Izolacja magnetyczna komórek mikrogleju od noworodków myszy do pierwotnych hodowli komórkowych

Protokół ten pozwala nam hodować mikroglej w warunkach, które ściśle naśladują cechy in vivo. Wykorzystując technologię magnetycznego sortowania komórek, nasz protokół pozwolił nam stymulować mikroglej tylko przez dwa dni in vitro, bez użycia surowicy w pożywce. Na początek użyj małych nożyczek, aby przeciąć skórę od szyi do nosa, podążając za szwem strzałkowym od 15 do 20 milimetrów.

Włóż końcówki otworem wielkim równolegle do czaszki. Wytnij z każdej strony do oczu. Przeciąć między oczami małymi nożyczkami, aby odłączyć czaszkę i mózg od głowy.

Za pomocą dwóch kleszczy chwyć czaszkę blisko opuszki węchowej i ostrożnie rozerwij czaszkę. Za pomocą żyletki usuń móżdżek i opuszkę węchową, a następnie pokrój mózg na dwie części. Umieść fragmenty mózgu na szalce Petriego zawierającej 40 mililitrów HBSS bez wapnia i magnezu.

Przygotować mieszaninę dysocjacyjną zgodnie z tą tabelą. Przenieś 12 kawałków mózgu do probówki C, co daje łączną wagę 1,2 grama na probówkę dysocjacyjną. Następnie umieść rurki C na dysocjatorze z ogrzewaniem.

Uruchom zoptymalizowany program NTDK w dysocjacji. Wirować przez 20 sekund. Zakończ dysocjację mechaniczną, pipetując trzy razy.

Przenieś komórki do czterech 15-mililitrowych probówek z dołączonymi sitkami. Przepłucz sitka 10 mililitrami HBSS z wapniem i magnezem. Wirować przez 10 minut i usunąć supernatant za pomocą 10-mililitrowej pipety.

Ostrożnie dodaj 10 mililitrów HBSS z wapniem i magnezem i ponownie zawiesić granulkę. Ponownie odwirować i usunąć supernatant. Ponownie zawiesić granulat za pomocą sześciu mililitrów buforu sortującego.

Powtórzyć wirowanie i odrzucić supernatant. Następnie dodaj 200 mikrolitrów roztworu mikrogranulek CD11b i inkubuj probówki przez 15 do 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po inkubacji ponownie zawiesić osad z sześcioma mililitrami buforu sortującego.

Powtórzyć wirowanie i ponownie zawiesić osad z ośmioma mililitrami buforu sortującego. Następnie postępuj zgodnie z programem Possel na separatorze, aby przygotować osiem kolumn. Przepuść komórki przez kolumnę, dodając po jednym mililitrze zawiesiny komórek na raz.

Za pomocą jednego mililitra buforu sortującego eluować komórki CD11b-dodatnie na sterylnej płytce elucyjnej. Połącz komórki w 50-mililitrowej probówce. Odwirować i ponownie zawiesić osad w 10 mililitrach zimnego podłoża mikroglejowego.

Policz komórki CD11b-dodatnie. Ponownie zawiesić komórki w zimnym pożywce mikrogleju, aby uzyskać końcowe stężenie od 650 000 do 700 000 komórek na mililitr. Dozować zawiesinę na płytkach do hodowli komórkowych.

Inkubuj płytki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Następnego dnia zastąp pożywkę podgrzaną pożywką mikrogleju i powtórz inkubację przez noc. Stymuluj komórki przed tym krokiem i wykonaj test fagocytarny w ciągu ostatnich trzech godzin stymulacji.

Oblicz liczbę koralików zgodnie z tą tabelą w stosunku 50 koralików na komórkę. Przygotuj mieszankę koralików. Inkubować probówkę przez godzinę w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Wiruj co 10 minut. Do każdej studzienki dodaj obliczoną objętość roztworu kulek i inkubuj przez trzy godziny. Stosując to podejście, oceniano aktywność fagocytarną mikrogleju po stymulacji przez czynniki prozapalne, takie jak interleukina-1 beta, plus interferon gamma lub lipopolisacharydy.

Po stymulacji przez sześć do 24 godzin, fluorescencyjne kulki mikrogleju Cy3 analizowano za pomocą mikroskopu konfokalnego. Po sześciu godzinach mikroglej zaczyna fagocytować kulki Cy3 tylko w warunkach interleukiny-1 beta plus interferon gamma. Po 24 godzinach nastąpił wzrost fluorescencji Cy3 dla obu rodzajów stymulacji, co podkreśla zwiększoną aktywność fagocytarną.

Czystość hodowli mikrogleju została podwyższona za pomocą cytometrii przepływowej, która wykazała wzrost żywotności komórek po sortowaniu. Za pomocą cytometrii przepływowej i RT-qPCR analizowano markery populacji komórek przed i po sortowaniu komórek CD11b-dodatnich z mózgów myszy w ósmym dniu po urodzeniu. Analizy te pozwoliły wyróżnić różne populacje komórek mózgowych, takie jak CX3CR135 dla mikrogleju, O4 lub OLIG2 dla oligodendrocytów, NeuN lub synaptofizyna dla neuronów oraz ACSA-2 lub GFAP dla astrocytów.

Po sortowaniu komórek za pomocą przeciwciała CD11b uzyskano tylko mikroglej. Ważne jest, aby pipetować bardzo delikatnie podczas dodawania zawiesiny do kolumny, aby zapobiec zatkaniu i uniknąć mechanicznej śmierci komórki. Po tej metodzie można przeprowadzić proteomikę transkryptomiczną, taką jak western blood lub Luminex, a nawet immunochemię, aby zobaczyć efekt stymulacji mikrogleju.