Ocena zużycia aminokwasów w hodowanych komórkach kostnych i izolowanych trzonach kostnych

Wychwyt i metabolizm aminokwasów są niezbędne do specyfikacji, różnicowania i tworzenia kości osteoblastów. Protokół ten zapewnia szybką i czułą metodę oceny wychwytu aminokwasów. Nasz protokół wykorzystuje aminokwasy znakowane radioaktywnie do ilościowego określenia wychwytu aminokwasów.

Jest to tania, czuła i szybka metoda, którą można łatwo dostosować do różnych warunków. Protokół ten można łatwo zmodyfikować w celu oceny wychwytu innych składników odżywczych znakowanych radioaktywnie, takich jak glukoza i kwasy tłuszczowe, w różnych tkankach, a także w komórkach pierwotnych lub transformacyjnych. Aby rozpocząć test wychwytu aminokwasów, należy go wykonać pięć razy po 10 do czwartego komórki ST2 w każdym dołku 12-dołkowej płytki do hodowli tkankowej w pożywce alfa MEM uzupełnionej FBS, penicyliną i streptomycyną.

Umieść dodatkowe dołki komórek, aby określić ilościowo liczbę komórek na warunek normalizacji. Następnie inkubuj komórki w nawilżonym inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla przez dwa do trzech dni, aż do zlewania się. Po inkubacji odessać pożywkę i dwukrotnie przemyć komórki jednym mililitrem PBS o pH 7,4.

Następnie odessać PBS przed jednokrotnym umyciem komórek za pomocą jednego mililitra HEPES Krebsa-Ringera lub KRH. Inkubować komórki z 0,5 mililitra świeżo przygotowanego KRH zawierającego cztery mikrokiury na mililitr L34 trytowanej pożywki roboczej glutaminy przez pięć minut. Po inkubacji zebrać pożywkę radioaktywną, aby dozować ją do pojemnika na odpady płynne.

Następnie umyj komórki trzykrotnie lodowatym KH, aby zakończyć reakcję. Następnie dodaj jeden mililitr 1% dodecylosiarczanu sodu do każdej studzienki i rozcieraj mieszaninę 10 razy, aby lizować i homogenizować komórki. Następnie przenieś lizaty komórkowe do probówki o pojemności 1,5 mililitra i sklaruj lizat przez odwirowanie z minimalną prędkością 10 000 G przez 10 minut.

Przenieść supernatant do fiolki scyntylacyjnej zawierającej osiem mililitrów roztworu scyntylacyjnego i odczytać aktywność radiową oraz liczbę na minutę za pomocą licznika scyntylacji. Z pozostałych nieradioaktywnych płytek komórek trypsynizować, ponownie zawiesić i policzyć komórki, aby oszacować liczbę komórek w lizowanych kulturach radioaktywnych. Za pomocą hemacytometru policz liczbę komórek w studzience nieradioaktywnej dla każdego warunku doświadczalnego.

Aby określić wychwyt aminokwasów, wypłucz szpik z kości przed zważeniem trzonu kostnego. Aby usunąć komórkowość kości, gotuj jedną kość ramienną w PBS w temperaturze 100 stopni Celsjusza przez 10 minut. Równowaga zarówno żywych, jak i gotowanych kości ramiennych w jednym mililitrze KRH przez 30 minut w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnie inkubować eksperymentalne i gotowane kości kontrolne oddzielnie w świeżo przygotowanym KRH zawierającym cztery mikrocurry na mililitr trójcypicznej argininy L234 przez maksymalnie 90 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po usunięciu pożywki radioaktywnej zakończ reakcję, przemłukując kość ramienną trzykrotnie jednym mililitrem lodowatego KRH. Przenieś każdą kość do 1,5-mililitrowej probówki z 500 mikrolitrami buforu RIPA.

Następnie homogenizuj kość ramienną i bufor RIPA, siekając 100 razy nożyczkami, a następnie sonikację przy amplitudzie 35% i jednosekundowy impuls przez 10 sekund. Klarować lizat przez wirowanie przez 10 minut w temperaturze 10 000 razy G w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu przenieść 200 mikrolitrów supernatantu do fiolek scyntylacyjnych zawierających osiem mililitrów roztworu scyntylacyjnego.

Odczyt aktywności radiowej za pomocą licznika scyntylacyjnego. Właściwości kinetyczne in vitro trytyowanego wychwytu glutaminy L34 i zlewających się komórek ST2 oceniano w obecności lub braku kwasu metyloaminomasłowego sodu lub litu. Usunięcie sodu doprowadziło do 90% zmniejszenia wychwytu glutaminy.

Obecność litu zwiększyła wychwyt glutaminy o 2% w porównaniu ze stanem wolnym od sodu. Natomiast kwas metyloaminoizomasłowy nie wpływał na wychwyt glutaminy. Szacunkowy procentowy udział układu A, N, L lub ASC i gamma plus L wskazuje, że większość wychwytu glutaminy odbywa się za pośrednictwem układów ASC i gamma plus L. System N jest odpowiedzialny za około 2% zależny od sodu wychwyt glutaminy.

A system A wykazał 0% wkład i absorpcję. Wychwyt argininy przez X-VIVO L34 trytiowany w gotowanych i żywych kościach ramiennych noworodków analizowano w ciągu dwóch godzin. Wychwyt argininy wzrastał liniowo przez cały czas trwania eksperymentu i żywej kości ramiennej.

Gotowane kości ramienne nie wykazywały dynamicznego wzrostu wychwytu argininy w eksperymencie. Reprezentatywna analiza pokazuje znormalizowany i skorygowany wychwyt argininy. Ważne jest, aby zagotować kość przeciwległą jako aktywną kontrolę.

Ten krok jest niezbędny, ponieważ macierz kostna może wchłaniać radioaktywne aminokwasy, co skutkuje niedokładnymi wynikami. Protokół pozwolił nam potwierdzić kinetykę wychwytu aminokwasów zarówno in vitro, jak i in vivo.