Name: System eksplantatów do badań obrazowania poklatkowego zespołu obwodów węchowych u Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-13T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Poznaj metodę obrazowania poklatkowego zespołu obwodów węchowych u Drosophila na poziomie pojedynczych aksonów. Protokół obejmuje mikrochirurgię eksplantatu mózgu, warunki hodowli i techniki obrazowania żywych tkanek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy N. Özelowi i R. Hiesingerowi za ich rady dotyczące hodowli eksplantatów; M. Wagnerowi za pomoc techniczną w mikroskopii dwufotonowej; D.J. Luginbuhlowi za generowanie transgenicznych much; D. Friedmannowi za sugestie dotyczące analizy oprogramowania Fidżi; Y. Ge za pomoc w pracy w locie; C. McLaughlin i K.K.L. Wong za komentarze do manuskryptu. L.L. jest badaczem w Instytucie Medycznym Howarda Hughesa. Prace te były wspierane przez granty National Institutes of Health 1K99DC01883001 (dla T.L.) i R01-DC005982 (dla L.L.).

1. Przygotowanie odczynników
UWAGA: Wszystkie kroki w tym protokole są wykonywane w temperaturze pokojowej (20-25 °C), chyba że wyjaśniono inaczej.
<ol>
	<li>Aby przygotować naczynie hodowlane do unieruchomienia eksplantatu podczas obrazowania poklatkowego, połóż Sylgard o grubości 0,5 cm (przed użyciem dokładnie wymieszaj dwa płynne składniki w stosunku 10:1) na dolnej powierzchni szalki Petriego o wymiarach 60 mm x 15 mm i pozwól jej utwardzić się przez 48 godzin w temperaturze pokojowej (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A, określany jako płytka Sylgarda w poniższym tekście).</li>
	<li>Aby przygotować mikroszpilki do unieruchamiania eksplantatu na tej płytce, użyj pary kleszczyków, aby przykleić wiele mikro szpilek do taśmy z ostrymi końcami wyrównanymi po jednej stronie (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2B). Użyj nożyczek, aby odciąć ~2 mm od ostrych końców mikro szpilek (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B'). Użyj kleszczyków, aby przytrzymać wycięte mikroszpilki i włóż je w warstwę Sylgard gotowej płytki Sylgard (Rysunek 2C). Dwa mikro piny służą do unieruchomienia jednego eksplantatu.</li>
	<li>Za pomocą pędzla zebrać białe poczwarki, które tworzą poczwarkę w ciągu 1 godziny, od hsFLP, kamyczk-GAL4/+; UAS-FRT100-stop-FRT 100-mCD8-GFP8 genotypu i przenieść je do nowych fiolek. Szok termiczny w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 40 minut w celu wywołania rzadkich klonów ORN z losowych typów. Po szoku cieplnym umieścić fiolki w temperaturze 25 °C na 30 godzin, w wyniku czego poczwarki dojrzewają po 30 godzinach od powstania poczwarki (APF).</li>
	<li>Aby przygotować pożywkę hodowlaną do eksplantatu, dodaj 5 ml penicyliny-streptomycyny (10 000 U/ml) do 500 ml pożywki Schneider's Drosophila Medium. Przefiltrować pożywkę i przygotować 45 ml porcji w stożkowych probówkach o pojemności 50 ml. Pożywkę można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 1-2 miesiące.</li>
	<li>W dniu obrazowania należy pobrać jedną probówkę zawierającą 45 ml pożywki Drosophila firmy Schneider i dodać 5 ml płodowej surowicy bydlęcej (10% v/v), 125 μl roztworu podstawowego insuliny ludzkiej o stężeniu 4 mg/ml (stężenie końcowe 10 μg/ml), 50 μl roztworu podstawowego 20-hydroksyekdyzonu o stężeniu 1 mg/ml rozpuszczonym w etanolu (stężenie końcowe 1 μg/ml). Dobrze wymieszaj i przenieś 15 ml pełnego podłoża do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Pozostałą część pełnego podłoża można przechowywać w temperaturze 4 °C przez tydzień. Płodowa surowica bydlęca, roztwór podstawowy insuliny ludzkiej i roztwór podstawowy 20-hydroksyekdyzonu są podawane i przechowywane w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Natlenić pełne 15 ml pożywki, pompując pęcherzyki tlenu z butli tlenowej pod powierzchnią cieczy przez sterylną końcówkę pipety o pojemności 5 ml z szybkością jednego pęcherzyka/s przez 20-30 minut. Użyj folii parafinowej, aby zakryć otwór rurki podczas tego procesu.</li>
	<li>Wysterylizuj powierzchnię studzienki rozwarstwiającej i płytkę Sylgard (z mikroszpilkami umieszczonymi na warstwie Sylgard, przygotowanymi w krokach A1 i A2) 70% etanolem. Pozwól im wyschnąć przed użyciem.</li>
</ol>
2. Sekcja eksplantacji
<ol>
	<li>Za pomocą pędzla przenieś poczwarki 30 h APF (30 h after formation upral) na papierową chusteczkę i osusz zewnętrzną powierzchnię poczwarki przez 5 min.</li>
	<li>Umieść kawałek taśmy dwustronnej na szklanym szkiełku. Ostrożnie przymocuj wysuszone poczwarki do lepkiej powierzchni taśmy stroną grzbietową skierowaną do góry. Delikatnie dociśnij poczwarki szczoteczką, aby brzuszna strona poczwarki dobrze przylegała do taśmy (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3A). Nie uszkadzaj poczwarki.</li>
	<li>Użyj kleszczy, aby usunąć brązową kopertę poczwarki pokrywającą grzbietową stronę głowy (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A,B). Włóż jedną ostrą końcówkę kleszczy między brązową kopertę poczwarki a poczwarkę od strony bocznej i ostrożnie przełam brązową kopertę poczwarki przez linię do tylnego końca poczwarki (<silna klasa="xfig">Rysunek 3B,C). Otwórz brązową skrzynkę poczwarki. Użyj kleszczy, aby delikatnie przytrzymać poczwarkę i przenieść do dołka preparacyjnego z 1 ml natlenionego pełnego podłoża. Zanurz pływającą poczwarkę na średniej powierzchni, aby pomóc jej opaść na dno studni (<silna klasa="xfig">Rysunek 3D). 
	UWAGA: Nie wkładaj końcówki kleszczy zbyt głęboko do brązowego etui na poczwarkę, aby zapobiec zranieniu poczwarki kleszczami.</li>
	<li>Aby wypreparować eksplantat czułkowo-mózgowy z poczwarki, użyj kleszczy, aby delikatnie przytrzymać poczwarkę jedną ręką, a drugą ręką użyj mikronożyczek, aby wyciąć mały otwór z tylnej strony poczwarki (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3E). Ten mały otwór uwalnia wysokie ciśnienie wewnątrz poczwarki.</li>
	<li>Przetnij brzuszną linię środkową poczwarki od otworu do szyi (wąskiej struktury łączącej głowę i klatkę piersiową) za pomocą mikronożyczek (<silna klasa="xfig">Ryc. 3F). Następnie przeciąć obwód szyi, aby odłączyć głowę od ciała poczwarki (<silna klasa="xfig">Ryc. 3G). Wyjmij ciało i umieść je w innym dołku. 
	UWAGA: Nie przecinaj szyi bezpośrednio od grzbietowej/brzusznej strony poczwarki, która może ścisnąć mózg.</li>
	<li>Wytnij przezroczysty naskórek, który pokrywa grzbietową stronę mózgu (<silna klasa="xfig">Ryc. 3H). Spowoduje to odsłonięcie ciała tłuszczowego na szczycie mózgu. Zachowaj trochę naskórka, do którego przyczepia się siatkówka i czułki. Powtórz tę samą procedurę dla brzusznej strony mózgu. 
	UWAGA: Nie wkładaj ostrza nożyczek zbyt głęboko pod naskórek, ponieważ spowoduje to przecięcie nerwów czułkowych łączących czułki z mózgiem (<silna klasa="xfig">Rysunek 3H').</li>
	<li>Użyj pipety P10, aby delikatnie wypłukać tłuszcz pokrywający mózg i czułki, pipetując pożywkę w kierunku otwartych obszarów po grzbietowej i brzusznej stronie głowy (<silna klasa="xfig">Rysunek 3I). 
	UWAGA: Podczas pipetowania pożywki należy zachować ostrożność, ponieważ mózg można łatwo oderwać od naskórka. Upewnij się, że cała tkanka tłuszczowa została usunięta podczas tego kroku. Zahamowanie rozwoju aksonów ORN obserwowano, gdy ciało tłuszczowe nie było dobrze oczyszczone, prawdopodobnie z powodu słabego dostępu tlenu z pożywki.</li>
	<li>Aby zbadać interakcję obustronnych aksonów ORN lub aksonów ORN z celowaniem w dendryty PN, na tym etapie należy przeciąć jeden lub dwa nerwy czułkowe za pomocą mikronożyczek8 (<silna klasa="xfig">Rysunek 3J). Ostrożnie umieść ostrza nożyczek między naskórkiem a mózgiem i odetnij zainteresowane nerwy czułkowe.</li>
	<li>Aby przenieść wypreparowany eksplant na płytkę Sylgard, umieść kroplę natlenionej pełnej pożywki (~200 μL) na powierzchni Sylgarda. Pokryj wewnętrzną powierzchnię końcówki pipety z końcówką o szerokości 200 μl tłuszczowym korpusem z wypreparowanego pnia (krok 1.6), kilkakrotnie pipetując tłuszczową masę, co zapobiegnie przyklejaniu się eksplantatów do końcówki pipety podczas przenoszenia. Następnie użyj tej końcówki do pipety z szeroką końcówką, aby przenieść eksplant ze studzienki rozwarstwiającej do pożywki kropelki na płytce hodowlanej (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3K).</li>
	<li>Użyj kleszczy, aby przypiąć eksplant do warstwy Sylgard w dwóch płatach wzrokowych (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3L). Ostrożnie umieścić płytkę Sylgard na stacji obrazowania i unieruchomić płytkę za pomocą taśm. Powoli dodać 10 ml natlenionej pożywki do płytki Sylgard za pomocą pipety P1000. 
	UWAGA: Unikaj przerywania eksplantatu podczas dodawania pożywki do płytki Sylgard.</li>
</ol>
3. Obrazowanie na żywo oparte na mikroskopii dwufotonowej
<ol>
	<li>Aby wykonać obrazowanie poklatkowe, użyj mikroskopu dwufotonowego, lasera Ti:Sapphire, obiektywu z 20-krotnym zanurzeniem w wodzie (1,0 NA) i oprogramowania do obrazowania. Użyj długości fali wzbudzenia przy 920 nm do obrazowania białek GFP. Dostosuj czas zatrzymania piksela na 10 μs.</li>
	<li>Dostosuj położenie stacji obrazowania tak, aby eksplantaty znajdowały się mniej więcej pod obiektywem. Użyj 70% etanolu do sterylizacji soczewki przed obrazowaniem. Powoli opuść obiektyw pod podłożem w pobliżu eksplantatów. Sprawdź, czy na soczewce obiektywu nie ma pęcherzyków.
	<ol>
		<li>Jeśli tak, podnieś obiektyw nad medium i powtarzaj to, aż bańka zniknie. Znajdź eksplantaty za pomocą okularu i wyśrodkuj jeden eksplantat na polu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby zapewnić eksplant z kilkoma ORN słabo oznakowanymi do obrazowania poklatkowego, za każdym razem rozetnij ~10 eksplantatów i wyrównaj na osi y na płytce hodowlanej. Przesiewaj wszystkie eksplantaty, przesuwając obiektyw wzdłuż osi y i wybierz eksplantat, w którym kilka pojedynczych aksonów ORN właśnie dotarło do płata anteny do obrazowania (<silna klasa = "xfig">Rysunek 4A).
	<ol>
		<li>Rozpoznaj płat anteny po jego owalnym kształcie i aksonach ORN, które zaczynają go okrążać. Zobrazuj obszar ~150 μm x 150 μm w płaszczyźnie xy (3-krotny zoom z obiektywem 20x). Oszacuj granicę dwóch płatów antenowych i wyśrodkuj je w obszarze obrazowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wybierz początkowy obszar obrazowania wzdłuż osi z, definiując dolną i górną sekcję skanowania. Ustaw obszar obrazowania wzdłuż osi z. Ustaw najgłębszy odcinek z sygnałami aksonów ORN jako pierwszą sesję obrazowania, a sesję 100 μm powyżej (bardziej powierzchowna strona) jako ostatnią sesję obrazowania (<silna klasa="xfig">Rysunek 4B). 
	UWAGA: Pozostawia to niektóre sekcje na górze (powierzchownej) aksonów ORN i pozwala uniknąć przesuwania aksonów ORN w górę poza obszar obrazowania z powodu wzrostu mózgu podczas hodowli.
	<ol>
		<li>Obraz w odstępach co 2 μm. Ustaw automatyczne skanowanie obrazowe z częstotliwością co 20 minut za pomocą oprogramowania do obrazowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przesuń obszar obrazowania o 20 μm w górę wzdłuż osi z po pierwszych 4 godzinach obrazowania i kolejne 20 μm w górę wzdłuż osi z po 16 godzinach obrazowania. Można to osiągnąć, ustawiając skrypt i różne stosy z w oprogramowaniu do obrazowania.</li>
	<li>Hodować eksplant przez dodatkowy okres po obrazowaniu (do 24 godzin ex vivo) przed utrwaleniem i barwieniem N-kadheryną, markerem neuropilowym, w celu ujawnienia tożsamości genetycznej każdego pojedynczego ORN przez kłębuszki nerkowe, do których jest skierowany.</li>
</ol>
4. Przetwarzanie obrazu
<ol>
	<li>Aby przetworzyć obrazy stosu z serii sekcji wykonanych w każdym punkcie czasowym za pomocą oprogramowania Fiji, otwórz serię sekcji obrazu, kliknij Obraz | Stosy | Z projekt [/].</li>
	<li>Aby skorygować boczny dryf próbki podczas hodowli, zainstaluj wtyczkę TurboReg na Fidżi.
	<ol>
		<li>Otwórz serię obrazów stosu z i pojedynczy obraz stosu z z serii. Otwórz wtyczki | Rejestracja | TurboReg.</li>
		<li>Wybierz serię obrazów stosu z w polu Źródło i pojedynczy obraz stosu z w obszarze Cel | Tłumaczenie. Kliknij przycisk Partia, aby zarejestrować wszystkie obrazy z otwartej serii obrazów stosu z.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby zmaksymalizować użyteczność obrazowanych próbek, oddziel słabo oznaczone pojedyncze aksony znajdujące się w pobliżu siebie od obrazów stosu z następujących po sekcjach obrazu 3D.
	<ol>
		<li>Aby wyodrębnić pojedyncze aksony ORN z kilku aksonów na tym samym obrazie, otwórz serię sekcji obrazów, kliknij Wtyczki | Segmentacja | Edytor segmentacji [/]. Wybierz narzędzie pędzla i zamaskuj zainteresowany akson ORN w oknie roboczym Edytora Segmentacji za pomocą przycisków Wybierz "+" lub "-" na każdej sekcji obrazu.</li>
		<li>Kliknij Proces | Kalkulator obrazów [/]. Wybierz "Obraz X" na rysunku 1, "Mnożenie" w operacji, "Obraz X. etykiety" na obrazie 2, [/]. Spowoduje to wygenerowanie nowego pliku serii obrazów tylko z zainteresowanym aksonem. Wykonaj krok 4.1, aby przetworzyć obraz stosu z. Powtórz ten krok dla wszystkich punktów czasu, aby wygenerować plik obrazu szeregów czasowych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby pseudokolorować różne aksony z tego samego obrazu, najpierw wykonaj krok 4.3 w celu wygenerowania pliku obrazu szeregów czasowych dla każdego aksonu osobno. Otwórz pliki obrazów szeregów czasowych dla różnych pojedynczych aksonów z tego samego obrazu danych pierwotnych. Kliknij na Obrazek | Kolor | Scalanie kanałów. Wybierz różne pliki obrazów szeregów czasowych w różnych kanałach kolorów i kliknij przycisk OK.</li>
</ol>

<ol><li>Kolodkin, A. L., Tessier-Lavigne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+molecules+of+neuronal+wiring%3A+a+primer%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspective+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and molecules of neuronal wiring: a primer.</a> Cold Spring Harbor Perspective Biology. 3 (6), 001727(2011).</li>
<li>Vosshall, L. B., Stocker, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+architecture+of+smell+and+taste+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Molecular architecture of smell and taste in Drosophila.</a> Annual Review Neuroscience. 30, 505-533 (2007).</li>
<li>Hong, W., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+control+of+wiring+specificity+in+the+fly+olfactory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetic control of wiring specificity in the fly olfactory system.</a> Genetics. 196 (1), 17-29 (2014).</li>
<li>Bentley, D., Caudy, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pioneer+axons+lose+directed+growth+after+selective+killing+of+guidepost+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pioneer axons lose directed growth after selective killing of guidepost cells.</a> Nature. 304 (5921), 62-65 (1983).</li>
<li>Godement, P., Wang, L. C., Mason, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+axon+divergence+in+the+optic+chiasm%3A+dynamics+of+growth+cone+behavior+at+the+midline%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Retinal axon divergence in the optic chiasm: dynamics of growth cone behavior at the midline.</a> Journal of Neuroscience. 14 (11), Pt 2 7024-7039 (1994).</li>
<li>Harris, W. A., Holt, C. E., Bonhoeffer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+axons+with+and+without+their+somata%2C+growing+to+and+arborizing+in+the+tectum+of+Xenopus+embryos%3A+a+time-lapse+video+study+of+single+fibres+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Retinal axons with and without their somata, growing to and arborizing in the tectum of Xenopus embryos: a time-lapse video study of single fibres in vivo.</a> Development. 101 (1), 123-133 (1987).</li>
<li>Ozel, M. N., Langen, M., Hassan, B. A., Hiesinger, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filopodial+dynamics+and+growth+cone+stabilization+in+Drosophila+visual+circuit+development%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Filopodial dynamics and growth cone stabilization in Drosophila visual circuit development.</a> Elife. 4, 10721(2015).</li>
<li>Li, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+bases+of+olfactory+circuit+assembly+revealed+by+systematic+time-lapse+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular bases of olfactory circuit assembly revealed by systematic time-lapse imaging.</a> Cell. 184, 5107-5121 (2021).</li>
<li>Chen, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lattice+light-sheet+microscopy%3A+Imaging+molecules+to+embryos+at+high+spatiotemporal+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution.</a> Science. 346 (6208), 1257998(2014).</li>
<li>Liu, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observing+the+cell+in+its+native+state%3A+Imaging+subcellular+dynamics+in+multicellular+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Observing the cell in its native state: Imaging subcellular dynamics in multicellular organisms.</a> Science. 360 (6386), (2018).</li>
<li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+adaptive+optical+recovery+of+optimal+resolution+over+large+volumes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid adaptive optical recovery of optimal resolution over large volumes.</a> Nature Methods. 11 (6), 625-628 (2014).</li>
<li>Kohl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+tissue+staining+with+chemical+tags%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Ultrafast tissue staining with chemical tags.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 111 (36), 3805-3814 (2014).</li>
<li>Sutcliffe, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second-Generation+Drosophila+Chemical+Tags%3A+Sensitivity%2C+Versatility%2C+and+Speed%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Second-Generation Drosophila Chemical Tags: Sensitivity, Versatility, and Speed.</a> Genetics. 205 (4), 1399-1408 (2017).</li>
<li>Grimm, J. B., Brown, T. A., English, B. P., Lionnet, T., Lavis, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+Janelia+Fluor+HaloTag+and+SNAP-Tag+Ligands+and+Their+Use+in+Cellular+Imaging+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Synthesis of Janelia Fluor HaloTag and SNAP-Tag Ligands and Their Use in Cellular Imaging Experiments.</a> Methods Molecular Biology. 1663, 179-188 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Eksplant czułkowo-mózgowy Drosophila zachowuje normalne ukierunkowanie obwodu węchowego. Zauważyliśmy, że rozwój jest 2 razy wolniejszy ex vivo w porównaniu do in vivo. Należy zauważyć, że system eksplantacyjny nie zachowuje palpa szczęki, w którym znajduje się sześć typów ORN. Aby zapewnić rekapitulację normalnego rozwoju ex vivo, należy unikać rozciągania nerwów czułkowych podczas sekcji eksplantacji. Podczas hodowli ex vivo rozwój bakterii zwykle powoduje zahamowanie rozwoj...

Neurony są precyzyjnie połączone, tworząc obwody niezbędne do prawidłowego funkcjonowania mózgu. Przez ponad 100 lat neuronaukowcy próbowali zrozumieć, w jaki sposób neuryty rozciągają się w kierunku swoich celów pośrednich i końcowych z niezwykłą precyzją. W rezultacie zidentyfikowali ważne geny, które kodują wskazówki dotyczące rozwoju procesów neuronalnych1. Układ węchowy Drosophila stanowi doskonały model do badania tego procesu, ponieważ neurony receptorów węchowych (ORN, główne neurony czuciowe) rzutują na 50 możliwych do zidentyfikowania kłębuszków nerkowych o stereotypowym rozmiarze, kształcie i względnym położeniu, gdzie tworzą połączenia synaptyczne z dendrytami z 50 typów neuronów projekcyjnych drugiego rzędu (PN), z których każdy wysyła dendryty do jednego z 50 kłębuszków nerkowych2 (Rysunek 1A). Dlatego stosunkowo łatwo jest zidentyfikować zmutowane fenotypy w rozdzielczości synaptycznej (kłębuszkowej) w układzie węchowym muchy. Doprowadziło to do odkrycia ważnych genów, które regulują tworzenie obwodów węchowych3.
Montaż obwodu węchowego muchy opiera się na czasowo i przestrzennie skoordynowanych procesach rozwojowych3. ORN i PN uzyskują odrębne losy komórek, które konfigurują program pod kątem ich specyfiki okablowania. Następnie, dendryty PN wstępnie modelują płat anteny (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B). Aksony ORN następnie okrążają ipsilateralny płat czułkowy i przekraczają linię środkową mózgu, aby dotrzeć do przeciwległego płata czułkowego. Następnie aksony ORN atakują zarówno ipsi-, jak i przeciwległe płaty czułkowe i tworzą synapsy z dendrytami ich partnerskich PN w określonych kłębuszkach nerkowych. Ten zgrubny model montażu obwodów węchowych został zaproponowany w oparciu o charakterystykę stałych próbek z pośrednich punktów czasowych podczas rozwoju. Słaba rozdzielczość czasowa i niezdolność do śledzenia tych samych procesów neuronalnych w całym rozwoju z utrwalonej tkanki ograniczają mechanistyczne zrozumienie procesu składania obwodów.
Jest technicznie trudne, aby na żywo zobaczyć procesy ORN i PN in vivo, ponieważ proces okablowania zachodzi w pierwszej połowie fazy poczwarki, gdy płat czułka jest otoczony nieprzezroczystym ciałem tłuszczowym wewnątrz obudowy poczwarki. W związku z tym niemożliwe jest bezpośrednie zobrazowanie rozwijającego się obwodu węchowego z nienaruszonych poczwarek. Wypreparowane tkanki hodowane ex vivo mogą obejść zmętnienie tkanek i są z powodzeniem wykorzystywane do badania rozwoju neuronalnego4,5,6. Wyzwaniem związanym z zastosowaniem podobnej strategii hodowli eksplantatów ex vivo do badania okablowania neuronalnego w mózgu poczwarki jest to, czy odzwierciedla ona precyzyjne celowanie neuronów w warunkach hodowli. Na podstawie wcześniej opisanych warunków hodowli ex vivo dla kompleksu oko-mózg muchy7, niedawno opracowano eksplantat, który zawiera nienaruszony cały mózg poczwarki, czułki i łączące nerwy czułkowe, który zachowuje precyzyjne ukierunkowanie obwodu węchowego i może być poddawany obrazowaniu na żywo opartemu na mikroskopii dwufotonowej przez maksymalnie 24 godziny z częstotliwością co 20 minut8. Tutaj opisano szczegółowy protokół hodowli eksplantatów i obrazowania. System eksplantatów stanowi potężną metodę badania montażu obwodu węchowego i potencjalnie innych obwodów w centralnym mózgu.

<table><tbody><tr><td>20-hydroksyekdyzon</td><td>Sigma</td><td>H5142</td><td></td></tr><tr><td>Chameleon Ti: Szafirowy laser</td><td>Koherentna koherentna</td><td>MRU X1</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Insulina ludzka</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12585014</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do obrazowania</td><td>Prairie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro Scissors</td><td>World Precision Instruments</td><td>501778</td><td></td></tr><tr><td>Minutien Pins</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td></td></tr><tr><td>Butla tlenowa</td><td>Praxair</td><td>OX M-E</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Schneider' s Drosophila Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21720024</td><td></td></tr><tr><td>SYLGARD 184 Elastomer silikonowy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC0162601</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopia dwufotonowa</td><td>Obiektyw zanurzeniowy w wodzie Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(20X)</td><td>Zeiss</td><td>421452-9800-000</td><td></td></tr></tbody></table>

system eksplantatów do badań obrazowania poklatkowego zespołu obwodów węchowych u drosophila

An Explant System for Time-Lapse Imaging Studies of Olfactory Circuit Assembly in Drosophila

~Neurony są precyzyjnie połączone, tworząc obwody niezbędne do prawidłowego funkcjonowania mózgu. Układ węchowy Drosophila stanowi doskonały model do badania tego procesu, ponieważ 50 typów neuronów receptorów węchowych (ORN) z czułków i palpów szczękowych rzutuje swoje aksony na 50 możliwych do zidentyfikowania kłębuszków nerkowych w płacie czułkowym i tworzy połączenia synaptyczne z dendrytami z 50 typów neuronów projekcyjnych drugiego rzędu (PN). Wcześniejsze badania koncentrowały się głównie na identyfikacji ważnych cząsteczek, które regulują precyzyjne celowanie w obwodzie węchowym za pomocą utrwalonych tkanek. W tym miejscu opisano system eksplantacji czułkowo-mózgowy, który podsumowuje kluczowe kamienie milowe rozwoju tworzenia obwodów węchowych w kulturze. Poprzez preparowanie zewnętrznego naskórka i czyszczenie nieprzezroczystych ciałek tłuszczowych pokrywających rozwijający się mózg poczwarki, za pomocą mikroskopii dwufotonowej można uzyskać wysokiej jakości obrazy pojedynczych neuronów z żywych mózgów. Pozwala to na obrazowanie poklatkowe pojedynczego aksonu ORN z żywej tkanki. Podejście to pomoże w ujawnieniu ważnych kontekstów biologicznych komórek i funkcji wcześniej zidentyfikowanych ważnych genów oraz w zidentyfikowaniu mechanizmów leżących u podstaw dynamicznego procesu składania obwodów.

Aksony ORN docierają do płata czuciowego antennego między 18 h a 36 h APF. Następnie nawigują one w obrębie płata antennego, przekraczają linię środkową i unerwiają kłębuszki. Film 1 jest reprezentatywnym nagraniem pokazującym cały ten proces dla kilku pojedynczo zidentyfikowanych aksonów, rejestrowanym co 20 min przez 24 h. Przed rejestracją przy użyciu TurboReg aksony wykazują pewien dryf boczny w miarę rozwoju mózgu (pierwsza połowa filmu). Po rejestracji dryf ten zostaje skorygowany (druga połowa fil...

Ten protokół opisuje procedurę preparacji, warunki hodowli i obrazowanie na żywo systemu eksplantacji czułków-mózgu do badania zespołu obwodów węchowych.

System eksplantatów do badań obrazowania poklatkowego zespołu obwodów węchowych u Drosophila

~Neurons are precisely interconnected to form circuits essential for the proper function of the brain. The Drosophila olfactory system provides an ...

Protokół ten przedstawia metodę żywego obrazu, montażu obwodu węchowego muchy na poziomie pojedynczego aksonu z rozwijającego się mózgu. Sekcja Aby oczyścić tkankę pokrywającą rozwijający się mózg, możemy zebrać wysokiej jakości obrazy z wewnętrznego mózgu. Metoda ta dostarcza cennych informacji na temat biologicznych podstaw rozwoju obwodów komórkowych.Można go łatwo zmodyfikować, aby badać rozwój innych obwodów. Potrzeba trochę czasu, aby osoba wykonała stabilną kontrolę ręki w mikrodysekcji. Przyda się więcej praktyki.Na początek przygotuj naczynie hodowlane do mobilizacji eksplantatu podczas obrazowania poklatkowego, kładąc Sylgard o grubości 0,5 centymetra na dolnej powierzchni szalki Petriego i pozwalając jej utwardzić się przez 48 godzin w temperaturze pokojowej. Aby przygotować mikroszpilki do unieruchomienia eksplantatu na tej płytce za pomocą kleszczy, przyklej wiele mikro szpilek na taśmie z ostrymi końcami wyrównanymi z jednej strony i odetnij nożyczkami dwa milimetry ostrych końców. Następnie za pomocą kleszczyków włóż wycięte mikro szpilki w warstwę Sylgard gotowej płytki Sylgard.Za pomocą pędzla zbierz białe poczwarki, które tworzą poczwarkę w ciągu godziny i przenieś je do nowej fiolki. Inkubować poczwarki w łaźni wodnej hartowanej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 40 minut, aby uzyskać rzadkie klony ORN z losowych typów. Po szoku cieplnym umieść fiolkę w temperaturze 25 stopni Celsjusza na 30 godzin, w wyniku czego poczwarki osiągną wiek 30 godzin po utworzeniu poczwarki.Następnie przygotuj pożywkę hodowlaną do eksplantatu zgodnie z opisem w manuskrypcie tekstu i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza. W dniu obrazowania dodać płodową surowicę bydlęcą, roztwór podstawowy insuliny ludzkiej i 20 roztworów podstawowych hydroksyekdyzonu rozpuszczonych w etanolu do 50-mililitrowej fiolki zawierającej 45 mililitrów pożywki Drosophila Schneidera. Dobrze wymieszaj i przenieś 15 mililitrów pełnego podłoża do nowej 50-mililitrowej stożkowej probówki i przechowuj resztę pełnego podłoża w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez tydzień.Następnie przykryj otwór probówki zawierające pełne podłoże filmem parafinowym i natlenić pożywkę, pompując pęcherzyki tlenu pod powierzchnię cieczy przez sterylną pięciomililitrową końcówkę pipety z szybkością jednego pęcherzyka na sekundę przez 20 do 30 minut. Następnie wysterylizuj powierzchnię studzienki rozwarstwiającej i wcześniej przygotowaną płytkę Sylgard 70% etanolem i pozostaw do wyschnięcia przed użyciem. Za pomocą pędzla przenieś 30-godzinną poczwarkę APF na bibułkę w celu suszenia zewnętrznej powierzchni poczwarki przez pięć minut.Po nałożeniu taśmy dwustronnej na szkiełko podstawowe należy ostrożnie przymocować wysuszoną poczwarkę do lepkiej powierzchni taśmy stroną grzbietową skierowaną do góry. Delikatnie dociśnij poczwarkę szczoteczką, aby prawidłowo przymocować brzuszną stronę do taśmy, nie uszkadzając poczwarki. Włożyć jedną ostrą końcówkę kleszczy między brązową obudowę poczwarki a poczwarkę od strony bocznej i ostrożnie przeciąć brązową obudowę poczwarki przez linię do tylnego końca poczwarki.Po otwarciu brązowej skrzynki poczwarki, za pomocą kleszczy, delikatnie przytrzymaj poczwarkę i przenieś ją do studzienki rozwarstwiającej zawierającej jeden mililitr natlenionej pełnej pożywki. Zanurz poczwarkę w podłożu, aby zanurzyć ją na dnie studni. Aby wypreparować eksplantat mózgu anteny z poczwarki, delikatnie przytrzymaj poczwarkę za pomocą kleszczy jedną ręką i za pomocą mikronożyczek utwórz mały otwór z tylnej strony poczwarki, który uwalnia wysokie ciśnienie wewnątrz poczwarki.Zaczynając od otworu, przetnij brzuszną linię środkową aż do szyi, a następnie przetnij obwód szyi, aby oderwać głowę od ciała poczwarki i umieścić ciało w innej studzince. Następnie przetnij przezroczysty naskórek pokrywający grzbietową stronę mózgu, aby odsłonić ciało tłuszczowe na wierzchu mózgu, upewniając się, że zachowasz naskórek, do którego przyczepia się siatkówka i czułek, i podobnie, przetnij naskórek od brzusznej strony mózgu. Odpipetuj pożywkę w kierunku otwartych obszarów po grzbietowej i brzusznej stronie głowy za pomocą pipety P10, aby delikatnie wypłukać ciało tłuszczowe pokrywające mózg i czułkę.Aby zbadać interakcję obustronnych aksonów ORN lub aksonów ORN z celowaniem w dendryty PN, przeciąć nerw czułkowy podczas etapu, ostrożnie umieszczając ostrza mikronożyczek między naskórkiem a mózgiem i odciąć zainteresowany nerw czułkowy. W celu przeniesienia wypreparowanego eksplantatu na płytkę Sylgard, należy umieścić około 200 mikrolitrów kropli natlenionej pełnej pożywki na powierzchni Sylgard. Kilkakrotnie odpipetować tłuszcz pochodzący z wypreparowanego pnia przez końcówkę pipety o pojemności 200 mikrolitrów w celu pokrycia wewnętrznej powierzchni, aby zapobiec przywieraniu eksplantatów do końcówki pipety podczas przenoszenia ze studzienki rozwarstwiającej do pożywki kropelki na płytce Sylgarda.Za pomocą kleszczy przypiąć eksplant do warstwy Sylgard w dwóch płatach optycznych, następnie ostrożnie umieścić płytkę Sylgard na stacji obrazowania, unieruchomić płytkę taśmami i powoli dodawać 10 mililitrów natlenionej pełnej pożywki do płytki Sylgard za pomocą pipety P1000. Aksony ORN docierają do płata anteny między 18 godziną a 36 godziną APF, a następnie poruszają się po płacie anteny, przekraczają linię środkową i wprowadzają innowacje w kłębuszkach nerkowych. Przed rejestracją aksony wykazywały pewne boczne dryfowanie w miarę rozwoju mózgu, a po rejestracji dryfowanie zostało skorygowane.Tożsamość kłębuszków nerkowych wyekstrahowanych aksonów ORN ujawniono za pomocą barwienia immunologicznego markera neuropilu i kadheryny. Porównując z mapą płatów wewnętrznych, można było określić tożsamość każdego kłębuszka nerkowego. Podczas hodowli ex vivo rozwój bakterii zwykle powoduje spoczynkowy rozwój obwodu węchowego.Dlatego ważne jest, aby dokładnie wysterylizować naczynie hodowlane i szpilki przed obrazowaniem oraz utrzymać pomieszczenie do obrazowania w czystości i izolacji. Aby osiągnąć wyższą rozdzielczość przestrzenno-czasową, ten system eksplantacji można obrazować za pomocą bardziej zaawansowanego mikroskopu, mikroskopu światła siatkowego z optyką adaptatywną. Chociaż jako przykład pokazano tutaj rozwój obwodu fabrycznego, system ten może być potencjalnie rozszerzony o badania innych obwodów i procesów rozwojowych w rozwijającym się centralnym mózgu.

an-explant-system-for-time-lapse-imaging-studies-olfactory-circuit

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Mezoskopowa tomografia fluorescencyjna działa poza limitami penetracji charakterystycznymi dla fluorescencyjnej mikroskopii sekcji tkanek. Technika ta opiera się na oświetleniu wieloprojekcyjnym oraz opisie transportu fotonów. Demonstrujemy wizualizację 3D całego organizmu in-vivo podczas morfogenezy wyobraźników skrzydeł wykazujących ekspresję GFP u Drosophila melanogaster.

Mezoskopowa tomografia fluorescencyjna do obrazowania in-vivo rozwijających się Drosophila

Niniejszy protokół opisuje niezawodną metodę znieczulania i obrazowania nienaruszonych larw Drosophila melanogaster. Wykorzystaliśmy lotny anestetyk desfluran, aby umożliwić powtarzalne obrazowanie z rozdzielczością podkomórkową oraz ponowną identyfikację struktur przez okres do kilku dni1.

Obrazowanie in vivo nienaruszonych larw Drosophila z rozdzielczością podkomórkową

Ten film pokazuje sekcję i montaż eksplantatów mózgowych larw Drosophila. Ośrodkowy układ nerwowy (OUN), przyczepiony do krążków oka, jest ekstrahowany z larw, a następnie umieszczany na szkiełku podstawowym w roztworze soli fizjologicznej.

Rozwarstwienie i montaż eksplantatów mózgu larw muszki owocowej

Źródło: Ing-Esteves, S. &amp; Lefebvre, J. L. Obrazowanie poklatkowe arboryzacji neuronów przy użyciu rzadkiego znakowania wirusem związanym z adenowirusem genetycznie ukierunkowanych populacji komórek siatkówki. J. Vis. Exp. (2021)Ten film demonstruje zastosowanie mikroskopii konfokalnej do wizualizacji dynamiki dendrytycznej w żywych eksplantatach siatkówki myszy. Przedstawiono w nim etapy stabilizacji siatkówki pod mikroskopem konfokalnym, wykonywania obrazowania epifluorescencyjnego w celu...

Poklatkowe obrazowanie konfokalne dynamiki dendrytycznej neuronów w eksplantatach siatkówki myszy

Ten protokół szczegółowo opisuje uproszczoną metodę używaną do przeprowadzania obrazowania żywych komórek w kontekście nienaruszonego mózgu larwy. Metody obrazowania żywych komórek są nieocenione w badaniu asymetrycznych podziałów nerwowych komórek macierzystych, a także innych procesów neurogennych i rozwojowych, konsekwentnie odkrywając mechanizmy, które wcześniej były pomijane.

Obrazowanie na żywo neuroblastów larw Drosophila

Ten protokół przedstawia skuteczną metodę obrazowania żywego nabłonka oka poczwarki Drosophila. Metoda ta kompensuje ruch tkanek i nierówną topologię, poprawia wizualizację granic komórek dzięki zastosowaniu wielu białek połączeniowych znakowanych GFP i wykorzystuje łatwe w montażu urządzenie do obrazowania.

Obrazowanie na żywo oka poczwarki Drosophila

Celem tego protokołu jest stworzenie ex vivo hodowli mózgu larw Drosophila zoptymalizowanej do monitorowania okołodobowych rytmów molekularnych za pomocą długoterminowego fluorescencyjnego obrazowania poklatkowego. Omówiono również zastosowanie tej metody do testów farmakologicznych.

Obrazowanie na żywo fluorescencji w rozdzielczości pojedynczej komórki zegarów okołodobowych Drosophila w hodowli mózgu larw

Ten protokół jest przeznaczony do obrazowania i analizy dynamiki orientacji komórek i wzrostu tkanek w nabłonku brzusznym Drosophila, gdy muszka owocowa przechodzi metamorfozę. Opisana tutaj metodologia może być zastosowana do badania różnych etapów rozwojowych, tkanek i struktur subkomórkowych u Drosophila lub innych organizmów modelowych.

Obrazowanie i analiza orientacji tkanek i dynamiki wzrostu w rozwijającym się nabłonku Drosophila w stadiach poczwarkowych

Tutaj opisujemy metodę, którą zastosowaliśmy do zobrazowania wysoce ruchliwych filopodiów dendrytycznych w żywym przygotowaniu mózgu larwy Drosophila, oraz opracowany przez nas protokół do ilościowego oznaczania zestawów danych obrazowania 3D w celu ilościowej oceny dynamiki dendrytów w rozwijających się neuronach.

Obrazowanie na żywo w trybie poklatkowym i kwantyfikacja dynamiki szybkich gałęzi dendrytycznych w rozwoju neuronów Drosophila

Tutaj prezentujemy protokół, za pomocą którego można wizualizować wapń pre- i/lub postsynaptyczny w kontekście uczenia się i zapamiętywania Drosophila. Obrazowanie wapnia in vivo przy użyciu synaptycznie zlokalizowanych czujników wapnia jest połączone z klasycznym paradygmatem warunkowania węchowego, dzięki czemu można określić plastyczność synaptyczną leżącą u podstaw tego typu uczenia się asocjacyjnego.

Optyczne obrazowanie wapnia in vivo plastyczności synaptycznej indukowanej uczeniem się u Drosophila melanogaster

Przedstawiamy protokoły obrazowania wapnia dla larwalnego neuronu węchowego Drosophila , wykorzystując miejscowy klej tkankowy do unieruchomienia. Ta metoda zwiększa stabilność, ułatwiając wiarygodne eksperymenty in vivo i ex-vivo . Niestandardowe skrypty R analizują sygnały wapnia, zapewniając efektywną platformę do szczegółowych badań neurofizjologicznych.

Obrazowanie wapnia in vivo i ex vivo neuronu obwodu węchowego u larwy Drosophila melanogaster w trzecim stadium

Poznaj metodę obrazowania poklatkowego zespołu obwodów węchowych u Drosophila na poziomie pojedynczych aksonów. Protokół obejmuje mikrochirurgię eksplantatu mózgu, warunki hodowli i techniki obrazowania żywych tkanek.

System eksplantatów do badań obrazowania poklatkowego zespołu obwodów węchowych u Drosophila

Przeglądaj więcej filmów