Name: Indukcja i ocena dyskinez wywołanych lewodopą w szczurzym modelu choroby Parkinsona (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-14T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 51 s
Description: Poznaj metodę indukcji i oceny dyskinez wywołanych lewodopą w szczurzym modelu choroby Parkinsona. Protokół umożliwia ilościową analizę intensywności i częstotliwości nieprawidłowych ruchów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcemy wyrazić uznanie dla zmagań wszystkich osób z chorobą Parkinsona oraz siły i odporności, które okazują każdego dnia, szczególnie ukochanemu ojcu KSC, Markowi Steece'owi. Prace prowadzone tutaj były wspierane przez Narodowy Instytut Zaburzeń Neurologicznych i Udaru Mózgu (NS090107, NS110398) oraz Międzynarodowy Program Grantów Badawczych Fundacji Choroby Parkinsona, obecnie Fundacja Parkinsona. Chcielibyśmy również podziękować Molly VanderWerp za jej doskonałą pomoc redakcyjną.

Zwierzęta przedstawione w niniejszym opracowaniu były utrzymywane i obsługiwane zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi. Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Stanu Michigan zgodnie z przepisami federalnymi i stanowymi.
1. Potwierdzenie stanu uszkodzenia 6-OHDA bez zastosowania leków
<ol>
	<li>Test zawieszenia za ogon (postural tail hang test)11,12,13 
	UWAGA: Oceniać stan uszkodzenia co najmniej 1 tydzień po indukcji uszkodzenia 6-OHDA (szczegóły dotyczące uszkadzania patrz w9,10,35) u osobników doświadczalnych (np. dorosłych szczurów Sprague Dawley lub Fisher 344, samców lub samic). 
	<ol>
		<li>Zawiesić szczura na wysokości około 6 cm nad klatką, mocno trzymając go za nasadę ogona przez ~5 s.</li>
		<li>Zapisywać kierunek skręcenia ciała jako + dla zwierzęcia z pomyślnym uszkodzeniem, które skręca się po stronie przeciwległej do strony uszkodzonej, oraz - w przypadku braku skręcania lub skręcania w obu kierunkach.</li>
		<li>UWAGA: Testy te są opcjonalne, ale zalecane. Dodatkowe warianty testów bez użycia leków opisano w14,15,16,17.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Test dostosowania kroku podczas przeciągania (na podstawie16) 
	UWAGA: Oceniać stan uszkodzenia co najmniej 1 tydzień po indukcji jednostronnego uszkodzenia 6-OHDA u osobników doświadczalnych (np. dorosłych szczurów Sprague Dawley lub Fisher 344, samców lub samic).
	<ol>
		<li>Trzymając szczura za nasadę ogona, unieść tylne łapy około 6 cm nad powierzchnię i przeciągać zwierzę do tyłu po płaskiej, gładkiej, ale nieśliskej powierzchni na odległość ~75 cm w czasie od 5 do 10 s.</li>
		<li>Obserwować i zapisywać liczbę ruchów stukania/dostosowania kroku każdej przedniej łapy podczas trzech powtórzeń testu.</li>
		<li>Oceniać osobnika jako + dla pomyślnego jednostronnego uszkodzenia, gdy zaobserwowano 0–2 stąpnięcia przedniej łapy po stronie przeciwległej do uszkodzonej, przy jednoczesnym szybkim stukaniu (~10 stąpnięć) przednią łapą po stronie ipsilateralnej do uszkodzenia (np. zwierzęta z jednostronnym uszkodzeniem lewej strony wykazują deficyt stukania (0–2 stąpnięcia) prawą przednią łapą).</li>
		<li>Z kolei umiarkowane lub szybkie stukanie (5–10 stąpnięć) obiema przednimi łapami oceniać jako -, co wskazuje na niepełne lub nieznane stadium uszkodzenia. 
		UWAGA: Pobudzone lub lękliwe zwierzę może wykazywać szybkie stukanie/dostosowanie kroku nawet po pomyślnym uszkodzeniu. W przypadku podejrzenia takiej sytuacji należy umieścić szczura z powrotem w klatce domowej i powtórzyć test po co najmniej 30 min.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie odczynników i materiałów
<ol>
	<li>Określ dawkę L-3,4-dihydroksyfenyloalaniny metyloestru chlorowodorku (lewodopy lub L-DOPA) oraz benserazydy chlorowodorku, obwodowego inhibitora dehydrogenazy aromatycznych L-aminokwasów (zob. Tabela materiałów), częstotliwość podawania oraz harmonogram eksperymentalny, które są odpowiednie dla postawionego pytania badawczego12,18,19,20 (Rycina 1). 
	UWAGA: Pytania badawcze mogą być sformułowane w celu uzyskania dowolnej liczby odpowiedzi, od pytania, czy konkretna terapia może zmniejszyć istniejące LID lub zapobiec ich indukcji. Mogą one również badać, czy skuteczność terapeutyczna zależy od dawki lewodopy lub czy ekspresja LID i/lub skuteczność terapeutyczna różni się w zależności od płci, gatunku i wieku badanego obiektu.</li>
</ol>
<img alt="Schemat czasowy zapobiegania LID, harmonogram dawkowania z ocenami LID, układ leczenia eksperymentalnego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62970/62970fig1v3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Przykład harmonogramu leczenia. Przykład harmonogramu stopniowego zwiększania dawki L-DOPA o całkowitej długości 12 tygodni, obejmującego 8 tygodni iniekcji L-DOPA rozpoczynających się 3 tygodnie po uszkodzeniu 6-OHDA oraz 4 tygodnie po leczeniu eksperymentalnym. W tym przykładzie L-DOPA jest wstrzykiwana podskórnie 5x w tygodniu (od poniedziałku do piątku) o tej samej porze każdego dnia, przez 2 tygodnie przy każdej przepisanej dawce L-DOPA (3, 6, 9 i 12 mg/kg). Behawioralne oceny LID są przeprowadzane w dniach 1, 6 i 10 każdego poziomu dawkowania L-DOPA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62970/62970fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<ol start="2">
	<li>Ważyć szczury co tydzień, aby obliczyć odpowiednią ilość leku w zależności od bieżących zmian masy ciała w trakcie badania. 
	UWAGA: Ze względu na zwiększoną aktywność szczurów LID+, istnieje ryzyko utraty masy ciała przy długotrwałym leczeniu L-DOPA. W przypadku wystąpienia utraty masy ciała, po iniekcjach L-DOPA należy podawać szczurom pełnowartościowe żywieniowo, bardzo atrakcyjne smakowo przysmaki (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Obliczyć ilość L-DOPA i benserazydy wymaganą dla każdego tygodniowego stężenia, odważyć liofilizowane alikwoty na każdy dzień iniekcji i przechowywać je w kombinacji przez 1–2 tygodnie w temperaturze -20 °C w szklanych bursztynowych fiolkach do dnia podania. 
	UWAGA: Dawka docelowa wynosi 12 mg/kg lub 12 mg L-DOPA/1000 g masy ciała. Przykład obliczeń służących do wyznaczenia ilości L-DOPA i soli fizjologicznej potrzebnej na każdy dzień tygodnia, przy zastosowaniu dawki 12 mg L-DOPA/kg masy ciała i objętości iniekcji 1 cc/kg masy szczura, znajduje się w Pliku uzupełniającym 1.</li>
</ol>
3. Przygotowanie pomieszczenia i klatek
<ol>
	<li>W pierwszym dniu leczenia L-DOPA, 3-4 tygodnie po operacji uszkodzenia 6-OHDA, przenieś szczury do pojedynczych klatek, zapewniając wzbogacenie środowiskowe zatwierdzone przez IACUC.</li>
	<li>Przez cały okres badania utrzymuj zwierzęta w pojedynczym zakwaterowaniu, aby uniknąć wzajemnych zakłóceń podczas ocen behawioralnych.</li>
	<li>W dniach oceny LID umieść klatki domowe na stalowym drucianym regale, ustawionym pod kątem około 45° w celu optymalnej obserwacji szczura (Ryc. 2A). Odchyl etykiety identyfikacyjne (Ryc. 2B) do góry i usuń butelki z wodą, dozowniki z pokarmem oraz wszelkie rodzaje wzbogacenia z klatki (Ryc. 2C), aby uniknąć zakłóceń w ocenach behawioralnych.</li>
</ol>
<img alt="Ustawienie klatek dla myszy w laboratorium; widok przekroju środowiska klatki dla konfiguracji badań nad zwierzętami." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62970/62970fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Przykład ustawienia klatek do oceny LID w zakroju dużych eksperymentów na szczurach. (A) Wiele klatek można ustawić do oceny LID, korzystając z dużych metalowych regałów, które zapewniają optymalną widoczność każdego zwierzęcia. Klatki powinny być rozstawione pod kątem 45°, z kartami identyfikacyjnymi odwróconymi do góry (B), a pokarm, butelki z wodą, materiały do gniazdowania i inne wzbogacenia powinny zostać usunięte, aby ograniczyć zasłanianie szczura i rozpraszanie jego uwagi podczas badania zachowań dyskinetycznych (C). Regały metalowe muszą znajdować się kilka stóp od jakiejkolwiek ściany, aby oceniający mógł zbadać szczura z przodu lub z tyłu klatki w zależności od potrzeb. Niezbędne jest oznakowanie urządzeń do wzbogacania środowiska (np. C – czerwone domki-schronienia dla szczurów) indywidualnymi identyfikatorami zwierząt, aby móc umieścić je z powrotem w klatce, z której pochodziły. Jest to szczególnie istotne przy użyciu zwierząt obu płci, aby nie zwiększać stresu u obiektów doświadczalnych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62970/62970fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
4. Iniekcje lewodopy i ocena dyskinezji
<ol>
	<li>Iniekcje podskórne L-DOPA21,22
	<ol>
		<li>Bezpośrednio przed codzienną iniekcją L-DOPA, dodać odpowiednią objętość jałowej soli fizjologicznej do wcześniej odważonej liofilizowanej mieszanki L-DOPA i benserazydy w bursztynowej fiolce i energicznie wstrząsnąć przez 10 s (krok 2.3). 
		UWAGA: Docelowa objętość iniekcji wynosi 1 mL/1000 g masy ciała (przy stężeniu 12 mg L-DOPA na mL). Objętość jałowej soli fizjologicznej będzie zależeć od liczby zwierząt w badaniu.</li>
		<li>Napełnić poszczególne strzykawki (np. 1,0 lub 0,5 mL z igłą 26 G) wymaganą objętością dla każdego zwierzęcia (1 mL/kg masy szczura) i oznaczyć każdą strzykawkę identyfikatorem danego zwierzęcia. 
		UWAGA: Napełnione strzykawki należy przechowywać w sterylnych woreczkach, chroniąc je przed światłem, aż do momentu iniekcji. L-DOPA szybko utlenia się w obecności tlenu i światła w środowisku wodnym23,24,25,26.</li>
		<li>Przenieść pierwszą klatkę na stół do iniekcji.</li>
		<li>Wyjąć szczura z klatki i umieścić go na powierzchni do iniekcji.</li>
		<li>Delikatnie przytrzymać głowę i barki do powierzchni, na której spoczywa szczur, dłonią ręki niedominującej.</li>
		<li>Delikatnie ująć skórę na grzbiecie nad łopatkami kciukiem i palcem wskazującym ręki niedominującej, wstrzyknąć dawkę L-DOPA ręką dominującą w przestrzeń podskórną między/pod palcami, prowadząc igłę jak najbardziej równolegle do ciała, aby uniknąć iniekcji domięśniowej. 
		​UWAGA: Przed iniekcją szczury nie są znieczulane.</li>
		<li>Każdą zużytą strzykawkę zutylizować w pojemniku na odpady ostre.</li>
		<li>Umieścić szczura z powrotem w indywidualnej klatce i podać pełnowartościowe smakołyki, z wyjątkiem dni oceny LID, aby uniknąć zakłóceń w ocenach behawioralnych aż do czasu zakończenia pomiarów.</li>
		<li>Ustawić czasomierz na 1–2 min, w zależności od pożąnego czasu oceny i liczby szczurów w badaniu w dniach oceny. Pobrać kolejną klatkę i wykonać iniekcję kolejnemu szczurowi po sygnale z czasomierza.</li>
		<li>Powtarzać tę procedurę, wykonując iniekcję jednemu szczurowi co 1–2 min, aż wszystkie szczury zostaną zaszczepione.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ocena dyskinez indukowanych lewodopą po iniekcji
	<ol>
		<li>Ocenić intensywność (Tabela 1) i częstotliwość (Tabela 2) ruchów dystonicznych i hiperkinetycznych dyskinez w wybranych punktach czasowych, które powinny obejmować początek występowania zachowań LID, szczyt aktywności oraz fazę wygasania (patrz Plik uzupełniający 2 w celu uzyskania przykładu arkusza oceny LID).</li>
		<li>W przypadku dorosłych samców i samic szczurów linii Sprague Dawley lub Fisher 344 przy wielkości próby N = 40 szczurów, rozpocząć oceny dyskinezy 20 min po pierwszej iniekcji L-DOPA, a następnie w odstępach 50 min aż do 220 lub 270 min po iniekcji, w zależności od tego, kiedy zachowania LID ustąpiły u 90%–100% szczurów.</li>
		<li>W przypadku zastosowania 1-minutowych interwałów oceny, ustawić czasomierz na 1 min. Oceniać pierwszego szczura przez jedną minutę. Przejść do następnego szczura i oceniać go przez 1 min. Kontynuować dla wszystkich szczurów w interwałach 1-minutowych.</li>
		<li>Umieścić czasomierz w widocznym miejscu obok klatki, aby można było obserwować intensywność zachowań LID (Tabela 1) podczas szacowania częstotliwości dowolnego danego zachowania (Tabela 2) w okresie oceny.</li>
		<li>Po zakończeniu ocen dla pierwszego punktu czasowego rozpocząć ponownie od pierwszego szczura w kolejnym punkcie czasowym (np. 70 min po iniekcji) i kontynuować w pożądanym interwale (np. co 50 min), aż wszystkie punkty czasowe zostaną zrealizowane. 
		UWAGA: Ze względu na nakładanie się zadań związanych z iniekcją L-DOPA i oceną LID, w dniach oceny potrzebne są dwie osoby: jedna do iniekcji i jedna do ocen behawioralnych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Poniżej przedstawiono szczegóły dotyczące powtarzalnej indukcji i oceny LIDs w modelu szczura z chorobą Parkinsona po jednostronnym uszkodzeniu 6-OHDA w układzie nigrostriatal DA. Podczas gdy kiedyś sądzono, że gryzonie nie rozwinęły LID i że asymetria rotacyjna może być analogiem LID u szczurów31, modele szczurów i myszy zostały scharakteryzowane w ciągu ostatnich dwóch dekad i są dobrze akceptowanym narzędziem do badań nad LID 15,32,33,34.</su...

Chociaż minęło ponad 50 lat od pierwszego wprowadzenia lewodopy (L-DOPA) jako metody leczenia osób z PD1,2, to jednak zdecydowanie pozostaje najskuteczniejszą terapią objawów motorycznych choroby Parkinsona. Kliniczne objawy motoryczne związane z chorobą Parkinsona wynikają z utraty neuronów dopaminy (DA) w istocie czarnej (SN) pars compacta, co skutkuje dramatycznym spadkiem dostępnej dopaminy w prążkowiu. L-DOPA skutecznie przywraca poziom DA prążkowia, co skutkuje korzyściami motorycznymi na wczesnym etapie choroby3,4. Nieodpowiednio, przy długotrwałym leczeniu, u większości osób z PD rozwiną się dyskinezy wywołane L-DOPA (LID), w tym pląsawica, dystonia i atetoza, które często znacząco wpływają na czynności życia codziennego5,6,7.
Chociaż istnieje kilka modeli behawioralnych LID u gryzoni, różnice w modelowaniu i ocenie behawioralnej LID postawiły pod znakiem zapytania powtarzalność wyników między laboratoriami, jak również wiarygodność tych eksperymentalnych narzędzi do przedklinicznych badań nad PD. Opracowany we współpracy ze specjalistą od klinicznych zaburzeń ruchowych8, obecny protokół jest prostą metodą indukcji i oceny LID i jest odpowiedni do zastosowania w szczurzym modelu PD wykorzystującym jednostronne zmiany nikralne wywołane przez 6-hydroksydopaminę (6-OHDA)9,10. Przedstawiona tutaj skala ocen LID obejmuje punktację zarówno za intensywność, jak i częstotliwość zachowań dyskinetycznych w różnych częściach ciała. Podano również istotne informacje dotyczące przepływu pracy, optymalizacji eksperymentów oraz właściwej opieki i obchodzenia się ze zwierzętami z chorobą Parkinsona i dyskinetyką.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; 100-minutowe</td><td>zszywki</td> z cyfrowym timerem <td>1111764</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Kompas CX Kompaktowa waga</td><td>Ohaus</td><td>30428202</td><td></td></tr><tr><td>5-(2-aminoetylo)-1,2,4-benzenotriolu, monohydrobromek</td><td>Cayman Chemicals</td><td>25330</td><td>6-OHDA to neurotoksyna katecholaminergiczna, która jest stosowana do wywoływania zmian dopaminergicznych i objawów parkinsonowskich u gryzoni</td></tr>.<tr><td>Klatki Allentown</td><td>Allentown, LLC</td><td>Rat900</td><td>Klatki Allentown zapewniają możliwość oglądania szczurów ze wszystkich stron.</td></tr><tr><td>Tacki dla alergików BD z igłą przymocowaną na stałe</td><td>BD</td><td>BD 305540</td><td>Do podskórnych wstrzyknięć L-DOPA</td></tr><tr><td>Chlorowodorek benzerazydu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B7283</td><td>Benzerazyd jest obwodowym inhibitorem dekarboksylazy stosowanym z L-DOPA w celu wywołania dyskinezy w modelach PD u gryzoni</td></tr>.<tr><td>Szklane bursztynowe fiolki scyntylacyjne</td><td>Thermo Scientific</td><td>B7921</td><td>Służy do przechowywania L-DOPA/benzerazydu w temperaturze -20 & deg; C do zmieszania ze sterylną solą fizjologiczną.</td></tr><tr><td>Ester metylowy estru L-3,4-dihydroksyfenyloalaniny chlorowodorek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1507</td><td>Ester metylowy L-3,4-dihydroksyfenyloalaniny jest prekursorem do&nbsp; L-DOPA, który przenika przez barierę krew-mózg i stosuje się w leczeniu objawów parkinsonowskich u gryzoni.</td></tr><tr><td>Paper Mate Sharpwriter Ołówki mechaniczne</td><td>Zszywki</td><td>107250</td><td></td></tr><tr><td>Gryzonie kompletne odżywczo wzbogacające smakołyki</td><td>Bio-Serv</td><td>F05478</td><td></td></tr><tr><td>Okrągłe wiadro na lód z pokrywką, 2,5 l</td><td>Corning</td><td>432129</td><td></td></tr><tr><td>Standardowe plastikowe</td><td>zszywki</td> do schowka <td>1227770</td><td></td></tr><tr><td>Stalowe przesuwne regały o długości 6 stóp</td><td>Uline</td><td>H9488</td><td>Szerokość/wysokość można dostosować do potrzeb/liczby szczurów na eksperyment</td></tr><tr><td>Sterylna sól fizjologiczna 0,9%</td> <td>Covidien/Argyle</td><td>1020</td><td>Do mieszania z L-DOPA/benzerazydem przed wstrzyknięciami podskórnymi.</td></tr></tbody></table>

indukcja i ocena dyskinez wywołanych lewodopą w szczurzym modelu choroby parkinsona

Induction and Assessment of Levodopa-induced Dyskinesias in a Rat Model of Parkinson's Disease

Lewodopa (L-DOPA) pozostaje złotym standardem terapii stosowanej w leczeniu objawów motorycznych choroby Parkinsona (PD). Jednak niepożądane mimowolne ruchy znane jako dyskinezy wywołane przez L-DOPA (LID) rozwijają się przy długotrwałym stosowaniu tego prekursora dopaminy. Szacuje się, że częstość występowania LIDs wzrasta do około 90% osób z PD w ciągu 10-15 lat leczenia. Zrozumienie mechanizmów tej choroby i opracowanie zarówno nowatorskich, jak i skutecznych metod leczenia dyskinezy wymaga spójnego i dokładnego modelowania na potrzeby badań przedklinicznych interwencji terapeutycznych. Szczegółowa metoda wiarygodnej indukcji i kompleksowej oceny LIDs po indukowanej przez 6-OHDA zmianie nikralnej w szczurzym modelu PD przedstawiono tutaj. Niezawodna ocena LID u szczurów stanowi potężne narzędzie, które można łatwo wykorzystać w laboratoriach do testowania nowych terapii skoncentrowanych na zmniejszeniu lub wyeliminowaniu tego powszechnego obciążenia wywołanego leczeniem u osób z chorobą Parkinsona.

LID u szczurów z modelem choroby Parkinsona mogą przejawiać się jako szereg nieprawidłowych ruchów mimowolnych (AIMs), w tym zachowania dystoniczne, hiperkinetyczne i stereotypowe. Przedstawiono tutaj kryteria oceny LID dla takich zachowań, obejmujące zarówno intensywność (Tabela 1), jak i częstotliwość (Tabela 2). Pozwala to na uzyskanie ogólnego wyniku nasilenia LID dla każdego szczura, który odzwierciedla zarówno jakość (intensywność), jak i ilość czasu poświęconego na wykonywanie tyc...

Ten artykuł opisuje metody wywoływania i oceny dyskinez wywołanych lewodopą w szczurzym modelu choroby Parkinsona. Protokół zawiera szczegółowe informacje dotyczące intensywności i częstotliwości szeregu zachowań dyskkinetycznych, zarówno dystonicznych, jak i hiperkinetycznych, zapewniając niezawodne narzędzie do testowania terapii ukierunkowanych na tę niezaspokojoną potrzebę medyczną.

Indukcja i ocena dyskinez wywołanych lewodopą w szczurzym modelu choroby Parkinsona

Levodopa (L-DOPA) remains the gold-standard therapy used to treat Parkinson&#39;s disease (PD) motor symptoms. However, unwanted involuntary movements ...

Nasz protokół zapewnia szczegółową metodę wiarygodnej indukcji i kompleksowej oceny dyskinezy wywołanej lewodopą w szczurzym modelu choroby Parkinsona. Główną zaletą naszej skali oceny dyskinez jest to, że pozwala ona na ilościowe określenie zarówno intensywności danego nieprawidłowego mimowolnego ruchu, jak i ilości czasu spędzonego na przejawianiu tego zachowania. Wiarygodne modele zwierzęce dyskinezy wywołanej lewodopą mają kluczowe znaczenie dla realizacji ostatecznego celu, jakim jest znalezienie skutecznych metod leczenia w celu zmniejszenia lub wyeliminowania efektu ubocznego u osób z chorobą Parkinsona.Rozpocznij przygotowania do eksperymentu od cotygodniowego ważenia szczurów, aby obliczyć odpowiednią ilość leku na podstawie zmian wagi. Zapewnij szczurom pełnowartościowe i bardzo smaczne smakołyki. W pierwszym dniu leczenia L-DOPA szczury należy przenieść do pojedynczego pomieszczenia wyposażonego w wzbogacenie zatwierdzone przez instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt.I utrzymuj szczury w pojedynczym pomieszczeniu przez cały czas trwania badania, aby uniknąć ingerencji rówieśników w oceny behawioralne. W dniach, w których występuje ocena dyskinezy, usuń butelki z wodą, stojaki na żywność i wzbogacenie w klatce, aby uniknąć zakłóceń w ocenach behawioralnych, i umieść klatki na stojaku z drutu stalowego pod kątem około 45 stopni, a następnie odwróć znaczniki identyfikacyjne do góry. Przed wstrzyknięciem L-DOPA dodać odpowiednią objętość sterylnego soli fizjologicznej do wstępnie zważonej liofilizowanej mieszanki L-DOPA i benzerazydu w bursztynowej fiolce i dobrze wstrząsać przez 10 sekund.Bezpośrednio po przygotowaniu należy napełnić wymaganą objętość mieszaniny L-DOPA-benzerazyd dla każdego zwierzęcia w oddzielnych strzykawkach wyposażonych w igłę o rozmiarze 26G i oznaczyć każdą strzykawkę indywidualnym identyfikatorem zwierzęcia. Po umieszczeniu pierwszej klatki na stole do wstrzykiwań, należy wyjąć szczura z klatki i umieścić go na powierzchni iniekcji. Użyj ręki niedominującej, aby przytrzymać głowę i ramiona szczura dłonią przy powierzchni i poślizgnąć skórę na grzbiecie pokrywającą łopatki kciukiem i palcem wskazującym.Użyj dominującej ręki, aby wstrzyknąć objętość L-DOPA do podskórnej przestrzeni między palcami, trzymając igłę równolegle do ciała, aby uniknąć wstrzyknięcia domięśniowego. Po wstrzyknięciu należy przenieść szczura do klatki. Następnie ustaw minutnik na jedną do dwóch minut i powtarzaj procedurę, wstrzykując jednego szczura co jedną do dwóch minut, aż wszystkie szczury zostaną wstrzyknięte.W dniu oceny umieść zegar obok klatki, aby obserwować dyskinezę wywołaną lewodopą lub intensywność zachowania LID, jednocześnie szacując częstotliwość dowolnego zachowania w okresie oceny. Oceń intensywność i częstotliwość ruchów dyskinezy dystonicznej i hiperkinetycznej, w tym początkowy początek zachowania LID, zachowanie szczytowe i fazę spadku w pożądanej liczbie punktów czasowych. Jeśli używasz jednominutowych interwałów oceny, ustaw timer na jedną minutę, aby ocenić pierwszego szczura i kontynuuj ocenę przez wszystkie szczury w jednominutowych odstępach.Ocena LID dla nieprawidłowych mimowolnych zachowań u szczurów z chorobą Parkinsona została skategoryzowana tak, aby obejmowała intensywność i częstotliwość zachowań. U szczurów zaobserwowano szereg nieprawidłowych ruchów mimowolnych, w tym zachowania dystoniczne, hiperkinetyczne i stereotypowe. Reprezentatywna analiza stanowi przykład danych przedstawionych jako LID dawki szczytowej w całym okresie eksperymentu i schemacie dawkowania.Szczytowa dawka LID została zdefiniowana jako czas, w którym średni wynik LID w grupie był największy. Dodatkowo, dane oceny LID zostały przeanalizowane dla każdego dziennego kursu czasowego oceny przy różnych stężeniach L-DPOA z grupami połączonymi i wykreślonymi jako pojedyncze zwierzęta. Tkanki pośmiertne od osób poddanych ocenie behawioralnej można wykorzystać do zbadania mechanizmów molekularnych związanych z dyskinezami wywołanymi lewodopą oraz wpływu interwencji terapeutycznych na takie mechanizmy molekularne.Modele zwierzęce dyskinezy wywołanej lewodopą były przydatne w wyjaśnieniu kilku mechanizmów, które uważa się za leżące u podstaw tej choroby behawioralnej. Wiedza ta doprowadziła do przedklinicznej i klinicznej oceny kilku celów.

induction-assessment-levodopa-induced-dyskinesias-rat-model-parkinson

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Choroba Parkinsona jest spowodowana utratą unerwienia dopaminergicznego prążkowia, którą można wywołać eksperymentalnie za pomocą 6-OH-dopaminy. Opisujemy sposób wykonania stereotaktycznej lekcji oraz monitorowania zachowania rotacyjnego indukowanego apomorfiną u myszy. Model ten jest użyteczny i wiarygodny w testowaniu nowych terapii choroby Parkinsona.

Model mysi choroby Parkinsona: od uszkodzenia dopaminergicznego 6-OHDA do testów behawioralnych

Opisano protokół wykonywania jednostronnych uszkodzeń wiązki przedniej części mózgu (MFB) za pomocą 6-OHDA u myszy. Metoda ta charakteryzuje się niskim wskaźnikiem śmiertelności (13,3 %), przy czym u 89% przeżywających zwierząt stwierdzono &gt;95% ubytku dopaminy w prążkowiu oraz tendencję do rotacji ipsypsilaternej w stronę strony uszkodzenia na poziomie 90,63±-4,02 %.

Opracowanie jednostronnego modelu choroby Parkinsona u myszy z wykorzystaniem lekcji 6-OHDA

Farmakoterapia polegająca na zastępowaniu dopaminy za pomocą L-DOPA jest najczęściej stosowanym leczeniem objawowym choroby Parkinsona, jednak wiąże się z efektami ubocznymi, w tym z mimowolnymi, nieprawidłowymi ruchami, określanymi mianem dyskinezy 1. W niniejszym materiale przedstawiono protokół obrazowania metodą spektrometrii mas MALDI, który pozwala wykryć zmiany w poziomach neuropeptydów w mózgu szczura związane z dyskinezą.

Obrazowanie spektrometrią mas MALDI neuropeptydów w chorobie Parkinsona

Ten film pokazuje proces wywoływania dyskinez wywołanych lewodopą w modelu szczurzym z chorobą Parkinsona poprzez podawanie lewodopy wraz z inhibitorem konwersji dopaminy. Powtarzające się zastrzyki nadmiernie stymulują neurony mózgu, powodując dysfunkcję motoryczną.

Indukcja dyskinez wywołanych lewodopą w szczurzym modelu choroby Parkinsona

W chorobie Parkinsona i ogólnie w zaburzeniach ruchowych, czułe i wiarygodne testy behawioralne są niezbędne do testowania nowych potencjalnych terapii. W tym miejscu opisujemy łatwą do opanowania baterię testów sensomotorycznych dla myszy, które są wrażliwe na różne stopnie uszkodzenia układu nigrostriatal i przydatne w badaniach przedklinicznych.

Ocena funkcji sensomotorycznych w mysich modelach choroby Parkinsona

Opisujemy ustanowienie mysiego modelu choroby Parkinsona za pomocą MPTP, oraz oceny behawioralne za pomocą testów cylindrycznych i otwartych do pomiaru funkcji motorycznych. Następnie używamy L-DOPA jako jednego z przykładów, aby pokazać, jak zastosować ten model w badaniu leków na chorobę Parkinsona.

Behawioralna ocena spontanicznej lokomocji w mysim modelu choroby Parkinsona wywołanym MPTP

Udostępniamy protokół do generowania farmakologicznego modelu myszy dystonii DYT/PARK-ATP1A3 poprzez wszczepienie kaniul do zwojów podstawy i móżdżku podłączonych do pomp osmotycznych. Opisujemy indukcję ruchów podobnych do dystonii poprzez zastosowanie wyzwania motorycznego i charakterystykę fenotypu za pomocą behawioralnych systemów punktacji.

Implantacja pomp osmotycznych i indukcja stresu w celu ustalenia objawowego, farmakologicznego modelu myszy dla dystonii DYT/PARK-ATP1A3

Tutaj opisujemy system RatWalker, zbudowany przez przeprojektowanie aparatu MouseWalker, aby dostosować go do zwiększonych rozmiarów i wagi szczurów. System ten wykorzystuje sfrustrowane całkowite odbicie wewnętrzne (FTIR), szybkie przechwytywanie wideo i oprogramowanie do analizy w otwartym dostępie do śledzenia i ilościowego określania parametrów chodu.

Zastosowanie systemu RatWalker do analizy chodu w genetycznym modelu szczurzym choroby Parkinsona

Model 6-hydroksydopaminy (6-OHDA) jest używany od dziesięcioleci do pogłębiania wiedzy na temat choroby Parkinsona. W tym protokole pokazujemy, jak wykonać jednostronne zmiany nigrostriatalne u szczura poprzez wstrzyknięcie 6-OHDA w pęczek przyśrodkowy przodomózgowia, ocenić deficyty motoryczne i przewidzieć zmiany za pomocą testu krokowego.

Szczurzy model choroby Parkinsona z 6-hydroksydopaminą

Modele dyskinez wywołanych przez L-DOPA są nieocenionymi narzędziami do identyfikowania interwencji terapeutycznych w celu osłabienia rozwoju lub złagodzenia objawów, które pojawiają się w wyniku wielokrotnego podawania L-DOPA. Protokół ten pokazuje, jak indukować i analizować ruchy podobne do dyskinetycznych w jednostronnie zmienionym 6-OHDA szczurzym modelu choroby Parkinsona.

Ocena dyskinez wywołanych L-DOPA w jednostronnie szczurzym modelu choroby Parkinsona z 6-OHDA

Poznaj metodę indukcji i oceny dyskinez wywołanych lewodopą w szczurzym modelu choroby Parkinsona. Protokół umożliwia ilościową analizę intensywności i częstotliwości nieprawidłowych ruchów.

Indukcja i ocena dyskinez wywołanych lewodopą w szczurzym modelu choroby Parkinsona

Przeglądaj więcej filmów