Izolacja magnetyczna komórek mikrogleju od noworodków myszy do pierwotnych hodowli komórkowych
25 lipca 2022
Pierwotne kultury mikrogleju są powszechnie używane do oceny nowych cząsteczek przeciwzapalnych. Niniejszy protokół opisuje powtarzalną i odpowiednią metodę magnetycznego izolowania mikrogleju od nowonarodzonych młodych.
Protokół ten pozwala nam hodować mikroglej w warunkach, które ściśle naśladują cechy in vivo. Wykorzystując technologię magnetycznego sortowania komórek, nasz protokół pozwolił nam stymulować mikroglej tylko przez dwa dni in vitro, bez użycia surowicy w pożywce. Na początek użyj małych nożyczek, aby przeciąć skórę od szyi do nosa, podążając za szwem strzałkowym od 15 do 20 milimetrów.
Włóż końcówki otworem wielkim równolegle do czaszki. Wytnij z każdej strony do oczu. Przeciąć między oczami małymi nożyczkami, aby odłączyć czaszkę i mózg od głowy.
Za pomocą dwóch kleszczy chwyć czaszkę blisko opuszki węchowej i ostrożnie rozerwij czaszkę. Za pomocą żyletki usuń móżdżek i opuszkę węchową, a następnie pokrój mózg na dwie części. Umieść fragmenty mózgu na szalce Petriego zawierającej 40 mililitrów HBSS bez wapnia i magnezu.
Przygotować mieszaninę dysocjacyjną zgodnie z tą tabelą. Przenieś 12 kawałków mózgu do probówki C, co daje łączną wagę 1,2 grama na probówkę dysocjacyjną. Następnie umieść rurki C na dysocjatorze z ogrzewaniem.
Uruchom zoptymalizowany program NTDK w dysocjacji. Wirować przez 20 sekund. Zakończ dysocjację mechaniczną, pipetując trzy razy.
Przenieś komórki do czterech 15-mililitrowych probówek z dołączonymi sitkami. Przepłucz sitka 10 mililitrami HBSS z wapniem i magnezem. Wirować przez 10 minut i usunąć supernatant za pomocą 10-mililitrowej pipety.
Ostrożnie dodaj 10 mililitrów HBSS z wapniem i magnezem i ponownie zawiesić granulkę. Ponownie odwirować i usunąć supernatant. Ponownie zawiesić granulat za pomocą sześciu mililitrów buforu sortującego.
Powtórzyć wirowanie i odrzucić supernatant. Następnie dodaj 200 mikrolitrów roztworu mikrogranulek CD11b i inkubuj probówki przez 15 do 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po inkubacji ponownie zawiesić osad z sześcioma mililitrami buforu sortującego.
Powtórzyć wirowanie i ponownie zawiesić osad z ośmioma mililitrami buforu sortującego. Następnie postępuj zgodnie z programem Possel na separatorze, aby przygotować osiem kolumn. Przepuść komórki przez kolumnę, dodając po jednym mililitrze zawiesiny komórek na raz.
Za pomocą jednego mililitra buforu sortującego eluować komórki CD11b-dodatnie na sterylnej płytce elucyjnej. Połącz komórki w 50-mililitrowej probówce. Odwirować i ponownie zawiesić osad w 10 mililitrach zimnego podłoża mikroglejowego.
Policz komórki CD11b-dodatnie. Ponownie zawiesić komórki w zimnym pożywce mikrogleju, aby uzyskać końcowe stężenie od 650 000 do 700 000 komórek na mililitr. Dozować zawiesinę na płytkach do hodowli komórkowych.
Inkubuj płytki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Następnego dnia zastąp pożywkę podgrzaną pożywką mikrogleju i powtórz inkubację przez noc. Stymuluj komórki przed tym krokiem i wykonaj test fagocytarny w ciągu ostatnich trzech godzin stymulacji.
Oblicz liczbę koralików zgodnie z tą tabelą w stosunku 50 koralików na komórkę. Przygotuj mieszankę koralików. Inkubować probówkę przez godzinę w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Wiruj co 10 minut. Do każdej studzienki dodaj obliczoną objętość roztworu kulek i inkubuj przez trzy godziny. Stosując to podejście, oceniano aktywność fagocytarną mikrogleju po stymulacji przez czynniki prozapalne, takie jak interleukina-1 beta, plus interferon gamma lub lipopolisacharydy.
Po stymulacji przez sześć do 24 godzin, fluorescencyjne kulki mikrogleju Cy3 analizowano za pomocą mikroskopu konfokalnego. Po sześciu godzinach mikroglej zaczyna fagocytować kulki Cy3 tylko w warunkach interleukiny-1 beta plus interferon gamma. Po 24 godzinach nastąpił wzrost fluorescencji Cy3 dla obu rodzajów stymulacji, co podkreśla zwiększoną aktywność fagocytarną.
Czystość hodowli mikrogleju została podwyższona za pomocą cytometrii przepływowej, która wykazała wzrost żywotności komórek po sortowaniu. Za pomocą cytometrii przepływowej i RT-qPCR analizowano markery populacji komórek przed i po sortowaniu komórek CD11b-dodatnich z mózgów myszy w ósmym dniu po urodzeniu. Analizy te pozwoliły wyróżnić różne populacje komórek mózgowych, takie jak CX3CR135 dla mikrogleju, O4 lub OLIG2 dla oligodendrocytów, NeuN lub synaptofizyna dla neuronów oraz ACSA-2 lub GFAP dla astrocytów.
Po sortowaniu komórek za pomocą przeciwciała CD11b uzyskano tylko mikroglej. Ważne jest, aby pipetować bardzo delikatnie podczas dodawania zawiesiny do kolumny, aby zapobiec zatkaniu i uniknąć mechanicznej śmierci komórki. Po tej metodzie można przeprowadzić proteomikę transkryptomiczną, taką jak western blood lub Luminex, a nawet immunochemię, aby zobaczyć efekt stymulacji mikrogleju.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia powtarzalny protokół izolacji pierwotnej mikroglei z myszy noworodkowych z wykorzystaniem technologii sortowania magnetycznego. Metodologia ta umożliwia hodowlę mikroglei w warunkach, które ściśle odwzorowują charakterystykę in vivo, co pozwala na analizę ich aktywności fagocytarniej.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Badania nad mikroglejem
Wprowadzenie
- Mikroglej odgrywa kluczową rolę w ośrodkowym układzie nerwowym.
- Zrozumienie odpowiedzi mikrogleju na bodźce jest istotne dla badań nad neurozapaleniem.
- Magnetyczna separacja komórek stanowi skuteczną strategię izolacji mikrogleju.
- Poprzednie protokoły mogły charakteryzować się brakiem powtarzalności lub niskim stopniem odzwierciedlenia warunków in vivo.
Cel badania
- Opracowanie protokołu efektywnej izolacji i hodowli pierwotnych mikroglejów.
- Umożliwienie oceny odpowiedzi mikroglejów na bodźce zapalne.
- Ocena czystości i żywotności izolowanych mikroglejów.
Zastosowane metody
- Metoda hodowli komórkowej wykorzystująca sortowanie magnetyczne do izolacji mikrogleju z myszy noworodkowych.
- Model biologiczny obejmuje mikroglej korowy z noworodków.
- Do oceny czystości komórek zastosowano immunochemię oraz cytometrię przepływową.
- Kluczowe etapy obejmują sekcję, dysocjację enzymatyczną oraz sortowanie przy użyciu mikrokulek CD11b.
- Testy fagocytarne pozwoliły ocenić aktywność mikrogleju w odpowiedzi na czynniki prozapalne.
Główne wyniki
- Mikroglię wykazano zwiększoną aktywność fagocytarną w odpowiedzi na określone warunki zapalne.
- Zwiększona żywotność i czystość komórek zostały potwierdzone za pomocą cytometrii przepływowej po sortowaniu.
- Mikroskopia konfokalna uwidoczniła wyraźne różnice w aktywności fagocytarnej w zależności od czasu stymulacji.
- Metoda ta pozwoliła na doprecyzowanie różnic pomiędzy różnymi populacjami komórek mózgowych.
Wnioski
- Niniejsze badanie ustanawia niezawodną metodę izolacji mikrogleju mysiego do eksperymentów in vitro.
- Wyniki te pogłębiają zrozumienie funkcji mikrogleju oraz jego reakcji na stan zapalny.
- Niniejszy protokół stanowi podstawę do dalszych badań nad procesami neurozapalnymi.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejszy protokół przedstawia powtarzalną metodę izolacji pierwotnych mikroglejów z myszy noworodkowych, umożliwiając tworzenie fizjologicznie istotnych modeli in vitro do badań nad neurozapaleniem. Dzięki uzyskaniu wysokiej czystości i żywotności za pomocą sortowania magnetycznego opartego na CD11b, podejście to wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego w walidacji celów oraz opracowywaniu testów dla schorzeń ośrodkowego układu nerwowego. Metoda ta zwiększa pewność prognostyczną w przesiewach przedklinicznych poprzez zachowanie funkcjonalności i stanów aktywacji mikroglejów, które ściśle naśladują warunki in vivo.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju BioPharma
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie fenotypów aktywacji mikrogleju i odpowiedzi prozapalnych istotnych dla hipotez dotyczących chorób neurorozwojowych i neurodegeneracyjnych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia zestandaryzowany, bezserwatkowy system hodowli, który redukuje zmienność biologiczną i wspiera spójne badania angażowania celów molekularnych.
Przesiewy i rozwój testów
- Wartość naukowa: Generuje ilościowo ocenialne wyniki fagocytozy i transkrypcji do przesiewowego badania związków modyfikujących szlaki zapalne.
- Wartość operacyjna: Zapewnia skalowalny i powtarzalny proces izolacji, kompatybilny z wysiewem do płytek wielodołkowych oraz z analizami stymulacji w przebiegu czasowym.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wspiera modelowanie istotne dla chorób poprzez zachowanie markerów tożsamości mikrogleju (np. CX3CR1) oraz odpowiedzi funkcjonalnych na bodźce takie jak IL-1β/IFN-γ i LPS.
- Wartość operacyjna: Ułatwia ciągłość translacyjną od etapu odkryć do walidacji przedklinicznej dzięki ustandaryzowanemu oczyszczaniu oraz walidacji funkcjonalnej za pomocą cytometrii przepływowej i mikroskopii konfokalnej.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum wczesnego etapu odkrywania leków, dostarczając walidowane pierwotne komórki do testowania hipotez, przygotowania testów oraz generowania danych, które służą do identyfikacji wiodących związków i oceny ryzyka w badaniach przedklinicznych.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez izolację mikrogleju w celu wyjaśnienia udziału poszczególnych szlaków w procesach neurozapalnych.
- Przesiewanie: Dostarcza gotowe do analizy komórki z mierzalnymi odczytami fagocytozy i mRNA do badań nad przesiewaniem związków oraz modulacją celów terapeutycznych.
- Analityka: Wspiera ilościowe pomiary zmiennych zależnych, w tym aktywności fagocytowej (wychwyt kulek Cy3) oraz ekspresji genów (RT-qPCR), w celu analizy porównawczej warunków.
- Badania translacyjne: Zachowuje wierność fenotypową i ekspresję markerów, wspierając dopasowanie biomarkerów i ciągłość w walidacji przedklinicznej.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy powtarzalną platformę izolacji, którą można zastosować w wielu projektach badających funkcje mikrogleju w modelach chorób OUN.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność walidacji celu poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej dzięki zastosowaniu fizjologicznie istotnych modeli mikrogleju.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i standaryzację dzięki sortowaniu magnetycznemu i określonym warunkom hodowli, co minimalizuje zmienność między partiami.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go poprzez dostarczanie wiarygodnych danych przedklinicznych na temat modulacji celu i profili odpowiedzi zapalnej.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów w obrębie OUN z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o zwalidowane dane dotyczące zaangażowania mikrogleju i wyników funkcjonalnych.
Kwestie dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie sekcji tkanek noworodkowych, dysocjacji enzymatycznej oraz technik magnetycznego sortowania komórek.
- Zależne od dostępu do sorterów komórek (np. MACS), wirówek oraz sterylnej infrastruktury do hodowli komórkowych.
- Wymaga standaryzacji przygotowania odczynników oraz czasu inkubacji w celu zapewnienia spójnej wydajności i żywotności komórek CD11b-dodatnich.
- Adaptacja do innych systemów modelowych lub etapów rozwoju może wymagać optymalizacji parametrów dysocjacji i sortowania.
- Ograniczenia praktyczne obejmują wrażliwość mechaniczną podczas przepuszczania przez kolumnę, co wymaga delikatnego pipetowania, aby uniknąć zapchania i uszkodzenia komórek.
