System eksplantatów do badań obrazowania poklatkowego zespołu obwodów węchowych u Drosophila

Protokół ten przedstawia metodę żywego obrazu, montażu obwodu węchowego muchy na poziomie pojedynczego aksonu z rozwijającego się mózgu. Sekcja Aby oczyścić tkankę pokrywającą rozwijający się mózg, możemy zebrać wysokiej jakości obrazy z wewnętrznego mózgu. Metoda ta dostarcza cennych informacji na temat biologicznych podstaw rozwoju obwodów komórkowych.

Można go łatwo zmodyfikować, aby badać rozwój innych obwodów. Potrzeba trochę czasu, aby osoba wykonała stabilną kontrolę ręki w mikrodysekcji. Przyda się więcej praktyki.

Na początek przygotuj naczynie hodowlane do mobilizacji eksplantatu podczas obrazowania poklatkowego, kładąc Sylgard o grubości 0,5 centymetra na dolnej powierzchni szalki Petriego i pozwalając jej utwardzić się przez 48 godzin w temperaturze pokojowej. Aby przygotować mikroszpilki do unieruchomienia eksplantatu na tej płytce za pomocą kleszczy, przyklej wiele mikro szpilek na taśmie z ostrymi końcami wyrównanymi z jednej strony i odetnij nożyczkami dwa milimetry ostrych końców. Następnie za pomocą kleszczyków włóż wycięte mikro szpilki w warstwę Sylgard gotowej płytki Sylgard.

Za pomocą pędzla zbierz białe poczwarki, które tworzą poczwarkę w ciągu godziny i przenieś je do nowej fiolki. Inkubować poczwarki w łaźni wodnej hartowanej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 40 minut, aby uzyskać rzadkie klony ORN z losowych typów. Po szoku cieplnym umieść fiolkę w temperaturze 25 stopni Celsjusza na 30 godzin, w wyniku czego poczwarki osiągną wiek 30 godzin po utworzeniu poczwarki.

Następnie przygotuj pożywkę hodowlaną do eksplantatu zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstu i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza. W dniu obrazowania dodać płodową surowicę bydlęcą, roztwór podstawowy insuliny ludzkiej i 20 roztworów podstawowych hydroksyekdyzonu rozpuszczonych w etanolu do 50-mililitrowej fiolki zawierającej 45 mililitrów pożywki Drosophila Schneidera. Dobrze wymieszaj i przenieś 15 mililitrów pełnego podłoża do nowej 50-mililitrowej stożkowej probówki i przechowuj resztę pełnego podłoża w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez tydzień.

Następnie przykryj otwór probówki zawierające pełne podłoże filmem parafinowym i natlenić pożywkę, pompując pęcherzyki tlenu pod powierzchnię cieczy przez sterylną pięciomililitrową końcówkę pipety z szybkością jednego pęcherzyka na sekundę przez 20 do 30 minut. Następnie wysterylizuj powierzchnię studzienki rozwarstwiającej i wcześniej przygotowaną płytkę Sylgard 70% etanolem i pozostaw do wyschnięcia przed użyciem. Za pomocą pędzla przenieś 30-godzinną poczwarkę APF na bibułkę w celu suszenia zewnętrznej powierzchni poczwarki przez pięć minut.

Po nałożeniu taśmy dwustronnej na szkiełko podstawowe należy ostrożnie przymocować wysuszoną poczwarkę do lepkiej powierzchni taśmy stroną grzbietową skierowaną do góry. Delikatnie dociśnij poczwarkę szczoteczką, aby prawidłowo przymocować brzuszną stronę do taśmy, nie uszkadzając poczwarki. Włożyć jedną ostrą końcówkę kleszczy między brązową obudowę poczwarki a poczwarkę od strony bocznej i ostrożnie przeciąć brązową obudowę poczwarki przez linię do tylnego końca poczwarki.

Po otwarciu brązowej skrzynki poczwarki, za pomocą kleszczy, delikatnie przytrzymaj poczwarkę i przenieś ją do studzienki rozwarstwiającej zawierającej jeden mililitr natlenionej pełnej pożywki. Zanurz poczwarkę w podłożu, aby zanurzyć ją na dnie studni. Aby wypreparować eksplantat mózgu anteny z poczwarki, delikatnie przytrzymaj poczwarkę za pomocą kleszczy jedną ręką i za pomocą mikronożyczek utwórz mały otwór z tylnej strony poczwarki, który uwalnia wysokie ciśnienie wewnątrz poczwarki.

Zaczynając od otworu, przetnij brzuszną linię środkową aż do szyi, a następnie przetnij obwód szyi, aby oderwać głowę od ciała poczwarki i umieścić ciało w innej studzince. Następnie przetnij przezroczysty naskórek pokrywający grzbietową stronę mózgu, aby odsłonić ciało tłuszczowe na wierzchu mózgu, upewniając się, że zachowasz naskórek, do którego przyczepia się siatkówka i czułek, i podobnie, przetnij naskórek od brzusznej strony mózgu. Odpipetuj pożywkę w kierunku otwartych obszarów po grzbietowej i brzusznej stronie głowy za pomocą pipety P10, aby delikatnie wypłukać ciało tłuszczowe pokrywające mózg i czułkę.

Aby zbadać interakcję obustronnych aksonów ORN lub aksonów ORN z celowaniem w dendryty PN, przeciąć nerw czułkowy podczas etapu, ostrożnie umieszczając ostrza mikronożyczek między naskórkiem a mózgiem i odciąć zainteresowany nerw czułkowy. W celu przeniesienia wypreparowanego eksplantatu na płytkę Sylgard, należy umieścić około 200 mikrolitrów kropli natlenionej pełnej pożywki na powierzchni Sylgard. Kilkakrotnie odpipetować tłuszcz pochodzący z wypreparowanego pnia przez końcówkę pipety o pojemności 200 mikrolitrów w celu pokrycia wewnętrznej powierzchni, aby zapobiec przywieraniu eksplantatów do końcówki pipety podczas przenoszenia ze studzienki rozwarstwiającej do pożywki kropelki na płytce Sylgarda.

Za pomocą kleszczy przypiąć eksplant do warstwy Sylgard w dwóch płatach optycznych, następnie ostrożnie umieścić płytkę Sylgard na stacji obrazowania, unieruchomić płytkę taśmami i powoli dodawać 10 mililitrów natlenionej pełnej pożywki do płytki Sylgard za pomocą pipety P1000. Aksony ORN docierają do płata anteny między 18 godziną a 36 godziną APF, a następnie poruszają się po płacie anteny, przekraczają linię środkową i wprowadzają innowacje w kłębuszkach nerkowych. Przed rejestracją aksony wykazywały pewne boczne dryfowanie w miarę rozwoju mózgu, a po rejestracji dryfowanie zostało skorygowane.

Tożsamość kłębuszków nerkowych wyekstrahowanych aksonów ORN ujawniono za pomocą barwienia immunologicznego markera neuropilu i kadheryny. Porównując z mapą płatów wewnętrznych, można było określić tożsamość każdego kłębuszka nerkowego. Podczas hodowli ex vivo rozwój bakterii zwykle powoduje spoczynkowy rozwój obwodu węchowego.

Dlatego ważne jest, aby dokładnie wysterylizować naczynie hodowlane i szpilki przed obrazowaniem oraz utrzymać pomieszczenie do obrazowania w czystości i izolacji. Aby osiągnąć wyższą rozdzielczość przestrzenno-czasową, ten system eksplantacji można obrazować za pomocą bardziej zaawansowanego mikroskopu, mikroskopu światła siatkowego z optyką adaptatywną. Chociaż jako przykład pokazano tutaj rozwój obwodu fabrycznego, system ten może być potencjalnie rozszerzony o badania innych obwodów i procesów rozwojowych w rozwijającym się centralnym mózgu.