Zwiększanie zawartości guza poprzez makrodysekcję guza

Tkanki zatopione w parafinie lub FFPE utrwalone w formalinie są często domieszkami materiałów nowotworowych i nienowotworowych, gdzie obecność materiału nienowotworowego jest często niepożądana i może, jeśli jest obecna w dużej proporcji, znacząco wpłynąć na wyniki analizy genomowej, dlatego główną zaletą makro-rozwarstwienia w porównaniu z pracą z niewyciętymi tkankami jest to, że powstałe odparafinowane wycięte skrawki tkanki można pobrać do ekstrakcji RNA i DNA, które można następnie z pewnością wykorzystać w dalszej analizie genomicznej. Wiedząc, że wyekstrahowane materiały pochodzą z tkanek o zwiększonej zawartości guza przy minimalnym udziale zanieczyszczenia tkanek nienowotworowych. Wieloetapowy przebieg tego procesu zostanie zademonstrowany przez pana Lee Wisnera, dr Brandona Larsena i mnie Przygotowując się do cięcia tkanek, namocz bloki parafiny na lodowatej wodzie przez 10 do 15 minut.

Schładzanie bloków utwardza wosk, podczas gdy woda nawilża tkankę, co razem ułatwia cięcie tkanki. Gdy bloki znajdują się na lodzie, odpowiednio oznacz szkiełka mikroskopowe. Napełnij i podgrzej łaźnię wodną do 39 stopni Celsjusza i ustaw mikrotom na żądaną grubość cięcia.

Ostrożnie załaduj ostrze na mikrotom. Zablokuj ostrze na miejscu i umieść osłonę bezpieczeństwa, aż będziesz gotowy do rozpoczęcia dzielenia bloków. Gdy osłona bezpieczeństwa jest na swoim miejscu, włóż blok FFPE do uchwytu mikrotomowego.

Aby rozpocząć, powoli przekrój blok, aż uzyskasz pełny przekrój twarzy. Nazywa się to zwróceniem się do bloku. Gdy to zostanie osiągnięte, blok może znajdować się w sekcji szybciej, aby uzyskać wstęgę sekcji.

Po przecięciu przenieś wstęgę skrawków tkanki do ciepłej kąpieli wodnej. Użyj kleszczy, aby oddzielić pojedynczy odcinek tkanki od wstążki. Aby to zrobić, umieść tył zamkniętych zakrzywionych kleszczy na styku między dwiema sekcjami i pozwól kleszczom delikatnie się otworzyć, aby oddzielić sekcje.

Pobrać wyizolowany wycinek tkanki na szkiełku mikroskopowym. Aby uniknąć uwięzienia pęcherzyków, włóż szkiełko mikroskopowe do wody pod kątem. Delikatnie potrząśnij szkiełkiem, aby usunąć nadmiar wody przed umieszczeniem na ruszcie do wyschnięcia na powietrzu.

Po wyschnięciu wybierz co najmniej jeden ze świeżo ściętych odcinków tkanki do barwienia hematoksyliną i eozyną, znanych również jako H i E. Po wybarwieniu prześlij szkiełko H i E do oceny patologicznej. Podczas przeglądu patologicznego ekspert patolog przegląda szkiełka barwienia H i E, aby określić, gdzie w każdej tkance znajduje się tkanka będąca przedmiotem zainteresowania. Patolog najpierw przegląda całą tkankę, aby określić, gdzie w tkance znajdują się interesujące go tkanki.

Po zakończeniu wstępnego przeglądu histologicznego i morfologicznego patolog używa pisaka do oznaczania slajdów do adnotacji każdego zabarwionego H i E szkiełka. Za pomocą markera patolog rysuje okrąg wokół tkanki będącej przedmiotem zainteresowania, wykluczając tkankę, która nie jest przedmiotem zainteresowania. Ten proces przeglądu jest następnie powtarzany dla wszystkich szkiełek barwionych H i E w projekcie.

Skonfiguruj obszar roboczy stołu do makrosekcji, który umożliwia sekwencyjną i wydajną obsługę każdej próbki. Dla każdej próbki należy mieć pod ręką poddane patologicznie przeglądowi H i E, odpowiadające im niebarwione skrawki tkanek zamontowane na szkiełku, a także wstępnie znakowane mikroprobówki zawierające bufor trawienny do pobrania tkanek. Załaduj niepoplamione szkiełka do stojaka i przystąp do dygestorium w celu odparafinowania.

Odparafinować szkiełka, zanurzając je w dwóch sekwencyjnych płukaniach nierozcieńczonym D-limonenem lub CitriSolv, a następnie w końcowym płukaniu w 100% etanolu przez dwie minuty na pranie. Na początku każdego prania delikatnie mieszaj pranie przez około pięć do 10 sekund. Aby zminimalizować przenoszenie między praniami, pozwól szkiełkom na chwilę spłynąć i przetrzyj stojak ręcznikiem papierowym.

Po trzech płukaniach tkanki są teraz dobrze widoczne na szkiełkach mikroskopowych. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na powietrzu przez 10 minut. Po wyschnięciu H i E umieszcza się następnie twarzą w dół na ławce, a odparafinowaną tkankę umieszcza się na górze, również twarzą w dół, wyrównując odparafinowaną tkankę z H i E. Po prawidłowym ustawieniu, obszar guza zaznaczony przez patologa na H i E jest śledzony na odwrocie szkiełka z odparafinowaną tkanką.

Teraz oznaczone niebarwione szkiełka są zanurzane w 3% roztworze glicerolu, aby zminimalizować elektryzowanie się i ułatwić gromadzenie się tkanek. Powoli zdejmuj zanurzone szkiełka, aby zminimalizować ilość roztworu glicerolu, który przylega do zanurzonego szkiełka. Po wyjęciu szkiełka wytrzyj tylną część szkiełka i wszelkie wolne od tkanek obszary z przodu szkiełka, aby usunąć nadmiar glicerolu.

Następnie, używając czystego ostrza, prześledź oznaczenia patologiczne ostrzem, aby zerwać połączenie między tkanką będącą przedmiotem zainteresowania a resztą tkanki. Należy zauważyć, że ten krok można wykonać przed zanurzeniem glicerolu, szczególnie jeśli patologiczne oznaczenia są złożone, ponieważ cięcie suchej tkanki może być łatwiejsze, a także może zminimalizować ryzyko przeciągania się tkanki. Tkanka poza oznaczeniami patologicznymi nie jest interesująca.

Są one usuwane za pomocą płaskiej krawędzi ostrza, upewniając się, że róg ostrza zaczepia się o zewnętrzną stronę oznaczeń patologicznych. Po usunięciu niechcianej tkanki używa się nowego ostrza do zebrania interesującej tkanki. Pobrana tkanka jest następnie usuwana z ostrza za pomocą płaskiego końca drewnianego patyczka, a następnie przenoszona do wstępnie znakowanej mikroprobówki z buforem do wytrawiania, kończąc w ten sposób wzbogacanie tkanki nowotworowej za pośrednictwem makro-rozwarstwienia, która jest teraz gotowa do ekstrakcji kwasów nukleinowych.

Aby zademonstrować, w jaki sposób makrodysekcja może wpływać na dalszą analizę genomiczną, skrawki tkanek z pięciu rozlanych chłoniaków z dużych komórek B (DLBCL) o różnej zawartości guza zostały wypreparowane w skali makro lub nie zostały wypreparowane. Ekstrakcje kwasów nukleinowych przeprowadzono na pobranych tkankach, a otrzymany RNA zbadano za pomocą DLBCL90 cyfrowego testu profilowania ekspresji genów, znanego również jako test sygnatury podwójnego trafienia. DLBCL składa się z trzech odrębnych podtypów molekularnych, a mianowicie GCB, ABC i ich podtypu pośredniego oznaczonego jako niesklasyfikowany, który można określić za pomocą testu DLBCL90.

Ten test jest również w stanie zidentyfikować guzy DLBCL, które zawierają translokacje podwójnego trafienia z udziałem genu BCL2. Wyniki DLBCL 90 przedstawiono w tej tabeli. Próbki wypreparowane w skali makro przeprowadzono dwukrotnie.

Raz używając ich stężenia RNA i raz używając zapasu RNA rozcieńczonego w celu dopasowania do stężenia ich odpowiednich odpowiedników bez makrosekcji. Wyniki pokazują, że makro-dyssekcja spowodowała zmiany podtypu lub podwójnego trafienia w trzech z pięciu próbek. Makro-rozbiór próbki A nie miał wpływu na wywołanie podtypu, ale zmienił wywołanie podwójnego trafienia z ujemnego na niesklasyfikowane, a zmiana ta była obserwowana niezależnie od danych wejściowych RNA próbki wypreparowanej makro.

W przeciwieństwie do tego, makro-rozbiór próbki C nie miał wpływu na wywołanie podwójnego trafienia, ale zmienił wywołanie podtypu z GCB na niesklasyfikowane, co również zaobserwowano niezależnie od danych wejściowych makro próbki RNA. Podobnie jak w przypadku próbki A, makroanaliza próbki E nie miała wpływu na wywołanie podtypu, ale zmieniła wywołanie podwójnego trafienia. Jednak w przypadku próbki E wywołanie zmieniło się z niesklasyfikowanego na ujemne i ponownie stało się tak niezależnie od danych wejściowych próbki RNA wypreparowanej w makro

Warto zauważyć, że to wywołanie zmienione na podwójnie ujemne ma sens biologiczny, biorąc pod uwagę, że próbka E okazała się być ABC, a translokacje podwójnego trafienia z udziałem BCL2 zostały zgłoszone jako obserwowane wyłącznie w guzach GCB. Łącznie wyniki te podkreślają znaczenie czystości guza i testów genomicznych oraz makrodysekcji jako niezawodnego narzędzia do osiągnięcia tego celu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś lepiej zrozumieć, czym jest makrodyssekcja, znaczenie przeglądu patologicznego i korzyści płynące z włączenia makrosekcji do przepływu pracy związanego z obsługą tkanek.