Automatyzacja zagregowanej kwantyfikacji u Caenorhabditis elegans
14 października 2021
Poniższy protokół opisuje rozwój i optymalizację wysokoprzepustowego przepływu pracy dla hodowli robaków, obrazowania fluorescencyjnego i automatycznego przetwarzania obrazów w celu ilościowego określenia agregatów poliglutaminy jako oceny zmian w proteostazie.
Zastosowano proste podejście do monitorowania zmian w proteostazie poprzez ocenę agregacji poliglutaminy i zapewnienie ramy, którą można wykorzystać do zastosowań o wysokiej przepustowości. Ocena fenotypu, takiego jak liczba agregatów przez I, może stać się subiektywna. Automatyzacja zliczania agregatów pozwala nam wyeliminować takie odchylenia, zwiększyć przepustowość i powtarzalność.
Metoda ta pomaga zidentyfikować geny bakteryjne przyczyniające się do zakłócenia proteostazy gospodarza. Zrozumienie wkładu poszczególnych genów bakteryjnych pomoże nam zrozumieć ich wpływ na patogenezę chorób takich jak choroba Alzheimera, Parkinsona i Huntingtona. Zacznij od wyjęcia płytek zawierających robaki z zamrażarki i pozostawienia ich do rozmrożenia w temperaturze pokojowej.
Następnie zetrzyj nadmiar kondensatu i zdejmij pokrywę przed obrazowaniem. Korzystaj z ustawień mikroskopu z czasem naświetlania 500 milisekund, powiększeniem 40 x z adapterem aparatu 0,63 x i intensywnością GFP ustawioną na 100% podczas rejestrowania obrazu. Teraz dostosuj sterowanie światłem przechodzącym, aż robaki będą wyświetlane jasno oświetlone w porównaniu z ciemnym tłem, unikając prześwietlenia.
Zmień położenie robaków w studzince, aby zapobiec nadmiernemu zbrylaniu, używając końcówki pipety o pojemności 10 mikrolitrów, aby delikatnie wepchnąć robaki do żądanej pozycji. Ustaw kanał na filtr GFP, aby ustalić płaszczyznę ogniskową dla obu obrazów. Uchwyć obraz w jasnym polu.
Wykonaj odpowiedni obraz fluorescencyjny bez naruszania płytki lub zmiany ostrości mikroskopu. Teraz, aby ocenić obrazy, najpierw pobierz CellProfiler. Otwórz oprogramowanie, a następnie przeciągnij i upuść interesujące obrazy do pola obrazów.
Kliknij obrazy na liście plików, aby je otworzyć. Wybierz lupę, aby podświetlić obszar zainteresowania, oraz ikonę strzałki, aby zmierzyć długość zarówno robaków, jak i agregatów. Najedź kursorem na żądany obiekt, aby określić jego wartość intensywności, którą można zobaczyć w dolnej części ekranu.
Aby skorzystać z potoku analizy obrazu CellProfiler, po pobraniu CellProfiler z oficjalnej strony internetowej nazwij pary obrazów poprawnie, zgodnie z opisem w rękopisie tekstowym. Pobierz potok i przekaż go do programu CellProfiler, wybierając file, import i pipeline from file. Wybierz moduł niesplątanych robaków, aby otworzyć jego ustawienia i załadować zestaw treningowy używany do identyfikowania robaków w module niesplątanych robaków.
Następnie zidentyfikuj nazwę pliku zestawu treningowego. Wybierz ikonę przesyłania pliku i prześlij również plik uzupełniający. Prześlij obrazy, wybierając moduł obrazów w lewym górnym rogu.
A następnie przeciągnij i upuść obrazy o odpowiednich nazwach. Przed analizą obrazów wybierz żądany folder wyjściowy, który będzie używany do przechowywania wyników, klikając przycisk ustawień wyjściowych znajdujący się w lewym dolnym rogu programu. Następnie wybierz ikonę folderu po prawej stronie domyślnych danych wyjściowych, aby wybrać żądaną lokalizację wyjściową.
Wybierz ikonę analizowania obrazów, aby rozpocząć analizę obrazu. Jeśli analiza trwa zbyt długo i utknęła w martwym punkcie podczas przetwarzania pojedynczego obrazu, przerwij przebieg i zidentyfikuj nieprzetworzony obraz, sortując folder wyjściowy i zwracając uwagę, która nazwa obrazu nie została znaleziona. Po pełnej analizie oprogramowanie zorganizuje wyniki w arkuszu kalkulacyjnym Excel zawierającym pojedyncze robaki w kolumnie N i odpowiednią liczbę agregacji w kolumnie K. Pobierz organizator metadanych, aby wygodnie uporządkować dane z wyjściowego pliku CSV z CellProfiler.
W systemie operacyjnym Windows zlokalizuj pobrany plik i rozpakuj go do żądanej lokalizacji. Zlokalizuj i otwórz wyodrębniony folder o nazwie gui_Windowsos_64x. I uruchom aplikację, klikając ikonę aplikacji GUI.
Może zostać otwarty monit z prośbą o pozwolenie na uruchomienie. Wybierz więcej informacji, a następnie kliknij uruchom mimo to. Organizator metadanych jest teraz gotowy do przeciągania i upuszczania wyjściowych plików CSV CellProfiler.
W systemie Mac OS zlokalizuj pobrany plik i rozpakuj plik aplikacji do organizowania metadanych plików. Otwórz wyodrębniony folder znajdujący się w pobranych plikach. Kliknij prawym przyciskiem myszy aplikację GUI i wybierz otwórz.
Pojawi się monit z prośbą o pozwolenie na otwarcie z powodu braku oficjalnej licencji. Wybierz pozycję Otwórz. Po otwarciu aplikacji do organizowania metadanych w odpowiednim systemie operacyjnym kliknij prześlij swoje pliki tutaj lub przeciągnij i upuść żądane pliki CSV CellProfiler.
Kliknij przycisk organizowania, który przeniesie użytkownika do nowego ekranu z przyciskiem pobierania plików. Kliknij przycisk i wybierz żądaną lokalizację, aby zapisać plik wyjściowy. Plik wyjściowy pojawi się jako oryginalna nazwa pliku z rozszerzeniem dodanym do nazwy pliku _organized.
W obecności FUDR robaki, które były karmione różnymi bakteriami, miały bardziej spójny rozmiar ciała, co pozwoliło na bardziej jednolite i dokładne wykrywanie robaków, rozwiązując w ten sposób problem przeludnienia. Zamrożenie robaków poprawiło wykrywanie agregatów polyQ poprzez wyeliminowanie fluorescencji tła, a także dokładność automatycznego liczenia porównywalną z liczeniem ręcznym. Oświetlenie odwróconym jasnym polem wykorzystano do wykrycia całego kanału C.elegans i GFP w celu zobrazowania agregatów polyQ YFP.
Wykrywanie, rozplątywanie i kwantyfikacja zagregowanych danych dla każdego robaka zostały przeprowadzone poprzez zastosowanie zoptymalizowanego potoku przetwarzania obrazu CellProfiler, który pozwala na uzyskanie liczby agregatów dla każdego pojedynczego robaka. Różnica między skutecznością automatycznej kwantyfikacji zagregowanej a wykorzystaniem potoku CellProfiler była minimalna, co wskazuje, że zautomatyzowana metoda może być stosowana do badań przesiewowych na dużą skalę. Spośród 90 badanych szczepów bakteryjnych kolonizacja jelita C.elegans jednym kandydatem wykazała istotny spadek liczby agregatów.
Eksperymenty potwierdzające poprzez ręczne liczenie wykazały, że żaden z mutantów, w tym ten, który znacząco zmniejszył liczbę agregatów, nie wpłynął na agregację polyQ. Naukowcy, którzy zdecydują się na skorzystanie z tych ram, powinni zrozumieć, że przedstawione kroki nie są bezwzględne. Modyfikacja i podstawowa wiedza na temat manipulowania CellProfiler są niezbędne do osiągnięcia sukcesu.
Dodatkowe podejścia biochemiczne, takie jak western blot, można zastosować w celu potwierdzenia agregacji polyQ.
Przegląd
W niniejszym badaniu opracowano wysokoprzepustowy schemat postępowania obejmujący hodowlę nicieni, obrazowanie fluorescencyjne oraz zautomatyzowaną analizę obrazów w celu ilościowego oznaczenia agregatów poliglutaminy jako miary zmian w proteostazie. Metoda ta usprawnia ocenę tych agregatów, szczególnie w kontekście badania ich roli w chorobach neurodegeneracyjnych.
Kluczowe elementy badania
Obszar badań
- Proteostaza
- Choroby neurodegeneracyjne
- Przesiewanie wysokoprzepustowe
Wstęp
- Agregacja poliglutaminy jest powiązana z takimi chorobami jak choroba Alzheimera, Parkinsona i Huntingtona.
- Zrozumienie roli genów bakteryjnych w zaburzaniu proteostazy jest niezbędne.
- Tradycyjne metody oceny agregatów mogą być subiektywne.
Zastosowane metody
- Wysokoprzepustowe obrazowanie i analiza z wykorzystaniem oprogramowania CellProfiler
- C. elegans jako model biologiczny
- Zautomatyzowana kwantyfikacja agregatów poliglutaminy
Główne wyniki
- Zautomatyzowane przetwarzanie obrazów pozwala na wyeliminowanie błędu subiektywnego i zwiększenie powtarzalności zliczania agregatów.
- Zidentyfikowano geny bakteryjne wpływające na proteostazę gospodarza, wykazując istotne różnice w liczbie agregatów nicieni.
- Zwalidowane wyniki wskazują, że automatyzacja jest porównywalna z liczeniem ręcznym, co wspiera prowadzenie przesiewów na dużą skalę.
Wnioski
- Niniejsze badanie dostarcza wiarygodnych ram do analizy proteostazy poprzez agregację poliglutaminy.
- Wnioski uzyskane dzięki tej metodzie są istotne dla zrozumienia mechanizmów chorób neurodegeneracyjnych.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Automatyzacja ilościowego oznaczania agregatów u C. elegans odpowiada na potrzebę wysokoprzepustowej i obiektywnej oceny proteostazy w modelach chorób neurodegeneracyjnych. Dzięki standaryzacji akwizycji obrazów oraz analizy opartej na programie CellProfiler, metoda ta umożliwia reprodukowalne przesiewanie dużych bibliotek związków lub bibliotek genetycznych. Wspiera to wczesną walidację celów terapeutycznych oraz redukcję ryzyka mechanistycznego w procesach odkrywania leków na choroby konformacyjne białek.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez kwantyfikację agregacji poliglutaminy jako wskaźnika zaburzeń proteostazy.
- Wartość operacyjna: Ogranicza subiektywizm w ocenie fenotypowej, zwiększając niezawodność danych w kampaniach walidacji celów terapeutycznych.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów w portfolio poprzez dostarczanie ilościowych i powtarzalnych wyników służących do priorytetyzacji związków w oparciu o mechanizm działania.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Generuje zestandaryzowane, ilościowe zliczenia agregatów na jednego nicienia, co umożliwia uzyskanie wiarygodnych wyników testów w kampaniach przesiewowych.
- Wartość operacyjna: Zwiększa przepustowość i powtarzalność dzięki automatyzacji, ograniczając nakład pracy ręcznej oraz zmienność międzyoperatorową.
- Gotowość do analizy: Tworzy ustrukturyzowane dane wyjściowe (arkusz Excel z liczbą nicieni i agregatów) kompatybilne z dalszymi etapami analizy danych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy modele proteostazy C. elegans z mechanizmami ludzkich chorób neurodegeneracyjnych poprzez konserwatywne szlaki agregacji polyQ.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Ułatwia identyfikację bakteryjnych lub genetycznych modyfikatorów agregacji, wspierając walidację celów w systemach istotnych dla danej choroby.
- Pewność prognostyczna: Umożliwia zespołom interdyscyplinarnym porównywanie warunków przy użyciu znormalizowanej, zautomatyzowanej kwantyfikacji agregatów.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków, od walidacji celu po identyfikację związku wiodącego, dostarczając ilościowych wyników proteostazy, które stanowią podstawę do podejmowania decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących mechanizmów proteostazy poprzez umożliwienie obiektywnego, wysokotreściowego fenotypowania agregacji.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowe do analizy, zestandaryzowane obrazowanie i analizę nicieni, kompatybilne z formatami przesiewowymi 96-dołkowymi lub większymi.
- Analityka: Generuje mierzalne wartości zmiennych zależnych (liczba agregatów na nicienia), co pozwala na statystyczne porównanie różnych warunków eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki uzyskane na modelach bezkręgowców ze szlakami chorób ludzkich poprzez konserwatywną biologię agregacji.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku rurociąg obrazowania i analizy, który można dostosować do wielu celów proteostazy oraz kampanii przesiewowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną w walidacji celu poprzez eliminację błędu wynikającego z ręcznego zliczania agregatów.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i skalowalność dzięki standaryzowanemu przetwarzaniu obrazów i zautomatyzowanemu generowaniu danych.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową, umożliwiając prowadzenie przesiewów na dużą skalę przy zmniejszonym nakładzie pracy ręcznej i wyższej jakości danych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera decyzje o rozwoju projektów skorygowane o ryzyko dzięki wiarygodnym, ilościowym biomarkerom proteostazy.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest znajomość mikroskopii fluorescencyjnej oraz parametrów obrazowania GFP/YFP w celu wykrywania polyQ.
- Metoda opiera się na oprogramowaniu CellProfiler i powiązanej konfiguracji potoku (pipeline) do zautomatyzowanej segmentacji nicieni oraz agregatów.
- Pomyślne przetwarzanie wsadowe wymaga standaryzacji nazewnictwa obrazów i organizacji folderów.
- Zaleca się zastosowanie FUDR w celu zmniejszenia zmienności rozmiarów nicieni i poprawy dokładności detekcji w studzienkach o wysokiej gęstości.
- Konieczne jest przeszkolenie użytkownika w zakresie adaptacji potoku do różnych szczepów nicieni, wzorców ekspresji lub konfiguracji obrazowania.
