Name: Zwiększanie zawartości guza poprzez makrodysekcję guza (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: Poznaj metodę makrodysekcji guza w próbkach FFPE, aby zwiększyć zawartość tkanki nowotworowej i poprawić dokładność analiz genomowych. Technika ta izoluje materiał nowotworowy, eliminując zanieczyszczenia z tkanek niebędących nowotworami.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca jest wspierana przez NIH finansowany przez NIH AIDS and Cancer Specimen Resource (<a href="https://www.acsr1.com/">ACSR</a>, UM1 CA181255-2) w ramach programu badań nad próbkami biologicznymi. Film został nakręcony, a montaż postprodukcyjny został wykonany przez Mayo Clinic Media Services.

Wszystkie próbki zostały pobrane i użyte zgodnie z zatwierdzonymi protokołami IRB Mayo Clinic (PR16-000507 i PR2207-02).
1. Przygotowanie próbki
<ol>
	<li>Włącz kąpiel wodną z unoszeniem się tkanek. Ustaw temperaturę na 39 °C i pozwól, aby woda osiągnęła odpowiednią temperaturę. Namocz drewniane patyczki do zbierania w kąpieli wodnej.</li>
	<li>Zidentyfikuj i odzyskaj bloki tkanek FFPE, które mają zostać poddane sekcji.</li>
	<li>Wstępnie oznacz szkiełka mikroskopowe za pomocą markera permanentnego klasy histologicznej, który jest odporny na mycie rozpuszczalnikiem.</li>
	<li>Użyj mikrotomu, aby pokroić bloki FFPE. Wytnij co najmniej 2 sekcje pełnopowierzchniowe o grubości 4-5 μm na sekcję dla każdego bloku (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A).</li>
	<li>Przenieś świeżo przeciętą wstęgę skrawków tkanki do wstępnie podgrzanej kąpieli flotacyjnej tkanek w celu zamontowania na szkiełku (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B, C). 
	UWAGA: Ciepła woda pomaga "wyprasować" zmarszczki na odcinkach (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C).</li>
	<li>Obsługując każdą sekcję sekwencyjnie, użyj kleszczyków, aby oderwać pojedynczą sekcję od wstążki (Rysunek 1D).</li>
	<li>Zbierz pojedynczą sekcję na wstępnie oznaczonym szkiełku mikroskopowym.
	<ol>
		<li>Zanurz szkiełko mikroskopowe pod kątem pod sekcją, ustawiając szkiełko tak, aby krawędź przekroju tkanki dotykała szkiełka (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1E).</li>
		<li>Po zetknięciu się z sekcją tkanki powoli wyciągnij szkiełko z kąpieli flotacyjnej, aby umożliwić wyprostowanie się części tkanki równo ze szkiełkiem, gdy wynurza się z wody (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1F).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zamontuj 1 fragment tkanki na szkiełku i powtarzaj, aż wszystkie skrawki zostaną zebrane.</li>
	<li>Pozwól mocowanym na szkiełku skrawkom chusteczki dokładnie wyschnąć w temperaturze pokojowej (RT).</li>
</ol>
2. Przegląd patologiczny
<ol>
	<li>Wykonaj barwienie H&E na jednym reprezentatywnym fragmencie tkanki dla każdego bloku9.</li>
	<li>Prześlij świeżo zabarwione H&E do oceny patologicznej przez certyfikowanego patologa. 
	UWAGA: Podczas przeglądu patolog określa i rejestruje procentową zawartość guza w każdej tkance i zakreśla obszar guza na każdym szkiełku H&E (patrz <silna klasa = "xfig" >Rysunek 2 i <silna klasa = "xfig" >Rysunek 3, wiersz 1). Tabela 1 przedstawia procentową zawartość guza według komórkowości określoną podczas przeglądu patologicznego H&E dla próbek A-E pokazanych w <silna klasa = "xfig" >Rysunek 3, wiersz 1. Sekcje z zawartością guza <60% wymagają makro-dyssekcji7. Liczba odcinków potrzebnych do ekstrakcji kwasu nukleinowego zależy od wielkości zakreślonego obszaru guza. Jeśli w sekcji 1 protokołu wycięto niewystarczającą ilość odcinków i możliwe są dalsze cięcia, może być konieczne wycięcie dodatkowych sekcji.</li>
</ol>
3. Deparafinizacja
<ol>
	<li>W dygestorii napełnij dwa szklane naczynia do barwienia nierozcieńczonym d-limonenem klasy histologicznej lub rozpuszczalnikiem na bazie d-limonenu i 1 szklane naczynie do barwienia nierozcieńczonym 200-procentowym etanolem molekularnym. 
	UWAGA: Unikać kontaktu d-limonenu ze skórą i oczami, unikać wdychania oparów lub mgły oraz trzymać z dala od źródeł zapłonu. Przechowywać etanol z dala od źródeł ciepła, iskier i otwartego ognia, unikać rozlewania i kontaktu ze skórą lub oczami, dobrze wentylować i unikać wdychania oparów. 
	UWAGA: Napełnij naczynia na tyle, aby zanurzyć szkiełka z kolumnami (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 4A); Do napełnienia pokazanych 20-szkiełkowych naczyń do barwienia potrzeba 250 ml. Wymieniaj płyny do płukania d-limonenem i etanolem po każdych 40 szkiełkach. D-limonen (C10H16) jest alternatywnym, podobnie skutecznym i mniej toksycznym środkiem odparafinującym ksylen, który staje się coraz bardziej powszechny w metodologiach histologicznych i daje dobrej jakości kwas nukleinowy po ekstrakcji10,11,12,13,14. Chociaż protokół ten może być wykonywany przy użyciu bardziej przyjaznych dla biotechnologii alternatyw15, ich wpływ, jeśli w ogóle, na jakość ekstrahowanych kwasów nukleinowych pozostaje do ustalenia.</li>
	<li>Umieść niebarwione szkiełka z bibułą FFPE w szklanych stojakach na prowadnice Coplin (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 4A, wstawka).</li>
	<li>Zanurzyć szkiełka w kratkach w myciu d-limonenem 1 na 2 minuty; delikatnie mieszać przez pierwsze 20 s. 
	UWAGA: Aby zminimalizować przenoszenie między praniami, podczas wyjmowania stojaka na szkiełka z prania poczekaj, aż ruszt na chwilę spunie, a następnie delikatnie przetrzyj spód rusztu bibułą, aby usunąć nadmiar prania.</li>
	<li>Zanurz szkiełka podstawowe w nierozcieńczonym roztworze D-limonenu 2 na 2 minuty; delikatnie mieszaj przez pierwsze 20 sekund. Wyjmij, osusz i ponownie przetrzyj ruszt.</li>
	<li>Zanurz szkiełka w stojaku w roztworze do płukania etanolem na 2 minuty; delikatnie mieszaj przez pierwsze 20 sekund. Wyjmij stojak i umieść go na chłonnej chusteczce, aby odsączyć. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na powietrzu przez co najmniej 10 minut, ale nie dłużej niż 2 godziny.</li>
</ol>
3. Makrodysekcja
<ol>
	<li>Na stole napełnij słoik ze szkła Coplin 50 ml 3% glicerolu w wodzie wolnej od DNaz/RNaz 
	UWAGA: Płyn do płukania glicerolem należy wymieniać co 40 szkiełek.</li>
	<li>Wstępnie oznaczyć i napełnić mikroprobówki o pojemności 1,5 ml 160 μl buforu do trawienia tkankowego na mikroprobówkę. 
	UWAGA: Ekstrakcje kwasów nukleinowych wykonywane po makrodysekcji wykorzystywały zestaw do ekstrakcji DNA/RNA FFPE (tabela materiałów). Tak więc bufor trawienia tkankowego zastosowany w tym protokole składał się z 10 μl proteinazy K i 150 μl buforu PKD.</li>
	<li>Prześledź patologiczne oznaczenia na H&E na odwrocie szkiełek tkankowych odparafinowanych. 
	UWAGA: W porównaniu z tkankami nieodparafinowanymi (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 3, rząd 2 i <silna klasa = "xfig" >Rysunek 4B), odparafinowane tkanki są białe i dobrze widoczne (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 3, Wiersz 3 i <silna klasa = "xfig" > Rysunek 4C). To właśnie ta zwiększona widoczność i dostrzegalność cech odparafinizowanych tkanek umożliwia makrodysekcję. Umieść H&E twarzą do dołu na ławce i umieść przód odparafinowanego szkiełka na plecach dopasowanego patologa recenzowanego H&E (<silna klasa = "xfig">Rysunek 4D). Wyrównaj zdeparafinową tkankę z tkanką H&E (<silna klasa="xfig">Rysunek 4E). Śledzenie oznaczeń patologa jest krytycznym krokiem w procesie makrodysekcji i należy zadbać o jak najdokładniejsze odtworzenie tych oznaczeń. Może to być szczególnie trudne w przypadku małych i/lub niepołączonych tkanek, takich jak próbki B, D i E (<silna klasa="xfig">Rysunek 3, <silna klasa="xfig">Figura 4E i <silna klasa="xfig">Figura 4E wstawka i). Aby ułatwić śledzenie, należy użyć atramentowego markera z cienką lub bardzo cienką końcówką (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 4E, wstawka ii) do śledzenia oznaczeń narysowanych przez patologa. Chusteczki z etanolem mogą być przydatne do usuwania błędów i umożliwiania ponownego śledzenia, jeśli zajdzie taka potrzeba.</li>
	<li>Obróć teraz oznaczoną odparafinowaną szkiełko chusteczką do góry i obrysuj linię markera rogiem czystej żyletki, aby wstępnie przyciąć krawędzie obszaru guza</li>.
	<li>Obsługując każde szkiełko sekwencyjnie, zanurz odparafinizowane szkiełka w 3% roztworze glicerolu. Upewnij się, że tkanka jest całkowicie zanurzona przed powolnym wyjęciem szkiełka (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 4F). 
	UWAGA: Celem dipu glicerolowego jest zwilżenie tkanki, aby ułatwić zbieranie tkanek, ale także zmniejszyć gromadzenie się ładunku statycznego, który może powodować odpychanie między tkanką a plastikową mikrorurką, w której należy umieścić pobraną tkankę.</li>
	<li>Delikatnie przetrzyj tylną część szkiełka chusteczką, aby usunąć nadmiar roztworu glicerolu, i połóż szkiełko na ławce, wycieraną stroną do dołu. Pozostaw chusteczki do krótkiego wyschnięcia na powietrzu przez 1-2 minuty. 
	UWAGA: Przeniesienie nadmiaru glicerolu do procesu ekstrakcji może negatywnie wpłynąć na wydajność i jakość ekstrakcji kwasami nukleinowymi. Tkanki powinny być lekko wilgotne, ale nie widocznie mokre po zebraniu.</li>
	<li>W zależności od tego, gdzie na szkiełku znajduje się obszar zainteresowania guza, użyj płaskiej krawędzi żyletki, aby (a) bezpośrednio zebrać tkankę nowotworową, używając brzytwy do zeskrobania/zebrania interesującej tkanki ze szkiełka, lub (b) najpierw usunąć i wyrzucić tkankę nienowotworową przed pobraniem interesującej tkanki nowotworowej (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3). 
	UWAGA: Zebrana tkanka ma tendencję do gromadzenia się lub zwijania na dnie ostrza (<silna klasa="xfig">Rysunek 4G)</li>
	<li>Użyj drewnianego patyczka, aby usunąć zebraną tkankę z ostrza (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 4H i wkładka) i przenieś ją do odpowiedniej, wstępnie oznaczonej i wstępnie napełnionej mikroprobówki (<silna klasa = "xfig">Rysunek 4I). 
	UWAGA: Bufor wytrawiający służy do "wciągnięcia" tkanki z drewnianego kilofa do płynu.</li>
	<li>Przejdź do ekstrakcji kwasów nukleinowych. 
	UWAGA: Ekstrakcje kwasów nukleinowych zakończono przy użyciu zestawu do ekstrakcji DNA/RNA FFPE zgodnie z instrukcjami producenta, a otrzymane kwasy nukleinowe określono ilościowo za pomocą spektrofotometru UV-vis. Uzyskany RNA przeprowadzono na cyfrowym teście DLBCL90 opartym na profilowaniu ekspresji genów16.</li>
</ol>

<ol><li>Mathieson, W., Thomas, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+biospecimens+must+be+used+in+genomic+medicine%3A+An+evidence-based+review+and+conclusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Why formalin-fixed, paraffin-embedded biospecimens must be used in genomic medicine: An evidence-based review and conclusion.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 68 (8), 543-552 (2020).</li>
<li>Robetorye, R. S., Maguire, A., Rosenthal, A. C., Rimsza, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+of+lymphoma+from+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Hematology%22%5BJournal%5D)">Profiling of lymphoma from formalin-fixed paraffin-embedded tissue.</a> Seminars in Hematology. 56 (1), 46-51 (2019).</li>
<li>Moorcraft, S. Y., Gonzalez, D., Walker, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+next+generation+sequencing+in+oncology%3A+A+guide+for+oncologists%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Oncology%2FHematology%22%5BJournal%5D)">Understanding next generation sequencing in oncology: A guide for oncologists.</a> Critical Reviews in Oncology/Hematology. 96 (3), 463-474 (2015).</li>
<li>Haile, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+high+throughput+nucleic+acid+purification+from+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue+samples+for+next+generation+sequence+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Automated high throughput nucleic acid purification from formalin-fixed paraffin-embedded tissue samples for next generation sequence analysis.</a> PLoS One. 12 (6), 0178706(2017).</li>
<li>Oh, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+accuracy+of+whole-exome+sequencing+with+formalin-fixed+paraffin-embedded+and+fresh+frozen+tissue+samples%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparison of accuracy of whole-exome sequencing with formalin-fixed paraffin-embedded and fresh frozen tissue samples.</a> PLoS One. 10 (12), 0144162(2015).</li>
<li>Holley, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+clonal+profiling+of+formalin+fixed+paraffin+embedded+clinical+samples%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Deep clonal profiling of formalin fixed paraffin embedded clinical samples.</a> PLoS One. 7 (11), 50586(2012).</li>
<li>Network T.C.G.A.R. TCGA Tissue sample requirements: High quality requirements yield high quality data. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/structural-genomics/tcga/studied-cancers">https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/structural-genomics/tcga/studied-cancers</a> (2021).</li>
<li>Javey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innovative+tumor+tissue+dissection+tool+for+molecular+oncology+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Molecular+Diagnostics%3A+JMD%22%5BJournal%5D)">Innovative tumor tissue dissection tool for molecular oncology diagnostics.</a> The Journal of Molecular Diagnostics: JMD. 23 (4), 399-406 (2021).</li>
<li>Feldman, A. T., Wolfe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+processing+and+hematoxylin+and+eosin+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Tissue processing and hematoxylin and eosin staining.</a> Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).</li>
<li>Duan, Q., Zhang, H., Zheng, J., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turning+cold+into+hot%3A+Firing+up+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cancer%22%5BJournal%5D)">Turning cold into hot: Firing up the tumor microenvironment.</a> Trends in Cancer. 6 (7), 605-618 (2020).</li>
<li>Kim, Y. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safety+evaluation+and+risk+assessment+of+d-Limonene%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Toxicology+and+Environmental+Health+Part+B%3A+Critical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Safety evaluation and risk assessment of d-Limonene.</a> Journal of Toxicology and Environmental Health Part B: Critical Reviews. 16 (1), 17-38 (2013).</li>
<li>Foti, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occupational+contact+dermatitis+to+a+limonene-based+solvent+in+a+histopathology+technician%5BTitle%5D)+AND+%22Contact+Dermatitis%22%5BJournal%5D)">Occupational contact dermatitis to a limonene-based solvent in a histopathology technician.</a> Contact Dermatitis. 56 (2), 109-112 (2007).</li>
<li>Meuse, C. W., Barker, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+infrared+spectroscopy+of+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissue+specimens%3A+paraffin+wax+removal+with+organic+solvents%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Immunohistochemistry+and+Molecular+Morphology%22%5BJournal%5D)">Quantitative infrared spectroscopy of formalin-fixed, paraffin-embedded tissue specimens: paraffin wax removal with organic solvents.</a> Applied Immunohistochemistry and Molecular Morphology. 17 (6), 547-552 (2009).</li>
<li>Schmeller, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Setting+out+the+frame+conditions+for+feasible+use+of+FFPE+derived+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Pathology+-+Research+and+Practice%22%5BJournal%5D)">Setting out the frame conditions for feasible use of FFPE derived RNA.</a> Pathology - Research and Practice. 215 (2), 381-386 (2019).</li>
<li>Prema, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofriendly+substitutes+for+xylene+in+deparaffinization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacy+and+Bioallied+Sciences%22%5BJournal%5D)">Biofriendly substitutes for xylene in deparaffinization.</a> Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 12, Suppl 1 623-630 (2020).</li>
<li>Ennishi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-hit+gene+expression+signature+defines+a+distinct+subgroup+of+germinal+center+B-cell-like+diffuse+large+B-cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Double-hit gene expression signature defines a distinct subgroup of germinal center B-cell-like diffuse large B-cell lymphoma.</a> Journal of Clinical Oncology. 37 (3), 190-201 (2019).</li>
<li>Alizadeh, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+types+of+diffuse+large+B-cell+lymphoma+identified+by+gene+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Distinct types of diffuse large B-cell lymphoma identified by gene expression profiling.</a> Nature. 403 (6769), 503-511 (2000).</li>
<li>Rosenwald, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+molecular+profiling+to+predict+survival+after+chemotherapy+for+diffuse+large-B-cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">The use of molecular profiling to predict survival after chemotherapy for diffuse large-B-cell lymphoma.</a> The New England Journal of Medicine. 346 (25), 1937-1947 (2002).</li>
<li>Scott, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-grade+B-cell+lymphoma+with+MYC+and+BCL2+and%2For+BCL6+rearrangements+with+diffuse+large+B-cell+lymphoma+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">High-grade B-cell lymphoma with MYC and BCL2 and/or BCL6 rearrangements with diffuse large B-cell lymphoma morphology.</a> Blood. 131 (18), 2060-2064 (2018).</li>
<li>Scott, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+cell-of-origin+subtypes+of+diffuse+large+B-cell+lymphoma+using+gene+expression+in+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Determining cell-of-origin subtypes of diffuse large B-cell lymphoma using gene expression in formalin-fixed paraffin-embedded tissue.</a> Blood. 123 (8), 1214-1217 (2014).</li>
<li>Heinrich, M. A., Mostafa, A., Morton, J. P., Hawinkels, L., Prakash, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+complexity+and+heterogeneity+of+pancreatic+tumor%3A+3D+in+vitro+to+in+vivo+models%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Translating complexity and heterogeneity of pancreatic tumor: 3D in vitro to in vivo models.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 174, 265-293 (2021).</li>
<li>Erickson, H. S., Gillespie, J. W., Emmert-Buck, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Tissue microdissection.</a> Methods in Molecular Biology. 424, 433-448 (2008).</li>
<li>Geiersbach, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digitally+guided+microdissection+aids+somatic+mutation+detection+in+difficult+to+dissect+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Genetics%22%5BJournal%5D)">Digitally guided microdissection aids somatic mutation detection in difficult to dissect tumors.</a> Cancer Genetics. 209 (1-2), 42-49 (2016).</li>
<li>de Bruin, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrodissection+versus+microdissection+of+rectal+carcinoma%3A+minor+influence+of+stroma+cells+to+tumor+cell+gene+expression+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Macrodissection versus microdissection of rectal carcinoma: minor influence of stroma cells to tumor cell gene expression profiles.</a> BMC Genomics. 6, 142(2005).</li>
<li>Ramsower, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+laboratory+validation+of+the+MCL35+assay+for+molecular+risk+stratification+of+mantle+cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hematopathology%22%5BJournal%5D)">Clinical laboratory validation of the MCL35 assay for molecular risk stratification of mantle cell lymphoma.</a> Journal of Hematopathology. 13 (4), 231-238 (2020).</li>
<li>Maguire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+DNA+repair+and+genomic+stability+identify+a+novel+HIV-related+diffuse+large+B-cell+lymphoma+signature%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Enhanced DNA repair and genomic stability identify a novel HIV-related diffuse large B-cell lymphoma signature.</a> International Journal of Cancer. 145 (11), 3078-3088 (2019).</li>
<li>Rosenwald, A., Staudt, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiling+of+diffuse+large+B-cell+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+%26+Lymphoma%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiling of diffuse large B-cell lymphoma.</a> Leukemia & Lymphoma. 44, Suppl 3 41-47 (2003).</li>
<li>Wright, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+probabilistic+classification+tool+for+genetic+subtypes+of+diffuse+large+B+cell+lymphoma+with+therapeutic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">A probabilistic classification tool for genetic subtypes of diffuse large B cell lymphoma with therapeutic implications.</a> Cancer Cell. 37 (4), 551-568 (2020).</li>
<li>Hilton, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+double-hit+signature+identifies+double-hit+diffuse+large+B-cell+lymphoma+with+genetic+events+cryptic+to+FISH%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The double-hit signature identifies double-hit diffuse large B-cell lymphoma with genetic events cryptic to FISH.</a> Blood. 134 (18), 1528-1532 (2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Tkanki FFPE są często heterogenicznymi domieszkami tkanek nowotworowych i nienowotworowych. Testy genomowe o wysokiej czułości stają się coraz bardziej powszechne zarówno w warunkach klinicznych, jak i badawczych, ale mogą być mylone przez obecność zanieczyszczającej tkanki nienowotworowej. Rzeczywiście, minimalna zawartość guza wynosząca 60% jest często zalecana w badaniach genomicznych. Procent guza można określić na podstawie obszaru tkanki zajętego przez materiał nowotworowy lub na podstawie proporcji komórek nowotworowych w tkance. Chociaż guz według obszaru jest powszechnie używanym wskaźnikiem czystości guza, nie zawsze przedstawia dokładny opis tkanki. Rozważmy dwie tkanki, obie z 1000 komórek, z których 500 to komórki nowotworowe. W tkance A 500 komórek nienowotworowych to komórki zrębu o objętości podobnej do objętości komórki nowotworowej. W tej tkance procent guza można uznać za 50% zarówno pod względem komórkowości, jak i obszaru. W tkance B 500 komórek nienowotworowych to komórki tłuszczowe o objętości 4 razy większej niż komórka nowotworowa. W tej tkance odsetek guza wynosi nadal 50% pod względem komórkowości, ale 20% pod względem powierzchni. Trzecia tkanka, tkanka C, składa się z 500 komórek nowotworowych plus 400 komórek tłuszczowych i 800 komórek zrębu o objętościach odpowiednio 4 i 0,5 razy większych niż komórki nowotworowe. Biorąc pod uwagę, że 100 komórek tłuszczowych równa się objętości 800 komórek zrębu, procent guza C wynosi 29% pod względem komórkowości (500/1700), ale nadal 20% pod względem powierzchni. Tkanka D składa się również z komórek guza, tłuszczu i zrębu o proporcjach objętości 1x, 4x i 0,1x. Jednak liczba komórek wynosi odpowiednio 400, 10 i 720. Tak więc procent guza tkanki D wynosi 35% pod względem komórkowości (400/1130), ale 78% pod względem powierzchni. Przykłady te są nadmiernie uproszczone i nie odzwierciedlają rzeczywistego składu tkanek, ale wyraźnie pokazują znaczenie składu tkanek i różnicę między zawartością guza w zależności od obszaru i komórkowości. Co ważne, jeśli chodzi o wzbogacanie zawartości guza w celu ekstrakcji kwasów nukleinowych, komórkowość guza jest ważniejszym atrybutem ze względu na zwiększony potencjał mylący ekstrakcji materiału genomowego z większej liczby komórek nienowotworowych niż komórek nowotworowych. Podkreśla to nie tylko potrzebę oceny zawartości guza w tkankach pod względem procentowej komórkowości, ale także potrzebę wycięcia niechcianej tkanki w celu zminimalizowania wszelkich potencjalnych negatywnych skutków tkanki nienowotworowej. Dostępnych jest kilka metod wzbogacania tkanek, z których główne to makrodysekcja i mikrodysekcja.
Makrodysekcja, metoda opisana w tym protokole, jest stosunkowo szybka, prosta i nie wymaga kosztownego ani specjalistycznego sprzętu. Chociaż makrodysekcja może znacznie poprawić zawartość guza, ważne jest, aby zrozumieć, że nie eliminuje całkowicie materiału nienowotworowego. Celem makrodysekcji jest wystarczające wzbogacenie tkanki będącej przedmiotem zainteresowania poprzez wykluczenie niechcianej tkanki w celu zmniejszenia "szumu" wynikającego z niechcianej tkanki, co z kolei może wzmocnić sygnał zainteresowania ze strony tkanki będącej przedmiotem zainteresowania. Tak więc wzbogacanie guza za pośrednictwem makrodysekcji jest sposobem na zwiększenie stosunku sygnału do szumu w celu lepszego wykrywania markerów będących przedmiotem zainteresowania, w szczególności markerów molekularnych specyficznych dla nowotworu o niskiej liczebności lub słabej ekspresji. Jednak makrodysekcja ma ograniczenia ze względu na brak precyzji oferowanej przez grube narzędzia, takie jak żyletki, i jest podatna na problemy z precyzją wynikające z grubości linii markera patologa, a także potencjalne błędy podczas śledzenia granic H&E patologów. Jak wspomniano powyżej, nie jest możliwe osiągnięcie 100% czystości guza ze względu na obecność nieodłącznych i indukujących nowotwór elementów zrębu (tj. tkanki łącznej, fibroblastów zrębu, naczyń krwionośnych, łagodnych reaktywnych limfocytów, makrofagów) osadzonych w samym guzie. Rzeczywiście, wiele inwazyjnych lub rozlanych nowotworów złośliwych indukuje silną desmoplastyczną odpowiedź zrębu, w wyniku czego powstają skupiska komórek nowotworowych, które są ściśle zmieszane z fibroblastami zrębu i innymi typami komórek nienowotworowych; gdzie nowotwory związane z tym wzorcem reakcji zrębu, takie jak tkanki raka trzustki21, mogą odnieść większe korzyści z cyfrowo sterowanej mikrodysekcji niż ręcznej makrodysekcji. 
Ręczna mikrodysekcja jest wykonywana pod mikroskopem w celu ułatwienia identyfikacji, rozwarstwienia i izolacji tkanek określonych komórek lub populacji za pomocą igły lub skalpela i ma tę zaletę, że jest bardziej precyzyjna w porównaniu z makrodysekcją22. Jednak ręczna mikrodysekcja jest pracochłonnym procesem, któremu brakuje finezji potrzebnej w przypadku złożonych tkanek o niskiej zawartości guza lub skomplikowanych cechach, które są niekompatybilne z ręcznym rozwarstwieniem. Takie tkanki można wypreparować przy użyciu wysoce precyzyjnych zautomatyzowanych metod, takich jak mikrodysekcja laserowa. Rzeczywiście, wykazano, że mikrodysekcja pod kontrolą cyfrową daje wyższy procent zawartości guza w porównaniu z ręczną makrodysekcją w tkankach raka trzustki23. Jednak wady tych wysoce precyzyjnych zautomatyzowanych metod, takie jak potrzeba specjalistycznego, drogiego sprzętu i wysoko wykwalifikowanych osób, utrudniają ich włączenie do przepływów pracy. Badanie przeprowadzone przez de Bruin i wsp., porównujące wpływ makrodysekcji i mikrodysekcji wychwytu laserowego (LCM) na profilowanie ekspresji genów, wykazało, że próbki LCM miały niską całkowitą wydajność RNA (średnio 30 ng) i wymagały dwóch rund amplifikacji mRNA, aby osiągnąć próg wejściowy przygotowania biblioteki cDNA24. Autorzy stwierdzili, że uzyskane profile ekspresji genów LCM były bardziej dotknięte przez rundy amplifikacji mRNA niż profile makrowypreparowane były dotknięte wkładem zrębu nienowotworowego i doszli do wniosku, że makrodysekcja może być odpowiednio wykorzystana do generowania wiarygodnych danych dotyczących ekspresji genów24. 
Istotną zaletą cyfrowego profilowania ekspresji genów NanoString, szczególnie podczas pracy z wysoce zdegradowanym RNA pochodzącym z FFPE, jest to, że nie wymaga ono procesów zależnych od enzymów, takich jak amplifikacja RNA lub przygotowanie bibliotek cDNA. Jednak testy są zwykle optymalizowane pod kątem danych wejściowych między 50-300 ng całkowitego RNA25,26, które, w oparciu o wyniki de Bruin i wsp.24, mogą nie być kompatybilne z mikrowypreparowanymi tkankami bez zwiększenia wkładu tkankowego; Jest to niekorzystny popyt w epoce, w której próbki tkanek są coraz częściej pobierane w postaci małych biopsji, a nie resekcji chirurgicznych. Dane wejściowe RNA użyte do testu DLBCL90 wahały się od 68,5 do 300 ng zarówno dla makrowypreparowanych, jak i niewypreparowanych tkanek. Wyniki pokazują, że makrodysekcja spowodowała zmiany wywołania w 60% badanych próbek i że zmiany te obserwowano niezależnie od wprowadzenia RNA do makrowypreparowanych próbek. Jednak prawdopodobieństwo COO dla niskiego wejścia RNA przekroczyło próg wywołania prawdopodobieństwa COO GCB/UNC, gdzie progi wynoszą od 0 do <0,1 dla GCB, 0,1-0,9 dla UNC i >0,9 do 1,0 dla połączeń ABC20. Głównymi podtypami COO DLBCL są GCB i ABC, które stanowią 41% i 44% wszystkich przypadków DLBCL, przy czym UNC stanowi grupę pośrednią z tych dwóch, a ABC jest najbardziej agresywną20,27. Tak więc, podczas gdy zmiana wywołania COO po makrodysekcji próbki C nie spowodowała jawnej zmiany podtypu COO z GCB na ABC, zmiana z GCB na UNC może sugerować przesunięcie w kierunku bardziej agresywnej choroby. Co więcej, ostatnie badania wskazują, że podtyp UNC nie jest po prostu podtypem pośrednim i że może potencjalnie posiadać cechy specyficzne dla podtypu, które można wykorzystać terapeutycznie28. Podobnie, makrodysekcja próbek A i E nie spowodowała szczerych zmian w wywołaniach DHITsig z DH ujemnych na DH dodatnich lub odwrotnie. Jednak przemieszczenia próbki GCB (próbki A) z NEG do UNCLASS i próbki ABC (próbki E) z UNCLASS do NEG po makrodysekcji są biologicznie odpowiednie, ponieważ translokacje podwójnego trafienia z udziałem BCL2 są zgłaszane jako zjawisko wyłącznie GCB19. Chociaż translokacje są tradycyjnie i powszechnie wykrywane przez FISH w warunkach klinicznych, rośnie tempo poszukiwania alternatywnej, mniej skomplikowanej i czasochłonnej metody ich wykrywania. Test DLBCL90 jest ważnym narzędziem, które odpowiada na tę potrzebę, a uzasadnienie jego stosowania jest wzmocnione przez ustalenie, że test ten jest w stanie wykryć translokacje tajemnicze do sond FISH stosowanych w diagnostyce klinicznej29.
Opisany powyżej protokół makrodysekcji przedstawia prostą metodę, która umożliwia naukowcom zwiększenie zawartości guza w próbkach tkanek, które zwykle spadłyby poniżej powszechnie stosowanych progów kryteriów włączenia do badania. Włączenie makrodysekcji do przebiegu badania umożliwia naukowcom uratowanie tkanek o niskiej gęstości guza przed wykluczeniem z badania poprzez zwiększenie ich zawartości guza. To z kolei pozwala na zwiększenie pewności, że powstałe eluaty RNA i DNA reprezentują guz poddany badaniom genomicznym. Chociaż istnieją inne, bardziej precyzyjne metody preparacji tkanek, w przypadku guzów, które rosną w bardziej ekspansywny, nienaciekający, przypominający arkusz lub w sposób stały, makrodysekcja jest prawdopodobnie wystarczająca. Przedstawione tutaj wyniki podkreślają znaczenie czystości guza w testach genomicznych i makrodysekcji jako niezawodnego narzędzia do osiągnięcia tego celu.

Tkanki zatopione w parafinie (FFPE) utrwalone w formalinie, zebrane w ramach normalnego procesu diagnostyki klinicznej i przechowywane w klinicznych repozytoriach tkanek, stanowią ogromne źródło do badań na ludziach, w tym badań nad rakiem1. W miarę pogłębiania się naszej wiedzy na temat chorób u ludzi staje się coraz bardziej jasne, że choroby, wcześniej uważane za pojedyncze jednostki oparte na cechach morfologicznych i immunofenotypowych, w rzeczywistości składają się z odrębnych podtypów molekularnych, które wymagają molekularnych testów podtypowania. W związku z tym coraz ważniejsze stają się testy genomowe o wysokiej czułości, zdolne do rozpoznania tych podtypów2. Chociaż tkanki FFPE są znane z tego, że są słabo kompatybilne z technikami genomicznymi ze względu na problemy związane z fiksacją, wraz z rozwojem technologii i protokołów, techniki te stają się coraz bardziej kompatybilne z tym klinicznie wszechobecnym formatem tkanki3,4,5. Jednak tkanki FFPE są często domieszkami materiałów tkankowych nowotworowych i nienowotworowych, w których obecność materiału nienowotworowego jest często niepożądana i może, jeśli występuje w dużej proporcji, znacznie podważyć i wpłynąć na wyniki analiz genomicznych6. Rzeczywiście, minimalna zawartość guza wynosząca 60% jest często stosowana do takich analiz, w których tkanki, które nie spełniają tego progu, mogą zostać wykluczone, mimo że w przeciwnym razie spełniają kryteria badania7. Może to być szczególnie problematyczne w przypadku chorób rzadkich, gdzie tkanki pacjentów są cenne i trudne do pobrania w dużych ilościach.
Makrodysekcja to metoda, która minimalizuje skutki niskiej zawartości guza poprzez zmniejszenie ilości normalnej tkanki3. Usunięcie takiego mylącego materiału nienowotworowego przed ekstrakcją kwasu nukleinowego może znacznie zwiększyć procentową zawartość guza, a tym samym czystość guza ekstrahowanych kwasów nukleinowych. Resekcja tkanki opiera się na specjalistycznej ocenie patologicznej, w której obszar guza jest identyfikowany i zakreślany na świeżo wygenerowanym skrawku tkanki barwionej hematoksyliną i eozyną (H&E) przez certyfikowanego patologa8. Zakreślony H&E jest następnie używany do kierowania usuwaniem i zbieraniem odpowiednio niechcianych i docelowych tkanek. Protokół ten opisuje etapy makrodysekcji od oceny patologicznej do pobrania tkanek, które są wykonywane w Technicznym Laboratorium Podstawowym Zasobów Próbek AIDS i Raka (ACSR) w Klinice Mayo.

<table><tbody><tr><td>200-procentowy etanol</td><td>Decon</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw AllPrep DNA/RNA FFPE</td><td>Qiagen</td><td>80234</td><td>Zestaw do ekstrakcji DNA/RNA FFPE</td></tr><tr><td>Doniczki z kopliny</td><td>Różne</td><td></td> sondy x <td></td></tr><tr><td>DLBCL90</td><td>NanoString</td><td>różne</td><td>Cyfrowe profilowanie ekspresji genów na podstawie testu DLBCL90</td></tr><tr><td>d-Limonen</td><td>VWR</td><td>89376-092</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Różne</td><td>x</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe</td><td>FisherBrand</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>VWR</td><td>0854-1L</td><td></td></tr><tr><td>Zestawy główne</td><td>NanoString</td><td>różne</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotomy</td><td>Leica</td><td>RM2265</td><td></td></tr><tr><td>Mikrorurki</td><td>Ambion</td><td>AM12400</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop One</td><td>Thermo Scientific</td> Spektrofotometr <td>ND-ONE-W</td><td>do jakościowania DNA, RNA i białek</td></tr><tr><td>nCounter</td><td>NanoString</td><td>x</td><td>Cyfrowa platforma do profilowania ekspresji genów używana do przeprowadzenia testu DLBCL90</td></tr><tr><td>Marker permanentny</td><td>Electrib Microscope Sciences</td><td>72109-12</td><td></td></tr><tr><td>Dozownik żyletki</td><td>Electrib Microscope Sciences</td><td>71985-10</td><td></td></tr><tr><td>Żyletki</td><td>Mikroskop Electrib Nauki</td><td>71985-23</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do trawienia tkanek</td><td>Qiagen</td><td>80234</td><td></td></tr><tr><td>Woda ultraczysta</td><td>VWR</td><td>SH30538.02</td><td></td></tr><tr><td>Trójkąt do kąpieli wodnej</td><td>Nauki biomedyczne</td><td>TFB-120</td><td></td></tr><tr><td>Drewniany kij</td><td>FisherBrand</td><td>22363158</td><td></td></tr></tbody></table>

zwiększanie zawartości guza poprzez makrodysekcję guza

Enhancing Tumor Content through Tumor Macrodissection

Obecność zanieczyszczających tkanek nienowotworowych w tkankach zatopionych w parafinie (FFPE) może znacznie podważyć badania genomiczne. W tym miejscu opisujemy makrodysekcję, metodę mającą na celu zwiększenie procentowej zawartości guza w próbce tkanki poprzez usunięcie i wyeliminowanie niechcianej tkanki przed wykonaniem ekstrakcji kwasów nukleinowych. Bloki tkankowe FFPE podzielono na sekcje w celu wytworzenia skrawków tkanek montowanych na szkiełku o grubości 4-5 μm. Reprezentatywny wycinek został przedłożony do barwienia hematoksyliną i eozyną (H&E), a następnie poddany przeglądowi przez certyfikowanego patologa. Podczas przeglądu patolog zidentyfikował i oznaczył obszary tkanki nowotworowej w H&E. Po zakończeniu, oznaczone H&E zostało użyte do przeprowadzenia resekcji seryjnych niebarwionych odcinków z tego samego bloku tkanki. Aby zademonstrować efekty makrodysekcji, RNA wyekstrahowane z dopasowanych makrowypreparowanych i niewypreparowanych chłoniaków rozlanych dużych komórek B (DLBCL) przeprowadzono na cyfrowym teście ekspresji genów zdolnym do określenia podtypu DLBCL i statusu translokacji BCL2. Wyniki wykazały, że makrodysekcja zmieniła podtyp lub wywołania statusu translokacji BCL2 w 60% badanych próbek. Podsumowując, makrodysekcja jest prostą i skuteczną metodą wzbogacania guza przed ekstrakcją kwasów nukleinowych, której produkt może być następnie z pewnością wykorzystany w dalszych badaniach genomicznych.

Przecięto łącznie 5 bloków tkanek FFPE z chłoniaka rozlanego z dużych komórek B (DLBCL), a uzyskane skrawki poddano makrodysekcji lub nie przed ekstrakcją kwasów nukleinowych. Wyekstrahowane RNA poddano analizie DLBCL9016. Próbki poddane makrodysekcji analizowano dwukrotnie: raz przy użyciu 5 µL stężonego roztwoku RNA, ale z całkowitą ilością RNA nieprzekraczającą 300 ng, a drugi raz przy użyciu 5 µL roztwoku RNA rozcieńczonego tak, aby dopasować ilość RNA do odpowiadających im próbek niepoddanych dysekcji. Wyniki DLBCL90 przedstawiono w Tabeli 2.
DLBCL składa się z 3 odrębnych podtypów w zależności od komórki pochodzenia (COO) o różnej odpowiedzi na leczenie, mianowicie GCB, ABC oraz grupy pośredniej znanej jako niezaklasyfikowana lub UNC17,18. Translokacje obejmujące MYC, BCL2 i/lub BCL6, pojedynczo lub w kombinacji (double hit lub triple hit), są również często obserwowane w DLBCL, szczególnie w podtypie GCB19. Test DLBCL90 jest rozwinięciem jego poprzednika, testu klinicznego Lymph2Cx, i w związku z tym umożliwia wyznaczenie podtypu COO w DLBCL, ale został opracowany przede wszystkim w celu identyfikacji próbek zawierających translokacje typu double hit (DH) obejmujące BCL2, wykorzystując cyfrową ekspresję genów jako alternatywę dla hybrydyzacji in situ fluorescencyjnej (FISH)16,20. Wyniki przedstawione w Tabeli 2 pokazują, że makrodysekcja zmieniła ocenę statusu COO lub DHITsig w 60% (3/5) badanych próbek.
Makrodyssekcja próbki A nie miała wpływu na wynik COO, ale zmieniła wynik DHITsig z NEG na UNCLASS; zmiana ta była obserwowana niezależnie od ilości wprowadzonego RNA z próbki poddanej makrodyssekcji i przy podobnych wynikach prawdopodobieństwa (0,224, 0,254). W przeciwieństwie do tego, makrodyssekcja próbki C nie miała wpływu na wynik DHITsig, ale zmieniła wynik COO z GCB na UNC. Ponownie, zmiana ta była obserwowana niezależnie od ilości wprowadzonego RNA z próbki poddanej makrodyssekcji. Jednakże, przy wartości 0,117, prawdopodobieństwo wyniku COO było bliższe progu odcięcia 0,1 dla próbki poddanej makrodyssekcji z mniejszą ilością wprowadzonego RNA. Podobnie jak w przypadku próbki A, makrodyssekcja próbki E nie miała wpływu na wynik COO, ale zmieniła wynik DHITsig. Jednak w przypadku próbki E wynik zmienił się z UNCLASS na NEG i stało się to niezależnie od ilości wprowadzonego RNA z próbki poddanej makrodyssekcji, przy dość podobnych wynikach prawdopodobieństwa (0,849, 0,833). Co istotne, zmiana tego wyniku na DHITsig NEG ma sens biologiczny, biorąc pod uwagę, że próbka E została zidentyfikowana jako ABC-DLBCL, a translokacje double hit obejmujące BCL2 są raportowane jako występujące wyłącznie w GCB-DLBCL19.
<img alt="Proces mikrotomii, schemat badawczy przedstawiający cięcie tkanek i technikę przenoszenia do kąpieli wodnej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62961/62961fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Przygotowanie skrawków tkanek na szkiełkach przedmiotowych przy użyciu mikrotomu. (A) Blok tkanki FFPE unieruchomiony w uchwycie mikrotomu i cięty w celu uzyskania wstęgi sekwencyjnych skrawków tkanki FFPE. (B) Przy użyciu uprzednio namoczonych drewnianych patyczków wstęga jest pobierana z mikrotomu i przenoszona do ciepłej kąpieli wodnej. (C) Ciepło wody pomaga wyprostować zagniecenia w wstędze tkankowej. (D) Poszczególne skrawki tkanki FFPE są oddzielane od wstęgi poprzez umieszczenie zamkniętej pęsety na styku dwóch skrawków i delikatne otwarcie pęsety, co powoduje ich rozdzielenie. (E) Skrawki są pobierane z wody poprzez zanurzenie szkiełka przedmiotowego pod kątem i delikatne przesuwanie go w stronę skrawka tkanki, aż krawędź skrawka dotknie szkiełka. (F) Po zetknięciu się szkiełka i skrawka, należy powoli wyjąć szkiełko z wody, pozwalając skrawkowi tkanki przylgnąć płasko do powierzchni szkiełka. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62961/62961fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Układ mikroskopowy do analizy tkanek; obraz mikroskopowy; przygotowanie i inspekcja szkiełek z próbkami." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62961/62961fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Analiza patomorfologiczna i histologiczna skrawków barwionych hematoksyliną i eozyną (H&amp;E). (A,B) Skrawki tkanki barwione H&amp;E poddawane są ocenie mikroskopowej przez certyfikowanego patologa. (C,D) Po obejrzeniu całej tkanki i stwierdzeniu, że nie składa się ona w 100% z tkanki nowotworowej, patolog zaznacza markerem obszar nowotworu w tkance. (E,F) Przyłożenie zaznaczonego preparatu H&amp;E do oryginalnego bloku tkankowego FFPE pokazuje, że nie cała tkanka jest materiałem nowotworowym. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62961/62961fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Zróżnicowanie barwienia w próbkach komórkowych; siatka rzędów obrazów; analiza mikroskopowa; badanie morfologii komórkowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62961/62961fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Próbki tkanek. Na obrazie przedstawiono: barwienia H&amp;E z recenzją patomorfologiczną i zaznaczonym guzami (Rząd 1), nieprzetworzone przekroje tkanek FFPE zamontowane na szkiełkach (Rząd 2), odparafinowane przekroje tkanek FFPE zamontowane na szkiełkach (Rząd 3), odparafinowane przekroje tkanek FFPE zamontowane na szkiełkach z naniesionymi na odwrocie szkiełka oznaczeniami patomorfologicznymi (Rząd 4) oraz odparafinowane i makrodysekcyjne przekroje tkanek FFPE zamontowane na szkiełkach (Rząd 5) dla 5 próbek (A-E) wykorzystanych do zademonstrowania niniejszego protokołu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62961/62961fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Proces histologiczny: zatapianie tkanek, krojenie i barwienie na szkiełkach mikroskopowych do analizy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62961/62961fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Deparafinizacja i makrosekcja przekrojów tkankowych FFPE: (A) W dygestorium tkanki FFPE umieszczone w kasecie do szkiełek są płukane w dwóch kąpielach z d-limonenem i jednej kąpieli z etanolem. (B,C) Po płukaniu cała parafina została usunięta, a na szkiełku pozostała jedynie tkanka, która jest teraz biała i bardzo widoczna w porównaniu do stanu przed płukaniem. (D) Deparafinizowany przekrój tkanki na szkiełku jest kładziony stroną z tkanką do dołu na odwrocie odpowiadającego mu, oznakowanego preparatu H&amp;E. (E) Oznaczenia obszaru guza na preparacie H&amp;E są następnie odwzorowywane na odwrocie deparafinizowanego szkiełka za pomocą permanentnego markera z cienką lub ultracialką końcówką. (F) Oznakowany deparafinizowany przekrój tkanki na szkiełku jest następnie zanurzany w glicerolu, aby nawilżyć tkankę przed pobraniem. Szkiełko jest powoli wyjmowane z glicerolu, a jego odwrotna strona jest wycierana chusteczką w celu usunięcia nadmiaru glicerolu przed położeniem szkiełka stroną z tkanką do góry na blacie. (G) Za pomocą płaskiej strony czystego ostrza żyletki przeprowadza się makrosekcję tkanki; tkanka niepożądana, znajdująca się poza oznaczeniami patologa, jest odrzucana przed pobraniem tkanki docelowej, która gromadzi się wzdłuż krawędzi ostrza. (H) Do usunięcia zebranej tkanki z krawędzi ostrza używa się drewnianego patyczka. (I) Tkanka jest następnie przenoszona do wcześniej oznakowanej mikroprobówki wypełnionej buforem do trawienia tkanek i jest gotowa do ekstrakcji kwasów nukleinowych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62961/62961fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:font-size="7px" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="2" style="min-width: 80px;">Identyfikator próbki</td>
			<td colspan="2" style="min-width: 80px;">Cała tkanka (a)</td>
			<td colspan="2" style="min-width: 80px;">Zakreślony obszar tkanki (b)</td>
			<td rowspan="2" style="min-width: 80px;">Całkowita zawartość guza w całej tkance (c)</td>
			<td rowspan="2" style="min-width: 80px;">Wielokrotność wzrostu zawartości guza w makrodissekcji (d)</td>
			<td colspan="2" style="min-width: 80px;">Bez makrodysekcji (e)</td>
			<td colspan="2" style="min-width: 80px;">Makrodissekcja (f)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="min-width: 80px;">% żywotnego guza</td>
			<td style="min-width: 80px;">% Inne</td>
			<td style="min-width: 80px;">% żywych komórek nowotworu</td>
			<td style="min-width: 80px;">% Inne</td>
			<td style="min-width: 80px;">liczba 5 µm wyekstrahowane preparaty</td>
			<td style="min-width: 80px;">stężenie RNA (ng/µL)</td>
			<td style="min-width: 80px;">liczba 5 µm wyekstrahowane preparaty</td>
			<td style="min-width: 80px;">stężenie RNA 
			(ng/µL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="min-width: 80px;">Próbka A</td>
			<td style="min-width: 80px;">60</td>
			<td style="min-width: 80px;">40</td>
			<td style="min-width: 80px;">75</td>
			<td style="min-width: 80px;">25</td>
			<td style="min-width: 80px;">45</td>
			<td style="min-width: 80px;">1.7</td>
			<td style="min-width: 80px;">2</td>
			<td style="min-width: 80px;">19.0</td>
			<td style="min-width: 80px;">4</td>
			<td style="min-width: 80px;">58.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="min-width: 80px;">Próbka B</td>
			<td style="min-width: 80px;">60</td>
			<td style="min-width: 80px;">40</td>
			<td style="min-width: 80px;">65</td>
			<td style="min-width: 80px;">35</td>
			<td style="min-width: 80px;">39</td>
			<td style="min-width: 80px;">1.7</td>
			<td style="min-width: 80px;">1</td>
			<td style="min-width: 80px;">34.0</td>
			<td style="min-width: 80px;">2</td>
			<td style="min-width: 80px;">60.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="min-width: 80px;">Próbka C</td>
			<td style="min-width: 80px;">40</td>
			<td style="min-width: 80px;">60</td>
			<td style="min-width: 80px;">65</td>
			<td style="min-width: 80px;">35</td>
			<td style="min-width: 80px;">26</td>
			<td style="min-width: 80px;">2.5</td>
			<td style="min-width: 80px;">1</td>
			<td style="min-width: 80px;">13.7</td>
			<td style="min-width: 80px;">2</td>
			<td style="min-width: 80px;">46.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="min-width: 80px;">Próbka D</td>
			<td style="min-width: 80px;">35</td>
			<td style="min-width: 80px;">65</td>
			<td style="min-width: 80px;">90</td>
			<td style="min-width: 80px;">10</td>
			<td style="min-width: 80px;">32</td>
			<td style="min-width: 80px;">2.9</td>
			<td style="min-width: 80px;">1</td>
			<td style="min-width: 80px;">57.3</td>
			<td style="min-width: 80px;">2</td>
			<td style="min-width: 80px;">60.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td style="min-width: 80px;">Próbka E</td>
			<td style="min-width: 80px;">20</td>
			<td style="min-width: 80px;">80</td>
			<td style="min-width: 80px;">30</td>
			<td style="min-width: 80px;">70</td>
			<td style="min-width: 80px;">6</td>
			<td style="min-width: 80px;">5.0</td>
			<td style="min-width: 80px;">3</td>
			<td style="min-width: 80px;">25.2</td>
			<td style="min-width: 80px;">3</td>
			<td style="min-width: 80px;">44.6</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Dane z przeglądu patomorfologicznego. Tabela przedstawia (a) procent żywej tkanki nowotworowej w całym przekroju tkanki w zależności od powierzchni, (b) procent żywej tkanki nowotworowej w obszarze zakreślonym/oznaczonym przez patologa podczas przeglądu w zależności od komórkowości, (c) szacowaną całkowitą komórkowość nowotworu w całej tkance (a x b), (d) szacowany stopień zwiększenia komórkowości nowotworu osiągnięty dzięki makrodysekcji, (e i f) liczbę wyekstrahowanych niebarwionych przekrojów tkanki o grubości 5 µm zamontowanych na szkiełkach FFPE oraz wynikające z tego stężenia RNA dla dopasowanych próbek niepoddanych makrodysekcji oraz poddanych makrodysekcji. % Inne odnosi się do wszystkich pozostałych tkanek obecnych w danej próbce, które nie są tkanką nowotworową i mogą obejmować tkankę łączną, fibroblasty zrębu, naczynia krwionośne, a także inne wrodzone elementy zrębu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62961/Table%201-62961R3.xlsx" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
<table border="1" fo:font-size="8px" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td colspan="2">ID próbki</td>
			<td >Ilość RNA wejściowego (ng)</td>
			<td >Klasyfikacja COO DLBCL90</td>
			<td >Prawdopodobieństwo klasyfikacji DLBCL90</td>
			<td >Klasyfikacja DHITsig</td>
			<td >Prawdopodobieństwo wyniku dodatniego DHITsig</td>
			<td >Prawdopodobieństwo wyniku ujemnego DHITsig</td>
		</tr >
		<tr >
			<td rowspan="5">Bez makrodysekcji</td>
			<td >Próbka A</td>
			<td >95.0</td>
			<td >GCB</td>
			<td >0.000</td>
			<td >NEG</td>
			<td >0.135</td>
			<td >0.865</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Próbka B</td>
			<td >170.0</td>
			<td >GCB</td>
			<td >0.000</td>
			<td >NEG</td>
			<td >0.032</td>
			<td >0.968</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Próbka C</td>
			<td >68.5</td>
			<td >GCB</td>
			<td >0.028</td>
			<td >NEG</td>
			<td >0.033</td>
			<td >0.967</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Próbka D</td>
			<td >286.5</td>
			<td >ABC</td>
			<td >0.998</td>
			<td >NEG</td>
			<td >0.002</td>
			<td >0.998</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Próbka E</td>
			<td >126.0</td>
			<td >ABC</td>
			<td >0.989</td>
			<td >UNCLASS</td>
			<td >0.212</td>
			<td >0.788</td>
		</tr >
		<tr >
			<td rowspan="5">Makrodysekcjonowane</td>
			<td >Próbka A_M</td>
			<td >291.7</td>
			<td >GCB</td>
			<td >0.000</td>
			<td >UNCLASS</td>
			<td >0.224</td>
			<td >0.776</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Próbka B_M</td>
			<td >300.0</td>
			<td >GCB</td>
			<td >0.000</td>
			<td >NEG</td>
			<td >0.016</td>
			<td >0.984</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Próbka C_M</td>
			<td >231.2</td>
			<td >UNCLASS</td>
			<td >0.210</td>
			<td >NEG</td>
			<td >0.015</td>
			<td >0.985</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Próbka D_M</td>
			<td >300.0</td>
			<td >ABC</td>
			<td >0.999</td>
			<td >NEG</td>
			<td >0.002</td>
			<td >0.998</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Próbka E_M</td>
			<td >223.2</td>
			<td >ABC</td>
			<td >0.987</td>
			<td >NEG</td>
			<td >0.151</td>
			<td >0.849</td>
		</tr >
		<tr >
			<td rowspan="5">Makrodysekcjonowane i RNA rozcieńczone</td>
			<td >Próbka A_M</td>
			<td >95.0</td>
			<td >GCB</td>
			<td >0.000</td>
			<td >UNCLASS</td>
			<td >0.254</td>
			<td >0.746</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Próbka B_M</td>
			<td >170.0</td>
			<td >GCB</td>
			<td >0.000</td>
			<td >NEG</td>
			<td >0.023</td>
			<td >0.977</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Próbka C_M</td>
			<td >68.5</td>
			<td >UNCLASS</td>
			<td >0.117</td>
			<td >NEG</td>
			<td >0.027</td>
			<td >0.973</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Próbka D_M</td>
			<td >286.5</td>
			<td >ABC</td>
			<td >0.999</td>
			<td >NEG</td>
			<td >0.002</td>
			<td >0.998</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Próbka E_M</td>
			<td >126.0</td>
			<td >ABC</td>
			<td >0.995</td>
			<td >NEG</td>
			<td >0.167</td>
			<td >0.833</td>
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 2: Wyniki cyfrowego badania ekspresji genów DLBCL90. Pięć próbek (A-E) nie zostało poddanych makrodissekcji lub zostało poddanych makrodissekcji przed przeprowadzeniem ekstrakcji kwasów nukleinowych. Uzyskane RNA poddano badaniu DLBCL90, dla którego maksymalna objętość wejściowa RNA wynosi 5 µL. Próbki bez makrodissekcji analizowano przy użyciu 5 µL roztworu RNA. Każda próbka po makrodissekcji była analizowana dwukrotnie z użyciem (a) 5 µL roztworu RNA, chyba że możliwe było przygotowanie aliquotów 60 ng/µL oraz (b) 5 µL roztworu RNA rozcieńczonego tak, aby dopasować stężenia/ilość wejściową do odpowiadających im próbek bez makrodissekcji. Przyrostek _M oznacza, że próbka została poddana makrodissekcji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62961/Table%202-62961R3.xlsx" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>

Ten protokół przedstawia metodę zwiększania procentowej zawartości guza w próbkach tkanek zatopionych w parafinie utrwalonych w formalinie.

Zwiększanie zawartości guza poprzez makrodysekcję guza

The presence of contaminating non-tumor tissues in formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can greatly undermine genomic studies. Herein we ...

Tkanki zatopione w parafinie lub FFPE utrwalone w formalinie są często domieszkami materiałów nowotworowych i nienowotworowych, gdzie obecność materiału nienowotworowego jest często niepożądana i może, jeśli jest obecna w dużej proporcji, znacząco wpłynąć na wyniki analizy genomowej, dlatego główną zaletą makro-rozwarstwienia w porównaniu z pracą z niewyciętymi tkankami jest to, że powstałe odparafinowane wycięte skrawki tkanki można pobrać do ekstrakcji RNA i DNA, które można następnie z pewnością wykorzystać w dalszej analizie genomicznej. Wiedząc, że wyekstrahowane materiały pochodzą z tkanek o zwiększonej zawartości guza przy minimalnym udziale zanieczyszczenia tkanek nienowotworowych. Wieloetapowy przebieg tego procesu zostanie zademonstrowany przez pana Lee Wisnera, dr Brandona Larsena i mnie Przygotowując się do cięcia tkanek, namocz bloki parafiny na lodowatej wodzie przez 10 do 15 minut.Schładzanie bloków utwardza wosk, podczas gdy woda nawilża tkankę, co razem ułatwia cięcie tkanki. Gdy bloki znajdują się na lodzie, odpowiednio oznacz szkiełka mikroskopowe. Napełnij i podgrzej łaźnię wodną do 39 stopni Celsjusza i ustaw mikrotom na żądaną grubość cięcia.Ostrożnie załaduj ostrze na mikrotom. Zablokuj ostrze na miejscu i umieść osłonę bezpieczeństwa, aż będziesz gotowy do rozpoczęcia dzielenia bloków. Gdy osłona bezpieczeństwa jest na swoim miejscu, włóż blok FFPE do uchwytu mikrotomowego.Aby rozpocząć, powoli przekrój blok, aż uzyskasz pełny przekrój twarzy. Nazywa się to zwróceniem się do bloku. Gdy to zostanie osiągnięte, blok może znajdować się w sekcji szybciej, aby uzyskać wstęgę sekcji.Po przecięciu przenieś wstęgę skrawków tkanki do ciepłej kąpieli wodnej. Użyj kleszczy, aby oddzielić pojedynczy odcinek tkanki od wstążki. Aby to zrobić, umieść tył zamkniętych zakrzywionych kleszczy na styku między dwiema sekcjami i pozwól kleszczom delikatnie się otworzyć, aby oddzielić sekcje.Pobrać wyizolowany wycinek tkanki na szkiełku mikroskopowym. Aby uniknąć uwięzienia pęcherzyków, włóż szkiełko mikroskopowe do wody pod kątem. Delikatnie potrząśnij szkiełkiem, aby usunąć nadmiar wody przed umieszczeniem na ruszcie do wyschnięcia na powietrzu.Po wyschnięciu wybierz co najmniej jeden ze świeżo ściętych odcinków tkanki do barwienia hematoksyliną i eozyną, znanych również jako H i E. Po wybarwieniu prześlij szkiełko H i E do oceny patologicznej. Podczas przeglądu patologicznego ekspert patolog przegląda szkiełka barwienia H i E, aby określić, gdzie w każdej tkance znajduje się tkanka będąca przedmiotem zainteresowania. Patolog najpierw przegląda całą tkankę, aby określić, gdzie w tkance znajdują się interesujące go tkanki.Po zakończeniu wstępnego przeglądu histologicznego i morfologicznego patolog używa pisaka do oznaczania slajdów do adnotacji każdego zabarwionego H i E szkiełka. Za pomocą markera patolog rysuje okrąg wokół tkanki będącej przedmiotem zainteresowania, wykluczając tkankę, która nie jest przedmiotem zainteresowania. Ten proces przeglądu jest następnie powtarzany dla wszystkich szkiełek barwionych H i E w projekcie.Skonfiguruj obszar roboczy stołu do makrosekcji, który umożliwia sekwencyjną i wydajną obsługę każdej próbki. Dla każdej próbki należy mieć pod ręką poddane patologicznie przeglądowi H i E, odpowiadające im niebarwione skrawki tkanek zamontowane na szkiełku, a także wstępnie znakowane mikroprobówki zawierające bufor trawienny do pobrania tkanek. Załaduj niepoplamione szkiełka do stojaka i przystąp do dygestorium w celu odparafinowania.Odparafinować szkiełka, zanurzając je w dwóch sekwencyjnych płukaniach nierozcieńczonym D-limonenem lub CitriSolv, a następnie w końcowym płukaniu w 100% etanolu przez dwie minuty na pranie. Na początku każdego prania delikatnie mieszaj pranie przez około pięć do 10 sekund. Aby zminimalizować przenoszenie między praniami, pozwól szkiełkom na chwilę spłynąć i przetrzyj stojak ręcznikiem papierowym.Po trzech płukaniach tkanki są teraz dobrze widoczne na szkiełkach mikroskopowych. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na powietrzu przez 10 minut. Po wyschnięciu H i E umieszcza się następnie twarzą w dół na ławce, a odparafinowaną tkankę umieszcza się na górze, również twarzą w dół, wyrównując odparafinowaną tkankę z H i E. Po prawidłowym ustawieniu, obszar guza zaznaczony przez patologa na H i E jest śledzony na odwrocie szkiełka z odparafinowaną tkanką.Teraz oznaczone niebarwione szkiełka są zanurzane w 3% roztworze glicerolu, aby zminimalizować elektryzowanie się i ułatwić gromadzenie się tkanek. Powoli zdejmuj zanurzone szkiełka, aby zminimalizować ilość roztworu glicerolu, który przylega do zanurzonego szkiełka. Po wyjęciu szkiełka wytrzyj tylną część szkiełka i wszelkie wolne od tkanek obszary z przodu szkiełka, aby usunąć nadmiar glicerolu.Następnie, używając czystego ostrza, prześledź oznaczenia patologiczne ostrzem, aby zerwać połączenie między tkanką będącą przedmiotem zainteresowania a resztą tkanki. Należy zauważyć, że ten krok można wykonać przed zanurzeniem glicerolu, szczególnie jeśli patologiczne oznaczenia są złożone, ponieważ cięcie suchej tkanki może być łatwiejsze, a także może zminimalizować ryzyko przeciągania się tkanki. Tkanka poza oznaczeniami patologicznymi nie jest interesująca.Są one usuwane za pomocą płaskiej krawędzi ostrza, upewniając się, że róg ostrza zaczepia się o zewnętrzną stronę oznaczeń patologicznych. Po usunięciu niechcianej tkanki używa się nowego ostrza do zebrania interesującej tkanki. Pobrana tkanka jest następnie usuwana z ostrza za pomocą płaskiego końca drewnianego patyczka, a następnie przenoszona do wstępnie znakowanej mikroprobówki z buforem do wytrawiania, kończąc w ten sposób wzbogacanie tkanki nowotworowej za pośrednictwem makro-rozwarstwienia, która jest teraz gotowa do ekstrakcji kwasów nukleinowych.Aby zademonstrować, w jaki sposób makrodysekcja może wpływać na dalszą analizę genomiczną, skrawki tkanek z pięciu rozlanych chłoniaków z dużych komórek B (DLBCL) o różnej zawartości guza zostały wypreparowane w skali makro lub nie zostały wypreparowane. Ekstrakcje kwasów nukleinowych przeprowadzono na pobranych tkankach, a otrzymany RNA zbadano za pomocą DLBCL90 cyfrowego testu profilowania ekspresji genów, znanego również jako test sygnatury podwójnego trafienia. DLBCL składa się z trzech odrębnych podtypów molekularnych, a mianowicie GCB, ABC i ich podtypu pośredniego oznaczonego jako niesklasyfikowany, który można określić za pomocą testu DLBCL90.Ten test jest również w stanie zidentyfikować guzy DLBCL, które zawierają translokacje podwójnego trafienia z udziałem genu BCL2. Wyniki DLBCL 90 przedstawiono w tej tabeli. Próbki wypreparowane w skali makro przeprowadzono dwukrotnie.Raz używając ich stężenia RNA i raz używając zapasu RNA rozcieńczonego w celu dopasowania do stężenia ich odpowiednich odpowiedników bez makrosekcji. Wyniki pokazują, że makro-dyssekcja spowodowała zmiany podtypu lub podwójnego trafienia w trzech z pięciu próbek. Makro-rozbiór próbki A nie miał wpływu na wywołanie podtypu, ale zmienił wywołanie podwójnego trafienia z ujemnego na niesklasyfikowane, a zmiana ta była obserwowana niezależnie od danych wejściowych RNA próbki wypreparowanej makro.W przeciwieństwie do tego, makro-rozbiór próbki C nie miał wpływu na wywołanie podwójnego trafienia, ale zmienił wywołanie podtypu z GCB na niesklasyfikowane, co również zaobserwowano niezależnie od danych wejściowych makro próbki RNA. Podobnie jak w przypadku próbki A, makroanaliza próbki E nie miała wpływu na wywołanie podtypu, ale zmieniła wywołanie podwójnego trafienia. Jednak w przypadku próbki E wywołanie zmieniło się z niesklasyfikowanego na ujemne i ponownie stało się tak niezależnie od danych wejściowych próbki RNA wypreparowanej w makro.Warto zauważyć, że to wywołanie zmienione na podwójnie ujemne ma sens biologiczny, biorąc pod uwagę, że próbka E okazała się być ABC, a translokacje podwójnego trafienia z udziałem BCL2 zostały zgłoszone jako obserwowane wyłącznie w guzach GCB. Łącznie wyniki te podkreślają znaczenie czystości guza i testów genomicznych oraz makrodysekcji jako niezawodnego narzędzia do osiągnięcia tego celu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś lepiej zrozumieć, czym jest makrodyssekcja, znaczenie przeglądu patologicznego i korzyści płynące z włączenia makrosekcji do przepływu pracy związanego z obsługą tkanek.

enhancing-tumor-content-through-tumor-macrodissection

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Film opisuje laserową sekcję 3D organotypowego modelu współhodowli z precyzją na poziomie mikronów. W modelach organotypowych 3D składniki zrębu, takie jak fibroblasty, są trójwymiarowo współhodowane z komórkami nabłonka nowotworowego. Model 3D służy jako narzędzie eksperymentalne, które umożliwia badanie inwazji i interakcji rak-zrąb w warunkach zbliżonych do fizjologicznych.

Mikrodysekcja laserowa: technika izolowania inwazyjnych komórek raka jelita grubego z modelu hodowli organotypowej 3D

Ten film opisuje metodę ręcznego makrodysekcji tkanki rakowej z niebarwionych próbek tkanek w celu uzyskania określonej tkanki nowotworowej. Wycinek tkanki może być dalej przetwarzany w celu uzyskania DNA do badań całego genomu nad nowotworami przewodu pokarmowego.

Makrodysekcja tkanki nowotworowej FFPE: technika uzyskiwania określonej tkanki nowotworowej z niebarwionych próbek

Ten film ilustruje testowanie terapii uzupełniającej lub dodatkowej na modelu mysim z niekompletnie wyciętymi guzami podskórnymi. Mysz z częściowo wyciętym guzem jest leczona przeciwciałem skierowanym przeciwko antycytotoksycznemu białku komórek regulatorowych T, potencjalnie zmniejszając odrost guza i sugerując skuteczną terapię uzupełniającą.

Terapia uzupełniająca w modelu mysim z niecałkowicie wyciętym guzem podskórnym

Ten protokół opisuje użycie mikroskopii wielofotonowej do wykonywania rozszerzonego obrazowania poklatkowego interakcji wielokomórkowych w czasie rzeczywistym, in vivo w rozdzielczości pojedynczej komórki.

Rozszerzone poklatkowe obrazowanie przyżyciowe dynamiki wielokomórkowej w czasie rzeczywistym w mikrośrodowisku guza

Tutaj opisujemy metodę rozdzielania i wzbogacania składników mikrośrodowiska immunologicznego i nieimmunologicznego guza w ustalonych guzach podskórnych. Technika ta pozwala na oddzielną analizę nacieków immunologicznych guza i nieimmunologicznych frakcji guza, co może pozwolić na kompleksową charakterystykę mikrośrodowiska immunologicznego guza.

Wzbogacenie i charakterystyka mikrośrodowisk immunologicznych i nieimmunologicznych guza w ustalonych podskórnych guzach myszy

Opisujemy dwie metody oceny przejściowej przepuszczalności naczyń krwionośnych związanych z funkcją wejścia do mikrośrodowiska guza (TMEM) i wewnątrznaczynieniem komórek rakowych za pomocą dożylnego wstrzyknięcia dekstranu o wysokiej masie cząsteczkowej (155 kDa) u myszy. Metody te obejmują obrazowanie przyżyciowe u żywych zwierząt oraz analizę tkanek utrwalonych za pomocą immunofluorescencji.

Ocena mikrośrodowiska guza przepuszczalności naczyniowej za pośrednictwem drzwi z przerzutami związanych z rozsiewaniem komórek rakowych za pomocą obrazowania przyżyciowego i analizy tkanek stałych

Mikrodysekcja laserowa (LMD) jest czułą i wysoce powtarzalną techniką, która może być wykorzystana do odkrycia ścieżek pośredniczących w heterogeniczności i inwazji glejaka. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowany protokół izolacji dyskretnych obszarów z tkanki glejaka za pomocą laserowego LMD, a następnie analizy transkryptomicznej.

Mikrodysekcja podregionów glejaka do wychwytywania laserowego w celu przestrzennej i molekularnej charakterystyki heterogeniczności wewnątrznowotworowej, onkostrumieni i inwazji

Cyfrowa adnotacja z automatyczną sekcją tkanek zapewnia innowacyjne podejście do wzbogacania guza w przypadkach o niskiej zawartości guza i jest dostosowana zarówno do parafiny, jak i mrożonych typów tkanek. Opisany przepływ pracy poprawia dokładność, odtwarzalność i przepustowość i może być stosowany zarówno w warunkach badawczych, jak i klinicznych.

Zautomatyzowany protokół preparacji w celu wzbogacenia guza w tkankach o niskiej zawartości guza

W erze immunoterapii nowotworów, zainteresowanie wyjaśnieniem dynamiki mikrośrodowiska guza znacznie wzrosło. Protokół ten szczegółowo opisuje technikę obrazowania spektrometrii mas w odniesieniu do etapów barwienia i obrazowania, które pozwalają na wysoce zmultipleksowaną analizę przestrzenną.

Poszerzanie wiedzy na temat mikrośrodowiska guza za pomocą obrazowania spektrometrią mas próbek tkanek utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie

Ten protokół opisuje wysokoprzepustowy przepływ pracy dla sterowanej przez sztuczną inteligencję segmentacji obszarów zainteresowania potwierdzonych patologicznie na podstawie barwionych, cienkich obrazów skrawków tkanek w celu wzbogacenia populacji komórek z rozdzielczością histologiczną za pomocą mikrodysekcji laserowej. Strategia ta obejmuje nowatorski algorytm umożliwiający przenoszenie znaczników oznaczających interesujące populacje komórek bezpośrednio do mikroskopów laserowych.

Uprzemysłowiona, sterowana sztuczną inteligencją mikrodysekcja laserowa do mikroskalowej analizy proteomicznej mikrośrodowiska guza

Zaproponowano nowatorską metodę skanowania 3D i wirtualnego mapowania resekcji nowotworów w celu poprawy komunikacji między multidyscyplinarnym zespołem opieki onkologicznej.

Ulepszona komunikacja brzegów guza za pomocą skanowania 3D i mapowania

Poznaj metodę makrodysekcji guza w próbkach FFPE, aby zwiększyć zawartość tkanki nowotworowej i poprawić dokładność analiz genomowych. Technika ta izoluje materiał nowotworowy, eliminując zanieczyszczenia z tkanek niebędących nowotworami.

Zwiększanie zawartości guza poprzez makrodysekcję guza

Przeglądaj więcej filmów