Name: Izolacja magnetyczna komórek mikrogleju od noworodków myszy do pierwotnych hodowli komórkowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Naucz się izolacji mikrogleju magnetyczną metodą od noworodków myszy do pierwotnych hodowli. Technika CD11b zapewnia wysoką czystość komórek i pozwala badać aktywność fagocytową w warunkach zbliżonych do in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Figurki zostały stworzone przy użyciu BioRender. Badania są finansowane przez Inserm, Université de Paris, Horyzont 2020 (PREMSTEM-874721), Fondation de France, Fondation ARSEP, Fondation pour la Recherche sur le Cerveau, Fondation Grace de Monaco oraz dodatkowy grant z Investissement d'Avenir -ANR-11-INBS-0011-NeurATRIS i Investissement d'Avenir -ANR-17-EURE-001-EUR G.E.N.E.

Protokół został zatwierdzony, a wszystkie zwierzęta były traktowane zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi Institut National de la Santé et de la Recherche Scientifique (Inserm, Francja). Przedstawiono magnetyczną izolację mikrogleju z mózgów 24 młodych myszy OF1 (zarówno samca, jak i samicy) w P8, podzielonych na płytki 6-dołkowe, 12-dołkowe lub 96-dołkowe. Prace eksperymentalne prowadzono pod kapturem w celu utrzymania sterylnych warunków.
1. Przygotowanie sterylnych roztworów do izolacji i hodowli komórkowej
<ol>
	<li>Przygotuj 50 ml 1x Zbilansowanego Roztworu Soli Hanksa (HBSS) bez Ca2+ i Mg2+ (HBSS-/-) z dostępnego w handlu roztworu 10x (patrz Tabela Materiałów).</li>
	<li>Przygotować mieszaninę dysocjacyjną zgodnie ze składem podanym w tabeli 1, korzystając z dostępnego w handlu zestawu do dysocjacji tkanek (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Przygotuj 200 ml 1x HBSS z Ca2+ i Mg2+ (HBSS+/+) z dostępnego w handlu roztworu 10x.</li>
	<li>Przygotuj 200 ml 1x PBS + 0,5% BSA (określane jako bufor do sortowania komórek).</li>
	<li>Przygotować mikrogranulki CD11b zgodnie z tabelą 2.</li>
	<li>Przygotuj 500 ml pożywki hodowlanej bez surowicy makrofagów (SFM) + 1% penicyliny-streptomycyny (P/S). Przygotować porcje z probówek o pojemności 50 ml i przechowywać je w temperaturze 4 °C. W dalszej części tekstu nazywa się to pożywką mikrogleju. 
	UWAGA: Wszystkie roztwory izolacyjne muszą być świeżo przygotowane w sterylnych warunkach w dniu eksperymentu i przechowywane na lodzie. Można przygotować pożywkę do hodowli komórek mikrogleju, umieścić ją w probówkach o pojemności 50 ml i przechowywać w temperaturze 4 °C do wykorzystania w przyszłości. Filtracja nie jest potrzebna.</li>
</ol>
2. Sekcja mózgu
<ol>
	<li>Odetnij głowę szczeniaka dużymi nożyczkami bez wcześniejszego znieczulenia ogólnego.</li>
	<li>Przeciąć skórę od szyi do nosa zgodnie ze szwem strzałkowym (15-20 mm) małymi nożyczkami (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A-C).</li>
	<li>Włóż końcówki małych nożyczek w otwór wielki równolegle do czaszki. Przytnij ostrożnie z każdej strony do oczu (<silna klasa="xfig">Rysunek 1D,E).</li>
	<li>Przeciąć między oczami małymi nożyczkami, aby oddzielić czaszkę i mózg od głowy (<silna klasa="xfig">Ryc. 1F).</li>
	<li>Za pomocą dwóch kleszczy chwyć czaszkę blisko opuszki węchowej i ostrożnie rozerwij czaszkę, uważając, aby nie uszkodzić leżącego pod nią mózgu (<silna klasa = "xfig">Ryc. 1G-I).</li>
	<li>Usuń móżdżek i opuszkę węchową za pomocą żyletki i pokrój mózg na dwie części (<silna klasa="xfig">Rysunek 1J).</li>
	<li>Umieść fragmenty mózgu na szalce Petriego zawierającej 30-40 ml HBSS-/- (<silna klasa="xfig">Ryc. 1K).</li>
</ol>
3. Dysocjacja mózgu i magnetyczna izolacja mikrogleju
UWAGA: Wszystkie manipulacje komórkami i ponowne zawieszanie muszą być wykonywane za pomocą pipety 1,000 μL z dużą ostrożnością. Zastosowanie silnego działania mechanicznego może aktywować lub zabić komórki mikrogleju.
<ol>
	<li>Przenieś 12 kawałków mózgu (~1,2 g) na probówkę dysocjacyjną zawierającą mieszaninę dysocjacyjną zgodnie z tabelą 1. Na 24 szczenięta potrzebne były cztery rurki C (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A-B).</li>
	<li>Umieść rurki C na dysocjatorze (z trybem grzania). Uruchom zoptymalizowany program NTDK w sprzęcie zgodnie z instrukcją producenta (<silna klasa="xfig">Rysunek 2D).</li>
	<li>Wirować przy 300 x g przez 20 s (w temperaturze 4 °C) w celu zebrania wszystkich komórek. Zakończ dysocjację mechaniczną, pipetując trzy razy w górę i w dół za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl (<silna klasa="xfig">Rysunek 2E).</li>
	<li>Przenieś komórki do czterech probówek o pojemności 15 ml + sitka. Przepłucz sitka 10 ml HBSS+/+ (<klasa silna = "xfig">Rysunek 2F).</li>
	<li>Wirować przy 300 x g przez 10 minut (w temperaturze 4 °C) i usunąć supernatant. Ostrożnie ponownie zawiesić osad z 10 ml HBSS+/+ (<silna klasa="xfig">Rysunek 2G).</li>
	<li>Wirować przy 300 x g przez 10 minut (w temperaturze 4 °C) i usunąć supernatant. Ostrożnie ponownie zawiesić osad za pomocą 6 ml buforu sortującego (krok 1.4) (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2H).</li>
	<li>Wirować przy 300 x g przez 10 minut (w temperaturze 4 °C) i usunąć supernatant. Dodać 200 μl roztworu mikrogranulek CD11b (krok 1.5) do probówki i ostrożnie zawiesić (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2I).</li>
	<li>Inkubować probówki przez 15-20 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie zawiesić osad z 6 ml buforu sortującego (<silna klasa="xfig">Rysunek 2I-J).</li>
	<li>Wirować przy 300 x g przez 10 minut (w temperaturze 4 °C) i usunąć supernatant. Ostrożnie ponownie zawiesić osad z 8 ml buforu sortującego (<silna klasa="xfig">Rysunek 2K).</li>
	<li>Postępuj zgodnie z programem POSSEL na separatorze (patrz Tabela materiałów), aby przygotować osiem kolumn. Przenieść komórki 1 ml na 1 ml na kolumnę. Poczekaj, aż wszystkie komórki przejdą przed dodaniem kolejnego ml. Eluować komórki CD11b+ na sterylnej płytce elucyjnej z 1 ml buforu sortującego (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2L).</li>
	<li>Umieść komórki CD11b+ w nowej probówce o pojemności 50 ml (<silna klasa="xfig">Rysunek 2M).</li>
	<li>Wirować przy 300 x g przez 10 minut (w temperaturze 4 °C) i usunąć supernatant. Ostrożnie ponownie zawiesić osad z 10 ml zimnej pożywki dla mikrogleju (krok 1.6) (<silna klasa="xfig">Rysunek 2N).</li>
	<li>Policz komórki CD11b+. W P8 należy uzyskać ~650 000 komórek na mózg. 
	UWAGA: W niniejszym protokole komórki zostały zliczone za pomocą automatycznego licznika komórek (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Zawiesić komórki w zimnej pożywce mikrogleju do końcowego stężenia 650 000-700 000 komórek/ml i dozować na płytkach do hodowli komórkowych. 
	UWAGA: Płytki 6-dołkowe są przeznaczone do Western Blot (2 ml na studzienkę); płytki 12-dołkowe służą do analizy RT-qPCR (1 ml na dołek), a płytki 96-dołkowe służą do oznaczania fagocytarnego (250 μl na dołek); Wszystkie trzy zostały wykorzystane do tej pracy. Jednak w tym manuskrypcie wyniki analizy Western Blot nie są pokazane, ale możliwe jest przeprowadzenie za pomocą tego protokołu.</li>
	<li>Umieść płytki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez noc. Ostrożnie zmienić pożywkę za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl z podgrzaną pożywką dla mikrogleju.</li>
	<li>Umieścić płytki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 na noc przed stymulacją. 
	UWAGA: Nie zaleca się izolowania mikrogleju od więcej niż 36 szczeniąt i po P9. Zwiększy to ryzyko zanieczyszczenia i akumulacji szczątków komórkowych w celu aktywacji mikrogleju.</li>
</ol>
4. Stymulacja komórek
<ol>
	<li>Przygotować odczynniki do stymulacji zgodnie z tabelą 3, używając dostępnych w handlu odczynników (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Dodaj odpowiednią objętość do każdej stymulowanej studzienki. 
	UWAGA: Odpowiednia objętość zależy od stężenia bodźca i wielkości studni.</li>
	<li>Umieścić płytki w temperaturze 37 °C z 5% CO2do końca stymulacji po 6 godzinach, 24 godzinach lub 48 godzinach.</li>
	<li>W przypadku analizy Western Blot należy odessać supernatant i dodać 50 μl buforu do lizy białek (patrz tabela materiałów) za pomocą pipety. Za pomocą końcówek zdrap spód płytki, aby odłączyć zlizowane komórki i przenieść je do probówek o pojemności 1,5 ml. Przechowywać w temperaturze -80 °C. 
	UWAGA: Płytki hodowlane mogą być przechowywane przez lata w temperaturze -80 °C, jeśli supernatant jest prawidłowo zasysany.</li>
	<li>Do analizy RT-qPCR6,31, odessać supernatant i przechowywać płytki hodowlane bezpośrednio w temperaturze -80 °C do ekstrakcji mRNA (krok 5).</li>
	<li>Aby uzyskać informacje na temat testu fagocytarnego, zobacz krok 6.</li>
</ol>
5. ekstrakcja mRNA i analiza RT-qPCR
<ol>
	<li>Wykonaj ekstrakcję RNA, RT-PCR i RT-qPCR zgodnie z protokołem producenta (patrz Tabela materiałów). Zapoznaj się z Tabelą 4, aby zapoznać się z sekwencjami starterów5,6,31.</li>
	<li>Wykonaj analizę RT-qPCR, postępując zgodnie z wcześniej opublikowanym raportem5.</li>
</ol>
6. Test fagocytarny
<ol>
	<li>Stymuluj komórki i wykonaj test fagocytarny w ciągu ostatnich 3 godzin stymulacji. Na przykład w przypadku stymulacji trwającej 6 godzin rozpocznij test fagocytarny po 3 godzinach stymulacji; a w przypadku stymulacji trwającej 12 godzin rozpocznij test fagocytarny 9 godzin po rozpoczęciu stymulacji.</li>
	<li>Oblicz liczbę koralików potrzebnych do przygotowania, biorąc pod uwagę stosunek (1 komórka: 50 koralików). Do jednego dołka z płytki 96-dołkowej wymagane jest 8,1 x 106 koralików. Przygotować mieszaninę kulek zgodnie z tabelą 5. 
	UWAGA: Ostrożnie wymieszać fiolkę z kulkami przed dodaniem do mieszaniny PBS/FBS.</li>
	<li>Inkubować przez 1 godzinę w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C. Wirować co 10 minut.</li>
	<li>Oblicz objętość roztworu, który należy dodać do każdej studzienki. Dodać roztwór i inkubować przez 3 godziny.</li>
	<li>Przepłucz studzienki trzy razy 1x PBS. Odczytaj emisję fluorescencji przy 550 nm (długość fali emisji Cy3).</li>
</ol>
7. Kontrola jakości czystości
<ol>
	<li>Oceń czystość izolacji magnetycznej CD11b za pomocą cytometrii przepływowej (FACS) (przed i po sortowaniu komórek), a następnie wykonaj RT-qPCR.
	<ol>
		<li>Policz komórki i ponownie zawieś w buforze FACS (PBS + 2 mM EDTA + 0,5% albuminy surowicy bydlęcej) w celu uzyskania rozcieńczenia 10 x 106 komórek/ml po kroku 3.5 i kroku 3.14.</li>
		<li>Po 15 minutach konwencjonalnego blokowania Fc32,33, inkubuj komórki przez 15 minut z sondą żywotności (FVS780) i przeciwciałami sprzężonymi z fluoroforem przeciwko mysim CD45, CD11b, CX3CR1, ACSA-2, O4 lub odpowiadającym im izotypom kontrolnym32,33 w stężeniu zalecanym przez producentów (patrz Tabela materiałów).</li>
		<li>Umyj komórki buforem FACS, utrwal i przepuśćcie za pomocą dostępnego w handlu zestawu do przepuszczalności (patrz tabela materiałów).</li>
		<li>Ponownie wykonać blokowanie Fc na permeabilizowanych komórkach, a następnie inkubować z przeciwciałem sprzężonym z fluoroforem przeciwko NeuN (patrz tabela materiałów) lub jego izotypowi kontrolnemu przez 15 minut.</li>
		<li>Wykonaj analizę FACS po umyciu buforem FACS.</li>
		<li>Po wykluczeniu dubletów i martwych komórek na podstawie parametrów morfologicznych i barwienia FVS780, odpowiednio, wybierz strategię bramkowania dla powierzchniowej ekspresji CX3CR1 (mikroglej), ACSA-2 (astrocyty), O4 (oligodendrocyty) i wewnątrzkomórkową obecność NeuN (neurony) w celu analizy procentu komórek dodatnich.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po kroku 5 wyekstrahuj mRNA i wykonaj RT-qPCR w celu ilościowego określenia Itgam (CD11b), Cx3cr1, Olig2, synaptofizyny i mRNA Gfap. Normalizuj Cq za pomocą mRNA Rpl13a jako reportera i wykonaj względną ekspresję do mRNA Itgam.</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Obecna praca przedstawia pierwotną hodowlę komórek mikrogleju przy użyciu magnetycznie posortowanych komórek CD11b+. Oprócz oceny funkcjonalnej mikrogleju (RT-qPCR i testy fagocytarne) określono również czystość kultur mikrogleju.
Klasyczne hodowle komórek mikrogleju są zwykle generowane z mózgu noworodków gryzoni P1 lub P2 i hodowane wspólnie z astrocytami przez co najmniej 10 dni. Mikroglej jest następnie oddzielany mechanicznie za pomocą wytrząsarki orbitalnej. Metoda izolacji i hodowli mik...

Mikroglej to komórki podobne do makrofagów rezydujące w centralnym układzie nerwowym, pochodzące z erytropoetycznych prekursorów woreczka żółtkowego, które migrują do nabłonka nerwowego podczas wczesnego rozwoju embrionalnego1. Oprócz funkcji odpornościowych, odgrywają również znaczącą rolę podczas rozwoju neurologicznego, szczególnie w synaptogenezie, homeostazie neuronów i mielinizacji2. W wieku dorosłym mikroglej rozwija długie procesy komórkowe, aby stale skanować środowisko. W przypadku zaburzeń homeostazy, takich jak uszkodzenie mózgu lub choroba mózgu, mikroglej może zmienić swój wygląd morfologiczny, aby przyjąć kształt ameboidalny, migrować do uszkodzonego obszaru, zwiększać i uwalniać wiele czynników cytoprotekcyjnych lub cytotoksycznych. Mikroglej ma niejednorodne stany aktywacji w zależności od etapu rozwoju i rodzaju odniesionego urazu3,4,5. W tym badaniu te stany aktywacji są ogólnie klasyfikowane do trzech różnych fenotypów: prozapalny/fagocytarny, przeciwzapalny i immunoregulacyjny, mając na uwadze, że w rzeczywistości sytuacja może być bardziej złożona6.
Badanie in vivo aktywacji mikrogleju i badań przesiewowych pod kątem strategii neuroprotekcyjnych na wczesnych etapach rozwoju mózgu może być wyzwaniem ze względu na (1) kruchość zwierząt przed odsadzeniem i (2) niską liczbę komórek mikrogleju. Dlatego badania in vitro nad mikroglejem są szeroko stosowane w odniesieniu do toksyczności7,8,9, strategie neuroprotekcyjne5,10,11,12,13,14, oraz co-cultures15,16,17,18,19,20,21. W badaniach in vitro można wykorzystać linie komórek mikrogleju, mikroglej pochodzący z komórek macierzystych lub pierwotną hodowlę mikrogleju. Wszystkie te podejścia mają zalety i wady, a wybór zależy od początkowego pytania biologicznego. Korzyści płynące z zastosowania pierwotnych kultur mikrogleju to jednorodne tło genetyczne, historia wolna od patogenów i kontrola czasu, w którym mikroglej jest stymulowany po śmierci zwierzęcia22.
Z biegiem lat opracowano różne metody (cytometria przepływowa, wstrząsanie lub znakowanie magnetyczne) do hodowli pierwotnego mikrogleju od gryzoni, zarówno noworodków, jak i dorosłych23,24,25,26,27,28,29. W niniejszej pracy izolacja mikrogleju od mysich noworodków jest przeprowadzana przy użyciu wcześniej opisanej technologii sortowania komórek aktywowanych magnetycznie przy użyciu pokrytego mikrokulkami anty-mysiego CD11b25,27,29. CD11b jest receptorem integryny ulegającym ekspresji na powierzchni komórek szpikowych, w tym mikrogleju. Gdy w mózgu nie ma prowokacji zapalnej, prawie wszystkie komórki CD11b+ są mikroglejowe30. W porównaniu z innymi wcześniej opublikowanymi metodami23,24,25,26,27,28,29, niniejszy protokół równoważy natychmiastowe analizy aktywacji mikrogleju ex vivo i powszechne in vitro pierwotna hodowla mikrogleju. Tak więc mikroglej jest (1) izolowany w dniu pourodzeniowym (P)8 bez usuwania mieliny, (2) hodowany bez surowicy i (3) wystawiany na działanie siRNA, miRNA, związku farmakologicznego i / lub bodźców zapalnych tylko 48 godzin po izolacji mózgu. Każdy z tych trzech aspektów sprawia, że obecny protokół jest istotny i szybki. Przede wszystkim zastosowanie mikrogleju pediatrycznego pozwala na uzyskanie dynamicznych i reaktywnych żywotnych komórek w hodowli bez konieczności dodatkowego etapu demielinizacji, który mógłby potencjalnie modyfikować reaktywność mikrogleju in vitro. Niniejszy protokół ma na celu jak największe zbliżenie się do fizjologicznego środowiska mikrogleju. Rzeczywiście, mikroglej nigdy nie napotyka surowicy, a ten protokół również nie wymaga stosowania surowicy. Co więcej, wystawienie mikrogleju już po 48 godzinach od hodowli zapobiega utracie przez nie zdolności fizjologicznych.

<table><tbody><tr><td>Anty myszy ACSA-2 PE Vio 615</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-116-246</td><td></td></tr><tr><td>Anti Mouse CD11b BV421</td><td>Sony Biotechnology</td><td>1106255</td><td></td></tr><tr><td>Anti mouse CD45 BV510</td><td>Sony Biotechnology</td><td>1115690</td><td></td></tr><tr><td>Anti mouse CX3CR1 PE Cy7</td><td>Sony Biotechnology</td><td>1345075</td><td></td></tr><tr><td>Anti mouse NeuN PE</td><td>Milli-Mark</td><td>FCMAB317PE</td><td></td></tr><tr><td>przeciw myszom O4 Vio Bright B515</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-120-016</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do permeabilizacji BD Cytofix/Cytoperm</td><td>BD Biosciences</td><td>554655</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-376</td><td></td></tr><tr><td>CD11b (Microglej) MicroBeads, h, m</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-634</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Leica TCS SP8</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (10x)</td><td>Thermo Scientific</td><td>14200067</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1644</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Cell culture 12-dołkowa płytka, płaskie dno + pokrywka</td><td>Dutscher</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Cell culture 96-dołkowa płytka, płaskie dno + pokrywka</td><td>Dutscher</td><td>353072</td><td></td></tr><tr><td>Falcon probówki 50 ml</td><td>Dutscher</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik blokujący Fc (mysz CD16/32)</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Nikon ECLIPSE TE300</td><td></td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS C Tubes (4 x 25 probówek)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-334</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS Octo Disocjator z grzałkami</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-427</td><td></td></tr><tr><td>Zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS) +CaCl2 +MgCl2 10x</td><td>Thermo Scientific</td><td>14065049</td><td></td></tr><tr><td>Zbilansowany roztwór soli Hanksa (HBSS) -CaCl2 -MgCl2 10x</td><td>Thermo Scientific</td><td>14185045</td><td></td></tr><tr><td>iQ SYBR&nbsp; Green Supermix</td><td>Bio-rad</td><td>1725006CUST</td><td></td></tr><tr><td>Iscript Synteza c-DNA</td><td>Bio-rad</td><td>1708890</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki lateksowe, polistyren modyfikowany aminami, fluorescencyjna czerwień</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2776-1mL</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolisacharydy (LPS) z&nbsp; Escherichia coli&nbsp; O55:B5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2880</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka bez surowicy</td><td>Thermo Scientific</td><td>12065074</td><td></td></tr><tr><td>MACS BSA Roztwór podstawowy</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-376</td><td></td></tr><tr><td>Filtry siatkowe MACS SmartStrainers (70 &mu; m), 4 x 25 szt</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-110-916</td><td></td></tr><tr><td>Mysz IgG1 PE</td><td>Millipore</td><td>MABC002H</td><td></td></tr><tr><td>Mysz IgG2a PE Cy7</td><td>Mysz 2601265</td><td></td><td></td>Sony Biotechnology</tr><tr><td>IL1 beta</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-101-684</td><td></td></tr><tr><td>Bloki kolumnowe Multi-24</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-691</td><td></td></tr><tr><td>Separator MultiMACS Cell24</td><td>Miltenyi Zestaw</td> do dysocjacji tkanek nerwowych Biotec <td></td><td></td></tr><tr><td>- Papaina</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-628</td><td></td></tr><tr><td>Licznik nukleologiczny NC-200</td><td>Chemometec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nucleospin RNA Plus XS</td><td>Macherey Nagel</td><td>740990.5</td><td></td></tr><tr><td>Zakonnica EZFlip Stożkowe probówki wirówkowe</td><td>Thermo Scientific</td><td>362694</td><td></td></tr><tr><td>OPTILUX szalka Petriego - 100 x 20 mm</td><td>Dutscher</td><td></td><td></td>353003</tr><tr><td>P&eacute; nicylina-streptomycyna (10 000 U/ml)</td><td>Thermo Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Rat IgG2b, k BV421</td><td>BD Biosciences</td><td>562603</td><td></td></tr><tr><td>Rat IgG2b, k BV510</td><td>Sony Biotechnology</td><td>2603230</td><td></td></tr><tr><td>REA control (S) PE vio 615</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-104-616</td><td></td></tr><tr><td>REA control (S) Vio Bright B515</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-113-445</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowane mysie białko IFN-gamma R</td><td>& D System</td><td>485-MI</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowane białko myszy IL-10 R</td><td>& D System</td><td>417-ML</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowane białko IL-4 myszy</td><td>R& D System</td><td>404-ML</td><td></td></tr><tr><td>RIPA Bufor</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R0278</td><td></td></tr><tr><td>Sonda żywotności (FVS780)</td><td>BD Biosciences</td><td>565388</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja magnetyczna komórek mikrogleju od noworodków myszy do pierwotnych hodowli komórkowych

Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures

Mikroglej, jako makrofagi rezydujące w mózgu, mają fundamentalne znaczenie dla wielu funkcji, w tym reakcji na stres środowiskowy i homeostazy mózgu. Mikroglej może przyjmować szerokie spektrum fenotypów aktywacji. Co więcej, mikroglej, który popiera fenotyp prozapalny, jest związany zarówno z zaburzeniami neurorozwojowymi, jak i neurodegeneracyjnymi. Badania in vitro są szeroko stosowane w badaniach mających na celu ocenę potencjalnych strategii terapeutycznych w określonych typach komórek. W tym kontekście badanie aktywacji mikrogleju i zapalenia układu nerwowego in vitro przy użyciu pierwotnych kultur mikrogleju jest bardziej istotne niż linie komórek mikrogleju lub mikroglej pochodzący z komórek macierzystych. Jednak stosowanie niektórych kultur pierwotnych może cierpieć z powodu braku odtwarzalności. W protokole tym zaproponowano powtarzalną i odpowiednią metodę magnetycznego izolowania mikrogleju od nowonarodzonych młodych. Wykazano tutaj aktywację mikrogleju za pomocą kilku bodźców po 4 godzinach i 24 godzinach poprzez kwantyfikację ekspresji mRNA i test fagocytarny z kulkami Cy3. Oczekuje się, że obecne prace dostarczą łatwej do odtworzenia techniki izolowania fizjologicznie istotnego mikrogleju od młodzieńczych stadiów rozwojowych.

Mikrogleja to rezydujące w OUN makrofagi, które ulegają aktywacji pod wpływem czynników środowiskowych (urazy, cząsteczek toksycznych, stanu zapalnego)4,5,6,34 (Rycina 3A). Badania in vitro nad mikrogleją są powszechnie stosowane do oceny autonomicznych mechanizmów komórkowych związanych z tymi czynnikami środowiskowymi oraz do charakterystyki stanu aktyw...

Pierwotne kultury mikrogleju są powszechnie używane do oceny nowych cząsteczek przeciwzapalnych. Niniejszy protokół opisuje powtarzalną i odpowiednią metodę magnetycznego izolowania mikrogleju od nowonarodzonych młodych.

Izolacja magnetyczna komórek mikrogleju od noworodków myszy do pierwotnych hodowli komórkowych

Microglia, as brain resident macrophages, are fundamental to several functions, including response to environmental stress and brain homeostasis. ...

Protokół ten pozwala nam hodować mikroglej w warunkach, które ściśle naśladują cechy in vivo. Wykorzystując technologię magnetycznego sortowania komórek, nasz protokół pozwolił nam stymulować mikroglej tylko przez dwa dni in vitro, bez użycia surowicy w pożywce. Na początek użyj małych nożyczek, aby przeciąć skórę od szyi do nosa, podążając za szwem strzałkowym od 15 do 20 milimetrów.Włóż końcówki otworem wielkim równolegle do czaszki. Wytnij z każdej strony do oczu. Przeciąć między oczami małymi nożyczkami, aby odłączyć czaszkę i mózg od głowy.Za pomocą dwóch kleszczy chwyć czaszkę blisko opuszki węchowej i ostrożnie rozerwij czaszkę. Za pomocą żyletki usuń móżdżek i opuszkę węchową, a następnie pokrój mózg na dwie części. Umieść fragmenty mózgu na szalce Petriego zawierającej 40 mililitrów HBSS bez wapnia i magnezu.Przygotować mieszaninę dysocjacyjną zgodnie z tą tabelą. Przenieś 12 kawałków mózgu do probówki C, co daje łączną wagę 1,2 grama na probówkę dysocjacyjną. Następnie umieść rurki C na dysocjatorze z ogrzewaniem.Uruchom zoptymalizowany program NTDK w dysocjacji. Wirować przez 20 sekund. Zakończ dysocjację mechaniczną, pipetując trzy razy.Przenieś komórki do czterech 15-mililitrowych probówek z dołączonymi sitkami. Przepłucz sitka 10 mililitrami HBSS z wapniem i magnezem. Wirować przez 10 minut i usunąć supernatant za pomocą 10-mililitrowej pipety.Ostrożnie dodaj 10 mililitrów HBSS z wapniem i magnezem i ponownie zawiesić granulkę. Ponownie odwirować i usunąć supernatant. Ponownie zawiesić granulat za pomocą sześciu mililitrów buforu sortującego.Powtórzyć wirowanie i odrzucić supernatant. Następnie dodaj 200 mikrolitrów roztworu mikrogranulek CD11b i inkubuj probówki przez 15 do 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po inkubacji ponownie zawiesić osad z sześcioma mililitrami buforu sortującego.Powtórzyć wirowanie i ponownie zawiesić osad z ośmioma mililitrami buforu sortującego. Następnie postępuj zgodnie z programem Possel na separatorze, aby przygotować osiem kolumn. Przepuść komórki przez kolumnę, dodając po jednym mililitrze zawiesiny komórek na raz.Za pomocą jednego mililitra buforu sortującego eluować komórki CD11b-dodatnie na sterylnej płytce elucyjnej. Połącz komórki w 50-mililitrowej probówce. Odwirować i ponownie zawiesić osad w 10 mililitrach zimnego podłoża mikroglejowego.Policz komórki CD11b-dodatnie. Ponownie zawiesić komórki w zimnym pożywce mikrogleju, aby uzyskać końcowe stężenie od 650 000 do 700 000 komórek na mililitr. Dozować zawiesinę na płytkach do hodowli komórkowych.Inkubuj płytki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Następnego dnia zastąp pożywkę podgrzaną pożywką mikrogleju i powtórz inkubację przez noc. Stymuluj komórki przed tym krokiem i wykonaj test fagocytarny w ciągu ostatnich trzech godzin stymulacji.Oblicz liczbę koralików zgodnie z tą tabelą w stosunku 50 koralików na komórkę. Przygotuj mieszankę koralików. Inkubować probówkę przez godzinę w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Wiruj co 10 minut. Do każdej studzienki dodaj obliczoną objętość roztworu kulek i inkubuj przez trzy godziny. Stosując to podejście, oceniano aktywność fagocytarną mikrogleju po stymulacji przez czynniki prozapalne, takie jak interleukina-1 beta, plus interferon gamma lub lipopolisacharydy.Po stymulacji przez sześć do 24 godzin, fluorescencyjne kulki mikrogleju Cy3 analizowano za pomocą mikroskopu konfokalnego. Po sześciu godzinach mikroglej zaczyna fagocytować kulki Cy3 tylko w warunkach interleukiny-1 beta plus interferon gamma. Po 24 godzinach nastąpił wzrost fluorescencji Cy3 dla obu rodzajów stymulacji, co podkreśla zwiększoną aktywność fagocytarną.Czystość hodowli mikrogleju została podwyższona za pomocą cytometrii przepływowej, która wykazała wzrost żywotności komórek po sortowaniu. Za pomocą cytometrii przepływowej i RT-qPCR analizowano markery populacji komórek przed i po sortowaniu komórek CD11b-dodatnich z mózgów myszy w ósmym dniu po urodzeniu. Analizy te pozwoliły wyróżnić różne populacje komórek mózgowych, takie jak CX3CR135 dla mikrogleju, O4 lub OLIG2 dla oligodendrocytów, NeuN lub synaptofizyna dla neuronów oraz ACSA-2 lub GFAP dla astrocytów.Po sortowaniu komórek za pomocą przeciwciała CD11b uzyskano tylko mikroglej. Ważne jest, aby pipetować bardzo delikatnie podczas dodawania zawiesiny do kolumny, aby zapobiec zatkaniu i uniknąć mechanicznej śmierci komórki. Po tej metodzie można przeprowadzić proteomikę transkryptomiczną, taką jak western blood lub Luminex, a nawet immunochemię, aby zobaczyć efekt stymulacji mikrogleju.

magnetic-isolation-microglial-cells-from-neonate-mouse-for-primary

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Izolowanie pierwotnych mikroglejów z heterogenicznej populacji komórek mózgu jest niezbędne do zbadania ich roli w warunkach fizjologicznych i patologicznych. Niniejszy protokół opisuje technikę mechanicznej izolacji i mieszanej hodowli komórkowej, która zapewnia wysoką wydajność oraz wysoką czystość żywych, pierwotnych komórek mikrogleju do badań in vitro i dalszych zastosowań.

Izolacja pierwotnych mikroglejów z mieszanych kultur komórek glejowych tkanki mózgu noworodka szczura

W tym filmie opisujemy protokół izolacji komórek CD11b, w tym mikrogleju, z mózgów młodych myszy za pomocą sortowania komórek aktywowanego magnetycznie. Tkanki mózgowe są homogenizowane w celu uzyskania zawiesin pojedynczych komórek, które są inkubowane z mikrokulkami pokrytymi przeciwciałem anty-CD11b, a następnie rozdzielane na podstawie kolumny magnetycznej w celu oczyszczenia populacji komórek CD11b +.

Izolacja magnetyczna mikrogleju z mózgów młodych myszy

Ten film demonstruje protokół ekstrakcji komórek mikrogleju ze zmian demielinizacyjnych w mózgach myszy za pomocą magnetycznego sortowania komórek. Protokół obejmuje preparację uszkodzonej tkanki mózgowej zawierającej komórki mikrogleju, potraktowanie tkanki określonymi enzymami w celu uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki oraz wykorzystanie kulek magnetycznych specyficznych dla receptora mikrogleju do wyizolowania komórek mikrogleju.

Izolowanie mikrogleju ze zmian demielinizacyjnych w mózgu myszy za pomocą magnetycznego sortowania komórek aktywowanych

Film demonstrował metodę izolowania i hodowli komórek z mózgu noworodka myszy. Polegało to na enzymatycznej i mechanicznej dysocjacji mózgu, a następnie hodowli w pożywkach wzrostowych pozbawionych neuronalnego czynnika wzrostu w celu uzyskania mieszanej populacji glejowej.

Uzyskiwanie mieszanej hodowli komórek glejowych z mózgu noworodka myszy

Jednym z kluczy do udanego badania biologii mikrogleju jest zachowanie funkcji immunologicznej mikrogleju ex vivo podczas izolacji z tkanki OUN. Wyizolowanie mikrogleju za pomocą wytrząsania obrotowego daje wysoce czyste i immunofunkcjonalne hodowle komórek, oceniane za pomocą obrazowania fluorescencyjnego, immunocytochemii i ELISA po aktywacji mikrogleju za pomocą bodźców prozapalnych lipopolisacharydu (LPS) i Pam3CSK4 (Pam).

Izolacja mikrogleju korowego z zachowanym immunofenotypem i funkcjonalnością od mysich noworodków

Tutaj prezentujemy protokół izolacji mikrogleju od pourodzeniowych szczeniąt myszy (dzień 1) do eksperymentów in vitro. Ta improwizowana metoda izolacji zapewnia zarówno wysoką wydajność, jak i czystość, co stanowi znaczną przewagę nad alternatywnymi metodami, która pozwala na szeroki zakres eksperymentów w celu wyjaśnienia biologii mikrogleju.

Szybka i udoskonalona izolacja magnetyczna CD11b pierwotnego mikrogleju o zwiększonej czystości i wszechstronności

Przedstawiono protokół izolacji pierwotnego mikrogleju z mysich mózgów. Technika ta pomaga w pogłębieniu obecnego zrozumienia schorzeń neurologicznych. Wirowanie w gradiencie gęstości i separacja magnetyczna są połączone w celu uzyskania wystarczającej wydajności próbki o wysokiej czystości. Ponadto przedstawiamy etapy charakterystyki mikrogleju.

Charakterystyka i izolacja pierwotnego mikrogleju myszy za pomocą wirowania w gradifikacji gęstości

Wysiłki zmierzające do szczegółowego zrozumienia funkcji mikrogleju zostały utrudnione przez brak modeli hodowli mikrogleju, które podsumowują właściwości dojrzałego mikrogleju in vivo. Protokół ten opisuje podejście oparte na izolacji i hodowli, mające na celu utrzymanie solidnego przetrwania wysoce rozgałęzionego dojrzałego mikrogleju szczurów w warunkach o zdefiniowanej pożywce.

Izolacja i hodowla mikrogleju gryzoni w celu promowania dynamicznej, rozgałęzionej morfologii w pożywce wolnej od surowicy

Tutaj prezentujemy protokół izolacji i oczyszczania pierwotnego mikrogleju w zwierzęcych modelach chorób demielinizacyjnych, wykorzystując kolumnowe sortowanie komórek aktywowane magnetycznie.

Izolacja pierwotnego mikrogleju myszy przez sortowanie komórek aktywowanych magnetycznie w zwierzęcych modelach demielinizacji

Opisujemy protokół izolowania komórek mikrogleju z podwzgórza myszy (lub równoważnych małych struktur mózgu) za pomocą magnetycznie aktywowanego sortowania komórek (MACS), w stosunkowo krótkim czasie. Mikroglej podwzgórza sortowany przez MACS może być używany do analizy ex vivo i może być posiany w celu przeprowadzenia testów in vitro.

Izolacja mikrogleju podwzgórza ze świeżo perfundowanego mózgu dorosłej myszy przez sortowanie komórek aktywowanych magnetycznie

Naucz się izolacji mikrogleju magnetyczną metodą od noworodków myszy do pierwotnych hodowli. Technika CD11b zapewnia wysoką czystość komórek i pozwala badać aktywność fagocytową w warunkach zbliżonych do in vivo.

Izolacja magnetyczna komórek mikrogleju od noworodków myszy do pierwotnych hodowli komórkowych

Przeglądaj więcej filmów