywności tworzenia sferoidów. Zamknięte sferoidy są chronione przed ścinaniem lub energią mechaniczną związaną z mieszaniem lub kołysaniem. Rozwój komórek macierzystych pochodzących z terapii komórkowej zależy częściowo od zdolności do wytworzenia pożądanego produktu komórkowego w sposób skalowalny, wydajny i opłacalny.

Opisana tutaj technologia enkapsulacji stanowi krok w tym kierunku. Opisana tutaj technologia enkapsulacji będzie prawdopodobnie miała zastosowanie do hodowli 3D różnych typów komórek z innych komórek do innych pluripotencjalnych komórek macierzystych. Zacznij od przygotowania 30 mililitrów dwukrotnego roztworu podstawowego rdzenia, mieszając 4,8 grama 35 kilodaltonu PEG, 10,2 mililitra pożywki gradientowej gęstości i 19,8 mililitra pożywki DMEM / F-12.

Następnie przefiltruj ten roztwór rdzeniowy za pomocą filtra strzykawkowego o średnicy 0,22 mikrometra. Następnie przygotuj 50 mililitrów oleju mineralnego z 3-procentowym środkiem powierzchniowo czynnym, mieszając 48,5 mililitra oleju mineralnego i 1,5 mililitra środka powierzchniowo czynnego. Następnie wysterylizuj roztwór, przepuszczając go przez filtr strzykawkowy o średnicy 0,22 mikrometra.

Następnie przygotuj 1 molowy DTT, 1 molowy roztwór herbaty i 1 procent PF127, zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstowym. Następnie przygotuj emulsję sieciującą, mieszając 4,5 mililitra oleju mineralnego z 3-procentowym środkiem powierzchniowo czynnym i 300 mikrolitrami 1 molowego DTT. Po wirowaniu roztworu przez dwie minuty, sonikować przez 45 do 60 minut w łaźni ultradźwiękowej w temperaturze 20 stopni Celsjusza i załadować go do 5-mililitrowej strzykawki z igłą o rozmiarze 27.

Następnie przygotuj roztwór oleju osłonowego, ładując olej mineralny z 0,5% środkiem powierzchniowo czynnym do 5-mililitrowej strzykawki z igłą o rozmiarze 27. Aby przygotować roztwór otoczki, dodaj 32 miligramy maleimidu PEG4 w 400 mikrolitrach DPBS. Następnie dodaj 6 mikrolitrów 1 molowej herbaty.

Wiruj roztwór przez 2 minuty i odwiruj go przez filtr wirowy. Trzymaj roztwór w ciemności na wahaczu przez 30 minut przed załadowaniem do 1-mililitrowej strzykawki z igłą o rozmiarze 27. Na koniec przygotuj ostateczne rozwiązanie rdzeniowe, ponownie zawieszając 20 milionów hPSC w pożywce o pojemności 200 mikrolitrów i mieszając z 30 mikrolitrami 1% PF127 i 200 mikrolitrami roztworu rdzeniowego 2X.

Włóż małe mieszadło do strzykawki o pojemności 1 mililitra. Następnie załadować komórkę zawierającą roztwór rdzenia do strzykawki za pomocą igły o rozmiarze 27. Zacznij od umieszczenia klejonego urządzenia kropelkowego PDMS, 4 sztuk o długości 20 centymetrów i 1 sztuki mikrorurek wlotowych o długości 5 centymetrów, 1 sztuki 10-centymetrowej rurki wylotowej i 6 sztuk 0,5-centymetrowych rurek mocujących pod bakteriobójczym źródłem światła na 30 minut w celu sterylizacji.

Teraz włóż 4 kawałki mikroprobówek wlotowych o długości 20 centymetrów do powłoki, oleju, emulsji sieciującej i wlotów urządzenia dysocjacyjnego za pomocą kleszczy. Następnie włożyć przeciwległy koniec probówek do igły strzykawki z odpowiednim roztworem. W międzyczasie połącz wlot rdzenia urządzeń mikroprzepływowych i wylot urządzeń dysocjacyjnych za pomocą mikrorurki o średnicy 5 centymetrów.

Włóż 1 rurkę wylotową do portu wylotowego płynu i umieść przeciwległy koniec w zbiorniku zbiorczym. Następnie umieść urządzenie na stoliku mikroskopu i przymocuj rurkę, aby uniknąć jakichkolwiek ruchów. Ustaw mikroskop i ustaw ostrość na dyszy urządzenia w celu kontroli przepływu.

Umieścić każdą strzykawkę na różnych pompach strzykawkowych i odpowiednio zabezpieczyć. Zaprogramuj każdą pompę zgodnie z protokołami producenta do natężeń przepływu wymienionych w manuskrypcie tekstowym i uruchom przepływ we wszystkich pompach. Poczekaj, aż każdy płyn dostanie się do urządzenia i wypełnij kanały, jednocześnie wypychając pozostałe powietrze.

Gdy tworzenie się kapsułki zostanie ustabilizowane, umieść przeciwległy koniec probówki zbiorczej w nowej stożkowej probówce zawierającej 5 mililitrów pożywki mTeSR. Po zebraniu wystarczającej ilości kapsułek inkubuj je przez 10 minut. Kapsułki znajdujące się w fazie olejowej będą znajdować się w górnej części tuby, która osiada na dnie po delikatnym stuknięciu w rurkę.

Aby odzyskać kapsułki, należy rozpocząć od usunięcia oleju z probówki zbiorczej. Następnie umieść kapsułki na sitku o porach o wielkości 100 mikrometrów i umyj sitko dużą ilością pożywki. Odwróć filtr na górze studzienki 6-dołkowej płytki hodowlanej i zbierz mikrokapsułki, przepuszczając 2 mililitry pożywki przez filtr.

Inkubuj kapsułki z komórkami macierzystymi w 6-dołkowym naczyniu hodowlanym w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Zmieniaj pożywkę co drugi dzień, zbierając kapsułki na filtrze siatkowym, myjąc je nadmiarem pożywki i ponownie zawieszając w nowej studzience na 6-dołkowych płytkach z 2 mililitrowymi pożywkami. Przeprowadzić test żywotności, dodając 4 mikrolitry 2 mikromolowych homodimerów etydyny-1 i 1 mikrolitr 4 mikromolowych roztworów Calcein-AM do 2 mililitrów sterylnego DPBS.

Wiruj, aby zapewnić całkowite wymieszanie. Zebrać około 100 mikrokapsułek na sitku do komórek i przepłukać je sterylnym DPBS, aby umożliwić dyfuzję medium z kapsułek. Zebrać je ponownie na 12-dołkowej płytce hodowlanej, używając 1 mililitra przygotowanego roztworu zawierającego Ethidium Homodimer-1 i kalceinę AM i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 minut.

Wizualizuj komórki pod mikroskopem fluorescencyjnym. Optymalne i nieoptymalne mikrokapsułki wytworzone przy użyciu mikroprzepływowego generowania kropelek wykazały różnice w morfologii kapsułki w funkcji zawartości PEG4-maleimidu w otoczce. Gładkie kapsułki z jasnymi krawędziami kojarzą się z pożądaną integralnością mechaniczną.

Agregacja kulek w środku kapsułek wskazuje, że rdzeń był wodny, a kulki mogły się swobodnie poruszać. Fluorescencyjny pierścień wskazywał na obecność powłoki hydrożelowej i służył do określenia grubości powłoki. Żywe lub martwe barwienie 6 godzin po enkapsulacji komórek H9 wykazało, że komórki osiągnęły ponad 95 procent żywotności rutynowo podczas przebiegów enkapsulacji.

Po porównaniu tempa wzrostu i potencjału różnicowania sferoid kapsułkowanych i niekapsułkowanych. Stwierdzono, że proces enkapsulacji nie ma negatywnego wpływu na hPSC. Należy pamiętać, że ważne jest, aby ustalić optymalny stosunek natężenia przepływu między powłoką rdzenia a strumieniami oleju.

Niezastosowanie się do tego może spowodować, że kapsułki nie będą wytrzymałe mechanicznie i mogą pęknąć podczas przenoszenia. Chcielibyśmy zwrócić uwagę, że ta technika enkapsulacji dotyczyła typów komórek innych niż ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste. Zamknęliśmy kapsułki, głównie hipotetyczne, linie komórek nowotworowych i mezenchymalne komórki macierzyste przy użyciu podobnej strategii.

Obecnie nasz zespół opracowuje nową generację mikroprzechwytywaczy. Te mikrowychwyty są bioaktywne i mogą być obciążone czynnikami krzyżowymi do enkapsulowanego różnicowania komórek macierzystych.