Analiza cytometrii przepływowej w celu identyfikacji wrodzonych i adaptacyjnych komórek odpornościowych płuc myszy

Ponieważ płuca są gospodarzem bardzo złożonego i unikalnego układu odpornościowego, opracowano i opisano kilka strategii bramkowania do identyfikacji komórek odpornościowych płuc. Istnienie kilku różnych podejść utrudnia porównywanie wyników uzyskanych przez różne laboratoria. Nasza strategia bramkowania zapewnia kompleksowy i powtarzalny sposób identyfikacji do 12 różnych pulmonoidowych i nieszpikowych populacji immunologicznych przy użyciu dziewięciu markerów.

Niniejszy protokół opisuje charakterystykę i identyfikację populacji immunologicznych płuc w warunkach stanu stacjonarnego. Jednak protokół ten może być wykorzystany do identyfikacji zmian w tych populacjach komórek w różnych modelach choroby, gdzie może pomóc w identyfikacji specyficznych dla choroby zmian w krajobrazie immunologicznym płuc. Badacze, którzy wykonują tę technikę po raz pierwszy, powinni zwrócić uwagę na warunki trawienia i odczynniki, ponieważ mają one duży wpływ na uwalnianie komórek odpornościowych z tkanki płucnej.

Zacznij od przygotowania uśpionego zwierzęcia do operacji. Ustabilizuj mysz grzbietowo za pomocą igieł lub taśmy na czterech kończynach, a następnie użyj 70% etanolu do odkażenia skóry w okolicy brzusznej. Wykonaj nacięcie od szyi do brzucha.

Usuń skórę z okolicy klatki piersiowej, wraz z żebrami i mostkiem. Przepłucz płuca, wstrzykując 10 mililitrów zimnego PBS do prawej komory za pomocą igły o rozmiarze od 18 do 21, aż staną się całkowicie białe. Następnie usuń grasicę i serce, nie dotykając płuc.

Odłączyć płuca od otaczających tkanek i przenieść je do probówki zawierającej zimny bufor BSA. Przenieś płuco na szalkę Petriego, zmiel je za pomocą dwóch drobnych skalpeli, a następnie umieść w stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów. Dodaj pięć mililitrów buforu wytrawiającego, aby umyć płytkę.

Zabezpiecz pokrywę rurki i traw płuca przez 30 minut na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 150 obrotów na minutę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Zatrzymaj reakcję, dodając 10 mililitrów zimnego buforu BSA. Po strawieniu wymieszaj i rozpuść kawałki płuc za pomocą igły o rozmiarze 18G.

Umieść sitko filtrujące o średnicy 70 mikrometrów na nowej stożkowej rurce o pojemności 50 mililitrów i przenieś strawioną mieszaninę płuc do sitka. Użyj gumowej strony 10-mililitrowego tłoka strzykawki, aby rozbić pozostałe kawałki płuc na filtrze i umyć go buforem BSA. Odwirować zawiesinę jednokomórkową o stężeniu 350 G przez osiem minut w temperaturze siedmiu stopni Celsjusza.

Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze buforu do lizy ACK. Wymieszać zawiesinę za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra i inkubować przez 90 sekund w temperaturze pokojowej. Dodać 10 mililitrów zimnego buforu BSA do mieszaniny reakcyjnej i odwirować ją w temperaturze 350 G przez siedem minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić osad w buforze barwiącym i policzyć komórki za pomocą hemocytometru. Ponownie zawiesić komórki w stężeniu 5 milionów komórek na mililitr w celu barwienia powierzchni. Przenieść 1 milion komórek w 200 mikrolitrach na studzienkę do 96-dołkowej płytki i odwirować płytkę w temperaturze 350 G przez siedem minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Przygotować roztwór blokowy cytometrii przepływowej, rozcieńczając przeciwciało anty-1632 w buforze barwiącym. Zawiesić komórki w 50 mikrolitrach roztworu blokowego cytometrii przepływowej. Inkubować zawiesinę przez 15 do 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza lub na lodzie.

Następnie dodaj 150 mikrolitrów buforu barwiącego do płytki i odwiruj ją 350 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przygotować powierzchniowy roztwór przeciwciał, rozcieńczając przeciwciała powierzchniowe w buforze barwiącym. Ponownie zawiesić komórki w 50 mikrolitrach powierzchniowego roztworu przeciwciał i inkubować płytkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności.

Następnie dwukrotnie umyj komórki buforem barwiącym. Przygotować bufor do utrwalania i przepuszczalności, mieszając trzy części rozcieńczalnika do utrwalania i przepuszczalności oraz jedną część buforu barwiącego. Ponownie zawiesić komórki w 50 mikrolitrach wstępnie przygotowanego buforu na dołek 96-dołkowej płytki i inkubować je przez 20 do 25 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności.

Rozcieńczyć bufor permeabilizacji oczyszczoną wodą dejonizowaną, aby przygotować jednorazowy bufor przepuszczalny i użyć go do przemycia komórek. Przygotować wewnątrzkomórkowy roztwór przeciwciała, rozcieńczając go jednym mililitrem buforu permeabilizacyjnego. Ponownie zawiesić komórki w 50 mikrolitrach rozcieńczonego wewnątrzkomórkowego roztworu przeciwciał na dołek 96-dołkowej płytki i inkubować przez 40 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności.

Przemyć komórki buforem do permeabilizacji, a następnie buforem barwiącym. Po ostatnim myciu ponownie zawieś komórki w 200 mikrolitrach buforu barwiącego. Pobrać co najmniej 1,5 miliona komórek na próbkę na cytometrze przepływowym.

Po udanej operacji i odpowiednim zabiegu pooperacyjnym, zanieczyszczenia i dublety zostały wykluczone za pomocą strategii bramkowania. Komórki odpornościowe zidentyfikowano za pomocą markera krwiotwórczego CD45+ za pomocą cytometrii przepływowej. Komórki rozróżniano jako żywe i martwe.

Immunologiczne komórki płuc podzielono na trzy grupy przy użyciu przeciwciał anty-GR-1 i anty-CD68. Neutrofile zostały zidentyfikowane i zweryfikowane przy użyciu Ly6G jako unikalnego markera. Populacja CD45+ zawiera również komórki NK , limfocyty T i limfocyty B.

Komórki te zostały wybarwione i zweryfikowane przez przeciwciała przeciwko naturalnym zabójcom 1.1, CD3 i B220. Płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe zidentyfikowało eozynofile, które były dodatnie dla markera CD11b, oraz makrofagi pęcherzykowe, które nie wyrażały wysokich poziomów CD11b. Znaleziono komórki dendrytyczne CD45 + i potwierdzono je ekspresją CD24.

Komórki te wykazały pozytywną lub negatywną odpowiedź na markery CD103 i CD11b. Komórki CD103 ujemne sklasyfikowano jako konwencjonalne i monocytytyczne komórki dendrytyczne na podstawie ekspresji CD64. komórki dendrytyczne pochodzące z monocytów były nisko dodatnie dla markera dendrytycznego CD24 i dodatnie dla markera pan-makrofagowego CD64.

Na podstawie ekspresji CD64 i GR-1 wyróżniono makrofagi śródmiąższowe z monocytami klasycznymi i nieklasycznymi. Komórki te wykazały dodatnią ekspresję receptora chemokiny CX3C. Najważniejszymi etapami tej procedury są prawidłowe pobranie tkanek, trawienie i przygotowanie zawiesiny jednokomórkowej oraz bramkowanie na żywych komórkach i singletach.

Oprócz charakteryzowania komórek odpornościowych płuc za pomocą cytometrii przepływowej, w izolowanych populacjach komórkowych można przeprowadzić hodowlę komórkową i testy funkcjonalne. Technika ta może utorować naukowcom drogę do zbadania nowych pytań dotyczących chorób płuc, takich jak infekcje, choroby autoimmunologiczne i nowotwory.