Name: Rozwarstwienie i barwienie immunologiczne larw ślinowych komarów z rodzaju Anopheles gambiae (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-30T14:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 12 s
Description: Naucz się izolować gruczoły ślinowe larw Anopheles gambiae za pomocą techniki rozwarstwiania i barwienia immunologicznego. Ta metoda umożliwia badanie morfologii gruczołów i ich roli w transmisji patogenów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Johns Hopkins Malaria Research Institute za dostęp i hodowlę larw An. gambiae.

1. Przygotowanie rozwiązań i narzędzi
<ol>
	<li>Przygotowanie roztworu preparacyjnego
	<ol>
		<li>Aby przygotować roztwór preparacyjny, dodaj 2,5 ml 100% etanolu do 7,5 ml destylowanego H2O w 15 plastikowej probówce. Odwróć rurkę 3 razy, aby wymieszać. 
		UWAGA: Ten roztwór można przechowywać w temperaturze pokojowej przez kilka tygodni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie 10 razy wywaru z soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS)
	<ol>
		<li>Aby przygotować 10x PBS bulionu, dodaj 17,8 g Na2HPO4• 2H2O, 2,4 g KH2PO4, 80 g NaCl i 2 g KCl do 800 ml wody dejonizowanej. Mieszaj z mieszadłem na talerzu mieszającym, aż ciała stałe całkowicie się rozpuszczą. Uzupełnij końcową objętość do 1 l oczyszczoną wodą. 
		UWAGA: Roztwór ten można przechowywać w temperaturze pokojowej przez kilka miesięcy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie 1x PBS
	<ol>
		<li>Dodaj 10 ml 10x PBS do 90 mlH2Ow sterylnej szklanej butelce. Zamknij szczelnie pokrywkę i odwróć 3x, aby wymieszać. 
		UWAGA: Roztwór można przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka tygodni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie utrwalacza.
	<ol>
		<li>Dodać 600 μl metanolu do 200 μl lodowatego kwasu octowego. Spraw, aby roztwór był świeży za każdym razem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Budowa płyty szpachlowej (naczynie do hodowli tkankowych wypełnione gumą silikonową)
	<ol>
		<li>Wymieszać składniki (1:50) żywicy epoksydowej (1 g) i wody (50 ml) i wlać mieszaninę na szalkę Petriego. Poczekaj, aż komponenty wyschną przed użyciem. 
		UWAGA: Raz zbudowana płyta szpachlowa może być używana przez lata.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Rozwarstwienie gruczołów (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A)
<ol>
	<li>Zbierz larwy L4 w późnym stadium (~10 dni po wykluciu; <silna klasa="xfig">Rysunek 2) z tacek do karmienia za pomocą plastikowej pipety transferowej. 
	UWAGA: Zapoznaj się z tym pomocnym podręcznikiem online dotyczącym standardowej hodowli komarów i hodowli larw13.
	<ol>
		<li>Umieść płytkę szpachlową na stoliku mikroskopu preparacyjnego i przenieś larwy na płytkę szpachlową. 
		UWAGA: Podczas porcjowania larw do wstępnego rozbioru pomocne jest przeniesienie ~10 larw na szkiełko jednorazowo za pomocą plastikowej pipety transferowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieścić kroplę roztworu preparacyjnego (1:3 EtOH:H2O) na płytce szpachlowej, oddzielnie od 10 larw.</li>
	<li>Użyj plastikowej pipety transferowej lub jednorazowej szklanej pipety, aby umieścić jedną larwę L4 w kropli 25% EtOH.</li>
	<li>Weź kleszcze (#4), po jednym w każdą rękę, i ręką niedominującą chwyć głowę larwy. Używając dominującej ręki, chwyć larwę kleszczami tuż pod głową i delikatnie pociągnij z minimalną stałą siłą, tak aby głowa oderwała się od reszty ciała, a gruczoły pozostały przyczepione do głowy. Wyrzuć część ciała tuszy larwy. 
	UWAGA: Podczas sekcji ustaw w pobliżu ręcznik papierowy, aby zebrać tusze larw.</li>
	<li>Zebrać głowę/gruczoły do 1 ml 1x PBS w 1,5 ml probówki do mikrowirówki. Użyj 1 ml PBS na ~40 wypreparowanych gruczołów z dołączonymi główkami. Poczekaj, aż głowice/SG opadną na dno bufora.</li>
</ol>
3. Utrwalenie do barwienia przeciwciał (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B)
<ol>
	<li>Opróżnij PBS, zaczynając od góry probówki mikrowirówki za pomocą szklanej pipety transferowej, unikając lepkich tkanek komara i usuwając jak najwięcej roztworu PBS bez uszkadzania tkanek. Zastąp roztwór 800 μl mieszaniny metanolu z lodowatym kwasem octowym w stosunku 3:1. Umieść probówkę w temperaturze 4 °C na noc (zalecane 12-24 godziny; preferowane 19 godzin).</li>
	<li>Następnego dnia odcedź roztwór i zastąp go 1 ml zimnego 100% acetonu. Pozostaw na 90 sekund.</li>
	<li>Usuń aceton i delikatnie spłucz chusteczki trzy razy 1 ml 1x PBS za każdym razem. 
	UWAGA: Próbki powinny powoli unosić się w górę wraz z przepływem, a następnie opaść z powrotem na dno probówki do czasu zakończenia każdego dodawania PBS.</li>
</ol>
4. Barwienie immunologiczne (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B)
<ol>
	<li>Dodać przeciwciało pierwszorzędowe (np. Rab11) w odpowiednim rozcieńczeniu (1:100) w 200 μl całkowitej objętości 1x PBS. Delikatnie zamieszaj zawartość probówki za pomocą końcówki do pipety. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usunąć roztwór przeciwciała pierwszorzędowego i przemyć trzykrotnie 1 ml 1x PBS (delikatnie pipetując roztwór do i z pipety).</li>
	<li>Dodać przeciwciało drugorzędowe (Alex Fluor 488 Goat anti-Rabbit) w odpowiednim rozcieńczeniu (1:200) w 200 μl całkowitej objętości. Delikatnie zamieszaj zawartość probówki za pomocą końcówki do pipety. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 90 minut.</li>
	<li>Na tym etapie do 200 μl PBS dodać barwniki, takie jak czerwień nilowa (lipidy, 5 μl z 1 μg/μl) i/lub Hoechst (DNA, 3 μl z 1 μg/μl). Inkubować w temperaturze pokojowej przez dodatkowe 60 minut. Umyj delikatnie trzy razy za pomocą 1x PBS.</li>
</ol>
5. Montaż barwionych dławnic do mikroskopii (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C)
<ol>
	<li>Odpipetować 200 μl 100% glicerolu na szkiełko mikroskopowe. 
	UWAGA: Ponieważ glicerol jest lepki, pozostaw końcówkę pipety w płynie, aż osiągnie odpowiednią objętość. Nie zaobserwowano kurczenia się tkanek po przejściu bezpośrednio do 100% glicerolu. Jednak naukowcy mogą przejść przez 30% i 50% płukanie glicerolem w probówkach przed przeniesieniem próbek do 100% glicerolu.</li>
	<li>Przenieś wybarwione głowy (do 20 na szkiełko) wraz z dołączonymi dławnicami (wraz z innymi strukturami wewnętrznymi) na szkiełko mikroskopowe za pomocą miękkiej szczoteczki (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3A). Rozłóż próbki tak, aby były równomiernie rozłożone wzdłuż szkiełka podstawowego. 
	UWAGA: Podczas osadzania dławików na szkiełku nakrywkowym za pomocą pędzla, kleszcze mogą być używane do delikatnego zorientowania SG tak, aby wszystkie były zorientowane w tym samym kierunku.</li>
	<li>Oglądając pod mikroskopem preparacyjnym, oddziel głowę larwy od gruczołów za pomocą dwóch par kleszczy i ostrożnie ciągnąc dwie tkanki w przeciwnych kierunkach. 
	UWAGA: Ponieważ całkowite odizolowanie SG jest trudne, po prostu usuń głowice, pozostawiając SG i związane z nimi struktury wewnętrzne. Nawet jeśli SG pozostają związane z innymi tkankami, można je łatwo rozpoznać po zabarwieniu Hoechst i innymi markerami (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3B, C).</li>
	<li>Wyjmij i wyrzuć głowice i powtórz proces separacji dla każdego SG. 
	UWAGA: Podczas zdejmowania głów ustaw w pobliżu ręcznik papierowy, aby je zebrać.</li>
	<li>Delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe o grubości 1,5 mm na wierzchu (unikając pęcherzyków powietrza) i uszczelnij przezroczystym lakierem do paznokci.</li>
	<li>Przechowywać w temperaturze 4 °C w światłoszczelnym opakowaniu. 
	UWAGA: Przygotowane szkiełka z barwionych gruczołów można przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności przez okres do sześciu miesięcy do jednego roku bez zauważalnych zmian jakości. Jeśli glicerol zacznie przeciekać w miarę upływu miesięcy, delikatnie podnieś szkiełko nakrywkowe i odpipetuj więcej glicerolu, aby wypełnić otwory.</li>
</ol>

<ol><li>World malaria report 2020: 20 years of global progress and challenges. World Health Organization. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://apps.who.int/iris/handle/10665/337660">https://apps.who.int/iris/handle/10665/337660</a> (2020).</li>
<li>Feachem, R. G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malaria+eradication+within+a+generation%3A+ambitious%2C+achievable%2C+and+necessary%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Malaria eradication within a generation: ambitious, achievable, and necessary.</a> Lancet. 394 (10203), 1056-1112 (2019).</li>
<li>Adolfi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+population+modification+gene-drive+rescue+system+in+the+malaria+mosquito+Anopheles+stephensi%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Efficient population modification gene-drive rescue system in the malaria mosquito Anopheles stephensi.</a> Nature Communications. 11, 5553(2020).</li>
<li>Kyrou, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CRISPR-Cas9+gene+drive+targeting+doublesex+causes+complete+population+suppression+in+caged+Anopheles+gambiae+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A CRISPR-Cas9 gene drive targeting doublesex causes complete population suppression in caged Anopheles gambiae mosquitoes.</a> Nature Biotechnology. 36 (11), 1062-1066 (2018).</li>
<li>Rostami, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+gene+drive+technology+to+control+transmission+of+vector-borne+parasitic+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Parasite+Immunology%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 gene drive technology to control transmission of vector-borne parasitic infections.</a> Parasite Immunology. 42 (9), 12762(2020).</li>
<li>Bhatt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coverage+and+system+efficiencies+of+insecticide-treated+nets+in+Africa+from+2000+to+2017%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Coverage and system efficiencies of insecticide-treated nets in Africa from 2000 to 2017.</a> Elife. 4, 09672(2015).</li>
<li>Mellink, J. J., Vanden Bovenkamp, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+aspects+of+mosquito+salivation+in+blood+feeding+of+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Mosquito+News%22%5BJournal%5D)">Functional aspects of mosquito salivation in blood feeding of Aedes aegypti.</a> Mosquito News. 41 (1), 115(1981).</li>
<li>Ribeiro, J. M., Rossignol, P. A., Spielman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+mosquito+saliva+in+blood+vessel+location%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Role of mosquito saliva in blood vessel location.</a> Journal of Experimental Biology. 108, 1-7 (1984).</li>
<li>Yamamoto, D. S., Sumitani, M., Kasashima, K., Sezutsu, H., Matsuoka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+malaria+infection+in+transgenic+Anopheline+mosquitoes+lacking+salivary+gland+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Inhibition of malaria infection in transgenic Anopheline mosquitoes lacking salivary gland cells.</a> PLoS Pathogens. 12 (9), 1005872(2016).</li>
<li>Rishikesh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+and+development+of+the+salivary+glands+and+their+chromosomes+in+the+larvae+of+Anopheles+stephensi+sensu+stricto%5BTitle%5D)+AND+%22Bulletin+of+the+World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">Morphology and development of the salivary glands and their chromosomes in the larvae of Anopheles stephensi sensu stricto.</a> Bulletin of the World Health Organization. 20 (1), 47-61 (1959).</li>
<li>Jensen, D. V., Jones, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+the+salivary+glands+in+Anopheles+albimanus+Wiedemann+%28Diptera%2C+Culicidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+Entomological+Society+of+America%22%5BJournal%5D)">The development of the salivary glands in Anopheles albimanus Wiedemann (Diptera, Culicidae).</a> Annals of the Entomological Society of America. 50 (5), 40824(1957).</li>
<li>Chiu, M., Trigg, B., Taracena, M., Wells, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+cellular+morphologies+during+lumen+maturation+in+Anopheles+gambiae+larval+salivary+glands%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Diverse cellular morphologies during lumen maturation in Anopheles gambiae larval salivary glands.</a> Insect Molecular Biology. 30 (2), 210-230 (2021).</li>
<li>Benedict, M. Q. MR4. Methods in Anopheles research. Center for Disease Control. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.beiresources.org/Portals/2/ VectorResources/2016%20Methods%20in%20Anopheles%20Research%20full%20manual.pdf">https://www.beiresources.org/Portals/2/ VectorResources/2016%20Methods%20in%20Anopheles%20Research%20full%20manual.pdf</a> (2015).</li>
<li>Wells, M. B., Andrew, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salivary+gland+cellular+architecture+in+the+Asian+malaria+vector+mosquito+Anopheles+stephensi%5BTitle%5D)+AND+%22Parasites+%26+Vectors%22%5BJournal%5D)">Salivary gland cellular architecture in the Asian malaria vector mosquito Anopheles stephensi.</a> Parasites & Vectors. 8, 617(2015).</li>
<li>Wells, M. B., Villamor, J., Andrew, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salivary+gland+maturation+and+duct+formation+in+the+African+malaria+mosquito+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Salivary gland maturation and duct formation in the African malaria mosquito Anopheles gambiae.</a> Scientific Reports. 7 (1), 601(2017).</li>
<li>Wells, M. B., Andrew, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anopheles+salivary+gland+architecture+shapes+plasmodium+sporozoite+availability+for+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Anopheles salivary gland architecture shapes plasmodium sporozoite availability for transmission.</a> mBio. 10 (4), 01238(2019).</li>
<li>Clements, A. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aClements%2C+AN+%22The+physiology+of+mosquitoes%22">The physiology of mosquitoes</a>. , Pergamon Press. Paris. (1963).</li>
<li>Imms, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+larval+and+pupal+stages+of+Anopheles+maculipennis%2C+meigen%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">On the larval and pupal stages of Anopheles maculipennis, meigen.</a> Parasitology. 1 (2), 103-133 (1908).</li>
<li>Favia, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteria+of+the+genus+Asaia+stably+associate+with+Anopheles+stephensi%2C+an+Asian+malarial+mosquito+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Bacteria of the genus Asaia stably associate with Anopheles stephensi, an Asian malarial mosquito vector.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (21), 9047-9051 (2007).</li>
<li>Neira Oviedo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+salivary+transcriptome+of+Anopheles+gambiae+%28Diptera%3A+Culicidae%29+larvae%3A+A+microarray-based+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The salivary transcriptome of Anopheles gambiae (Diptera: Culicidae) larvae: A microarray-based analysis.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 39 (5-6), 382-394 (2009).</li>
<li>Linser, P. J., Smith, K. E., Seron, T. J., Neira Oviedo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbonic+anhydrases+and+anion+transport+in+mosquito+midgut+pH+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Carbonic anhydrases and anion transport in mosquito midgut pH regulation.</a> Journal of Experimental Biology. 212 (11), 1662-1671 (2009).</li>
<li>Linser, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slc4-like+anion+transporters+of+the+larval+mosquito+alimentary+canal%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Slc4-like anion transporters of the larval mosquito alimentary canal.</a> Journal of Insect Physiology. 58 (4), 551-562 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Opisany w niniejszym dokumencie protokół został zaadaptowany z protokołu sekcji Drosophila SG i protokołu sekcji dorosłych komarów 14,15,16. Jednak większość markerów nie przeniknęła przez błonę podstawną (dane nie pokazano) podczas stosowania metod preparacji dorosłych i barwienia SG. Adaptacje protokołu dla dorosłych obejmowały wypreparowanie gruczołów w 25% roztworze EtOH, przemycie gruczołów kombinacją MeOH i lodowatego kwas...

Malaria jest głównym zagrożeniem dla zdrowia publicznego, powodując prawie 230 milionów infekcji i szacunkowo 409 000 zgonów w 2019 roku1. Większość zgonów ma miejsce w Afryce Subsaharyjskiej i jest spowodowana przez pasożyta Plasmodium falciparum, którego wektorem owadów jest Anopheles gambiae, który jest przedmiotem tej demonstracji wideo. Chociaż liczby wskazują na znaczny spadek rocznej śmiertelności od przełomu wieków (>300 000 mniej zgonów rocznie), obiecujące spadki wskaźników zachorowań obserwowane od 2000 do 2015 r. postępują krótko, co sugeruje potrzebę nowego podejścia do ograniczania przenoszenia chorób2. Wśród obiecujących dodatkowych strategii kontrolowania i możliwego eliminowania malarii jest ukierunkowanie zdolności wektorów komarów za pomocą edycji genów i napędu genów opartego na CRISPR/Cas93,4,5. Rzeczywiście, to właśnie ukierunkowanie na wektora komarów (poprzez rozszerzone zastosowanie długotrwałych moskitier nasączonych środkami owadobójczymi) miało największy wpływ na ograniczenie przenoszenia chorób6.
Samice komarów nabywają gametocyty Plasmodium od zarażonego człowieka podczas posiłku krwi. Po zapłodnieniu, dojrzewaniu, przechodzeniu nabłonka jelita środkowego, ekspansji populacji i nawigacji hemocoelów w ich obowiązkowych żywicielach komarów, setki do dziesiątek tysięcy sporozoitów Plasmodium atakują SG komarów i wypełniają jamy wydzielnicze składowych komórek wydzielniczych. Po dostaniu się do jam wydzielniczych pasożyty mają bezpośredni dostęp do przewodu ślinowego i są w ten sposób gotowe do przeniesienia się na nowego żywiciela kręgowców przy następnym posiłku z krwi. Ponieważ SG mają kluczowe znaczenie dla przenoszenia sporozoitów powodujących malarię na ich ludzkich gospodarzy, a badania laboratoryjne sugerują, że SG nie są niezbędne do odżywiania krwi, przeżywalności komarów lub płodności7,8,9, stanowią idealne miejsce dla środków blokujących transmisję. Dorosłe komary SG powstają jako rozwinięcie resztek "pączków przewodowych" w larwach SG, które utrzymują się po wczesnej histolizie SG poczwarki10, co czyni larwę SG idealnym celem dla interwencji mających na celu ograniczenie przenoszenia choroby w stadium dorosłym.
Scharakteryzowanie larwalnego stadium rozwoju SG może pomóc nie tylko w lepszym zrozumieniu jego morfologii i adaptacji funkcjonalnych, ale może również pomóc w ocenie nowych interwencji, które są ukierunkowane na ten narząd poprzez edycję genów kluczowych regulatorów SG. Ponieważ wszystkie dotychczasowe badania nad architekturą gruczołów ślinowych larw poprzedzają barwienie immunologiczne i nowoczesne techniki obrazowania10,11, opracowaliśmy protokół izolowania i barwienia gruczołów ślinowych różnymi przeciwciałami i markerami komórkowymi12. Ten film pokazuje to podejście do ekstrakcji, utrwalania i barwienia larw SG z larw Anopheles gambiae L4 do obrazowania konfokalnego.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; KH2PO4</td><td>Millipore Sigma</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Na2HPO4 &bull; 2H2O</td><td>Millipore Sigma</td><td>71643</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; NaCl</td><td>Millipore Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Millipore Sigma</td><td>179124</td><td></td></tr><tr><td>Pędzel z miękkim włosiem</td><td>Amazon (SN NJDF) Zestaw pędzli do detali</td><td>B08LH63D89</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe (22 x 50 mm)</td><td>VWR</td><td>48393-195</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (DNA)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol etylowy 200 proof</td><td>Millipore Sigma</td><td>EX0276</td><td></td></tr><tr><td>Gilson Pipetman P200 Pipeta</td><td>Gilson</td><td>P200</td><td></td></tr><tr><td>Glacial Octe Acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>695092</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze jubilerskie, Dumont No. 5</td><td>Millipore Sigma</td><td>F6521</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Millipore Sigma</td><td>58221</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Millipore Sigma</td><td>1414209</td><td></td></tr><tr><td>Lakier do paznokci</td><td>Amazonka (Sally Hansen)</td><td>B08148YH9M</td><td></td></tr><tr><td>Czerwień Nilowa (lipid)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>N1142</td><td></td></tr><tr><td>Ręczniki/chusteczki papierowe</td><td>ULINE</td><td>S-7128</td><td></td></tr><tr><td>Płytka Petriego (do wykonania płyty szpachlowej)</td><td>Końcówki</td> do pipet ThermoFisher <td>Scientific FB0875712</td><td></td></tr><tr><td></td> Plastikowa pipeta transferowa <td>Gilson</td><td>Tips E200ST</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Naukowe</td><td>S304671</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciała pierwszorzędowe (np. Crb, Rab11)</td><td>Badania rozwojowe Hybridoma Bank (DSHB); Andrew Lab</td><td>Mouse anty-Crb (Cq4) lub Rabbit anty-Rab11</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciała drugorzędowe ze znacznikami fluorescencyjnymi (np. Alexa Fluor 488 Goat-anti Rabbit)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Żywica silikonowa i utwardzacz do szpachli</td><td>Dow Chemicals - Ximeter Silicone</td><td>PMX-200</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka, matowe na jednym końcu do etykietowania</td><td>VWR&nbsp; 20 X 50 mm</td><td>48393-195</td><td></td></tr><tr><td>Aglutynina z kiełków pszenicy</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>W834</td><td></td></tr></tbody></table>

rozwarstwienie i barwienie immunologiczne larw ślinowych komarów z rodzaju anopheles gambiae

Dissection and Immunostaining of Larval Salivary Glands from Anopheles gambiae Mosquitoes

Gruczoły ślinowe komarów (SG) są niezbędnym organem bramnym do przenoszenia patogenów przenoszonych przez owady. Czynniki chorobotwórcze, w tym wirusy i pasożyty Plasmodium wywołujące malarię, gromadzą się w jamach wydzielniczych komórek SG. Tutaj są gotowe do przeniesienia się na swoich kręgowców gospodarzy podczas kolejnego posiłku z krwi. Ponieważ dorosłe gruczoły tworzą się jako rozwinięcie resztek pączków przewodu SG larw, które utrzymują się po wczesnej histolizie SG poczwarki, larwa SG jest idealnym celem dla interwencji ograniczających przenoszenie choroby. Zrozumienie rozwoju larw SG może pomóc w lepszym zrozumieniu ich morfologii i adaptacji funkcjonalnych oraz pomóc w ocenie nowych interwencji ukierunkowanych na ten narząd. Ten protokół wideo demonstruje skuteczną technikę izolowania, mocowania i barwienia larw SG komarów Anopheles gambiae. Gruczoły wycięte z larw w 25% roztworze etanolu utrwala się w mieszaninie metanolu i lodowatego kwasu octowego, a następnie przemywania zimnym acetonem. Po kilku płukaniach w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), SG mogą być barwione szeroką gamą barwników markerowych i/lub surowic odpornościowych przeciwko białkom ulegającym ekspresji SG. Ta metoda izolacji larw SG może być również stosowana do pobierania tkanek do analizy hybrydyzacji in situ, innych zastosowań transkryptomicznych i badań proteomicznych.

Gruczoły ślinowe są stosunkowo łatwe do wypreparowania ze wszystkich larw w stadium L4. Samce i samice larw można rozróżnić w późnym stadium L4 po czerwonym pasie wzdłuż grzbietowej części klatki piersiowej u samic, który nie występuje u samców (Rycina 2). Zaobserwowaliśmy również, że morfologia czułków jest znacznie bardziej rozbudowana u samców niż u samic w stadium L4 (Rycina 2), co odpowiada różnicom obserwowanym w tej strukturze u dorosłych komarów. Równole...

Dorosły gruczoł ślinowy komara (SG) jest niezbędny do przenoszenia wszystkich patogenów przenoszonych przez komary na ich ludzkich gospodarzy, w tym wirusów i pasożytów. Film ten pokazuje skuteczną izolację SG od stadium larwalnego (L4) komarów Anopheles gambiae i przygotowanie SG L4 do dalszej analizy.

Rozwarstwienie i barwienie immunologiczne larw ślinowych komarów z rodzaju Anopheles gambiae

Mosquito salivary glands (SGs) are a requisite gateway organ for the transmission of insect-borne pathogens. Disease-causing agents, including viruses and ...

Gruczoły ślinowe owadów są niezbędne do przenoszenia wielu chorób ludzkich. Tak więc lepsze zrozumienie biologii gruczołów płacowych powinno nam pomóc, uzupełnić istniejące strategie zapobiegania chorobom. Ta technika pozwoli nam szybko zapytać, czy mutacje w kandydujących regulatorach wpływają na morfologię gruczołów ślinowych larw komarów i potencjalnie wpływają na przenoszenie pasożytów malarii.Za pierwszym razem, gdy pracujesz z larwami komarów, są one trudne do uchwycenia, ponieważ szybko się poruszają. Im więcej ćwiczysz, tym lepszy się stajesz. Pracę nad procedurą rozpocznie Marisol Luchetti, asystentka naukowa w moim laboratorium.Aby rozpocząć eksperyment, umieść talerz do nocnika na stoliku mikroskopu preparacyjnego i przenieś 10 larw komarów L4 na tacę nocnika. Następnie umieść kroplę roztworu preparacyjnego na tacce nocnikowej oddzielnie od larw. Użyj kleszczy, aby umieścić jedną larwę L4 w kropli roztworu preparacyjnego zawierającego 25% etanol.Trzymając kleszcze numer pięć w każdej ręce, chwyć larwy kleszczami tuż pod głową, ręką dominującą i chwyć głowę larwy ręką niedominującą, a następnie delikatnie pociągnij głowę z minimalną stałą siłą, aby oderwać się od reszty ciała, podczas gdy gruczoły pozostają przyczepione do głowy. Po odrzuceniu części ciała tuszy larwy zbierz głowę lub gruczoły ślinowe do jednego mililitra PBS w 1,5-mililitrowej mikroprobówce wirówkowej i poczekaj, aż gruczoły ślinowe opadną na dno bufora. Następnego dnia odcedź roztwór, aby utrwalić tkanki, jednym mililitrem zimnego 100% acetonu przez 90 sekund.Po usunięciu acetonu delikatnie spłucz chusteczki trzy razy, jednym mililitrem PBS. W celu barwienia immunologicznego dodać pierwszorzędowe przeciwciało, takie jak Rab 11, w odpowiednim rozcieńczeniu, w 200 mikrolitrach całkowitej objętości PBS. Delikatnie zamieszaj zawartość probówki za pomocą końcówki do pipety.Inkubować przeciwciała pierwszorzędowe przez noc w temperaturze czterech stopni, a następnie trzykrotnie przemyć w jednym mililitrze PBS. Następnie dodać przeciwciało drugorzędowe, Alexa Fluor 488 Goat anti-Rabbit, w odpowiednim rozcieńczeniu, w 200 mikrolitrach całkowitej objętości. Po wymieszaniu zawartości z końcówką pipety, inkubować tkanki z barwnikami, takimi jak czerwień nilowa i Hoechst w 200 mikrolitrach PBS, w temperaturze pokojowej przez 60 minut, a następnie trzykrotnie przemyć PBS.Przygotuj szkiełko mikroskopowe, dodając 200 mikrolitrów 100% glicerolu za pomocą pipety i przenosząc do 20 barwionych główek z dołączonymi gruczołami i strukturami wewnętrznymi na szkiełko mikroskopowe za pomocą miękkiej szczoteczki. Rozłóż próbki głowy, aby równomiernie rozprowadzić je wzdłuż szklanego szkiełka. Oglądając pod mikroskopem preparacyjnym, oddziel głowę larwy od gruczołów za pomocą dwóch par kleszczy, ostrożnie ciągnąc dwie tkanki w przeciwnych kierunkach.Gdy wszystkie próbki są gotowe, delikatnie umieść szkiełko nakrywkowe o grubości 1,5 milimetra na szkiełku, unikając tworzenia się pęcherzyków powietrza, a następnie uszczelnij szkiełko przezroczystym lakierem do paznokci. Gruczoły ślinowe są stosunkowo łatwe do wypreparowania, od stadium czwartego larw. Larwy męskie i żeńskie można odróżnić w późnym stadium larwalnym L4 za pomocą czerwonego paska, wzdłuż grzbietowej klatki piersiowej samic.Morfologia czułków jest również bardziej skomplikowana, u samców niż u samic larw L4, jak widać, z białymi strzałkami skierowanymi na zewnątrz, czułkami żeńskimi na lewym zdjęciu i czułkami męskimi po prawej. Gruczoły ślinowe wyizolowane z larw we wczesnym stadium L4, barwione Hoechstem, odsłaniają płaty proksymalne i dystalne, oddzielone wąskim zwężeniem. Badano tworzące się światło w dystalnej gruczole ślinowej barwionej immunologicznie larwy L4 od średniej do późnej.Wierzchołkowe domeny komórek wydzielniczych, otaczające tworzące się światło, miały intensywne zabarwienie czerwienią nilową, sugerujące struktury przypominające mikrokosmki. Zabarwienie Rab 11 zaobserwowano blisko, przy powierzchni wierzchołkowej. Jest tylko jeden krok z czasem, a jest to 90-sekundowa inkubacja tkanek w zimnym acetonie.Ten protokół został opracowany dopiero niedawno, ale spodziewamy się, że będzie pomocny dla każdego, kto pracuje nad gruczołami ślinowymi komarów. Spodziewamy się, że będziemy z niego często korzystać.

dissection-immunostaining-larval-salivary-glands-from-anopheles

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Środkowy jelito oraz gruczoły ślinowe komara stanowią kluczowe punkty wejścia i wyjścia dla patogenów przenoszonych przez wektory, takich jak Plasmodium falciparum i wirus dengi. Niniejsze wideo prezentuje techniki sekcji służące do usuwania jelita środkowego i gruczołów ślinowych z komarów Aedes aegypti.

Disekcja jelita środkowego i gruczołów ślinowych komarów Ae. aegypti

Analizy czasowej i przestrzennej ekspresji genów odgrywają kluczową rolę w genomice funkcjonalnej. Hybrydyzacja in situ całego preparatu jest przydatna do określania lokalizacji transkryptów w obrębie tkanek i przedziałów subkomórkowych. W niniejszym materiale przedstawiamy protokół hybrydyzacji in situ z modyfikacjami dla konkretnych tkanek docelowych u komarów.

Hybrydyzacja in situ gruczołów ślinowych, jajników i embrionów komarów wektorowych

Wśród trzech rodzajów komarów, mianowicie Anopheles, Aedes oraz Culex, techniki fizycznego mapowania genomu opracowano jedynie dla Anopheles, którego przedstawiciele posiadają czytelne chromosomy politeniczne. W przypadku rodzajów Aedes i Culex mapowanie cytogenetyczne pozostaje jednak wyzwaniem ze względu na niską jakość chromosomów politenicznych. Przedstawiamy tutaj uniwersalny protokół otrzymywania wysokiej jakości preparatów chromosomów mitotycznych oraz zoptymalizowany protokół FISH dla...

Hybrydyzacja fluorescencyjna in situ na chromosomach mitotycznych komarów

Ten film opisuje gruczoł limfatyczny Drosophila - główne miejsce hematopoezy u larw muchy - i pokazuje przykładowy protokół do preparowania i montowania narządu do immunohistochemii i obrazowania fluorescencyjnego.

Rozwarstwienie gruczołów limfatycznych larw: izolowanie narządu wytwarzającego hemocyty Drosophila

Ze względu na uderzające podobieństwa cyklu życia i biologii pasożytów malarii u gryzoni do pasożytów malarii u ludzi, modele malarii u gryzoni stały się niezbędne do badań nad malarią. W niniejszym artykule ustandaryzowaliśmy niektóre z najważniejszych technik stosowanych w analizie fenotypowej dzikich i transgenicznych gatunków gryzoni gryzoni.

Analiza fenotypowa gryzoni, malaria, pasożyty, aseksualne i płciowe stadia krwi oraz stadia komarów

Szczegółowe badania nad stadiami pasożytów malarii u komarów są niezbędne do opracowania skutecznych strategii blokowania transmisji. Protokół ten pokazuje, jak skutecznie hodować zakaźne gametocyty, a następnie karmić te gametocyty komarami w celu wytworzenia stadiów komara P. falciparum.

Plasmodium falciparum (Plasmodium falciparum) Hodowla gametocytów i infekcja komarów poprzez sztuczne karmienie błoną

Ten protokół przedstawia metodologie testu Ramsaya, mikroelektrody selektywne jonowo, technikę skanowania elektrod jonoselektywnych (SIET) oraz testy skurczowe in vitro, stosowane do badania układu wydalniczego dorosłych komarów, składającego się z kanalików Malpighiego i jelita tylnego, do wspólnego pomiaru szybkości wydzielania jonów i płynów, aktywności skurczowej i transepitelowego transportu jonów.

Badanie aktywności neuropeptydów i innych regulatorów układu wydalniczego u dorosłego komara

Techniki mikroiniekcji są niezbędne do wprowadzenia egzogennych genów do genomów komarów. Protokół ten wyjaśnia metodę stosowaną przez laboratorium Jamesa do mikrowstrzykiwania konstruktów DNA do embrionów Anopheles gambiae w celu wygenerowania przekształconych komarów.

Metoda mikroiniekcji dla zarodków Anopheles gambiae

Doustne podawanie dsRNA wytwarzanego przez bakterie, metoda dostarczania interferencji RNA (RNAi), która jest rutynowo stosowana u Caenorhabditis elegans, została tutaj z powodzeniem zastosowana u dorosłych komarów. Nasza metoda pozwala na rzetelne badania genetyki odwrotnej i badania wektorów blokujących transmisję bez użycia iniekcji.

Skuteczne doustne podawanie RNA interferencji (RNAi) dorosłym komarom z rodzaju Anopheles gambiae

Biorąc pod uwagę ich prostą anatomię, jądra Anopheles oferują dobry model cytologiczny do badania spermatogenezy. Protokół ten opisuje hybrydyzację in situ z fluorescencją na całej górze, technikę stosowaną do badania tego procesu biologicznego, a także fenotyp szczepów transgenicznych zawierających mutacje w genach zaangażowanych w produkcję plemników.

Hybrydyzacja fluorescencji in situ w całości w celu zbadania spermatogenezy u komara Anopheles

Społeczności mikrobiologiczne u komarów są bardzo obiecujące dla strategii biokontroli wektorów. Większość symbiontów nie nadaje się do hodowli, co wymaga analiz metagenomicznych. Opisujemy metodę preparacji samic komarów i oddzielania jajników, jelita środkowego i gruczołów ślinowych, zapobiegając zanieczyszczeniu krzyżowemu, ułatwiając badania mikrobiomu na poziomie narządów i zwiększając zrozumienie roli mikroorganizmów w biologii komarów.

Rozwarstwienie jajników, jelita środkowego i gruczołów ślinowych komarów w celu analizy mikrobiomu na poziomie narządów

Naucz się izolować gruczoły ślinowe larw Anopheles gambiae za pomocą techniki rozwarstwiania i barwienia immunologicznego. Ta metoda umożliwia badanie morfologii gruczołów i ich roli w transmisji patogenów.

Rozwarstwienie i barwienie immunologiczne larw ślinowych komarów z rodzaju Anopheles gambiae

Przeglądaj więcej filmów