Name: Wizualizacja dynamiki plus-end mikrotubul w modelu choroby Huntingtona opartym na pierwotnych fibroblastach skóry człowieka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: Poznaj wizualizację dynamiki mikrotubul z użyciem białka EB3 w pierwotnych fibroblastach skóry pacjentów z chorobą Huntingtona. Ta metoda umożliwia badanie wpływu mutowanego huntingtyny na cytoszkielet.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało sfinansowane przez Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego Federacji Rosyjskiej, grant nr 075-15-2019-1669 (transfekcja fibroblastów), przez Rosyjską Fundację Naukową, grant nr 19-15-00425 (wszystkie inne prace nad hodowlą fibroblastów in vitro). Był on częściowo wspierany przez program rozwojowy Moskiewskiego Uniwersytetu Państwowego im. Łomonosowa PNR5.13 (obrazowanie i analiza). Autorzy dziękują za wsparcie Centrum Doskonałości firmy Nikon w Instytucie Biologii Fizyko-Chemicznej im. A. N. Biełozierskiego. Szczególne podziękowania kierujemy do Ekateriny Taran za pomoc, pomoc w podkładaniu głosu. Autorzy dziękują również Pavlowi Belikovowi za pomoc w montażu wideo. Figury w rękopisie zostały stworzone przy użyciu BioRender.com.

Ten protokół jest zgodny z wytycznymi Federalnego Centrum Badań i Klinicznych Medycyny Fizyko-Chemicznej Federalnej Medycznej Agencji Biologicznej z dnia 08 września 2015 roku.
UWAGA: Rysunek 1 przedstawia przegląd protokołu.
1. Uzyskanie pierwotnej kultury fibroblastów ludzkiej skóry (<silna klasa="xfig">Rysunek 2)
<ol>
	<li>Dostarczyć biopsję do laboratorium w ciągu kilku godzin w pożywce Modified Eagle Media (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionej 50 μg/ml penicyliny i 50 U/ml streptomycyny. 
	UWAGA: Biopsja skóry musi być wykonana w sterylnych warunkach przez lekarza po podpisaniu przez pacjenta świadomej zgody.</li>
	<li>Umieścić tkankę biopsyjną na szalce Petriego o średnicy 6 cm razem z niewielką ilością pożywki.</li>
	<li>Za pomocą sterylnego skalpela pokrój próbkę biopsji na kawałki o wielkości około 0,5-1 mm. Umieść 1-2 uzyskane fragmenty na szalce Petriego o średnicy 3,5 cm i umieść sterylne szkiełko nakrywkowe na fragmentach biopsji. Powoli dodaj 1,5 ml pożywki wzrostowej do następującej kompozycji: DMEM, 50 U/ml penicyliny-streptomycyny i 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS).</li>
	<li>Hodowla fibroblastów w pożywce wzrostowej w inkubatorze CO2 utrzymywanym w temperaturze 5% CO2 , 37 °C, 80% wilgotności. 
	UWAGA: Po 4-7 dniach najpierw keratynocyty, a następnie fibroblasty zaczynają migrować z tkanki na dno naczynia.</li>
</ol>
2. Przechowywanie, zamrażanie i rozmrażanie kultury pierwotnej
<ol>
	<li>Usunąć komórki z szalki hodowlanej (patrz punkty 3.2-3.4).</li>
	<li>Przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować przez 5 minut przy 200 x g. Następnie wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 900 μl schłodzonego FBS.</li>
	<li>Przenieś kropla po kropli do probówki do kriokonserwacji i dodaj 100 μl dimetylosulfotlenku (DMSO).</li>
	<li>Umieścić kriosondę w zamrażarce o niskiej temperaturze -80 °C. Dwadzieścia cztery godziny później przenieść kriosondę do ciekłego azotu (-196 °C) w celu długotrwałego przechowywania.</li>
	<li>W celu rozmrożenia kriokonserwowanych komórek należy wyjąć kriowial z magazynu azotu i w ciągu 1 minuty przenieść 1 ml zawartości do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 9 ml pożywki transportowej podgrzanej do temperatury 37 °C.</li>
	<li>Ostrożnie zawiesić, a następnie odwirować probówkę przez 5 minut przy 200 x g. Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić osad komórkowy w wymaganej objętości pożywki wzrostowej i umieścić go na szalce Petriego o wymaganej średnicy.</li>
</ol>
3. Hodowla komórek
<ol>
	<li>Przykryj dno naczynia autoklawowanym 0,1% roztworem żelatyny przygotowanym w wodzie destylowanej. Inkubować przez 15 min. 
	UWAGA: Do wizualizacji transfekcji należy używać talerzy ze szklanym dnem (naczynia konfokalne o grubości szkła 170 μm).</li>
	<li>Przygotować pożywkę hodowlaną o następującym składzie: DMEM uzupełniony 10% FBS, 2 mM L-alanylo-L-glutaminy, 50 U/ml penicyliny-streptomycyny. Dokładnie wymieszać i przechowywać w temperaturze 4 °C. Podgrzać podłoże do temperatury 37 °C przed dodaniem do komórek.</li>
	<li>Oceń kulturę pod mikroskopem. Usuń pożywkę i przemyj fibroblasty roztworem soli fosforanowej (DPBS) firmy Dulbecco.</li>
	<li>Dodaj 1 ml podgrzanego 0,25% roztworu trypsyny do komórek. Sprawdź komórki pod mikroskopem, czy całkowicie odrywają się od podłoża. Dezaktywować trypsynę za pomocą 1 ml pożywki hodowlanej.</li>
	<li>Przenieść zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Odwirować probówkę o stężeniu 200 x g przez 5 minut, usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml pożywki hodowlanej.</li>
	<li>Policz liczbę komórek. Obliczyć wymaganą liczbę komórek do ich wysiewu o gęstości 8-15 x 103/cm2 i ponownie zawiesić w 2 ml pożywki hodowlanej.</li>
	<li>Usunąć roztwór żelatyny z naczynia hodowlanego i natychmiast dodać 2 ml zawiesiny komórkowej. Hodować fibroblasty w temperaturze 37 °C w inkubatorze CO2 .</li>
	<li>Odświeżaj podłoże co 2-4 dni. 
	UWAGA: Do eksperymentów użyj komórek 4-11 pasaży.</li>
</ol>
4. Transfekcja
<ol>
	<li>Zastąp pożywkę żywą świeżą pożywką hodowlaną na 24 godziny przed transfekcją. 
	UWAGA: Zbieg komórek powinien wynosić 70-80%.</li>
	<li>Przygotuj kompleks DNA-lipid w oparciu o obszar i gęstość wysiewu komórek. Użyj środka do transfekcji na bazie liposomów. 
	UWAGA: Użyj gęstości wysiewu komórek jako 1 x 104 komórki/cm2.</li>
	<li>Dodać 3 μl dostępnego w handlu odczynnika do transfekcji do 125 μl optymalnej minimalnej pożywki niezbędnej (Opti-MEM) niezawierającej żadnych antybiotyków, nie dotykając ścianek probówki. Delikatnie zawiesić ponownie.</li>
	<li>Rozcieńczyć plazmidowy DNA (GFP-EB3) dodając 1 μg plazmidowego DNA do 125 μl Opti-MEM. Delikatnie ponownie zawiesić. 
	UWAGA: Kodowanie wektora wyrażeń GFP-EB311 zostało otrzymane jako miły prezent od dr I. Kaveriny (Vanderbilt University, Nashville) za zgodą dr A. Akhmanova (Erasmus University, Rotterdam)11.</li>
	<li>Dodać rozcieńczone plazmidowe DNA do każdej probówki z rozcieńczonym odczynnikiem do transfekcji (1:1). Inkubować przez 30 minut.</li>
	<li>Dodać kompleks DNA-lipid do 6-centymetrowej szalki Petriego zawierającej komórki i mieszać z huśtawką w kształcie krzyża przez 30 s. Inkubować komórki ze środkiem transfekcyjnym przez 24 godziny, a następnie zmienić na świeże podłoże. Analizuj skuteczność transfekcji po 24 h i 48 h. 
	UWAGA: 24 h po transfekcji sprawność wynosiła 10-15%, a po 48 h do 40%.</li>
</ol>
5. Przygotowanie do obrazowania
<ol>
	<li>Przed obrazowaniem komórek na żywo zmień pożywkę hodowlaną na pożywkę bez barwnika wskaźnikowego pH, aby zmniejszyć autofluorescencję.</li>
	<li>Ostrożnie nałożyć olej mineralny na powierzchnię podłoża, aby całkowicie pokryć podłoże, izolując je od środowiska zewnętrznego w celu zmniejszenia penetracjiO2 i parowania medium.</li>
	<li>Do wykonania zdjęć należy użyć lampy rtęciowej i obiektywu 60x lub 100x z dużym otworem przysłony cyfrowej. 
	UWAGA: W przypadku obserwacji in vivo mikroskop musi być wyposażony w inkubator w celu utrzymania niezbędnych warunków dla komórek, w tym podgrzanie stołu obiektowego i soczewki do +37 °C, zamkniętą komorę z dopływem CO2 oraz regulator poziomu wilgotności. Użyj podwójnie destylowanej wody, aby wytworzyć wilgoć. Sprawdź poziom podwójnie destylowanej wody przed filmowaniem.</li>
	<li>Umieść naczynie konfokalne z komórkami w uchwycie mikroskopu przed obrazowaniem. Upewnij się, że antena i aparat są bezpiecznie przymocowane do uchwytu, aby uniknąć dryfowania podczas robienia zdjęć.</li>
</ol>
6. Ustawianie parametrów obrazowania
<ol>
	<li>Wybierz niskie wartości ekspozycji, ponieważ światło indukuje uszkadzające komórki reaktywne formy tlenu (ROS). 
	UWAGA: Aby zbadać dynamikę mikrotubul w fibroblastach ludzkiej skóry, wybrano ekspozycję 300 ms.</li>
	<li>Skoncentruj się na obiekcie zainteresowania. 
	UWAGA: W przypadku długotrwałego obrazowania poklatkowego należy użyć systemu automatycznej stabilizacji ostrości, aby skompensować możliwe przesunięcie wzdłuż osi z.</li>
	<li>Wybierz optymalne warunki obrazowania w zależności od wrażliwości komórek na światło i szybkości blaknięcia fluorochromu. 
	UWAGA: Ponieważ mikrotubule są strukturami wysoce dynamicznymi, można wybrać rozsądnie krótki przedział czasu, a liczba klatek na sekundę musi być wystarczająco wysoka. Do zbadania dynamiki mikrotubul w fibroblastach skóry stosowaliśmy z częstotliwością 1 klatki/s przez 3-5 minut.</li>
	<li>Wybierając następny obiekt, aby uzyskać obraz, odsuń się od już zobrazowanego obszaru. Ponieważ obszar ten był pod wpływem światła, zauważalne będzie fotowybielanie. 
	UWAGA: Ponieważ zastosowano stosunkowo wysoką częstotliwość obrazowania, migawka nie zamykała się między obrazami, a lampa świeciła przez cały okres obrazowania, dlatego zwiększyło się blaknięcie.</li>
	<li>Wybierz optymalny film do wizualnego badania dynamiki mikrotubul, biorąc pod uwagę jakość transfekcji, jakość obrazów mikrotubul (optymalny stosunek sygnału do szumu) oraz brak dryftu w przypadku analizowanej komórki (<silna klasa="xfig">Rysunek 3).</li>
	<li>Wykorzystaj wybrane filmy, aby zbadać dynamikę plus-końcówek mikrotubul, śledząc je w programie ImageJ lub Fiji (<silna klasa="xfig">Rysunek 4). 
	UWAGA: Instrukcje dotyczące analizy ilościowej znajdują się na rysunku uzupełniającym 2 i pliku uzupełniającym 1.</li>
</ol>

<ol><li>Engelender, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin-associated+Protein+1+%28HAP1%29+Interacts+with+the+p150+Glued+Bubunit+of+Dynactin%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Huntingtin-associated Protein 1 (HAP1) Interacts with the p150 Glued Bubunit of Dynactin.</a> Human Molecular Genetics. 6 (13), 2205-2212 (1997).</li>
<li>Caviston, J. P., Ross, J. L., Antony, S. M., Tokito, M., Holzbaur, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin+facilitates+dynein%2Fdynactin-mediated+vesicle+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Huntingtin facilitates dynein/dynactin-mediated vesicle transport.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (24), 10045-10050 (2007).</li>
<li>MacMillan, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+analysis+and+clinical+correlations+of+the+Huntington%27s+disease+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Molecular analysis and clinical correlations of the Huntington's disease mutation.</a> The Lancet. 342 (8877), 954-958 (1993).</li>
<li>Proskura, A. L., Vechkapova, S. O., Zapara, T. A., Ratushniak, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-protein+interactions+of+huntingtin+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein-protein interactions of huntingtin in the hippocampus.</a> Molecular Biology. 51 (4), 647-653 (2017).</li>
<li>Steffan, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Huntington%27s+disease+protein+interacts+with+p53+and+CREB-binding+protein+and+represses+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">The Huntington's disease protein interacts with p53 and CREB-binding protein and represses transcription.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (12), 6763-6768 (2000).</li>
<li>Nekrasov, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manifestation+of+Huntington%27s+disease+pathology+in+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurodegeneration%22%5BJournal%5D)">Manifestation of Huntington's disease pathology in human induced pluripotent stem cell-derived neurons.</a> Molecular Neurodegeneration. 11 (1), 1-15 (2016).</li>
<li>Mitchison, T., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+instability+of+microtubule+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dynamic instability of microtubule growth.</a> Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).</li>
<li>Walker, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+instability+of+individual+microtubules+analyzed+by+video+light+microscopy%3A+rate+constants+and+transition+frequencies%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Dynamic instability of individual microtubules analyzed by video light microscopy: rate constants and transition frequencies.</a> The Journal of Cell Biology. 107 (4), 1437-1448 (1988).</li>
<li>Desai, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+polymerization+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Microtubule polymerization dynamics.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 13 (1), 83-117 (1997).</li>
<li>Allen, C., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+polarity+and+directional+growth+of+microtubules+of+Chlamydomonas+flagella%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural polarity and directional growth of microtubules of Chlamydomonas flagella.</a> Journal of Molecular Biology. 90 (2), 381-402 (1974).</li>
<li>Stepanova, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+microtubule+growth+in+cultured+neurons+via+the+use+of+EB3-GFP+%28end-binding+protein+3-green+fluorescent+protein%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein).</a> Journal of Neuroscience. 23 (7), 2655-2664 (2003).</li>
<li>Shelden, E., Wadsworth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observation+and+quantification+of+individual+microtubule+behavior+in+vivo%3A+microtubule+dynamics+are+cell-type+specific%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Observation and quantification of individual microtubule behavior in vivo: microtubule dynamics are cell-type specific.</a> Journal of Cell Biology. 120 (4), 935-945 (1993).</li>
<li>O'Brien, E. T., Salmon, E. D., Walker, R. A., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+magnesium+on+the+dynamic+instability+of+individual+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Effects of magnesium on the dynamic instability of individual microtubules.</a> Biochemistry. 29 (28), 6648-6656 (1990).</li>
<li>Drechsel, D. N., Hyman, A. A., Cobb, M. H., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+the+dynamic+instability+of+tubulin+assembly+by+the+microtubule-associated+protein+tau%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Modulation of the dynamic instability of tubulin assembly by the microtubule-associated protein tau.</a> Molecular Biology of the Cell. 3 (10), 1141-1154 (1992).</li>
<li>Gildersleeve, R. F., Cross, A. R., Cullen, K. E., Fagen, A. P., Williams, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubules+grow+and+shorten+at+intrinsically+variable+rates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Microtubules grow and shorten at intrinsically variable rates.</a> Journal of Biological Chemistry. 267 (12), 7995-8006 (1992).</li>
<li>Penazzi, L., Bakota, L., Brandt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+dynamics+in+neuronal+development%2C+plasticity%2C+and+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22International+Review+of+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Microtubule dynamics in neuronal development, plasticity, and neurodegeneration.</a> International Review of Cell and Molecular Biology. 321, 89-169 (2016).</li>
<li>van de Willige, D., Hoogenraad, C. C., Akhmanova, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+plus-end+tracking+proteins+in+neuronal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Microtubule plus-end tracking proteins in neuronal development.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (10), 2053-2077 (2016).</li>
<li>Applegate, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((plusTipTracker%3A+Quantitative+image+analysis+software+for+the+measurement+of+microtubule+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">plusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics.</a> Journal of Structural Biology. 176 (2), 168-184 (2011).</li>
<li>Komarova, Y. A., Vorobjev, I. A., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+cycle+of+MTs%3A+persistent+growth+in+the+cell+interior%2C+asymmetric+transition+frequencies+and+effects+of+the+cell+boundary%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Life cycle of MTs: persistent growth in the cell interior, asymmetric transition frequencies and effects of the cell boundary.</a> Journal of Cell Science. 115 (17), 3527-3539 (2002).</li>
<li>Nahidiazar, L., Agronskaia, A. V., Broertjes, J., vanden Broek, B., Jalink, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+imaging+conditions+for+demanding+multi-color+super+resolution+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Optimizing imaging conditions for demanding multi-color super resolution localization microscopy.</a> PLoS One. 11 (7), 0158884(2016).</li>
<li>Dixit, R., Cyr, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+damage+and+reactive+oxygen+species+production+induced+by+fluorescence+microscopy%3A+effect+on+mitosis+and+guidelines+for+non-invasive+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy.</a> The Plant Journal. 36 (2), 280-290 (2003).</li>
<li>Grzelak, A., Rychlik, B., Bartosz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-dependent+generation+of+reactive+oxygen+species+in+cell+culture+media%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Light-dependent generation of reactive oxygen species in cell culture media.</a> Free Radical Biology and Medicine. 30 (12), 1418-1425 (2001).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Lepszej jakości wyniki analizy dynamiki mikrotubul można uzyskać z wysokiej jakości obrazów mikroskopowych. Ważne jest, aby zachować wszystkie warunki niezbędne do obrazowania poklatkowego żywych komórek i prawidłowo dostosować parametry obrazowania. Ważne jest stosowanie specjalnych naczyń do hodowli komórkowych ze szklanym dnem (naczynia konfokalne), ponieważ szkło ma inny współczynnik załamania światła niż plastik. Niezwykle ważna jest również grubość szkła i jego jednorodność na całej jego powierzchni, ponieważ param...

Choroba Huntingtona (HD) jest nieuleczalną chorobą neurodegeneracyjną spowodowaną mutacją w genie kodującym białko huntingtyny (HTT). HTT jest przede wszystkim związany z pęcherzykami i mikrotubulami i prawdopodobnie bierze udział w procesach transportu zależnych od mikrotubul1,2. Do zbadania wpływu zmutowanego HTT na dynamikę mikrotubul wykorzystano wizualizację in vitro białka EB3, które reguluje dynamiczne właściwości mikrotubul poprzez wiązanie i stabilizację rosnących plus-endów. Aby załadować znakowany fluorescencyjnie EB3 do fibroblastów ludzkiej skóry, zastosowano transfekcję plazmidu. Do tego badania wykorzystaliśmy pierwotną hodowlę fibroblastów uzyskaną z biopsji skóry pacjentów z HD.
Mutacja w genie białka HTT prowadzi do wydłużenia przewodu poliglutaminowego3. HTT odgrywa rolę w takich procesach komórkowych jak endocytoza4, transport komórek1,2, degradacja białek5, itd. Znaczna część tych procesów obejmuje różne elementy cytoszkieletu komórkowego, w tym mikrotubule.
Ludzkie komórki pierwotne są najlepszym modelem do jak najdokładniejszego odtwarzania zdarzeń zachodzących w komórkach pacjenta. Aby stworzyć takie modele, należy wyizolować komórki z ludzkiego materiału biopsyjnego (np. z próbek chirurgicznych). Uzyskana w ten sposób pierwotna linia komórkowa nadaje się do badania patogenezy przy użyciu różnych metod genetycznych, biochemicznych, molekularnych i biologii komórki. Również ludzkie pierwotne hodowle komórkowe służą jako prekursor do tworzenia różnych kultur transzróżnicowanych i transgenicznych6.
Jednakże, w przeciwieństwie do unieśmiertelnionych kultur komórkowych, istotną wadą komórek pierwotnych jest ich ograniczona zdolność przejścia. Dlatego zalecamy stosowanie komórek we wczesnej fazie pasaży (do 15). Starsze kultury bardzo szybko się degenerują, tracąc swoje unikalne właściwości. W związku z tym nowo uzyskane komórki pierwotne powinny być przechowywane w stanie zamrożonym do długotrwałego przechowywania.
Pierwotne hodowle komórkowe są podatne na warunki uprawy. Dlatego często wymagają unikalnego podejścia i optymalizacji warunków uprawy. W szczególności pierwotne fibroblasty ludzkiej skóry używane w naszych eksperymentach są wymagające dla substratu. W związku z tym zastosowaliśmy różne dodatkowe powłoki (np. żelatynę lub fibronektynę) w zależności od rodzaju eksperymentu.
Cytoszkielet komórki określa kształt komórki, ruchliwość i lokomocję. Dynamika cytoszkieletu ma kluczowe znaczenie dla wielu procesów wewnątrzkomórkowych zarówno w interfazie, jak i mitozie. W szczególności cytoszkielet polimeryzowany z tubuliny jest wysoce dynamicznym i polarnym strukturą, umożliwiającą ukierunkowany transport wewnątrzkomórkowy za pośrednictwem białka motorycznego. Końce mikrotubul są w ciągłym przegrupowaniu, ich fazy składania przeplatają się z fazami demontażu, a to zachowanie nazywa się "niestabilnością dynamiczną"7,8,9. Różne powiązane białka zmieniają równowagę reakcji polimeryzacji, prowadząc albo do tworzenia polimeru, albo do tworzenia monomeru białkowego. Dodanie podjednostek tubuliny następuje głównie na dodatnim końcu mikrotubul10. Rodzina białek wiążących koniec (EB) składa się z trzech członków: EB1, EB2 i EB3. Służą one jako białka śledzące plus-end (+TIP) i regulują dynamiczne właściwości mikrotubul poprzez wiązanie i stabilizację ich rosnących plus-ends11.
Wiele badań wykorzystuje mikroiniekcję lub transfekcję tubuliny znakowaną cząsteczkami fluorescencyjnymi z obrazowaniem poklatkowym i analizą wideo do wizualizacji mikrotubul in vitro. Metody te mogą być inwazyjne i szkodliwe dla komórek, zwłaszcza pierwotnych komórek ludzkich. Najtrudniejszym krokiem jest znalezienie warunków do transfekcji komórek. Staraliśmy się osiągnąć jak najwyższy poziom transfekcji bez wpływu na żywotność i natywną morfologię komórek. W badaniu zastosowano klasyczną metodę do badania różnic w dynamice mikrotubul w fibroblastach skóry zdrowych dawców i pacjentów z chorobą Huntingtona.

<table><tbody><tr><td>Oprzyrządowanie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Camera iXon DU897 EMCCD</td><td>Andor Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Wirówka 5804 R</td><td>Eppendorf Corporate</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw filtrów fluorescencyjnych HYQ FITC</td><td>Nikon</td><td></td><td>Alternatywa: Leica, Olympus, Zeiss</td></tr><tr><td>LUNA-II Automated Cell Counte</td><td>Logos Biosystems</td><td>L40002</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator mikroskopowy do dożywotniego filmowania</td><td>Okolab</td><td>Regulator temperatury H301-T-UNIT-BL-PLUS</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>Kontroler gazu CO2-O2-UNIT-BL</td><td></td></tr><tr><td>Soczewka obiektywu CFI Plan Apo Lambda 60x Oil 1.4 (WD 0.13)</td><td>Nikon</td><td></td><td>Alternatywa: Leica, Olympus, Zeiss</td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny szerokokątny Eclipse Ti-E</td><td>Nikon</td><td></td><td>Alternatywa: Leica, Olympus, Zeiss&lt;</td></tr><tr><td>strong&gt;Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiji (Image J version 2.1.0/1.53c)</td><td>Oprogramowanie</td><td></td><td></td>do przetwarzania obrazów</tr><tr><td>Open source NIS</td><td>Elements Nikon</td><td></td><td>Alternatywa: Leica, Olympus, Zeiss</td></tr><tr><td>Dodatkowe odczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olej mineralny (jasnobiały olej)</td><td>MP</td><td>151694</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture dish</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Culture Dish</td><td>SPL Lifesciences</td><td>20035</td><td></td></tr><tr><td>Confocal Dish (grubość szkła 170 µ m)</td> <td>SPL Lifesciences</td><td>211350</td><td>Alternatywa:</td></tr><tr><td>Stożkowa probówka wirówkowa</td> MatTek <td>SPL Lifesciences</td><td>50015</td><td></td></tr><tr><td>Fiolki kriogeniczne</td><td>Corning-Costar</td><td>430659</td><td></td></tr><tr><td>Gniazdo probówek do mikrowirówek</td><td></td><td>615001</td><td></td></tr><tr><td>Cultivation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000 Odczynnik do transfekcji</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L3000001</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek</td><td>PanEko</td><td><img alt="Równanie 1" src="/files/ftp_upload/62963/62963eq01.jpg">135</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Media)</td><td>PanEko</td><td>C420<img alt="Równanie 2" src="/files/ftp_upload/62963/62963eq02.jpg"></td><td></td></tr><tr><td>DPBS (Dulbecco's roztwór soli fosforanowej)</td><td>PanEko</td><td>P060<img alt="Równanie 2" src="/files/ftp_upload/62963/62963eq02.jpg"></td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu (FBS)</td><td>Hyclon</td><td>K053/SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Żelatyna (skóra bydlęca)</td><td>PanEko</td><td><img alt="Równanie 1" src="/files/ftp_upload/62963/62963eq01.jpg">070</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050038</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM (1x) + Glutamax</td><td>Gibco</td><td>519850026</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna</td><td>PanEko</td><td>A063<img alt="Równanie 2" src="/files/ftp_upload/62963/62963eq02.jpg"></td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,25%)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>Transfekcja</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plazmidowe DNA z EB3-GFP</td><td>Uprzejmy dar dr I. Kaveriny [Vanderbilt University, Nashville] za zgodą dr A. Akhmanova [Erasmus University, Rotterdam]</td><td>Stepanova et al., 2003 DOI: 10.1523/JNEUROSCI.23-07-02655.2003</td><td></td></tr></tbody></table>

wizualizacja dynamiki plus-end mikrotubul w modelu choroby huntingtona opartym na pierwotnych fibroblastach skóry człowieka

Microtubule Plus-End Dynamics Visualization in Huntington's Disease Model based on Human Primary Skin Fibroblasts

Transfekcja z fluorescencyjnie znakowanym białkiem markerowym w połączeniu z poklatkową mikroskopią wideo jest klasyczną metodą badania dynamicznych właściwości cytoszkieletu. Protokół ten oferuje technikę transfekcji pierwotnej fibroblastów u ludzi, która może być trudna ze względu na specyfikę warunków pierwotnej hodowli komórek. Dodatkowo, utrzymanie właściwości dynamicznych cytoszkieletu wymaga niskiego poziomu transfekcji, aby uzyskać dobry stosunek sygnału do szumu bez powodowania stabilizacji mikrotubul. Ważne jest, aby podjąć środki w celu ochrony komórek przed stresem wywołanym światłem i blaknięciem barwnika fluorescencyjnego. W trakcie naszej pracy przetestowaliśmy różne metody i protokoły transfekcji, a także różne wektory, aby wybrać najlepszą kombinację warunków odpowiednich do badań pierwotnych fibroblastów u ludzi. Przeanalizowaliśmy powstałe filmy poklatkowe i obliczyliśmy dynamikę mikrotubul za pomocą ImageJ. Dynamika końców dodatnich mikrotubul w różnych częściach komórek nie jest podobna, dlatego podzieliliśmy analizę na podgrupy - region centrosomów, blaszkę i ogon fibroblastów. Warto zauważyć, że protokół ten może być wykorzystany do analizy in vitro dynamiki cytoszkieletu w próbkach pobranych od pacjentów, umożliwiając kolejny krok w kierunku zrozumienia dynamiki rozwoju różnych chorób.

Filmy GFP-EB3 uzyskane zgodnie z protokołem (Rysunek 1) ilustrują dynamiczne właściwości mikrotubul. Mikrotubule biorą udział w różnych procesach komórkowych, a ich właściwości dynamiczne wpływają na różnorodne cechy życiowe pierwotnej hodowli komórek ludzkich pochodzących z materiału z biopsji pacjentów (Rysunek 2).
O dynamicznej niestabilności mikrotubul decydują następujące parametry: szybkość wzrostu (polimeryzacji) i skracania si...

Ten protokół jest dedykowany do wizualizacji mikrotubul plus-end poprzez transfekcję białka EB3 w celu zbadania ich dynamicznych właściwości w pierwotnej hodowli komórkowej. Protokół został wdrożony na ludzkich pierwotnych fibroblastach skóry uzyskanych od pacjentów z chorobą Huntingtona.

Wizualizacja dynamiki plus-end mikrotubul w modelu choroby Huntingtona opartym na pierwotnych fibroblastach skóry człowieka

Transfection with a fluorescently labeled marker protein of interest in combination with time-lapse video microscopy is a classic method of studying the ...

Choroba Huntingtona, HD, jest nieuleczalną, neurodegeneracyjną patologią spowodowaną mutacją w genie kodującym białko huntingtyny. Huntingtyna jest przede wszystkim związana z pęcherzykami i mikrotubulami i prawdopodobnie bierze udział w procesach transportu zależnych od mikrotubul. Do zbadania wpływu zmutowanej huntingtyny na dynamikę mikrotubul wykorzystaliśmy wizualizację in vivo białka EB3, które reguluje dynamiczne właściwości mikrotubul poprzez zginanie i stabilizację rosnących końcówek dodatnich.Aby załadować znakowany fluorescencyjnie EB3 do fibroblastów ludzkiej skóry, zastosowaliśmy transfekcję plazmidu. W tym badaniu wykorzystaliśmy pierwotną hodowlę fibroblastów w celu uzyskania z biopsji skóry pacjenta z EB3. Dostarczyć biopsję do laboratorium w ciągu kilku godzin w pożywce DMEM, uzupełnionej 15 mikrogramami na mililitr penicyliny i 50 jednostkami na mililitr streptomycyny.Umieść tkankę biopsyjną na sześciocentymetrowej szalce Petriego wraz z niewielką ilością pożywki. Za pomocą sterylnego skalpela pokrój próbkę biopsji na kawałki o wielkości około 0,5 do jednego milimetra. Umieść jeden, dwa, uzyskane fragmenty na 3,5-centymetrowej szalce Petriego i umieść sterylną szkiełko nakrywkowe na fragmentach biopsji.Powoli dodawaj 1,5 mililitra pożywki wzrostowej. Hodowla włókien w pożywce wzrostowej w inkubatorze CO2, w 5% CO2, czyli siedem stopni Celsjusza, wilgotność 80%. Po czterech, siedmiu dniach najpierw keratynocyty, a następnie fibroblasty zaczynają migrować z tkanki na dno naczynia.Hodowla komórkowa. Do wizualizacji transfekcji należy używać szklanych talerzy konfokalnych, naczyń konfokalnych. Przykryj dno naczynia autoklawizowanym 0,1% roztworem żelatyny przygotowanym w wodzie destylowanej.Inkubować przez 15 minut. Przygotuj pożywkę hodowlaną. Dokładnie wymieszaj, przechowuj wysoko w temperaturze plus 4 stopni Celsjusza.Podgrzej podłoże do plus 37 stopni Celsjusza przed dodaniem do komórek. Oceń kulturę pod mikroskopem. Usuń pożywkę i umyj komórki sterylnym DPBS.Dodaj jeden mililitr podgrzanego 0,25% roztworu trypsyny do komórek. Sprawdź komórki pod mikroskopem, czy całkowicie odrywają się od podłoża. Dezaktywuj trypsynę jednym mililitrem pożywki hodowlanej.Przenieś zawiesinę komórek do 15-mililitrowej stożkowej probówki. Odwirować probówkę o stężeniu 200 G przez pięć minut. Usunąć supernatant, ponownie zawiesić paletę komórek w jednym mililitrze pożywki hodowlanej.Policz numer komórki. Oblicz wymaganą liczbę komórek. Usuń je z gęstością od ośmiu do 15, pomnożoną przez 10 do potęgi trzech, przekroczoną przez centymetr.Jest to przetłaczane na mililitry pożywki hodowlanej. Usuń roztwór żelatyny z naczynia hodowlanego przygotowanego do inokulacji i natychmiast dodaj dwa mililitry zawiesiny komórkowej. Hoduj fibroblasty w temperaturze plus 37 stopni Celsjusza w inkubatorze CO2.Odświeżaj podłoże co dwa, cztery dni. Do eksperymentów użyj komórek czterech, 11 fragmentów. Do czasu transfekcji zbieg nie powinien przekraczać 70, 80%Wymień pożywkę hodowlaną na świeżą 24 godziny przed transfekcją.Przygotuj kompleks DNA-lipid w oparciu o obszar i gęstość wysiewu komórek. Zastosowano środek do transfekcji liposomalnej i gęstość wysiewu komórek jednej, pomnożoną przez 10 do potęgi czterech komórek, przepuszczonej przez centymetr. Dodaj trzy mikrolitry komercyjnego odczynnika do 125 mikrolitrów Opti-MEM, nie zawierającego antybiotyku.Nie dotykając ścianek rury, delikatnie zawiesić ponownie. Rozcieńczyć plazmidowe DNA, GFP-EB3, dodając jeden mikrogram plazmidowego DNA do 125 mikrolitrów OptiMEM. Delikatnie zawiesić ponownie.Dodaj rozcieńczone plazmidowe DNA do każdej probówki rozcieńczonego odczynnika do transfekcji, w stosunku jeden do jednego. Inkubować przez 30 minut. Dodaj kompleks lipidowy DNA do sześciocentymetrowej szalki Petriego z komórkami.Mieszaj z huśtawką w kształcie krzyża przez 30 sekund. Inkubować komórki ze środkiem do transfekcji przez 24 godziny, a następnie zmienić pożywkę na świeżą. Analizuj wydajność po kontroli w ciągu 24 i 48 godzin.Przygotowanie do obrazowania. Przed obrazowaniem komórek na żywo zmień pożywkę hodowlaną na pożywkę bez barwnika wskaźnikowego PH, aby zmniejszyć autofluorescencję. Ostrożnie nałóż olej mineralny na pożywkę fazę komórkową, aby całkowicie pokryć pożywkę, izolując ją od środowiska zewnętrznego w celu zmniejszenia penetracji O2 i parowania pożywki.Użyj lampy makro i uporządkuj cały obraz w 60-krotnym, 100-krotnym obiektywie z dużą przysłoną cyfrową, aby zrobić zdjęcie. W przypadku obserwacji in viva mikroskop musi być wyposażony w inkubator, aby utrzymać niezbędne warunki, aby komórki, w tym uderzenie w stół optyczny, i soczewkę, aby przeszły przez 37 stopni Celsjusza, zamknięta komora była dostarczana CO2 i utrzymywała poziom wilgotności. Przed obrazowaniem umieścić naczynie konfokalne z komórkami w uchwycie mikroskopu.Upewnij się, że antena i aparat są bezpiecznie przymocowane do uchwytu, aby uniknąć dryfowania podczas robienia zdjęć. Ustawianie parametrów obrazowania. Wybierz niskie wartości ekspozycji, ponieważ szkiełko indukuje uszkodzenie komórek, reaguje z przestrzeniami tlenowymi.Aby zbadać dynamikę mikrotubul w fibroblastach ludzkiej skóry, wybraliśmy 300-milisekundową ekspozycję. Skoncentruj się na obiekcie zainteresowania. W przypadku długotrwałego obrazowania poklatkowego niezbędny jest system automatycznej stabilizacji ostrości, doskonały system ustawiania ostrości, ponieważ może nastąpić przesunięcie wzdłuż ustawionej osi, a tym samym obiekt zainteresowania będzie nieostry.Wybierz optymalne warunki obrazowania, w zależności od wrażliwości komórki na światło i szybkości blaknięcia chromu flary. Ponieważ mikrotubule są strukturami wysoce dynamicznymi, można z kolei wybrać odpowiednio krótki czas, a liczba klatek na sekundę musi być wystarczająco wysoka. Aby zbadać dynamikę mikrotubul w fibroblastach skóry, użyliśmy częstotliwości jednej klatki na sekundę przez trzy, pięć minut.Wybierając następny obiekt, aby uzyskać obraz, odsuń się od już sfotografowanego obszaru, ponieważ pod wpływem światła występuje usuwalne krwawienie fotograficzne. Ponieważ użyliśmy stosunkowo wysokiej częstotliwości obrazowania, migawka nie zamykała się między obrazami, a lampa była spóźniona przez cały okres obrazowania, co oznacza zwiększone blaknięcie. Wybierz optymalne filmy do wizualnego badania dynamiki mikrotubul, biorąc pod uwagę jakość transfekcji, jakość obrazów mikrotubul, optymalny stosunek sygnału do szumu oraz brak dryfowania analizowanej komórki.Wykorzystaj wybrane filmy, aby zbadać dynamikę plus-końców mikrotubul, wiążąc je w programie Fidżi. Najważniejszym krokiem w protokole jest transfekcja, zapewniająca wystarczającą ekspresję białka. Dobry stosunek sygnału do szumu, brak fotowybielania mikrotubul i brak dryfowania komórek mają kluczowe znaczenie dla obrazowania.Wizualizacja dynamiki mikrotubul in vivo dostarcza istotnych informacji na temat właściwości zmutowanej huntingtyny. Nasz protokół może być stosowany do badań nad innymi chorobami, których patologia implikuje dynamiczne właściwości cytoszkieletu.

microtubule-plus-end-dynamics-visualization-huntington-s-disease

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Fibroblasty pobrane od pacjentów z mutacjami w genach odpowiedzialnych za chorobę Parkinsona stanowią łatwo dostępny model ex vivo do badania fenotypów związanych z tą chorobą. Obrazowanie żywych komórek daje możliwość analizy parametrów morfologicznych i funkcjonalnych w żywych komórkach. W niniejszym opracowaniu opisujemy przygotowanie ludzkich fibroblastów oraz późniejsze monitorowanie fenotypów mitochondrialnych.

Wykorzystanie pierwotnych ludzkich fibroblastów do monitorowania fenotypów mitochondrialnych w badaniach nad chorobą Parkinsona

Oparty na MATLAB, pakiet oprogramowania open source, plusTipTracker, może być używany do analizy serii obrazów znakowanych fluorescencyjnie +TIPS w celu ilościowego określenia dynamiki mikrotubul.

Wykorzystanie oprogramowania plusTipTracker do pomiaru dynamiki mikrotubul w stożkach wzrostu Xenopus laevis

Szczegółowo opisano protokoły hodowli ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC), przejściowej transfekcji znakowanych fluorescencyjnie markerów wzrostu mikrotubul, obrazowania żywych komórek i automatycznej analizy dynamiki wzrostu mikrotubul międzyfazowych.

Obrazowanie poklatkowe w wysokiej rozdzielczości i automatyczna analiza dynamiki mikrotubul w żywych ludzkich komórkach śródbłonka żyły pępowinowej

Drożdże pączkujące są korzystnym modelem do badania dynamiki mikrotubul in vivo ze względu na ich potężną genetykę i prostotę cytoszkieletu mikrotubul. Poniższy protokół opisuje, w jaki sposób przekształcać i hodować komórki drożdży, uzyskiwać obrazy mikroskopii konfokalnej i ilościowo analizować dynamikę mikrotubul w żywych komórkach drożdży.

Obrazowanie i analiza w wysokiej rozdzielczości dynamiki poszczególnych mikrotubul astralnych u pączkujących drożdży

Tutaj prezentujemy solidną i szczegółową metodę analizy dynamiki mikrotubul w komórkach zsynchronizowanych w prometafazie przy użyciu mikroskopii konfokalnej z żywym krążkiem komórkowym i przetwarzania obrazów opartego na MATLAB.

Pomiar dynamiki mikrotubul za pomocą mikroskopii wirujących dysków w monopolarnych wrzecionach mitotycznych

Przedstawiono protokół obrazowania dynamicznych mikrotubul in vivo przy użyciu fluorescencyjnie znakowanego białka wiążącego End. Opisaliśmy metody znakowania, obrazowania i analizowania dynamicznych mikrotubul w neuronie tylnej bocznej mikrotubuli (PLM) C. elegans.

In vivo (in vivo) Ocena dynamiki i orientacji mikrotubul w neuronach Caenorhabditis elegans

Tutaj przedstawiono test rekonstytucji in vitro oparty na mikroskopii TIRF, który jednocześnie określa ilościowo i porównuje dynamikę dwóch populacji mikrotubul. Opisano metodę jednoczesnego przeglądania zbiorowej aktywności wielu białek związanych z mikrotubulami na usieciowanych wiązkach mikrotubul i pojedynczych mikrotubulach.

Jednoczesna wizualizacja dynamiki mikrotubul usieciowanych i pojedynczych in vitro za pomocą mikroskopii TIRF

W tym artykule przedstawiamy protokół wykrywania oligodendrocytów obciążonych mikrotubulami w modelu tubulinopatii za pomocą prostego, innowacyjnego podejścia do mikroskopii drugiej harmonicznej.

Bezznacznikowa optyka nieliniowa do badania zależnych od tubuliny defektów w centralnej mielinie

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół wizualizacji sieci mikrotubul w połączeniach nerwowo-mięśniowych i komórkach mięśniowych. W połączeniu z potężnymi narzędziami genetycznymi Drosophila melanogaster, protokół ten znacznie ułatwia genetyczne badania przesiewowe i analizę dynamiki mikrotubul pod kątem roli białek regulatorowych sieci mikrotubul w układzie nerwowym.

Wykorzystanie połączenia nerwowo-mięśniowego larw Drosophila i komórek mięśniowych do wizualizacji sieci mikrotubul

W niniejszym raporcie opisujemy trójwymiarowy model rekonstrukcji skóry, który naśladuje architekturę i skład ludzkiej skóry. Wykorzystując model rekonstrukcji skóry, badano fizjologię melanocytów, progresję czerniaka oraz losy dermalnych komórek macierzystych. Model ten jest również przydatny jako narzędzie przedkliniczne do oceny leków.

Trójwymiarowy model rekonstrukcji ludzkiej skóry: narzędzie do badania normalnej skóry i progresji czerniaka

Poznaj wizualizację dynamiki mikrotubul z użyciem białka EB3 w pierwotnych fibroblastach skóry pacjentów z chorobą Huntingtona. Ta metoda umożliwia badanie wpływu mutowanego huntingtyny na cytoszkielet.

Wizualizacja dynamiki plus-end mikrotubul w modelu choroby Huntingtona opartym na pierwotnych fibroblastach skóry człowieka

Przeglądaj więcej filmów