Ciągły test metylacji DNA sprzężony z endonukleazą oparty na fluorescencji w celu wykrycia inhibitorów metylotransferazy DNA
August 5th, 2022
Metylotransferazy DNA są potencjalnymi celami leków przeciwnowotworowych. W tym miejscu przedstawiono protokół oceny małych cząsteczek pod kątem hamowania metylotransferazy DNA. Test ten wykorzystuje endonukleazę do sprzężenia metylacji DNA z generowaniem fluorescencji i pozwala na monitorowanie aktywności enzymu w czasie rzeczywistym.
Solidny test czytnika płytek, taki jak nasz, jest bardzo przydatny do wstępnych badań przesiewowych potencjalnych inhibitorów metylotransferazy. Możliwość zbierania danych w czasie rzeczywistym jest dużą zaletą ciągłego testu sprzężonego z endonukleazą. Zacznij od przygotowania 600 mikrolitrów warunków testowych zawierających 20 związków mikromolowych i 50 mikromolowych oddzielnie w probówkach do mikrowirówek na lodzie.
Aby to zrobić, dodaj podwójnie destylowaną wodę i 5X bufor metylacyjny do każdej probówki, aby uzyskać końcowe stężenie 1X buforu metylacyjnego. Następnie dodaj 3,15 mikrolitra po 20 miligramów na mililitr białka surowicy bydlęcej lub BSA do każdej próbki. Następnie dodaj dwa mikrolitry 3,15 mikromolowego substratu DNA spinki do włosów i 1,33 mikrolitra 4,75 mikromolowej S-adenozylometioniny lub SAM do każdej próbki.
Dodać inhibitor do odpowiednich próbek, aby osiągnąć końcowe stężenie 21 mikromoli lub 52,5 mikromola i równoważną ilość sultlenku dimetylu lub DMSO do próbki kontrolnej przed zmieszaniem roztworów przez wirowanie z prędkością 3 000 obrotów na minutę przez trzy sekundy. Następnie obracaj próbki przez kilka sekund w mini wirówce stołowej z prędkością 1 200 razy G, aby upewnić się, że roztwór został zebrany na dnie probówki. Porcję 95 mikrolitrów każdego roztworu testowego do sześciu kolejnych dołków w czarnej płytce 96-dołkowej o połowie powierzchni.
Przygotować 75 mikrolitrów roztworu enzymatycznego Gla I lub DNMT1 plus Gla I w probówkach do mikrowirówek, jak opisano powyżej, do końcowego stężenia jednorazowego buforu. Następnie dodaj 1,2 mikrolitra po 10 jednostek na mikrolitr Gla I do każdego roztworu, aby uzyskać końcowe stężenie 0,16 jednostki na mikrolitr. Dodaj 0,6 mikrolitra pięciu mikromolowych DNMT1 bez RFTS do roztworu DNMT1 plus Gla I, aby uzyskać końcowe stężenie 40 nanomolowców.
Po delikatnym wymieszaniu należy wirować próbki przez kilka sekund w mini wirówce stołowej o sile 1,200 g, aby upewnić się, że roztwór został zebrany na dnie probówki. Następnie podwielokrotność 12 mikrolitrów każdego roztworu enzymatycznego do sześciu dołków w 96-dołkowej płytce ze stożkowym dnem. Do testu metylacji próbki DNA podgrzej wstępnie czytnik płytek do 37 stopni Celsjusza.
Następnie włożyć czarną płytkę zawierającą roztwory testowe do czytnika płytek. Po potrząśnięciu płytką z prędkością 425 CPM zmierz fluorescencję o długości fali wzbudzenia 485 nanometrów i długości fali emisyjnej 528 nanometrów. Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut.
Wyjąć płytkę testową z czytnika płytek i dodać pięć mikrolitrów roztworu enzymu do każdej studzienki, a następnie wymieszać roztwór przez pipetowanie w górę iw dół. Włóż płytkę do czytnika płytek i potrząśnij płytką przed rejestracją fluorescencji co 53 sekundy przez 30 minut. Uzyskać średnią fluorescencję potrójnych testów kontrolnych Gla I dla każdego warunku i odjąć średnią tacek kontrolnych zawierających Gla I od potrójnych śladów otrzymanych w obecności DNMT1 bez RFTS.
Następnie należy wyznaczyć średnią i błąd standardowy średniej dla skorygowanych kontrprób. Wykreślić średnią skorygowaną ścieżkę reakcji i dopasować początkową część liniową do linii, aby określić prędkość początkową. Określ procentową aktywność, dzieląc prędkość obserwowaną w obecności związku przez prędkość obserwowaną w DMSO zawierającym reakcję kontrolną i mnożąc przez 100.
Wyniki nieciągłego testu sprzężonego z endonukleazą wykazały, że w pełni zmetylowany DNA produktu jest chroniony przed rozszczepieniem, co potwierdza, że DNMT1 pozbawiony RFTS jest aktywny i zdolny do metylacji hemimetylowanego substratu DNA. W teście opartym na fluorescencji, przy braku Gla I, dodanie samego DNMT1 lub buforu nie wpłynęło na fluorescencję tła. Późniejsze dodanie Gla I do wszystkich testów spowodowało wytworzenie fluorescencji tylko w testach zawierających DNMT1.
Równoczesne dodanie DNMT1 i Gla I bez RFTS do trzech testów zaowocowało solidnym wytwarzaniem fluorescencji. Sam dodatek Gla I nie powodował fluorescencji. W celu przeprowadzenia badań przesiewowych pod kątem potencjalnych inhibitorów, aktywność metylacji DNA DNMT1 pozbawionego RFTS badano w obecności DMSO, związku pierwszego, związku drugiego lub związku trzeciego w stężeniach 20 i 50 mikromolowych.
Związki, które zmniejszają wytwarzanie fluorescencji w tym sprzężonym teście, muszą być dalej walidowane. Upewnienie się, że związki nie hamują enzymu sprzęgającego, jest kolejnym ważnym krokiem.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł przedstawia protokół oceny małych cząsteczek jako potencjalnych inhibitorów DNA metylotransferaz, które są ważnymi celami w terapii raka. Test wykorzystuje endonuklearzę do łączenia metylacji DNA z fluorescencyjnością, umożliwiając monitorowanie aktywności enzymu w czasie rzeczywistym.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Biochemia
- Badania nad rakiem
Tło
- DNA metylotransferazy odgrywają krytyczną rolę w regulacji genów i raku.
- Inhibicja tych enzymów mogłaby przynieść korzyści terapeutyczne w leczeniu raka.
- Testy w czasie rzeczywistym poprawiają proces przesiewowego badania potencjalnych inhibitorów.
- Metody oparte na fluorescencji pozwalają na wrażliwe wykrywanie aktywności enzymu.
Cel badania
- Opracowanie solidnego testu do przesiewowego badania inhibitorów DNA metylotransferaz.
- Wykorzystanie zbierania danych w czasie rzeczywistym dla poprawy wydajności testu.
- Ułatwienie identyfikacji małych cząsteczek, które mogą inhibować aktywność DNA metylotransferaz.
Stosowane metody
- Przygotowanie warunków testu z określonymi stężeniami związków.
- Zastosowanie albuminy surowicy wołowej (BSA) w konfiguracji testu.
- Włączenie substratu DNA w kształcie sierpa i S-adenozylometioniny (SAM).
- Monitorowanie aktywności enzymu poprzez generowanie fluorescencji.
Główne wyniki
- Test umożliwia ciągłe monitorowanie aktywności DNA metylotransferaz.
- Zbieranie danych w czasie rzeczywistym zapewnia znaczną przewagę nad tradycyjnymi metodami.
- Wstępne badanie związków wykazuje obiecujące wyniki w identyfikacji potencjalnych inhibitorów.
- Metoda jest przystosowana do różnych bibliotek małych cząsteczek.
Wnioski
- Opracowane badanie jest skuteczne w przesiewowym badaniu inhibitorów DNA metylotransferaz.
- Monitorowanie w czasie rzeczywistym poprawia niezawodność wyników.
- To podejście może przyspieszyć odkrywanie nowych terapii przeciwnowotworowych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This continuous fluorescence-based endonuclease-coupled assay enables real-time monitoring of DNA methyltransferase activity, supporting early-stage screening of small molecule inhibitors. By providing quantitative initial velocity measurements in a microtiter plate format, the method reduces reagent consumption and increases throughput for target validation campaigns. The assay’s ability to detect concentration-dependent inhibition aids in prioritizing compounds with mechanistic relevance to epigenetic dysregulation in cancer.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of DNMT1 inhibition kinetics to validate epigenetic targets in oncology pipelines.
- Operational Value: Supports rapid assessment of small molecule effects on enzyme activity using fluorescence readouts in a plate-based format.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates real-time, continuous data to distinguish true inhibitors from assay artifacts in primary screens.
- Operational Value: Compatible with standard plate readers and microtiter plates, enabling scalable screening of compound libraries.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links biochemical inhibition of DNMT1 to downstream epigenetic effects, supporting mechanistic de-risking of lead candidates.
- Operational Value: Provides a reproducible platform for hit-to-lead progression where target engagement is a key decision criterion.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the early discovery workflow, positioning after target confirmation and before lead optimization, where biochemical validation of target modulation is essential.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing of DNMT1 inhibition as a mechanism for altering DNA methylation patterns in disease models.
- Screening: Enables primary screening of compound libraries with real-time kinetic readouts to identify active molecules.
- Analytics: Delivers initial velocity and percent activity outputs that allow quantitative comparison of inhibitor potency across conditions.
- Translational Research: Supports continuity from enzymatic inhibition to cellular epigenetic outcomes when paired with downstream validation assays.
- Enterprise Reuse: Can be adapted for screening other DNMT isoforms or methyltransferase targets using the same endonuclease-coupled fluorescence principle.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target modulation by providing direct, real-time measurement of enzyme activity changes.
- Operational Value: Reduces reagent use and assay time through miniaturized, continuous monitoring in a 96-well format.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by distinguishing specific DNMT1 inhibitors from non-specific fluorescence interferents early in screening.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds demonstrating concentration-dependent, mechanism-consistent inhibition.
Implementation Considerations
- Requires expertise in enzymology and fluorescence-based assay design to interpret kinetic traces and control for background signals.
- Dependent on access to a plate reader capable of temperature control and timed fluorescence excitation at 485 nm and emission at 528 nm.
- Necessitates standardization of reagent preparation, including hemimethylated DNA substrate, SAM, BSA, and Gla I endonuclease, to ensure assay reproducibility.
- Requires validation that test compounds do not inhibit the coupling enzyme Gla I or interfere with fluorescence independently.
- Limited to methyltransferase activity assessment and does not directly report on cellular permeability, metabolic stability, or off-target effects.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:24
Prepare Assay Solutions for the Screen
1:48
Prepare Enzyme Solutions for the Screen
2:52
Run the Methylation Assay and Analyze the Data
4:29
Results: Determination of Initial Velocities of DNA Methylation in the Presence and Absence of Potential Inhibitors
5:40
Conclusion
