Rozwarstwienie i barwienie immunologiczne larw ślinowych komarów z rodzaju Anopheles gambiae

Dorosły gruczoł ślinowy komara (SG) jest niezbędny do przenoszenia wszystkich patogenów przenoszonych przez komary na ich ludzkich gospodarzy, w tym wirusów i pasożytów. Film ten pokazuje skuteczną izolację SG od stadium larwalnego (L4) komarów Anopheles gambiae i przygotowanie SG L4 do dalszej analizy.

Gruczoły ślinowe owadów są niezbędne do przenoszenia wielu chorób ludzkich. Tak więc lepsze zrozumienie biologii gruczołów płacowych powinno nam pomóc, uzupełnić istniejące strategie zapobiegania chorobom. Ta technika pozwoli nam szybko zapytać, czy mutacje w kandydujących regulatorach wpływają na morfologię gruczołów ślinowych larw komarów i potencjalnie wpływają na przenoszenie pasożytów malarii.

Za pierwszym razem, gdy pracujesz z larwami komarów, są one trudne do uchwycenia, ponieważ szybko się poruszają. Im więcej ćwiczysz, tym lepszy się stajesz. Pracę nad procedurą rozpocznie Marisol Luchetti, asystentka naukowa w moim laboratorium.

Aby rozpocząć eksperyment, umieść talerz do nocnika na stoliku mikroskopu preparacyjnego i przenieś 10 larw komarów L4 na tacę nocnika. Następnie umieść kroplę roztworu preparacyjnego na tacce nocnikowej oddzielnie od larw. Użyj kleszczy, aby umieścić jedną larwę L4 w kropli roztworu preparacyjnego zawierającego 25% etanol.

Trzymając kleszcze numer pięć w każdej ręce, chwyć larwy kleszczami tuż pod głową, ręką dominującą i chwyć głowę larwy ręką niedominującą, a następnie delikatnie pociągnij głowę z minimalną stałą siłą, aby oderwać się od reszty ciała, podczas gdy gruczoły pozostają przyczepione do głowy. Po odrzuceniu części ciała tuszy larwy zbierz głowę lub gruczoły ślinowe do jednego mililitra PBS w 1,5-mililitrowej mikroprobówce wirówkowej i poczekaj, aż gruczoły ślinowe opadną na dno bufora. Następnego dnia odcedź roztwór, aby utrwalić tkanki, jednym mililitrem zimnego 100% acetonu przez 90 sekund.

Po usunięciu acetonu delikatnie spłucz chusteczki trzy razy, jednym mililitrem PBS. W celu barwienia immunologicznego dodać pierwszorzędowe przeciwciało, takie jak Rab 11, w odpowiednim rozcieńczeniu, w 200 mikrolitrach całkowitej objętości PBS. Delikatnie zamieszaj zawartość probówki za pomocą końcówki do pipety.

Inkubować przeciwciała pierwszorzędowe przez noc w temperaturze czterech stopni, a następnie trzykrotnie przemyć w jednym mililitrze PBS. Następnie dodać przeciwciało drugorzędowe, Alexa Fluor 488 Goat anti-Rabbit, w odpowiednim rozcieńczeniu, w 200 mikrolitrach całkowitej objętości. Po wymieszaniu zawartości z końcówką pipety, inkubować tkanki z barwnikami, takimi jak czerwień nilowa i Hoechst w 200 mikrolitrach PBS, w temperaturze pokojowej przez 60 minut, a następnie trzykrotnie przemyć PBS.

Przygotuj szkiełko mikroskopowe, dodając 200 mikrolitrów 100% glicerolu za pomocą pipety i przenosząc do 20 barwionych główek z dołączonymi gruczołami i strukturami wewnętrznymi na szkiełko mikroskopowe za pomocą miękkiej szczoteczki. Rozłóż próbki głowy, aby równomiernie rozprowadzić je wzdłuż szklanego szkiełka. Oglądając pod mikroskopem preparacyjnym, oddziel głowę larwy od gruczołów za pomocą dwóch par kleszczy, ostrożnie ciągnąc dwie tkanki w przeciwnych kierunkach.

Gdy wszystkie próbki są gotowe, delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe o grubości 1,5 milimetra na szkiełku, unikając tworzenia się pęcherzyków powietrza, a następnie uszczelnij szkiełko przezroczystym lakierem do paznokci. Gruczoły ślinowe są stosunkowo łatwe do wypreparowania, od stadium czwartego larw. Larwy męskie i żeńskie można odróżnić w późnym stadium larwalnym L4 za pomocą czerwonego paska, wzdłuż grzbietowej klatki piersiowej samic.

Morfologia czułków jest również bardziej skomplikowana, u samców niż u samic larw L4, jak widać, z białymi strzałkami skierowanymi na zewnątrz, czułkami żeńskimi na lewym zdjęciu i czułkami męskimi po prawej. Gruczoły ślinowe wyizolowane z larw we wczesnym stadium L4, barwione Hoechstem, odsłaniają płaty proksymalne i dystalne, oddzielone wąskim zwężeniem. Badano tworzące się światło w dystalnej gruczole ślinowej barwionej immunologicznie larwy L4 od średniej do późnej.

Wierzchołkowe domeny komórek wydzielniczych, otaczające tworzące się światło, miały intensywne zabarwienie czerwienią nilową, sugerujące struktury przypominające mikrokosmki. Zabarwienie Rab 11 zaobserwowano blisko, przy powierzchni wierzchołkowej. Jest tylko jeden krok z czasem, a jest to 90-sekundowa inkubacja tkanek w zimnym acetonie.

Ten protokół został opracowany dopiero niedawno, ale spodziewamy się, że będzie pomocny dla każdego, kto pracuje nad gruczołami ślinowymi komarów. Spodziewamy się, że będziemy z niego często korzystać.