Automatyzacja zagregowanej kwantyfikacji u Caenorhabditis elegans
October 14th, 2021
Poniższy protokół opisuje rozwój i optymalizację wysokoprzepustowego przepływu pracy dla hodowli robaków, obrazowania fluorescencyjnego i automatycznego przetwarzania obrazów w celu ilościowego określenia agregatów poliglutaminy jako oceny zmian w proteostazie.
Zastosowano proste podejście do monitorowania zmian w proteostazie poprzez ocenę agregacji poliglutaminy i zapewnienie ramy, którą można wykorzystać do zastosowań o wysokiej przepustowości. Ocena fenotypu, takiego jak liczba agregatów przez I, może stać się subiektywna. Automatyzacja zliczania agregatów pozwala nam wyeliminować takie odchylenia, zwiększyć przepustowość i powtarzalność.
Metoda ta pomaga zidentyfikować geny bakteryjne przyczyniające się do zakłócenia proteostazy gospodarza. Zrozumienie wkładu poszczególnych genów bakteryjnych pomoże nam zrozumieć ich wpływ na patogenezę chorób takich jak choroba Alzheimera, Parkinsona i Huntingtona. Zacznij od wyjęcia płytek zawierających robaki z zamrażarki i pozostawienia ich do rozmrożenia w temperaturze pokojowej.
Następnie zetrzyj nadmiar kondensatu i zdejmij pokrywę przed obrazowaniem. Korzystaj z ustawień mikroskopu z czasem naświetlania 500 milisekund, powiększeniem 40 x z adapterem aparatu 0,63 x i intensywnością GFP ustawioną na 100% podczas rejestrowania obrazu. Teraz dostosuj sterowanie światłem przechodzącym, aż robaki będą wyświetlane jasno oświetlone w porównaniu z ciemnym tłem, unikając prześwietlenia.
Zmień położenie robaków w studzince, aby zapobiec nadmiernemu zbrylaniu, używając końcówki pipety o pojemności 10 mikrolitrów, aby delikatnie wepchnąć robaki do żądanej pozycji. Ustaw kanał na filtr GFP, aby ustalić płaszczyznę ogniskową dla obu obrazów. Uchwyć obraz w jasnym polu.
Wykonaj odpowiedni obraz fluorescencyjny bez naruszania płytki lub zmiany ostrości mikroskopu. Teraz, aby ocenić obrazy, najpierw pobierz CellProfiler. Otwórz oprogramowanie, a następnie przeciągnij i upuść interesujące obrazy do pola obrazów.
Kliknij obrazy na liście plików, aby je otworzyć. Wybierz lupę, aby podświetlić obszar zainteresowania, oraz ikonę strzałki, aby zmierzyć długość zarówno robaków, jak i agregatów. Najedź kursorem na żądany obiekt, aby określić jego wartość intensywności, którą można zobaczyć w dolnej części ekranu.
Aby skorzystać z potoku analizy obrazu CellProfiler, po pobraniu CellProfiler z oficjalnej strony internetowej nazwij pary obrazów poprawnie, zgodnie z opisem w rękopisie tekstowym. Pobierz potok i przekaż go do programu CellProfiler, wybierając file, import i pipeline from file. Wybierz moduł niesplątanych robaków, aby otworzyć jego ustawienia i załadować zestaw treningowy używany do identyfikowania robaków w module niesplątanych robaków.
Następnie zidentyfikuj nazwę pliku zestawu treningowego. Wybierz ikonę przesyłania pliku i prześlij również plik uzupełniający. Prześlij obrazy, wybierając moduł obrazów w lewym górnym rogu.
A następnie przeciągnij i upuść obrazy o odpowiednich nazwach. Przed analizą obrazów wybierz żądany folder wyjściowy, który będzie używany do przechowywania wyników, klikając przycisk ustawień wyjściowych znajdujący się w lewym dolnym rogu programu. Następnie wybierz ikonę folderu po prawej stronie domyślnych danych wyjściowych, aby wybrać żądaną lokalizację wyjściową.
Wybierz ikonę analizowania obrazów, aby rozpocząć analizę obrazu. Jeśli analiza trwa zbyt długo i utknęła w martwym punkcie podczas przetwarzania pojedynczego obrazu, przerwij przebieg i zidentyfikuj nieprzetworzony obraz, sortując folder wyjściowy i zwracając uwagę, która nazwa obrazu nie została znaleziona. Po pełnej analizie oprogramowanie zorganizuje wyniki w arkuszu kalkulacyjnym Excel zawierającym pojedyncze robaki w kolumnie N i odpowiednią liczbę agregacji w kolumnie K. Pobierz organizator metadanych, aby wygodnie uporządkować dane z wyjściowego pliku CSV z CellProfiler.
W systemie operacyjnym Windows zlokalizuj pobrany plik i rozpakuj go do żądanej lokalizacji. Zlokalizuj i otwórz wyodrębniony folder o nazwie gui_Windowsos_64x. I uruchom aplikację, klikając ikonę aplikacji GUI.
Może zostać otwarty monit z prośbą o pozwolenie na uruchomienie. Wybierz więcej informacji, a następnie kliknij uruchom mimo to. Organizator metadanych jest teraz gotowy do przeciągania i upuszczania wyjściowych plików CSV CellProfiler.
W systemie Mac OS zlokalizuj pobrany plik i rozpakuj plik aplikacji do organizowania metadanych plików. Otwórz wyodrębniony folder znajdujący się w pobranych plikach. Kliknij prawym przyciskiem myszy aplikację GUI i wybierz otwórz.
Pojawi się monit z prośbą o pozwolenie na otwarcie z powodu braku oficjalnej licencji. Wybierz pozycję Otwórz. Po otwarciu aplikacji do organizowania metadanych w odpowiednim systemie operacyjnym kliknij prześlij swoje pliki tutaj lub przeciągnij i upuść żądane pliki CSV CellProfiler.
Kliknij przycisk organizowania, który przeniesie użytkownika do nowego ekranu z przyciskiem pobierania plików. Kliknij przycisk i wybierz żądaną lokalizację, aby zapisać plik wyjściowy. Plik wyjściowy pojawi się jako oryginalna nazwa pliku z rozszerzeniem dodanym do nazwy pliku _organized.
W obecności FUDR robaki, które były karmione różnymi bakteriami, miały bardziej spójny rozmiar ciała, co pozwoliło na bardziej jednolite i dokładne wykrywanie robaków, rozwiązując w ten sposób problem przeludnienia. Zamrożenie robaków poprawiło wykrywanie agregatów polyQ poprzez wyeliminowanie fluorescencji tła, a także dokładność automatycznego liczenia porównywalną z liczeniem ręcznym. Oświetlenie odwróconym jasnym polem wykorzystano do wykrycia całego kanału C.elegans i GFP w celu zobrazowania agregatów polyQ YFP.
Wykrywanie, rozplątywanie i kwantyfikacja zagregowanych danych dla każdego robaka zostały przeprowadzone poprzez zastosowanie zoptymalizowanego potoku przetwarzania obrazu CellProfiler, który pozwala na uzyskanie liczby agregatów dla każdego pojedynczego robaka. Różnica między skutecznością automatycznej kwantyfikacji zagregowanej a wykorzystaniem potoku CellProfiler była minimalna, co wskazuje, że zautomatyzowana metoda może być stosowana do badań przesiewowych na dużą skalę. Spośród 90 badanych szczepów bakteryjnych kolonizacja jelita C.elegans jednym kandydatem wykazała istotny spadek liczby agregatów.
Eksperymenty potwierdzające poprzez ręczne liczenie wykazały, że żaden z mutantów, w tym ten, który znacząco zmniejszył liczbę agregatów, nie wpłynął na agregację polyQ. Naukowcy, którzy zdecydują się na skorzystanie z tych ram, powinni zrozumieć, że przedstawione kroki nie są bezwzględne. Modyfikacja i podstawowa wiedza na temat manipulowania CellProfiler są niezbędne do osiągnięcia sukcesu.
Dodatkowe podejścia biochemiczne, takie jak western blot, można zastosować w celu potwierdzenia agregacji polyQ.
Przegląd
To badanie opracowuje przepływ pracy o wysokiej wydajności do hodowli robaków, obrazowania fluorescencyjnego i zautomatyzowanej obróbki obrazów w celu ilościowego określenia agregatów poliglutaminy jako miary zmian w proteostazie. Metoda poprawia ocenę tych agregatów, szczególnie w badaniu ich roli w chorobach neurodegeneracyjnych.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Proteostaza
- Choroby neurodegeneracyjne
- Wysokowydajne badanie przesiewowe
Tło
- Agregacja poliglutaminy jest związana z chorobami takimi jak Alzheimera, Parkinsona i Huntingtona.
- Zrozumienie wkładu genów bakteryjnych w zakłócenie proteostazy jest istotne.
- Tradycyjne metody punktacji dla agregatów mogą być subiektywne.
Stosowane metody
- Wysokowydajne obrazowanie i analiza za pomocą CellProfiler
- C. elegans jako model biologiczny
- Zautomatyzowane ilościowe określenie agregatów poliglutaminy
Główne wyniki
- Zautomatyzowana obróbka obrazów pozwala na eliminację stronniczości i zwiększenie powtarzalności w liczeniu agregatów.
- Zidentyfikowano geny bakteryjne wpływające na proteostazę gospodarza ze znaczącymi wynikami w ilości agregatów u robaków.
- Wyniki zweryfikowane wskazują, że automatyzacja jest porównywalna z liczeniem ręcznym, wspierając duże skale badań przesiewowych.
Wnioski
- To badanie zapewnia niezawodną ramę do badania proteostazy poprzez agregację poliglutaminy.
- Wgląd uzyskany z tej metody jest istotny dla zrozumienia mechanizmów w chorobach neurodegeneracyjnych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Automating aggregate quantification in C. elegans addresses the need for high-throughput, bias-free assessment of proteostasis in neurodegenerative disease models. By standardizing image acquisition and CellProfiler-based analysis, the method enables reproducible screening of large compound or genetic libraries. This supports early target validation and mechanistic de-risking in discovery pipelines for protein conformational diseases.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying polyglutamine aggregation as a proxy for proteostasis disruption.
- Operational Value: Reduces subjectivity in phenotypic scoring, improving data reliability for target validation campaigns.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by providing quantitative, reproducible readouts for mechanism-based compound prioritization.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, quantitative aggregate counts per worm, enabling robust assay readouts for screening campaigns.
- Operational Value: Increases throughput and reproducibility through automation, reducing manual labor and inter-operator variability.
- Assay Readiness: Produces structured output (Excel spreadsheet with worm and aggregate counts) compatible with downstream data analysis workflows.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links C. elegans proteostasis models to human neurodegenerative disease mechanisms via conserved polyQ aggregation pathways.
- Mechanistic De-risking: Facilitates identification of bacterial or genetic modifiers of aggregation, supporting target validation in disease-relevant systems.
- Predictive Confidence: Enables cross-functional teams to compare conditions using normalized, automated aggregate quantification.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification, providing quantitative proteostasis readouts that inform go/no-go decisions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on proteostasis mechanisms by enabling objective, high-content aggregation phenotyping.
- Screening: Delivers assay-ready, standardized worm imaging and analysis compatible with 96-well or larger format screens.
- Analytics: Produces quantifiable dependent variable measurements (aggregates per worm) that allow statistical comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Connects invertebrate model findings to human disease pathways through conserved aggregation biology.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and analysis pipeline adaptable to multiple proteostasis targets and screening campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by eliminating bias from manual aggregate counting.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through standardized image processing and automated data output.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling large-scale screens with reduced hands-on time and higher data quality.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement decisions through reliable, quantitative proteostasis biomarkers.
Implementation Considerations
- Requires familiarity with fluorescence microscopy and GFP/YFP imaging parameters for polyQ detection.
- Depends on CellProfiler software and associated pipeline configuration for automated worm and aggregate segmentation.
- Necessitates standardized image naming and folder organization for successful batch processing.
- Benefits from FUDR treatment to reduce worm size variability and improve detection accuracy in high-density wells.
- Relies on user training to adapt the pipeline for different worm strains, expression patterns, or imaging setups.
