Wizualizacja dynamiki plus-end mikrotubul w modelu choroby Huntingtona opartym na pierwotnych fibroblastach skóry człowieka
8 stycznia 2022
Ten protokół jest dedykowany do wizualizacji mikrotubul plus-end poprzez transfekcję białka EB3 w celu zbadania ich dynamicznych właściwości w pierwotnej hodowli komórkowej. Protokół został wdrożony na ludzkich pierwotnych fibroblastach skóry uzyskanych od pacjentów z chorobą Huntingtona.
Choroba Huntingtona, HD, jest nieuleczalną, neurodegeneracyjną patologią spowodowaną mutacją w genie kodującym białko huntingtyny. Huntingtyna jest przede wszystkim związana z pęcherzykami i mikrotubulami i prawdopodobnie bierze udział w procesach transportu zależnych od mikrotubul. Do zbadania wpływu zmutowanej huntingtyny na dynamikę mikrotubul wykorzystaliśmy wizualizację in vivo białka EB3, które reguluje dynamiczne właściwości mikrotubul poprzez zginanie i stabilizację rosnących końcówek dodatnich.
Aby załadować znakowany fluorescencyjnie EB3 do fibroblastów ludzkiej skóry, zastosowaliśmy transfekcję plazmidu. W tym badaniu wykorzystaliśmy pierwotną hodowlę fibroblastów w celu uzyskania z biopsji skóry pacjenta z EB3. Dostarczyć biopsję do laboratorium w ciągu kilku godzin w pożywce DMEM, uzupełnionej 15 mikrogramami na mililitr penicyliny i 50 jednostkami na mililitr streptomycyny.
Umieść tkankę biopsyjną na sześciocentymetrowej szalce Petriego wraz z niewielką ilością pożywki. Za pomocą sterylnego skalpela pokrój próbkę biopsji na kawałki o wielkości około 0,5 do jednego milimetra. Umieść jeden, dwa, uzyskane fragmenty na 3,5-centymetrowej szalce Petriego i umieść sterylną szkiełko nakrywkowe na fragmentach biopsji.
Powoli dodawaj 1,5 mililitra pożywki wzrostowej. Hodowla włókien w pożywce wzrostowej w inkubatorze CO2, w 5% CO2, czyli siedem stopni Celsjusza, wilgotność 80%. Po czterech, siedmiu dniach najpierw keratynocyty, a następnie fibroblasty zaczynają migrować z tkanki na dno naczynia.
Hodowla komórkowa. Do wizualizacji transfekcji należy używać szklanych talerzy konfokalnych, naczyń konfokalnych. Przykryj dno naczynia autoklawizowanym 0,1% roztworem żelatyny przygotowanym w wodzie destylowanej.
Inkubować przez 15 minut. Przygotuj pożywkę hodowlaną. Dokładnie wymieszaj, przechowuj wysoko w temperaturze plus 4 stopni Celsjusza.
Podgrzej podłoże do plus 37 stopni Celsjusza przed dodaniem do komórek. Oceń kulturę pod mikroskopem. Usuń pożywkę i umyj komórki sterylnym DPBS.
Dodaj jeden mililitr podgrzanego 0,25% roztworu trypsyny do komórek. Sprawdź komórki pod mikroskopem, czy całkowicie odrywają się od podłoża. Dezaktywuj trypsynę jednym mililitrem pożywki hodowlanej.
Przenieś zawiesinę komórek do 15-mililitrowej stożkowej probówki. Odwirować probówkę o stężeniu 200 G przez pięć minut. Usunąć supernatant, ponownie zawiesić paletę komórek w jednym mililitrze pożywki hodowlanej.
Policz numer komórki. Oblicz wymaganą liczbę komórek. Usuń je z gęstością od ośmiu do 15, pomnożoną przez 10 do potęgi trzech, przekroczoną przez centymetr.
Jest to przetłaczane na mililitry pożywki hodowlanej. Usuń roztwór żelatyny z naczynia hodowlanego przygotowanego do inokulacji i natychmiast dodaj dwa mililitry zawiesiny komórkowej. Hoduj fibroblasty w temperaturze plus 37 stopni Celsjusza w inkubatorze CO2.
Odświeżaj podłoże co dwa, cztery dni. Do eksperymentów użyj komórek czterech, 11 fragmentów. Do czasu transfekcji zbieg nie powinien przekraczać 70, 80%Wymień pożywkę hodowlaną na świeżą 24 godziny przed transfekcją.
Przygotuj kompleks DNA-lipid w oparciu o obszar i gęstość wysiewu komórek. Zastosowano środek do transfekcji liposomalnej i gęstość wysiewu komórek jednej, pomnożoną przez 10 do potęgi czterech komórek, przepuszczonej przez centymetr. Dodaj trzy mikrolitry komercyjnego odczynnika do 125 mikrolitrów Opti-MEM, nie zawierającego antybiotyku.
Nie dotykając ścianek rury, delikatnie zawiesić ponownie. Rozcieńczyć plazmidowe DNA, GFP-EB3, dodając jeden mikrogram plazmidowego DNA do 125 mikrolitrów OptiMEM. Delikatnie zawiesić ponownie.
Dodaj rozcieńczone plazmidowe DNA do każdej probówki rozcieńczonego odczynnika do transfekcji, w stosunku jeden do jednego. Inkubować przez 30 minut. Dodaj kompleks lipidowy DNA do sześciocentymetrowej szalki Petriego z komórkami.
Mieszaj z huśtawką w kształcie krzyża przez 30 sekund. Inkubować komórki ze środkiem do transfekcji przez 24 godziny, a następnie zmienić pożywkę na świeżą. Analizuj wydajność po kontroli w ciągu 24 i 48 godzin.
Przygotowanie do obrazowania. Przed obrazowaniem komórek na żywo zmień pożywkę hodowlaną na pożywkę bez barwnika wskaźnikowego PH, aby zmniejszyć autofluorescencję. Ostrożnie nałóż olej mineralny na pożywkę fazę komórkową, aby całkowicie pokryć pożywkę, izolując ją od środowiska zewnętrznego w celu zmniejszenia penetracji O2 i parowania pożywki.
Użyj lampy makro i uporządkuj cały obraz w 60-krotnym, 100-krotnym obiektywie z dużą przysłoną cyfrową, aby zrobić zdjęcie. W przypadku obserwacji in viva mikroskop musi być wyposażony w inkubator, aby utrzymać niezbędne warunki, aby komórki, w tym uderzenie w stół optyczny, i soczewkę, aby przeszły przez 37 stopni Celsjusza, zamknięta komora była dostarczana CO2 i utrzymywała poziom wilgotności. Przed obrazowaniem umieścić naczynie konfokalne z komórkami w uchwycie mikroskopu.
Upewnij się, że antena i aparat są bezpiecznie przymocowane do uchwytu, aby uniknąć dryfowania podczas robienia zdjęć. Ustawianie parametrów obrazowania. Wybierz niskie wartości ekspozycji, ponieważ szkiełko indukuje uszkodzenie komórek, reaguje z przestrzeniami tlenowymi.
Aby zbadać dynamikę mikrotubul w fibroblastach ludzkiej skóry, wybraliśmy 300-milisekundową ekspozycję. Skoncentruj się na obiekcie zainteresowania. W przypadku długotrwałego obrazowania poklatkowego niezbędny jest system automatycznej stabilizacji ostrości, doskonały system ustawiania ostrości, ponieważ może nastąpić przesunięcie wzdłuż ustawionej osi, a tym samym obiekt zainteresowania będzie nieostry.
Wybierz optymalne warunki obrazowania, w zależności od wrażliwości komórki na światło i szybkości blaknięcia chromu flary. Ponieważ mikrotubule są strukturami wysoce dynamicznymi, można z kolei wybrać odpowiednio krótki czas, a liczba klatek na sekundę musi być wystarczająco wysoka. Aby zbadać dynamikę mikrotubul w fibroblastach skóry, użyliśmy częstotliwości jednej klatki na sekundę przez trzy, pięć minut.
Wybierając następny obiekt, aby uzyskać obraz, odsuń się od już sfotografowanego obszaru, ponieważ pod wpływem światła występuje usuwalne krwawienie fotograficzne. Ponieważ użyliśmy stosunkowo wysokiej częstotliwości obrazowania, migawka nie zamykała się między obrazami, a lampa była spóźniona przez cały okres obrazowania, co oznacza zwiększone blaknięcie. Wybierz optymalne filmy do wizualnego badania dynamiki mikrotubul, biorąc pod uwagę jakość transfekcji, jakość obrazów mikrotubul, optymalny stosunek sygnału do szumu oraz brak dryfowania analizowanej komórki.
Wykorzystaj wybrane filmy, aby zbadać dynamikę plus-końców mikrotubul, wiążąc je w programie Fidżi. Najważniejszym krokiem w protokole jest transfekcja, zapewniająca wystarczającą ekspresję białka. Dobry stosunek sygnału do szumu, brak fotowybielania mikrotubul i brak dryfowania komórek mają kluczowe znaczenie dla obrazowania.
Wizualizacja dynamiki mikrotubul in vivo dostarcza istotnych informacji na temat właściwości zmutowanej huntingtyny. Nasz protokół może być stosowany do badań nad innymi chorobami, których patologia implikuje dynamiczne właściwości cytoszkieletu.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół koncentruje się na wizualizacji końców plus mikrotubul przy użyciu transfekcji białkiem EB3 w pierwotnych kulturach komórkowych. W szczególności analizowane są pierwotne ludzkie fibroblasty skóry pochodzące od pacjentów z chorobą Huntingtona.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Genetyka
Wstęp
- Choroba Huntingtona to schorzenie neurodegeneracyjne spowodowane mutacją w genie huntingtiny.
- Białko huntingtina wiąże się z mikrotubulami i pęcherzykami.
- Zrozumienie dynamiki mikrotubul jest kluczowe dla badania efektów działania zmutowanej huntingtiny.
- Białko EB3 odgrywa rolę w stabilizacji i regulacji dynamiki mikrotubul.
Cel badania
- Zbadanie wpływu zmutowanej huntingtyny na dynamikę mikrotubul.
- Wykorzystanie wizualizacji białka EB3 do badania zachowania mikrotubul.
- Zastosowanie w badaniach pierwotnych kultur fibroblastów pochodzących od pacjentów z chorobą Huntingtona.
Zastosowane metody
- Transfekcja plazmidem w celu wprowadzenia znakowanego fluorescencyjnie białka EB3 do fibroblastów.
- Pierwotna hodowla fibroblastów uzyskana z biopsji skóry pacjentów z chorobą Huntingtona.
- Transport biopsji w podłożu DMEM z antybiotykami.
- Techniki wizualizacji in vivo do obserwacji dynamiki mikrotubul.
Główne wyniki
- Pomyślna wizualizacja końców plus mikrotubul w pierwotnych fibroblastach.
- Wgląd w dynamiczne właściwości mikrotubul pod wpływem zmutowanej huntingtyny.
- Wykazanie skuteczności białka EB3 w badaniu zachowania mikrotubul.
- Opracowanie protokołu do przyszłych badań nad dynamiką mikrotubul w chorobach neurodegeneracyjnych.
Wnioski
- Protokół ten umożliwia szczegółowe badanie dynamiki mikrotubul w chorobie Huntingtona.
- Wizualizacja EB3 stanowi wartościowe narzędzie do zrozumienia zachowania mikrotubul.
- Wyniki mogą przyczynić się do szerszego zrozumienia mechanizmów neurodegeneracyjnych.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejszy protokół umożliwia wizualizację dynamiki końców plus mikrotubul w ludzkich pierwotnych fibroblastach, zapewniając system istotny w kontekście chorób, służący do mechanistycznego ograniczania ryzyka podczas walidacji celów terapeutycznych w chorobach neurodegeneracyjnych. Dzięki zastosowaniu komórek pochodzących od pacjentów oraz znakowaniu białka EB3, metoda ta wspiera pewność prognostyczną w ocenie wpływu zmutowanej huntingtyny na mechanizmy transportu cytoszkieletowego. Podejście to łączy wczesny etap odkrywania z dostrojeniem biomarkerów translacyjnych poprzez ilościowe, oparte na obrazowaniu odczyty dynamiki subkomórkowej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikacja hipotezy terapeutycznej dotyczącej wpływu zmutowanej huntingtyny na transport zależny od mikrotubul.
- Wartość operacyjna: Umożliwia funkcjonalną walidację celu poprzez bezpośrednią wizualizację dynamiki cytoszkieletu w fibroblastach pochodzących od pacjentów.
- Wartość prognostyczna: Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez powiązanie mutacji genetycznej ze zmianami fenotypowymi na poziomie subkomórkowym.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do dalszego screeningu związków poprzez ustalenie bazowej dynamiki mikrotubul.
- Wartość operacyjna: Dostarcza ilościowe, powtarzalne wyniki za pomocą obrazowania poklatkowego oraz analizy szybkości wzrostu końców plus za pomocą programu ImageJ.
- Wartość skalowalności: Umożliwia ponowne wykorzystanie platformy w modelach chorób neurodegeneracyjnych przy zastosowaniu zestandaryzowanych parametrów transfekcji i obrazowania.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Zachowuje istotność w kontekście choroby dzięki wykorzystaniu fibroblastów skóry pacjentów z chorobą Huntingtona, co wspiera dostrojenie translacyjnych biomarkerów.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia do walidacji przedklinicznej poprzez zachowanie natywnego zachowania cytoszkieletu w komórkach pierwotnych.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Umożliwia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez kwantyfikację dynamicznych zaburzeń związanych z ekspresją patogennych białek.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków, od weryfikacji hipotez dotyczących celu molekularnego po identyfikację związku wiodącego, w szczególności w odniesieniu do szlaków neurodegeneracyjnych związanych z dysfunkcją cytoszkieletu. Umożliwia ona wczesną ocenę oddziaływania na cel poprzez bezpośrednią obserwację dynamiki mikrotubul w genetycznie odpowiednich modelach komórkowych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez dotyczących wpływu zmutowanej huntingtiny na stabilność mikrotubul oraz procesy transportu.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość testu poprzez standaryzowaną transfekcję, wizualizację niskiej ekspresji oraz kontrole środowiskowe w celu zminimalizowania fototoksyczności.
- Analityka: Generuje ilościowe pomiary zmiennych zależnych (np. prędkość wzrostu, częstotliwość zatrzymań), umożliwiając porównanie warunków i analizę statystyczną.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną dzięki zastosowaniu komórek pochodzących od pacjentów oraz odczytów cytoszkieletu istotnych dla przebiegu choroby.
- Ponowne wykorzystanie w organizacji: Tworzy reużywalną platformę obrazowania, którą można zastosować w przypadku wielu celów neurodegeneracyjnych poza chorobą Huntingtona.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zapewnia pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez zmniejszenie niejednoznaczności mechanistycznej w dysfunkcji cytoszkieletu.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i powtarzalność dzięki zdefiniowanej gęstości transfekcji, parametrom obrazowania i analizie regionalnej (centrosom, lamella, ogon).
- Wartość strategiczna: Usprawnia decyzje typu go/no-go poprzez powiązanie fenotypu molekularnego z funkcją komórkową, co zmniejsza biologiczne ryzyko na późnych etapach.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o mierzalne fenotypy dynamiczne w systemach istotnych dla danej choroby.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie pierwotnych kultur komórkowych, optymalizacji transfekcji oraz obrazowania żywych komórek.
- Zależne od zastosowania mikroskopii konfokalnej z kontrolą parametrów środowiskowych (37°C, 5% CO2, wilgotność) oraz konfiguracji o niskiej fototoksyczności.
- Konieczna jest standaryzacja w obrębie zespołów w zakresie wydajności transfekcji, poziomów ekspresji oraz wyboru obszarów zainteresowania (ROI).
- Należy uwzględnić adaptację w różnych systemach modelowych ze względu na zmienność morfologii fibroblastów i organizacji mikrotubul.
- Ograniczenie praktyczne: wymagane są niskie poziomy transfekcji, aby uniknąć stabilizacji mikrotubul, co ogranicza stosunek sygnału do szumu i wymaga detekcji o wysokiej czułości.
