Name: Automatyzacja zagregowanej kwantyfikacji u Caenorhabditis elegans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-14T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Poznaj zautomatyzowaną metodę kwantyfikacji agregatów poliglutaminowych u Caenorhabditis elegans przy użyciu CellProfiler. To podejście eliminuje subiektywizm, zwiększa przepustowość i pozwala badać zaburzenia proteostazy w chorobach neurodegeneracyjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health (1RO3AG069056-01) oraz Infectious Diseases Society of America, które finansowało DMC. Fundatorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badania, gromadzeniu i analizie danych, podejmowaniu decyzji o publikacji lub przygotowaniu manuskryptu. Dziękujemy członkom Laboratorium Czyż za korektę manuskryptu. Figurki z kreskówek zostały wygenerowane przy użyciu płatnej licencji BioRender.

<ol><li>Soto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unfolding+the+role+of+protein+misfolding+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Unfolding the role of protein misfolding in neurodegenerative diseases.</a> Nature Reviews Neuroscience. 4 (1), 49-60 (2003).</li>
<li>Fang, P., Kazmi, S. A., Jameson, K. G., Hsiao, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microbiome+as+a+modifier+of+neurodegenerative+disease+risk%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">The microbiome as a modifier of neurodegenerative disease risk.</a> Cell Host & Microbe. 28 (2), 201-222 (2020).</li>
<li>Kundu, P., Blacher, E., Elinav, E., Pettersson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Our+gut+microbiome%3A+The+evolving+inner+self%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Our gut microbiome: The evolving inner self.</a> Cell. 171 (7), 1481-1493 (2017).</li>
<li>Sherwin, E., Dinan, T. G., Cryan, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+developments+in+understanding+the+role+of+the+gut+microbiota+in+brain+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Recent developments in understanding the role of the gut microbiota in brain health and disease.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1420 (1), 5-25 (2018).</li>
<li>Mondal, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+microfluidics+providing+high-resolution+and+high-throughput+screening+of+Caenorhabditis+elegans+poly-glutamine+aggregation+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Large-scale microfluidics providing high-resolution and high-throughput screening of Caenorhabditis elegans poly-glutamine aggregation model.</a> Nature Communications. 7 (1), 13023(2016).</li>
<li>Guisbert, E., Czyz, D. M., Richter, K., McMullen, P. D., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+tissue-selective+heat+shock+response+regulatory+network%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Identification of a tissue-selective heat shock response regulatory network.</a> PLoS Genetics. 9 (4), 1003466(2013).</li>
<li>Silva, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+screening+strategy+identifies+novel+regulators+of+the+proteostasis+network%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A genetic screening strategy identifies novel regulators of the proteostasis network.</a> PLoS Genetics. 7 (12), 1002438(2011).</li>
<li>Nollen, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNA+interference+screen+identifies+previously+undescribed+regulators+of+polyglutamine+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNA interference screen identifies previously undescribed regulators of polyglutamine aggregation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (17), 6403-6408 (2004).</li>
<li>Walker, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colonization+of+the+Caenorhabditis+elegans+gut+with+human+enteric+bacterial+pathogens+leads+to+proteostasis+disruption+that+is+rescued+by+butyrate%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Colonization of the Caenorhabditis elegans gut with human enteric bacterial pathogens leads to proteostasis disruption that is rescued by butyrate.</a> PLOS Pathogens. 17 (5), 1009510(2021).</li>
<li>Goya, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probiotic+Bacillus+subtilis+protects+against+%CE%B1-Synuclein+aggregation+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Probiotic Bacillus subtilis protects against α-Synuclein aggregation in C. elegans.</a> Cell Reports. 30 (2), 367-380 (2020).</li>
<li>Kumsta, C., Chang, J. T., Schmalz, J., Hansen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormetic+heat+stress+and+HSF-1+induce+autophagy+to+improve+survival+and+proteostasis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Hormetic heat stress and HSF-1 induce autophagy to improve survival and proteostasis in C. elegans.</a> Nature Communications. 8, 14337(2017).</li>
<li>Prahlad, V., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+circuitry+regulates+the+response+of+Caenorhabditis+elegans+to+misfolded+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Neuronal circuitry regulates the response of Caenorhabditis elegans to misfolded proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14204-14209 (2011).</li>
<li>Mohri-Shiomi, A., Garsin, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+signaling+and+the+heat+shock+response+modulate+protein+homeostasis+in+the+Caenorhabditis+elegans+intestine+during+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Insulin signaling and the heat shock response modulate protein homeostasis in the Caenorhabditis elegans intestine during infection.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (1), 194-201 (2008).</li>
<li>Hakim, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WorMachine%3A+machine+learning-based+phenotypic+analysis+tool+for+worms%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">WorMachine: machine learning-based phenotypic analysis tool for worms.</a> BMC Biology. 16 (1), 8(2018).</li>
<li>Wählby, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+image+analysis+toolbox+for+high-throughput+C.+elegans+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">An image analysis toolbox for high-throughput C. elegans assays.</a> Nature Methods. 9 (7), 714-716 (2012).</li>
<li>Jones, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellProfiler+Analyst%3A+data+exploration+and+analysis+software+for+complex+image-based+screens%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">CellProfiler Analyst: data exploration and analysis software for complex image-based screens.</a> BMC Bioinformatics. 9 (1), 482(2008).</li>
<li>CellProfiler: an open-source image analysis software. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.cellprofiler.org">http://www.cellprofiler.org</a> (2021).</li>
<li>Held, K., Ramage, E., Jacobs, M., Gallagher, L., Manoil, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence-verified+two-allele+transposon+mutant+library+for+Pseudomona+aeruginosa+PA01%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Sequence-verified two-allele transposon mutant library for Pseudomona aeruginosa PA01.</a> Journal of Bacteriology. 194 (23), 6387-6389 (2012).</li>
<li>Schulenburg, H., Ewbank, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+pathogen+avoidance+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The genetics of pathogen avoidance in Caenorhabditis elegans.</a> Molecular Microbiology. 66 (3), 563-570 (2007).</li>
<li>Feldman, N., Kosolapov, L., Ben-Zvi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorodeoxyuridine+improves+Caenorhabditis+elegans+proteostasis+independent+of+reproduction+onset%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Fluorodeoxyuridine improves Caenorhabditis elegans proteostasis independent of reproduction onset.</a> PLoS One. 9 (1), 85964(2014).</li>
<li>Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FUdR+causes+a+twofold+increase+in+the+lifespan+of+the+mitochondrial+mutant+gas-1%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+and+Development%22%5BJournal%5D)">FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 132 (10), 519-521 (2011).</li>
<li>Haldimann, P., Muriset, M., Vígh, L., Goloubinoff, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+novel+hydroxylamine+derivative+ng-094+suppresses+polyglutamine+protein+toxicity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The novel hydroxylamine derivative ng-094 suppresses polyglutamine protein toxicity in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (21), 18784-18794 (2011).</li>
<li>Shinn-Thomas, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wrapping+culture+plates+with+Parafilm+M%C2%AE+increases+Caenorhabditis+elegans+growth%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Research+Notes%22%5BJournal%5D)">Wrapping culture plates with Parafilm M® increases Caenorhabditis elegans growth.</a> BMC Research Notes. 12 (1), (2019).</li>
<li>Alexander-Floyd, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unexpected+cell+type-dependent+effects+of+autophagy+on+polyglutamine+aggregation+revealed+by+natural+genetic+variation+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Unexpected cell type-dependent effects of autophagy on polyglutamine aggregation revealed by natural genetic variation in C. elegans.</a> BMC Biology. 18 (1), 18(2020).</li>
<li>Moronetti Mazzeo, L. E., Dersh, D., Boccitto, M., Kalb, R. G., Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+and+aging+induce+distinct+polyQ+protein+aggregation+states%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Stress and aging induce distinct polyQ protein aggregation states.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (26), 10587-10592 (2012).</li>
<li>Sink, R., Gobec, S., Pecar, S., Zega, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((False+positives+in+the+early+stages+of+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">False positives in the early stages of drug discovery.</a> Current Medicinal Chemistry. 17 (34), 4231-4255 (2010).</li>
</ol>

Autorzy oświadczyli, że nie występuje konflikt interesów.

Opisany protokół określa procedury hodowli, obrazowania i przetwarzania obrazów C. elegans , które obejmują CellProfiler, oprogramowanie do analizy obrazów o otwartym kodzie źródłowym. Reprezentatywne wyniki wskazują na odtwarzalność, redukcję błędu systematycznego i skalowalność. Ta ustandaryzowana procedura poprawi strategie badań przesiewowych stosowane w dużych bibliotekach bakteryjnych, genomicznych lub leków. Chociaż istnieją inne zautomatyzowane metody wykrywania obiektów C. elegans , opisana technika oferuje ustandaryzowany potok o wyższej przepustowości, który integruje hodowlę, akwizycję obrazu i analizę.
Konieczne było przetestowanie kilku wariantów hodowli robaków, aby zoptymalizować opisany w niniejszym dokumencie protokół. Początkowo robaki przenoszono do próbki bakterii natychmiast po synchronizacji wieku (etap L1). Jednak takie podejście doprowadziło do powstania populacji robaków o różnych rozmiarach, nawet wśród robaków w tej samej studni. C. elegans są znane z unikania patogenów19, co mogło przyczynić się do obserwowanej zmienności wielkości i ostatecznie wpłynąć w szczególności na dalsze obrazowanie, w szczególności wykrywanie robaków. Aby wyeliminować taką zmienność, cały obszar NGM w każdym dołku został pokryty bakteriami testowymi. Ponadto robaki karmiono E. coli OP50 i pozwalano im w pełni rozwinąć się w młode osobniki dorosłe przez 48 godzin w temperaturze 25 °C. Umożliwienie robakom osiągnięcia dorosłości na E. coli OP50 przed przeniesieniem ich na bakterie testowe skutkowało bardziej spójną wielkością ciała. Dodatkowo przeludnienie i szybkie wyczerpywanie się pokarmu przez potomstwo zostały wyeliminowane poprzez uzupełnienie agaru NGM FUDR. Wdrożenie FUDR usunęło potomstwo i poprawiło automatyczną identyfikację robaków, która była zasłonięta przez mieszanie się potomstwa z populacją rodzicielską. Jednak ważne jest, aby zachować ostrożność i stosować odpowiednie kontrole podczas korzystania z FUDR, ponieważ wiadomo, że związek ten wpływa na proteostazę i długość życia C. elegans 20,21. W warunkach opisanych w tym protokole FUDR nie wpływał na agregację poliQ w jelitach (rysunek uzupełniający 5); Dlatego jego wykorzystanie było odpowiednie i korzystne dla opisanej metody.
Zamrożenie próbek przed obrazowaniem okazało się kluczowym krokiem w pomyślnym wykorzystaniu rurociągu. Łączne zliczenia przed zamrożeniem były znacznie wyższe niż zliczenia ręczne (rysunek 3B). Utrzymywanie robaków w temperaturze -20 °C przez 18-48 godzin przed obrazowaniem zmniejszyło fluorescencję tła i ostatecznie poprawiło wykrywanie agregatów (ryc. 3A). Wpływ zamrażania na wykrywanie agregatów został zbadany tylko dla polyQ i nie powinien być uogólniany na inne modele bez dalszych badań takich efektów.
Pomimo tego, że wszystkie warunki są takie same, zaobserwowano, że średnia liczba agregatów na robaka może się różnić w różnych seriach, podczas gdy stosunek między liczbą agregatów u zwierząt skolonizowanych OP50 w porównaniu z MPAO1 pozostał stały (Rysunek 6, Rysunek uzupełniający 2, Rysunek uzupełniający 5). Dlatego ważne jest, aby zawsze włączać kontrolę E. coli OP50 lub wszelkie dodatkowe odpowiednie kontrole referencyjne w każdym przebiegu. Na taką zmienność zagregowanych liczb między doświadczeniami mogą mieć wpływ warunki środowiskowe (temperatura, wilgotność)22,23 lub tło genetyczne8. W rzeczywistości zaobserwowano, że po długotrwałej hodowli fluorescencja jelit drastycznie spadła lub została całkowicie utracona, co wymagało rozmrożenia nowego szczepu z zamrożonego bulionu. Obserwowany spadek fluorescencji może być wynikiem zmian genetycznych, które hamują toksyczne transgeny, takie jak te eksprymujące polyQ. Niemniej jednak wyjątkowa powtarzalność wyników obserwowanych między różnymi eksperymentatorami (rysunek uzupełniający 2), między powtórzeniami biologicznymi (rysunek 5) i w obrębie tej samej próbki (rysunek uzupełniający 3) podkreśla siłę tego podejścia.
W licznych doniesieniach wykorzystano poliQ jelitowe do badania proteostazy 9,11,12,13,24,25. Nie można jednak dokonać bezpośredniego porównania wyników ze względu na zmienność między podejściami eksperymentalnymi a metodami odczytu. Niemniej jednak kilka wyników z wcześniej opublikowanych danych jest rekapitulowanych przez opisaną w niniejszym dokumencie automatyczną kwantyfikację, w tym bakteryjną indukcję agregacji 9,13 i porównywalną liczbę agregatów11. Reasumując, opisany potok stanowi cenne narzędzie do badania proteostazy.
Opisana tutaj metoda wiąże się z pewnymi nieodłącznymi wyzwaniami. Na przykład wymaga to wystarczającej ilości czasu, aby opanować wszystkie składniki tego protokołu, co jest szczególnie prawdziwe w przypadku sekcji 8 protokołu, która wymaga znajomości testu w celu określenia, czy uzyskane obrazy są odpowiednie do analizy rurociągu. Możliwe są odchylenia od ustawień akwizycji obrazu stosowanych w tym protokole; Jednak prawdopodobnie będzie wymagana modyfikacja ustawień i zestawu do trenowania robaków. Rurociąg ten może rozróżniać agregaty o różnych rozmiarach i te, które się stykają, co ogranicza "mieszanie" kruszyw i ostatecznie zwiększa czułość wykrywania. Jednak podczas próby zidentyfikowania dużych agregatów, które przekraczają akceptowany zakres rozmiarów, mogą pojawić się problemy, ponieważ rozszerzenie górnego progu rozmiaru może prowadzić do błędów spowodowanych słabą identyfikacją, takich jak niemożność rozróżnienia zagregowań, które się stykają. Przed analizą obrazu należy znaleźć równowagę między dokładnością, rozmiarem i intensywnością. Skuteczność identyfikacji agregatów można jeszcze bardziej zwiększyć poprzez włączenie uczenia maszynowego w celu stworzenia sieci neuronowej zdolnej do usprawnienia wykrywania agregatów. Takie ulepszenia są obecnie badane i znacznie pomogą w rozwiązaniu bieżących problemów, takich jak wykrywanie agregatów, które leżą na różnych płaszczyznach ogniskowych lub mają nietypowe kształty.
Jedną z istotnych słabości opisanej metody jest zmienność w automatycznym zliczaniu zagregowanym, ponieważ nie zawsze są one rekapitulowane przez ręczne liczenie u robaków karmionych różnymi szczepami bakterii. Na przykład, w oparciu o zautomatyzowane liczenie, robaki karmione mutantem P. aeruginosa 53 (M53) miały znacznie mniej agregatów w porównaniu ze szczepem typu dzikiego (MPAO1) (Figura 7); jednak potwierdzenie trafienia nie wykazało istotnej różnicy (rysunek uzupełniający 4). Ogólnie rzecz biorąc, wysokoprzepustowe badania przesiewowe leków mają wysoki wskaźnik wykrywania wyników fałszywie dodatnich, a opisana metoda nie jest wyjątkiem26. W związku z tym jest to krytyczna część protokołu, aby potwierdzić wszystkie potencjalne trafienia.
Chociaż protokół ten został zoptymalizowany pod kątem strategii badań przesiewowych w celu identyfikacji bakterii, które wpływają na proteostazę gospodarza, każdy krok może być dalej modyfikowany w celu przetestowania wpływu bibliotek genomowych RNAi, małych cząsteczek lub innych warunków. Na każdym etapie można wprowadzać dodatkowe modyfikacje w celu dostosowania do wymagań konkretnej strategii kontroli przesiewowej. Co więcej, technika ta zapewnia poziom elastyczności, który pozwala na optymalizację każdego kroku w celu dopasowania do określonego modelu. Na przykład, podejście to można rozszerzyć na agregację polyQ w innych tkankach lub ekstrakcję innych cech wykrytych na obrazach, takich jak monitorowanie ekspresji genów za pomocą indukowalnych reporterów fluorescencyjnych (np. genów szoku cieplnego), ocena subkomórkowej lokalizacji białek (np. lokalizacja jądrowa DAF-16), badanie agregacji w innych modelach chorobowych (Aβ1-42, α-synukleina, TDP-43 itp.) lub ocena fenotypów fizjologicznych. takich jak rozmiar robaka.

Zależne od wieku choroby konformacyjne białek neurodegeneracyjnych (PCD), takie jak choroby Alzheimera, Parkinsona i Huntingtona, czy stwardnienie zanikowe boczne, charakteryzują się nieprawidłowym fałdowaniem białek, które prowadzi do agregacji, śmierci komórek i degeneracji tkanek1. Chociaż za winowajcę uznaje się nieprawidłowe fałdowanie białek, etiologia tych chorób nie jest jasna. W związku z tym rozwój skutecznych terapii jest utrudniony przez brak wiedzy na temat czynników i warunków, które przyczyniają się do wystąpienia i postępu choroby. Ostatnie badania sugerują, że zmiany w mikrobiomie wpływają na początek, progresję i nasilenie PCDs2,3,4. Jednak złożoność ludzkiego, a nawet mysiego mikrobiomu utrudnia przeprowadzenie badań, które ujawniłyby dokładny wpływ drobnoustrojów na ich gospodarza. Dlatego prostsze organizmy, takie jak Caenorhabditis elegans, są często używane jako narzędzie do odkrywania5,6,7,8. W ostatnich badaniach wykorzystano C. elegans do zbadania wpływu bakterii na proteostazę gospodarza i patogenezę choroby9,10. Kolonizacja bakteryjna, hormeza i zmiany genomowe należą do przykładowych warunków, które wpływają na agregację traktów poliglutaminy (polyQ)9,11,12. Dodatkowo, te nieprawidłowo sfałdowane klastry białek wykazują zależną od długości i wieku akumulację polyQ w organizmie gospodarza i są związane z upośledzoną ruchliwością9,13. Stosunkowo proste podejście polegające na ilościowym oznaczaniu znakowanych fluorescencyjnie puncta może wygenerować ważne dane na temat warunków, czynników lub leków, które wpływają na fałdowanie i agregację białek.
Chociaż kwantyfikacja fluorescencyjnej puncta okazała się wiarygodną i stosunkowo prostą procedurą, wyzwaniem pozostaje opracowanie protokołu, który ułatwiłby badania przesiewowe na dużą skalę związków, bakterii lub warunków wpływających na agregację białek. Koncepcja zautomatyzowanego przetwarzania obrazów C. elegans i kwantyfikacji punktowej nie jest całkowicie nowa, ponieważ opracowano szereg praktycznych narzędzi pomocniczych14,15. Jednak integracja hodowli, akwizycji obrazu i procesu przetwarzania jest niezbędna do wyeliminowania zmienności wyników i umożliwienia badań przesiewowych o większej przepustowości.
W związku z tym, intencją tego manuskryptu jest standaryzacja procedury używanej do ilościowego oznaczania agregacji polyQ u C. elegans jako proxy do wykrywania zmian w proteostazie. Zadanie to zostało zrealizowane dzięki zastosowaniu CellProfiler, oprogramowania do analizy obrazów o otwartym kodzie źródłowym16 zdolnego do automatycznej identyfikacji robaków i agregatów, i jest zintegrowane z większym protokołem do hodowli robaków, pozyskiwania obrazów i przetwarzania danych.

<table><tbody><tr><td>1,7 ml mikroprobówki</td><td>Olympus Plastics</td><td>Cat#24-282</td><td>Probówki do mikrowirówek</td></tr><tr><td>10 ml Pipety serologiczne</td><td>GenClone</td><td>Cat#12-104</td><td>Pipety plastikowe</td></tr><tr><td>15 mL Probówki wirówkowe, stojakowe</td><td>Olympus Plastics</td><td>Cat#28-101</td><td>Probówki stożkowe</td></tr><tr><td>5-fluoro-2&prime;-deoksyurydyna</td><td>Fisher Scientific</td><td>D2235100MG</td><td>FUDR</td></tr><tr><td>Kontroler pipet Accu-jet Pro Genesee</td><td>Scientific</td><td>91-600RB</td><td>Pistolet do pipet</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat#BP1423-2</td><td>Agar granulowany</td></tr><tr><td></td><td>BioRender BioRender</td><td></td><td>Generator figur graficznych</td></tr><tr><td>Wybielacz (regularny)</td><td>Clorox</td><td>Bar# 044600324111, wybielacz bez rozprysków</td><td>4,5% podchlorynu</td></tr> <tr><td>soduC. elegans: AM140: rmIs132 [unc-54p::q35::yfp]</td><td>Morimoto Lab (Northwestern University)</td><td>AM140, Q35::YFP</td><td>Muscle polyQ</td></tr><tr><td>C. elegans: AM738: rmIs297[vha-6p:: q44::yfp; rol-6(su1006)]</td><td>Morimoto Lab (Northwestern University)</td><td>AM738, Q44::YFP</td><td>PoliQ</td></tr><tr><td>jelitowy CaCl2&middot; 2H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat#C79-500</td><td>Dwuwodny chlorek wapnia</td></tr><tr><td>CellProfiler</td><td>Broad Institute</td><td></td><td>Oprogramowanie do analizy obrazu</td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat#ICN10138201</td><td>Głowica</td></tr><tr><td>do kąpieli z obiegiem</td> cholesterolu <td>Lauda</td><td>26LE</td><td>Lauda E 100</td></tr><tr><td>CoolLED pE300lite 365 dir mount STEREO</td><td>CoolLED</td><td>8114931</td><td>Kontrola i emiter światła fluorescencyjnego</td></tr><tr><td>16 ml Probówki hodowlane</td><td>Olympus Plastics</td><td>21-129</td><td>Probówki hodowlane, 17 mm x 100 mm</td></tr><tr><td>Escherichia coli OP50</td><td>Centrum Genetyki Caenorhabditis</td><td>OP50</td><td>E. coli control szczep</td></tr><tr><td>Etanol, 200 Proof</td><td>Decon Labs, Inc.</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>Okular 10x/23B, regulowany, 3d gen</td><td>Leica Microsystems</td><td>10450910</td><td>Zestaw okularów</td></tr><tr><td>Zestaw filtrów ET GFP - MZ10F</td><td>Leica Microsystems</td><td>10450588</td><td>Kostka filtra</td></tr><tr><td>GraphPad Prism v9.2.0</td><td>GraphPad Software, Inc.</td><td></td><td>Narzędzie do analizy statystycznej</td></tr><tr><td>Inkubator Heratherm IMP180</td><td>Thermo</td><td>51031562</td><td>Inkubator z chłodzeniem</td></tr><tr><td>Innova 4000</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>M1192-0000</td><td>Inkubator wstrząsowy</td></tr><tr><td>K5 Kamera</td><td>Leica Microsystems</td><td>11547112</td><td>Stereomikroskopowa</td></tr><tr><td>kamera KH2P04</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat#P285-3</td><td>Jednozasadowy fosforan potasu</td></tr><tr><td>LAS X Oprogramowanie</td> do <td>obrazowania mikroskopem</td><td>Leica Microsystems</td><td></td></tr><tr><td>Nośnik optyki Leica MZ10 F Leica</td><td>Microsystems</td><td>10450103</td><td>Mikroskop stereoskopowy</td></tr><tr><td>Fisher</td><td>Scientific</td><td>Cat#0215522805</td><td>Chlorowodorek lewamizolu</td></tr><tr><td>Bulion Luria (Lennox)</td><td>Apex Bioresearch Products</td><td>Cat#11-125</td><td>LB</td></tr><tr><td>Magnetyczna płytka mieszająca</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-100-49S Płytka</td><td>mieszająca</td></tr><tr><td>MgSO4&middot; 7H2O</td><td>Alfa</td><td>Aesar A14491</td> Szkiełka mikroskopowe <td>siedmiowodne siarczanu magnezu</td></tr><tr><td></td><td>Premiere</td><td>8205</td><td>Pojedyncze matowe szkiełka</td></tr><tr><td>mikroskopowe Na2HPO4&middot; 7H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat#S373-500</td><td>Fosforan sodu dwuzasadowy siedmiowodny</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat#S671-500</td><td>Chlorek sodu</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat#S318-3</td><td>Granulki wodorotlenku sodu</td></tr><tr><td>Obiektywny achromat, f = 100 mm</td><td>Leica Microsystems</td><td>10411597</td><td>Obiektyw mikroskopu</td></tr><tr><td>Szalki Petriego</td><td>Genesee Scientific</td><td>Cat#32-107G</td><td>100 mm x 15 mm</td></tr><tr><td>Pseudomonas aeruginosa Biblioteka mutantów</td><td>Manoil Lab (Uniwersytet Waszyngtoński)</td><td></td><td>P. aeruginosa Biblioteka mutantów</td></tr><tr><td>Płytka do hodowli zawiesiny 24-dołkowa, z płaskim dnem</td><td>Olympus Plastics</td><td>25-102</td><td>Służy do hodowli robaków i obrazowania</td></tr><tr><td>Tubus trójokularowy 100% Leica z serii M</td><td> Microsystems</td><td>10450043</td><td></td></tr><tr><td>Trypticase Peptone</td><td>ThermoFisher, Difco</td><td>Cat#211921</td><td></td></tr><tr><td>TX-400 Rotor</td><td>Thermo Scientific</td><td>Cat#75003181</td><td>Wirnik kubełkowy wahadłowy</td></tr><tr><td>System filtrów napędzany podciśnieniem</td><td>GenClone</td><td>Cat#25-227</td><td>500 mL, membrana PES, .22 i mikro; </td></tr><tr><td>m Obiektyw wideo z mocowaniem C-Mount</td><td>Leica Microsystems</td><td>10447367</td><td>tubus adaptera aparatu 0,63x</td></tr></tbody></table>

automatyzacja zagregowanej kwantyfikacji u caenorhabditis elegans

Automating Aggregate Quantification in Caenorhabditis elegans

Wzrost częstości występowania chorób konformacyjnych chorób neurodegeneracyjnych białek (PCD) przyczynił się do dużego zainteresowania tym tematem na przestrzeni lat. W związku z tym zwrócono na nie większą uwagę i wezwano do dywersyfikacji i ulepszenia modeli zwierzęcych zdolnych do odtwarzania fenotypów chorobowych obserwowanych u ludzi z PCD. Chociaż modele mysie okazały się nieocenione, są drogie i wiążą się z pracochłonnymi, niskoprzepustowymi metodami. Wykorzystanie modelu nicieni Caenorhabditis elegans do badania PCD jest uzasadnione jego względną łatwością konserwacji, niskimi kosztami i krótkim czasem wytwarzania, co pozwala na zastosowania o wysokiej przepustowości. Dodatkowo, wysoka zachowalność między C. elegans a ludzkim genomem sprawia, że model ten jest nieocenionym narzędziem odkrywczym. Nicienie, które wykazują ekspresję fluorescencyjnie znakowanych tkanek specyficznych dla tkanki odcinków poliglutaminy (polyQ), wykazują agregację zależną od wieku i długości polyQ, charakteryzującą się ogniskami fluorescencyjnymi. Takie reportery są często wykorzystywane jako proxy do monitorowania zmian w proteostazie w tkankach. Ręczna kwantyfikacja zagregowana jest czasochłonna, co ogranicza przepustowość eksperymentalną. Co więcej, ręczna kwantyfikacja ognisk może wprowadzać błąd systematyczny, ponieważ zagregowana identyfikacja może być wysoce subiektywna. W tym przypadku protokół składający się z hodowli robaków, akwizycji obrazu i przetwarzania danych został ustandaryzowany w celu wsparcia wysokoprzepustowej zagregowanej kwantyfikacji przy użyciu C. elegans, które wyrażają specyficzny dla jelita polyQ. Dzięki wdrożeniu potoku przetwarzania obrazu opartego na C. elegans przy użyciu CellProfiler, oprogramowania do analizy obrazu, metoda ta została zoptymalizowana pod kątem oddzielania i identyfikowania poszczególnych robaków oraz wyliczania ich odpowiednich agregatów. Chociaż koncepcja automatyzacji nie jest całkowicie wyjątkowa, potrzeba standaryzacji takich procedur w celu zapewnienia odtwarzalności, eliminacji odchyleń spowodowanych ręcznym liczeniem i zwiększenia przepustowości jest wysoka. Przewiduje się, że metody te mogą drastycznie uprościć proces badań przesiewowych dużych bibliotek bakteryjnych, genomicznych lub leków przy użyciu modelu C. elegans.

Poniższy protokół opisuje rozwój i optymalizację wysokoprzepustowego przepływu pracy dla hodowli robaków, obrazowania fluorescencyjnego i automatycznego przetwarzania obrazów w celu ilościowego określenia agregatów poliglutaminy jako oceny zmian w proteostazie.

Automatyzacja zagregowanej kwantyfikacji u Caenorhabditis elegans

A rise in the prevalence of neurodegenerative protein conformational diseases (PCDs) has fostered a great interest in this subject over the years. This ...

Zastosowano proste podejście do monitorowania zmian w proteostazie poprzez ocenę agregacji poliglutaminy i zapewnienie ramy, którą można wykorzystać do zastosowań o wysokiej przepustowości. Ocena fenotypu, takiego jak liczba agregatów przez I, może stać się subiektywna. Automatyzacja zliczania agregatów pozwala nam wyeliminować takie odchylenia, zwiększyć przepustowość i powtarzalność.Metoda ta pomaga zidentyfikować geny bakteryjne przyczyniające się do zakłócenia proteostazy gospodarza. Zrozumienie wkładu poszczególnych genów bakteryjnych pomoże nam zrozumieć ich wpływ na patogenezę chorób takich jak choroba Alzheimera, Parkinsona i Huntingtona. Zacznij od wyjęcia płytek zawierających robaki z zamrażarki i pozostawienia ich do rozmrożenia w temperaturze pokojowej.Następnie zetrzyj nadmiar kondensatu i zdejmij pokrywę przed obrazowaniem. Korzystaj z ustawień mikroskopu z czasem naświetlania 500 milisekund, powiększeniem 40 x z adapterem aparatu 0,63 x i intensywnością GFP ustawioną na 100% podczas rejestrowania obrazu. Teraz dostosuj sterowanie światłem przechodzącym, aż robaki będą wyświetlane jasno oświetlone w porównaniu z ciemnym tłem, unikając prześwietlenia.Zmień położenie robaków w studzince, aby zapobiec nadmiernemu zbrylaniu, używając końcówki pipety o pojemności 10 mikrolitrów, aby delikatnie wepchnąć robaki do żądanej pozycji. Ustaw kanał na filtr GFP, aby ustalić płaszczyznę ogniskową dla obu obrazów. Uchwyć obraz w jasnym polu.Wykonaj odpowiedni obraz fluorescencyjny bez naruszania płytki lub zmiany ostrości mikroskopu. Teraz, aby ocenić obrazy, najpierw pobierz CellProfiler. Otwórz oprogramowanie, a następnie przeciągnij i upuść interesujące obrazy do pola obrazów.Kliknij obrazy na liście plików, aby je otworzyć. Wybierz lupę, aby podświetlić obszar zainteresowania, oraz ikonę strzałki, aby zmierzyć długość zarówno robaków, jak i agregatów. Najedź kursorem na żądany obiekt, aby określić jego wartość intensywności, którą można zobaczyć w dolnej części ekranu.Aby skorzystać z potoku analizy obrazu CellProfiler, po pobraniu CellProfiler z oficjalnej strony internetowej nazwij pary obrazów poprawnie, zgodnie z opisem w rękopisie tekstowym. Pobierz potok i przekaż go do programu CellProfiler, wybierając file, import i pipeline from file. Wybierz moduł niesplątanych robaków, aby otworzyć jego ustawienia i załadować zestaw treningowy używany do identyfikowania robaków w module niesplątanych robaków.Następnie zidentyfikuj nazwę pliku zestawu treningowego. Wybierz ikonę przesyłania pliku i prześlij również plik uzupełniający. Prześlij obrazy, wybierając moduł obrazów w lewym górnym rogu.A następnie przeciągnij i upuść obrazy o odpowiednich nazwach. Przed analizą obrazów wybierz żądany folder wyjściowy, który będzie używany do przechowywania wyników, klikając przycisk ustawień wyjściowych znajdujący się w lewym dolnym rogu programu. Następnie wybierz ikonę folderu po prawej stronie domyślnych danych wyjściowych, aby wybrać żądaną lokalizację wyjściową.Wybierz ikonę analizowania obrazów, aby rozpocząć analizę obrazu. Jeśli analiza trwa zbyt długo i utknęła w martwym punkcie podczas przetwarzania pojedynczego obrazu, przerwij przebieg i zidentyfikuj nieprzetworzony obraz, sortując folder wyjściowy i zwracając uwagę, która nazwa obrazu nie została znaleziona. Po pełnej analizie oprogramowanie zorganizuje wyniki w arkuszu kalkulacyjnym Excel zawierającym pojedyncze robaki w kolumnie N i odpowiednią liczbę agregacji w kolumnie K. Pobierz organizator metadanych, aby wygodnie uporządkować dane z wyjściowego pliku CSV z CellProfiler.W systemie operacyjnym Windows zlokalizuj pobrany plik i rozpakuj go do żądanej lokalizacji. Zlokalizuj i otwórz wyodrębniony folder o nazwie gui_Windowsos_64x. I uruchom aplikację, klikając ikonę aplikacji GUI.Może zostać otwarty monit z prośbą o pozwolenie na uruchomienie. Wybierz więcej informacji, a następnie kliknij uruchom mimo to. Organizator metadanych jest teraz gotowy do przeciągania i upuszczania wyjściowych plików CSV CellProfiler.W systemie Mac OS zlokalizuj pobrany plik i rozpakuj plik aplikacji do organizowania metadanych plików. Otwórz wyodrębniony folder znajdujący się w pobranych plikach. Kliknij prawym przyciskiem myszy aplikację GUI i wybierz otwórz.Pojawi się monit z prośbą o pozwolenie na otwarcie z powodu braku oficjalnej licencji. Wybierz pozycję Otwórz. Po otwarciu aplikacji do organizowania metadanych w odpowiednim systemie operacyjnym kliknij prześlij swoje pliki tutaj lub przeciągnij i upuść żądane pliki CSV CellProfiler.Kliknij przycisk organizowania, który przeniesie użytkownika do nowego ekranu z przyciskiem pobierania plików. Kliknij przycisk i wybierz żądaną lokalizację, aby zapisać plik wyjściowy. Plik wyjściowy pojawi się jako oryginalna nazwa pliku z rozszerzeniem dodanym do nazwy pliku _organized.W obecności FUDR robaki, które były karmione różnymi bakteriami, miały bardziej spójny rozmiar ciała, co pozwoliło na bardziej jednolite i dokładne wykrywanie robaków, rozwiązując w ten sposób problem przeludnienia. Zamrożenie robaków poprawiło wykrywanie agregatów polyQ poprzez wyeliminowanie fluorescencji tła, a także dokładność automatycznego liczenia porównywalną z liczeniem ręcznym. Oświetlenie odwróconym jasnym polem wykorzystano do wykrycia całego kanału C.elegans i GFP w celu zobrazowania agregatów polyQ YFP.Wykrywanie, rozplątywanie i kwantyfikacja zagregowanych danych dla każdego robaka zostały przeprowadzone poprzez zastosowanie zoptymalizowanego potoku przetwarzania obrazu CellProfiler, który pozwala na uzyskanie liczby agregatów dla każdego pojedynczego robaka. Różnica między skutecznością automatycznej kwantyfikacji zagregowanej a wykorzystaniem potoku CellProfiler była minimalna, co wskazuje, że zautomatyzowana metoda może być stosowana do badań przesiewowych na dużą skalę. Spośród 90 badanych szczepów bakteryjnych kolonizacja jelita C.elegans jednym kandydatem wykazała istotny spadek liczby agregatów.Eksperymenty potwierdzające poprzez ręczne liczenie wykazały, że żaden z mutantów, w tym ten, który znacząco zmniejszył liczbę agregatów, nie wpłynął na agregację polyQ. Naukowcy, którzy zdecydują się na skorzystanie z tych ram, powinni zrozumieć, że przedstawione kroki nie są bezwzględne. Modyfikacja i podstawowa wiedza na temat manipulowania CellProfiler są niezbędne do osiągnięcia sukcesu.Dodatkowe podejścia biochemiczne, takie jak western blot, można zastosować w celu potwierdzenia agregacji polyQ.

automating-aggregate-quantification-in-caenorhabditis-elegans

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Obfitość receptorów neurotransmiterów zgromadzonych w synapsach silnie wpływa na siłę synaptyczną. Metoda ta pozwala na ilościowe określenie liczby znakowanych fluorescencyjnie receptorów neurotransmiterów w trzech wymiarach z rozdzielczością pojedynczej synapsy u C. elegans, co umożliwia szybką charakterystykę setek synaps w obrębie jednej próbki bez zniekształceń wynikających z projekcji płaszczyzny z.

Automatyczna kwantyfikacja fluorescencji synaptycznej u C. elegans

C. elegans podczas składania jaj może dostarczyć ważnych informacji w badaniach rozwojowych, reprodukcyjnych i anatomicznych. Ten film przedstawia ważne etapy testu składania jaj i pokazuje próbkę eksperymentu, w którym lek jest testowany pod kątem toksyczności reprodukcyjnej.

Test składania jaj: metoda ilościowego określania zachowania C. elegans podczas składania jaj

Tutaj prezentujemy ramy do powiązania szeroko pojętych ograniczeń dietetycznych z ekspresją genów i długością życia. Opisujemy protokoły dotyczące szeroko zakrojonych ograniczeń dietetycznych i ilościowego obrazowania ekspresji genów w ramach tego paradygmatu. Następnie przedstawiamy analizy obliczeniowe, aby ujawnić podstawowe cechy przetwarzania informacji w obwodach genetycznych zaangażowanych w wykrywanie żywności.

Kwantyfikacja informacji kodowanych przez poziomy ekspresji genów podczas modulacji długości życia w warunkach szerokiego zakresu ograniczeń dietetycznych u C. elegans

Opisujemy protokoły korzystania z platformy śledzenia nicieni o szerokim polu widzenia (WF-NTP), która umożliwia wysokoprzepustową charakterystykę fenotypową dużych populacji Caenorhabditis elegans. Protokoły te mogą być wykorzystywane do charakteryzowania subtelnych zmian behawioralnych w zmutowanych szczepach lub w odpowiedzi na leczenie farmakologiczne w wysoce skalowalny sposób.

Zautomatyzowana analiza behawioralna dużych populacji C. elegans przy użyciu platformy śledzenia o szerokim polu widzenia

To badanie przedstawia ilościowe pomiary wielkości i lokalizacji synaptycznej, morfologii mięśni i kształtu mitochondriów u C. elegans przy użyciu swobodnie dostępnych narzędzi do przetwarzania obrazów. Takie podejście pozwala przyszłym badaniom nad C. elegans na ilościowe porównanie zakresu zmian strukturalnych tkanek i organelli w wyniku mutacji genetycznych.

Ilościowe podejścia do badania struktur komórkowych i morfologii organelli u Caenorhabditis elegans

W tym artykule opisany jest protokół o wysokiej przepustowości do szybkiego i niezawodnego określania poziomów ekspresji genów w pojedynczych lub zbiorczych próbkach C. elegans. Protokół ten nie wymaga izolacji RNA i wytwarza cDNA bezpośrednio z próbek. Może być używany razem z wysokoprzepustowymi, multipleksowanymi, nanofluidycznymi platformami qPCR w czasie rzeczywistym.

Wysokoprzepustowy ilościowy RT-PCR w pojedynczych i masowych próbkach C. elegans przy użyciu technologii nanofluidycznej

Ten protokół opisuje podejścia do wykrywania i ilościowego oznaczania dużych zagregowań i/lub organelli (~4 μm) wytwarzanych przez komórki C. elegans w postaci egzoferów związanych z błoną. Opisujemy szczepy, warunki wzrostu, kryteria punktacji, czas i rozważania mikroskopowe potrzebne do ułatwienia sekcji tego mechanizmu wydalania gruzu.

Ilościowe podejścia do oceny in vivo agregatów neuronalnych i ekstruzji organelli w dużych pęcherzykach egzoferyjnych u C. elegans

To badanie przedstawia protokoły dla dwóch półautomatycznych metod analizy aktywności lokomotorycznej u robaków C. elegans complex I disease gas-1(fc21), a mianowicie ZebraLab (test o średniej przepustowości) i WormScan (test o wysokiej przepustowości) i dostarcza analizy porównawczej wśród szerokiego wachlarza metod badawczych do ilościowego określenia zachowania nicieni i zintegrowanej funkcji nerwowo-mięśniowej.

Analiza porównawcza metod eksperymentalnych do ilościowego określania aktywności zwierząt w modelach choroby mitochondrialnej Caenorhabditis elegans

Tutaj prezentowana jest metoda analizy kinetyki agregacji białek u nicieni Caenorhabditis elegans. Zwierzęta z populacji zsynchronizowanej pod względem wieku są obrazowane w różnych punktach czasowych, a następnie następuje półautomatyczne zliczanie inkluzji w CellProfiler i dopasowywanie do modelu matematycznego w AmyloFit.

Monitorowanie kinetyki agregacji białek in vivo przy użyciu automatycznego zliczania inkluzji u Caenorhabditis elegans

Ten protokół może być używany do przeprowadzania badań ekologicznych na dużą skalę nicieni Caenorhabditis. Podstawową zaletą tej metody jest sprawna organizacja i analiza danych ekologicznych i molekularnych związanych z nicieniami zebranymi z natury.

Wysoce skalowalne podejście do przeprowadzania badań ekologicznych nicieni Caenorhabditis

Poznaj zautomatyzowaną metodę kwantyfikacji agregatów poliglutaminowych u Caenorhabditis elegans przy użyciu CellProfiler. To podejście eliminuje subiektywizm, zwiększa przepustowość i pozwala badać zaburzenia proteostazy w chorobach neurodegeneracyjnych.

Automatyzacja zagregowanej kwantyfikacji u Caenorhabditis elegans

Przeglądaj więcej filmów