Name: Produkcja nanocząstek lipidowych obciążonych siRNA za pomocą urządzenia mikroprzepływowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 2 s
Description: Poznaj metodę produkcji nanocząstek lipidowych obciążonych siRNA za pomocą urządzenia mikroprzepływowego iLiNP. Technika umożliwia precyzyjną kontrolę wielkości od 20 do 100 nm, co jest kluczowe dla efektywności dostarczania leków.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez JST, CREST Grant Number JPMJCR17H1, Japan, JST, PRESTO Grant Number JPMJPR19K8, Japan, JST, SCORE, Japan, Special Education and Research Expenses z Ministerstwa Edukacji, Kultury, Sportu, Nauki i Technologii, JSPS KAKENHI Grant Number JP19KK0140, oraz Iketani Science and Technology Foundation.

1. Wykonanie urządzenia iLiNP
UWAGA: Urządzenie iLiNP jest wytwarzane przy użyciu standardowej metody miękkiej litografii18. Szczegółowy protokół wytwarzania został opisany wcześniej10,13.
<ol>
	<li>Wytwarzanie formy z SU-8
	<ol>
		<li>Nalać SU-8 3050 na 3-calowy wafelek krzemowy. Rozprowadzić warstwę metodą spin-coatingu, aby uzyskać warstwę SU-8 o grubości 100 µm.</li>
		<li>Wygrzać wafelek krzemowy na płycie grzejnej w temperaturze 65 °C przez 5 min i 95 °C przez 45 min.</li>
		<li>Po wygrzaniu umieścić wafelek krzemowy na stole systemu litografii bezmaskowej.</li>
		<li>Naświetlić wafelek krzemowy światłem UV o długości fali 365 nm przez 1,5 s na jedną pozycję. 
		UWAGA: W tym doświadczeniu wykorzystano system litografii bezmaskowej. System automatycznie naświetla UV podzielony obszar naświetlania (jedną pozycję) mikrokanału.</li>
		<li>Po naświetlaniu UV wygrzać wafelek krzemowy na płycie grzejnej w temperaturze 65 °C przez 1 min i 95 °C przez 5 min.</li>
		<li>Ostudzić wafelek krzemowy, a następnie namoczyć w wywoływaczu SU-8 przez 15 min w celu usunięcia nienaświetlonego SU-8.</li>
		<li>Poddać formę z SU-8 działaniu oparów trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silanu, używając eksykatora i pompy próżniowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wytwarzanie urządzenia iLiNP
	<ol>
		<li>Zmieszać bazę silikonową i czynnik sieciujący polidimetylosiloksanu (PDMS) w stosunku 10:1 (w/w).</li>
		<li>Odgazować mieszaninę za pomocą pompy próżniowej i eksykatora. 
		​UWAGA: PDMS był odgazowywany za pomocą pompy próżniowej przez 10 min w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Nalać odgazowany PDMS na formę z SU-8 w 100 mm szalce Petriego do grubości od 0,5 do 1 cm, a następnie wygrzać w piekarniku w temperaturze 80 °C przez 1 h.</li>
		<li>Ostudzić formę, a następnie oddzielić podłoże z PDMS od formy z SU-8 za pomocą pęsety.</li>
		<li>Wyciąć trzy otwory (0,5 mm) w podłożu z PDMS. Połączyć podłoże z PDMS ze szkiełkiem podstawowym za pomocą cleanera plazmowego tlenowego, aby zbudować urządzenie iLiNP (patrz Rysunek 1)13.</li>
		<li>Podłączyć trzy kapilary PEEK (I.D. 0,3 mm, O.D. 0,5 mm) do wlotów i wylotu urządzenia iLiNP i utrwalić superklejem. 
		​UWAGA: Długość kapilar PEEK jest regulowana i zależy od przeprowadzanego eksperymentu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie roztworów lipidów
<ol>
	<li>Przygotować roztwory lipidów w etanolu: 13,4 mM 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC), 10 mM 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC), 20 mM 1,2-dioleoyloxy-3-trimethylammonium propane (DOTAP), 5 mM 1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylene glycol-2000 (DMG-PEG2k) oraz 20 mM cholesterolu. Roztwory stokowe przechowywać w temperaturze -20 °C przed rozpoczęciem eksperymentu.</li>
	<li>W celu wytworzenia LNP obciążonych siRNA, zmieszać roztwory DOTAP, DSPC, cholesterolu i DMG-PEG2k w stosunku molowym 50/10/38,5/1,5. Całkowite stężenie lipidów należy dostosować do poziomu 8 mM.</li>
</ol>
3. Przygotowanie roztworów wodnych
<ol>
	<li>Przygotować roztwory wodne: 154 mM NaCl (sól fizjologiczna) oraz 25 mM bufor octanowy o pH 4.0, używając wody destylowanej wolnej od DNazy/RNazy.</li>
	<li>Przefiltrować roztwory przez filtry membranowe lub filtry strzykawkowe o rozmiarze porów 0.2 µm.</li>
</ol>
4. Przygotowanie roztworu siRNA/buforu
<ol>
	<li>Rozpuścić 70 µg siGL4 w 1 mL 25 mM buforu octanowego (pH 4.0). 
	UWAGA: siGL4 jest stosowany do wyciszenia genu lucyferazy.</li>
</ol>
5. Konfiguracja urządzenia iLiNP i produkcja LNP
UWAGA: Schematy znajdują się na Ryc. 1.
<ol>
	<li>Napełnij szklane strzykawki o pojemności 1 mL odpowiednio roztworem lipidowym i wodnym (z kroków 3.1 i 4.1, w osobnych strzykawkach). 
	UWAGA: Dostosuj objętość roztworu lipidowego i wodnego w zależności od ilości wymaganej do eksperymentu oceny LNP.</li>
	<li>Połącz szklane strzykawki z kapilarami PEEK za pomocą złączy do strzykawek.</li>
	<li>Ustaw szybkość przepływu roztworów lipidowego i wodnego. 
	UWAGA: Stosunek szybkości przepływu (FRR) fazy wodnej do fazy lipidowej mieści się w zakresie od 3:1 do 9:1.</li>
	<li>Wprowadź roztwory lipidowy i wodny osobno do urządzenia iLiNP, korzystając z pomp strzykawkowych.</li>
	<li>Zbierz zawiesiny LNP do mikroprobówki z wylotu urządzenia iLiNP (Rysunek 1).</li>
</ol>
6. Dializa zawiesiny LNP i pomiar wielkości LNP
<ol>
	<li>Dializować zawiesinę LNP przy użyciu membrany dializacyjnej (próg odcięcia MW 12−14 kDa) w temperaturze 4 °C przez noc przeciwko soli fizjologicznej (dla LNP POPC) lub D-PBS (dla LNP obciążonych siRNA). 
	UWAGA: POPC nie rozpuszcza się w soli fizjologicznej (patrz punkt 2.1). Roztwór POPC/etanol jest rozcieńczany solą fizjologiczną w urządzeniu iLiNP.</li>
	<li>Zebrać zdializowane zawiesiny LNP do mikroprobówek.</li>
	<li>Pipetować 20-30 µL zawiesiny LNP do mikrokuwety kwarcowej.</li>
	<li>Zmierzyć wielkość LNP, rozkład wielkości LNP oraz indeks polidyspersyjności za pomocą dynamicznego rozpraszania światła (DLS).</li>
</ol>
7. Pomiar potencjału zeta LNP
UWAGA: Do pomiaru potencjału zeta wykorzystano analizator cząstek (patrz Tabela materiałów) zgodnie z instrukcją producenta.
<ol>
	<li>Rozcieńczyć zawiesinę LNP otrzymaną w kroku 6.1, 35-krotnie w buforze HEPES 10 mM (pH 7.4).</li>
	<li>Nabrać pipetą od 700 do 1000 µL rozcieńczonej zawiesiny LNP do kuwety kapilarnej.</li>
	<li>Zmierzyć potencjał zeta zgodnie z instrukcją producenta.</li>
</ol>
8. Wydajność enkapsulacji siRNA za pomocą testu RiboGreen
UWAGA: Analizę Ribogreen przeprowadza się w celu oceny enkapsulacji siRNA w LNP19. Analiza Ribogreen pozwala zmierzyć ilość RNA wewnątrz i na zewnątrz LNP z dodatkiem lub bez dodatku surfaktantu (np. TritonX-100).
<ol>
	<li>Rozcieńć siGL4 o stężeniu 2 mg/mL w buforze HEPES 10 mM (pH 7,4) do uzyskania roztworu siGL4 o stężeniu 500 ng/mL.</li>
	<li>Przygotuj szereg rozcieńczeń (0, 12,5, 25, 50, 100, 200 ng/mL) roztworu siGL4 w celu sporządzenia krzywej kalibracyjnej dla próbek z dodatkiem Triton (+) oraz bez dodatku Triton (-).</li>
	<li>Rozcieńcz zawiesinę LNP 100-krotnie w buforze HEPES 10 mM (pH 7,4).</li>
	<li>W celu przygotowania roztworu Triton (+) wymieszaj następujące składniki: 980 µL HEPES 10 mM (pH 7,4), 20 µL 10% w/v TritonX-100 oraz 1,25 µL RiboGreen na 10 studzienek mikropłytki 96-dołkowej.</li>
	<li>W celu przygotowania roztworu Triton (-) wymieszaj następujące składniki: 1000 µL HEPES 10 mM (pH 7,4) oraz 1,25 µL RiboGreen na 10 studzienek mikropłytki 96-dołkowej.</li>
	<li>Pipetuj 100 µL szeregu rozcieńczeń roztworu siGL4 oraz rozcieńczonych zawiesin LNP do studzienek czarnej mikropłytki 96-dołkowej. 
	UWAGA: Szereg rozcieńczeń roztworu siGL4 oraz rozcieńczone zawiesiny LNP naniesiono do czterech mikrostudzienek dla każdego wariantu.</li>
	<li>Pipetuj 100 µL roztworu detekcyjnego (TritonX-100 (+) lub Triton (-)) do studzienek. 
	UWAGA: Roztwór detekcyjny (TritonX-100 (+)) naniesiono do dwóch studzienek na próbkę dla każdego wariantu, a roztwór TritonX-100 (-) do pozostałych dwóch studzienek dla każdego wariantu próbki.</li>
	<li>Inkubuj mikropłytkę przez 5 min w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zmierz intensywność fluorescencji za pomocą czytnika mikropłytek przy długości fali 475 nm.</li>
	<li>Oblicz wydajność enkapsulacji siRNA korzystając z następującego równania19. 
	<img alt="Równanie wydajności enkapsulacji siRNA; analiza stężenia siRNA z użyciem Triton do celów badawczych." src="/files/ftp_upload/62999/62999eq01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 1"></li>
</ol>
9. Hodowla komórek
<ol>
	<li>Przygotować pożywkę wzrostową zawierającą DMEM, 10% FBS inaktywowanego termicznie, 100 U/mL penicyliny, 100 µg/mL streptomycyny oraz 400 µg/mL G418.</li>
	<li>Hodować komórki HeLa stabilnie wykazujące ekspresję lucyferazy świetlika i Renilla (HeLa-dluc) w 100 mm szalce hodowlanej traktowanej TC, zawierającej pożywkę wzrostową, w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2 .</li>
</ol>
10. Test żywotności komórek
<ol>
	<li>Wysiać 100 µL zawiesiny komórek HeLa w pożywce wzrostowej (6 x 103 komórek/dołek) do mikropłytki 96-dołkowej. 
	UWAGA: Komórki policzono przy użyciu płytki do liczenia komórek i mikroskopu.</li>
	<li>Inkubować mikropłytkę przez 24 h w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2 .</li>
	<li>Rozcieńczyć LNP obciążone siRNA w DMEM (FBS (-)) do stężeń 10 i 100 nM siRNA.</li>
	<li>Nanieść 100 µL rozcieńczonej zawiesiny LNP obciążonych siRNA do każdego dołka.</li>
	<li>Inkubować mikropłytkę przez 4 h w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2 .</li>
	<li>Usunąć zawiesinę LNP i dodać 100 µL DMEM (FBS (+)).</li>
	<li>Inkubować mikropłytkę przez 20 h w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2 .</li>
	<li>Zmierzyć żywotność komórek przy użyciu dostępnego komercyjnie zestawu zgodnie z protokołem producenta. 
	UWAGA: Jako kontrolę negatywną zastosowano D-PBS (-).</li>
</ol>
11. Analiza wyciszania genu lucyferazy
<ol>
	<li>Wysiać 75 µL zawiesiny komórek HeLa w pożywce wzrostowej (4.5 x 103 komórek/dołek) na mikropłytce 96-dołkowej.</li>
	<li>Inkubować mikropłytkę przez 24 h w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2 .</li>
	<li>Rozcieńczyć LNP obciążone siRNA w DMEM (FBS (-)) do stężeń 10 i 100 nM siRNA.</li>
	<li>Nanieść 75 µL rozcieńczonej zawiesiny LNP obciążonych siRNA do każdego dołka.</li>
	<li>Inkubować mikropłytkę przez 4 h w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2 .</li>
	<li>Usunąć zawiesinę LNP i dodać 75 µL DMEM (FBS (+)).</li>
	<li>Inkubować mikropłytkę przez 20 h w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2 .</li>
	<li>Zmierzyć ekspresję lucyferazy przy użyciu dostępnego komercyjnie zestawu zgodnie z protokołem producenta. 
	UWAGA: Jako kontrolę negatywną zastosowano D-PBS (-).</li>
</ol>

<ol><li>Schoenmaker, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA-lipid+nanoparticle+COVID-19+vaccines%3A+Structure+and+stability%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">mRNA-lipid nanoparticle COVID-19 vaccines: Structure and stability.</a> International Journal of Pharmaceutics. 601, 120586(2021).</li>
<li>Chung, Y. H., Beiss, V., Fiering, S. N., Steinmetz, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COVID-19+Vaccine+frontrunners+and+their+nanotechnology+design%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">COVID-19 Vaccine frontrunners and their nanotechnology design.</a> ACS Nano. 14 (10), 12522-12537 (2020).</li>
<li>Dong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+review+of+SARS-CoV-2+vaccine+candidates%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduction+and+Targeted+Therapy%22%5BJournal%5D)">A systematic review of SARS-CoV-2 vaccine candidates.</a> Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 237(2020).</li>
<li>Cabral, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+sub-100+nm+polymeric+micelles+in+poorly+permeable+tumours+depends+on+size%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Accumulation of sub-100 nm polymeric micelles in poorly permeable tumours depends on size.</a> Nature Nanotechnology. 6 (12), 815-823 (2011).</li>
<li>Sato, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidation+of+the+physicochemical+properties+and+potency+of+siRNA-loaded+small-sized+lipid+nanoparticles+for+siRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Elucidation of the physicochemical properties and potency of siRNA-loaded small-sized lipid nanoparticles for siRNA delivery.</a> Journal of Controlled Release. 229, 48-57 (2016).</li>
<li>Kimura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional%2C+symmetrically+assembled+microfluidic+device+for+lipid+nanoparticle+production%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Advances%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional, symmetrically assembled microfluidic device for lipid nanoparticle production.</a> RSC Advances. 11 (3), 1430-1439 (2021).</li>
<li>Maeki, M., Kimura, N., Sato, Y., Harashima, H., Tokeshi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+microfluidics+for+lipid+nanoparticles+and+extracellular+vesicles+and+applications+in+drug+delivery+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Advances in microfluidics for lipid nanoparticles and extracellular vesicles and applications in drug delivery systems.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 128, 84-100 (2018).</li>
<li>Akinc, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Onpattro+story+and+the+clinical+translation+of+nanomedicines+containing+nucleic+acid-based+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">The Onpattro story and the clinical translation of nanomedicines containing nucleic acid-based drugs.</a> Nature Nanotechnology. 14 (12), 1084-1087 (2019).</li>
<li>Kulkarni, J. A., Witzigmann, D., Chen, S., Cullis, P. R., vander Meel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+nanoparticle+technology+for+clinical+translation+of+siRNA+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Lipid nanoparticle technology for clinical translation of siRNA therapeutics.</a> Accounts of Chemical Research. 52 (9), 2435-2444 (2019).</li>
<li>Maeki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+formation+mechanism+of+lipid+nanoparticles+in+microfluidic+devices+with+chaotic+micromixers%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Understanding the formation mechanism of lipid nanoparticles in microfluidic devices with chaotic micromixers.</a> PLoS One. 12 (11), 0187962(2017).</li>
<li>Maeki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+strategy+for+synthesis+of+lipid+nanoparticles+using+microfluidic+devices+with+a+mixer+structure%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Advances%22%5BJournal%5D)">A strategy for synthesis of lipid nanoparticles using microfluidic devices with a mixer structure.</a> RSC Advances. 5 (57), 46181-46185 (2015).</li>
<li>Belliveau, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+synthesis+of+highly+potent+limit-size+lipid+nanoparticles+for+in+vivo+delivery+of+siRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Microfluidic synthesis of highly potent limit-size lipid nanoparticles for in vivo delivery of siRNA.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 1, 37(2012).</li>
<li>Kimura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+iLiNP+Device%3A+Fine+Tuning+the+Lipid+Nanoparticle+Size+within+10+nm+for+Drug+Delivery%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Omega%22%5BJournal%5D)">Development of the iLiNP Device: Fine Tuning the Lipid Nanoparticle Size within 10 nm for Drug Delivery.</a> ACS Omega. 3 (5), 5044-5051 (2018).</li>
<li>Kimura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+microfluidic-based+post-treatment+process+for+size-controlled+lipid+nanoparticles+and+application+to+siRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Materials+%26+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Development of a microfluidic-based post-treatment process for size-controlled lipid nanoparticles and application to siRNA delivery.</a> ACS Applied Materials & Interfaces. 12 (30), 34011-34020 (2020).</li>
<li>Hashiba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+design+of+experiments+with+multiple+responses+to+determine+optimal+formulations+for+in+vivo+hepatic+mRNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">The use of design of experiments with multiple responses to determine optimal formulations for in vivo hepatic mRNA delivery.</a> Journal of Controlled Release. 327, 467-476 (2020).</li>
<li>Suzuki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+nanoparticles+loaded+with+ribonucleoprotein-oligonucleotide+complexes+synthesized+using+a+microfluidic+device+exhibit+robust+genome+editing+and+hepatitis+B+virus+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Lipid nanoparticles loaded with ribonucleoprotein-oligonucleotide complexes synthesized using a microfluidic device exhibit robust genome editing and hepatitis B virus inhibition.</a> Journal of Controlled Release. 330, 61-71 (2020).</li>
<li>Kimura, N., Maeki, M., Ishida, A., Tani, H., Tokeshi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+production+using+a+microfluidic+device+of+highly+biocompatible+size-controlled+noncationic+exosome-like+nanoparticles+for+RNA+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Bio+Materials%22%5BJournal%5D)">One-step production using a microfluidic device of highly biocompatible size-controlled noncationic exosome-like nanoparticles for RNA delivery.</a> ACS Applied Bio Materials. 4 (2), 1783-1793 (2021).</li>
<li>Deng, T., Wu, H., Brittain, S. T., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prototyping+of+masks%2C+masters%2C+and+stamps%2Fmolds+for+soft+lithography+using+an+office+printer+and+photographic+reduction%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Prototyping of masks, masters, and stamps/molds for soft lithography using an office printer and photographic reduction.</a> Analytical Chemistry. 72 (14), 3176-3180 (2000).</li>
<li>Sato, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pH-sensitive+cationic+lipid+facilitates+the+delivery+of+liposomal+siRNA+and+gene+silencing+activity+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">A pH-sensitive cationic lipid facilitates the delivery of liposomal siRNA and gene silencing activity in vitro and in vivo.</a> Journal of Controlled Release. 163 (3), 267-276 (2012).</li>
<li>Ong, S. G., Chitneni, M., Lee, K. S., Ming, L. C., Yuen, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+extrusion+technique+for+nanosizing+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Evaluation of extrusion technique for nanosizing liposomes.</a> Pharmaceutics. 8 (4), (2016).</li>
<li>Mijajlovic, M., Wright, D., Zivkovic, V., Bi, J. X., Biggs, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+hydrodynamic+focusing+based+synthesis+of+POPC+liposomes+for+model+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+and+Surfaces+B%3A+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Microfluidic hydrodynamic focusing based synthesis of POPC liposomes for model biological systems.</a> Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 104, 276-281 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Rozmiar LNP wpływa na biodystrybucję LNP, działanie przeciwnowotworowe i wyciszanie genów. W związku z tym metoda kontroli wielkości LNP jest istotną techniką wytwarzania nanoleków DDS, w tym systemów dostarczania RNA. Celem pracy jest wprowadzenie urządzenia iLiNP do precyzyjnego dostrajania wielkości LNP i jego zastosowanie do produkcji LNP obciążonych siRNA. Urządzenie iLiNP było w stanie kontrolować rozmiar LNP w zakresie od 20 do 100 nm (rysunek 2)13. Gdy warunki przepływu, takie jak całkowite natężenie przepływu i FRR, zostaną zmienione w celu kontrolowania wielkości LNP, zawiesinę LNP należy zebrać po około 5 do 10 sekundach, aby ustabilizować przepływ roztworu. Zawiesinę LNP pobraną z wylotu urządzenia iLiNP poddano natychmiastowej dializie w stosunku do roztworu buforowego w celu usunięcia etanolu i zapobieżenia agregacji LNP.
Kontrola wielkości LNP jest jednym z głównych wyzwań w dziedzinie DDS. Ogólnie rzecz biorąc, konwencjonalny proces produkcji LNP, taki jak metoda hydratacji filmu lipidowego, wymaga procesu dostrajania rozmiaru po produkcji LNP20. Z drugiej strony, metoda produkcji LNP oparta na mikroprzepływach może wytwarzać LNP o kontrolowanej wielkości poprzez wprowadzenie roztworów lipidowych i wodnych do urządzenia mikroprzepływowego 6,11,13. Chociaż proces dializy jest wymagany do usunięcia etanolu z zawiesiny LNP, ciągły proces za pomocą urządzenia mikroprzepływowego w połączeniu z systemem przepływu stycznego obiecuje automatyzację procesu produkcji LNP14. Zgodnie z literaturą rozmiary POPC LNP wynosiły 50-60 nm i 30-60 nm, dla urządzenia mikroprzepływowegoskupiającego przepływ 21 i urządzenia mieszającego chaotycznie odpowiednio10. W porównaniu z innymi urządzeniami mikroprzepływowymi, urządzenie iLiNP umożliwia kontrolę wielkości POPC LNP w szerokim zakresie od 20 do 100 nm.
Proces wytwarzania zastosowanego urządzenia iLiNP polegał na standardowej miękkiej litografii. Dzięki temu urządzenie iLiNP może być produkowane masowo techniką szybkiego prototypowania i zapobiegać zanieczyszczeniu krzyżowemu roztworów za pomocą urządzenia jednorazowego użytku. Urządzenie iLiNP może wytwarzać LNP obciążone siRNA w taki sam sposób, jak metoda produkcji POPC LNP. W przypadku metody produkcji LNP z wykorzystaniem urządzenia iLiNP użytkownik nie wymaga żadnych skomplikowanych procedur. Z tych powodów oczekuje się, że metoda produkcji LNP oparta na mikroprzepływach, w tym urządzenie iLiNP, będzie stosowana jako standardowa metoda produkcji LNP. Protokół zawarty w tym artykule może być dostosowany do innych urządzeń mikroprzepływowych do produkcji LNP. Ponadto produkcja LNP obciążonych mRNA jest również możliwa dzięki zmianie roztworu siRNA/buforu na roztwór buforowy zawierający mRNA.

Nanocząstka lipidowa (LNP) jest jednym z najczęściej używanych nanonośników w systemach dostarczania RNA. Niedawno LNP załadowane mRNA zostały zatwierdzone jako szczepionki do zapobiegania COVID-191,2,3. Ogólnie rzecz biorąc, rozmiar LNP odgrywa kluczową rolę w wydajności systemów biodystrybucji i dostarczania leków (DDS), w tym wyciszania genów lub ekspresji białek4,5,6. W związku z tym w procesie produkcji LNP wymagana jest precyzyjna metoda kontroli wielkości LNP.
Na przestrzeni lat uwagę przyciągnęły urządzenia mikroprzepływowe do produkcji LNP o kontrolowanej wielkości7. W 2018 r. opracowano pierwsze zatwierdzone przez Agencję ds. Żywności i Leków (FDA) LNP ładowane siRNA (np. Onpattro) przy użyciu urządzenia mikroprzepływowego8,9. W mikroprzepływowej metodzie produkcji LNP roztwór lipidowy i roztwór wodny są wprowadzane oddzielnie do urządzenia mikroprzepływowego, a następnie mieszane w mikrokanaliku. Aby zwiększyć wydajność mieszania, do produkcji LNP użyto mieszalnika chaotycznego10,11,12. Mieszalnik chaotyczny umożliwia produkcję LNP o określonych rozmiarach.
Proste urządzenie mikroprzepływowe, nazwane inwazyjną produkcją nanocząsteczek lipidowych (iLiNP), wyposażone w struktury przegrody, zostało opracowane do precyzyjnego kontrolowania wielkości LNP13,14. W porównaniu z mieszalnikiem chaotycznym, urządzenie iLiNP było w stanie kontrolować wielkość LNP w zakresie od 20 do 100 nm w odstępach 10 nm. Ponadto urządzenie iLiNP wyprodukowało LNP załadowane siRNAs6, LNPs15, LNPs<sup załadowane rybonukleoproteinąsup class="xref">16 oraz LNPs17. Celem artykułu jest przedstawienie procesu wytwarzania i produkcji LNP obciążonego siRNA urządzenia iLiNP oraz opisanie procesu oceny LNP wytwarzanego przez urządzenie iLiNP.

<table><tbody><tr><td>1-palmitoilo-2-oleoilo-sn-glicero-3-fosfocholina (POPC)</td><td>NOF Corp.</td><td>MC-6081</td><td></td></tr><tr><td>Glikol 1,2-dimyrystoilo-rac-glicero-3-metoksypolietylenowy-2000 (DMG-PEG2K)</td><td>NOF Corp.</td><td>GM-020</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dioleoiloksy-3-trimetyloamonowy propan (DOTAP)</td><td>NOF Corp.</td><td>CL-8181TA</td><td></td></tr><tr><td>1,2-distearoilo-sn-glicero-3-fosfocholinew (DSPC)</td><td>NOF Corp.</td><td>MC-8080</td><td></td></tr><tr><td>10 x D-PBS (-)</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp.</td><td>048-29805</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp.</td><td>017-00251</td><td></td></tr><tr><td>Test żywotności komórek CellTiter-Blue</td><td>Promega</td><td>G8081</td><td></td></tr><tr><td>cholesterol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8667-5G</td><td></td></tr><tr><td>Biurkowy system litografii bez maski</td><td>NEOARK CORPORATION</td><td>DDB-701-DL4</td><td></td></tr><tr><td>Membrana dializacyjna</td><td>Repligen</td><td>132697</td><td></td></tr><tr><td>System oznaczania lucyferazy Dual-Glo</td><td>Promega</td><td>E2940</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Lot: 42G6587K</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Nacalai Tesque</td><td>08973-14</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże szklane</td><td>Matsunami Glass Ind., Ltd.</td><td>S1111</td><td></td></tr><tr><td>Szklana strzykawka</td><td>Hamilton</td><td>GASSTIGHT 1002</td><td></td></tr><tr><td>Ogniwo</td><td></td><td></td><td>HeLa: Komórki HeLa-dluc zostały dostarczone przez dr Yusuke Sato z Uniwersytetu Hokkaido,</td></tr><tr><td>HEPES,</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp.</td><td>342-01375</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco o niskiej zawartości glukozy" s zmodyfikowane podłoże Eagle (DMEM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6046-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Tlenowy środek do czyszczenia plazmy</td><td>Femto Science</td><td>CUTE-1MP/R</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina&ndash; streptomycyna, trypsyna (2,5%)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT Odczynnik RNA RiboGreen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R11491</td><td></td></tr><tr><td>siGL4</td><td>Hokkaido System Science Co., Ltd</td><td>Sekwencje nici sensownej i antysensownej siGL4 to odpowiednio 5'-CCGUCGUAUUCGUGAGCAATsT -3' i 5'-UUGCUCACGAACGAACGACGGTsT -3'.</td><td></td></tr><tr><td>Wafel krzemowy</td><td>GTC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SILPOT 184 W/C (PDMS)</td><td>dow Corning Toray Co., Ltd.</td><td></td><td>w zestawie znajduje się baza silikonowa i utwardzacz</td></tr><tr><td>Octan sodu</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp.</td><td>192-01075</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp.</td><td>191-01665</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 3050</td><td>Nippon Kyaku Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Łącznik strzykawkowy</td><td>Instytut Technologii Mikrochemicznej Co., Ltd.</td><td>ISC-011</td><td></td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa</td><td>Chemyx</td><td>CX07200</td><td></td></tr><tr><td>trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooktylo)silan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>448931-10G</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Nacalai Tesque</td><td>35501-15</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure&nbsp; Woda destylowana bez DNaz/RNaz</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>Zetasizer Nano ZS</td><td>&nbsp; Malvern Instruments</td><td>ZEN3600</td><td></td></tr></tbody></table>

produkcja nanocząstek lipidowych obciążonych sirna za pomocą urządzenia mikroprzepływowego

Production of siRNA-Loaded Lipid Nanoparticles using a Microfluidic Device

Rozwój funkcjonalnych nanocząsteczek lipidowych (LNP) jest jednym z głównych wyzwań w dziedzinie systemów dostarczania leków (DDS). Ostatnio systemy dostarczania RNA oparte na LNP, a mianowicie LNP załadowane RNA, przyciągnęły uwagę terapii RNA. W szczególności szczepionki LNP zawierające mRNA zostały zatwierdzone do zapobiegania COVID-19, co doprowadziło do zmiany paradygmatu w kierunku opracowania nanoleków nowej generacji. W przypadku nanoleków opartych na LNP wielkość LNP jest istotnym czynnikiem w kontrolowaniu biodystrybucji LNP i wydajności LNP. Dlatego w procesie produkcji LNP niezbędna jest precyzyjna technika kontroli wielkości LNP. W tym miejscu przedstawiamy protokół produkcji LNP o kontrolowanej wielkości za pomocą urządzenia mikroprzepływowego o nazwie iLiNP. LNP załadowane siRNA są również wytwarzane za pomocą urządzenia iLiNP i oceniane w doświadczeniu in vitro. Przedstawiono reprezentatywne wyniki dla wielkości LNP, w tym LNP obciążone siRNA, potencjał Z, wydajność enkapsulacji siRNA, cytotoksyczność i aktywność wyciszania genu docelowego.

Rycina 2A,B przedstawia rozkład wielkości nanocząstek lipidowych (LNP) POPC wytworzonych przy różnych warunkach przepływu. Metoda przygotowania LNP oparta na mikroprzepływach pozwala kontrolować rozmiar LNP poprzez warunki przepływu, takie jak całkowity przepływ (TFR) oraz stosunek przepływów (FRR). W porównaniu z typowymi urządzeniami mikroprzepływowymi, w tym urządzeniem z mieszalnikiem chaotycznym oraz urządzeniem mikroprzepływowym z ogniskowaniem przepływu, urządzenie iLiNP umożliwiło precyzyjną kontrolę wielkości LNP w zakresie od 20 do 100 nm (Rycina 2). LNP o mniejszych rozmiarach powstawały przy wysokich całkowitych przepływach. Ponadto LNP wytworzone przy FRR wynoszącym 5 były mniejsze niż te przy FRR wynoszącym 3, niezależnie od całkowitego przepływu13.
Nanocząsteczki lipidowe (LNPs) obciążone siRNA przygotowano również przy użyciu urządzenia iLiNP (Rycyna 3A). Do przygotowania LNP obciążonych siRNA wykorzystano kationowy lipid DOTAP, aby skutecznie enkapsulować siRNA wewnątrz LNP. Urządzenie iLiNP wytworzyło kationowe LNP obciążone siRNA o rozmiarze 90 nm i wąskim rozkładzie (Rycyna 3A,B). Wydajność enkapsulacji siRNA wyniosła 95% ze względu na oddziaływanie elektrostatyczne pomiędzy kationowym lipidem a ujemnie naładowanymi cząsteczkami siRNA (Rycyna 3C).
Cytotoksyczność oraz aktywność wyciszania genów LNP obciążonych siRNA o rozmiarze 90 nm oceniono, jak pokazano na Rysunku 4 oraz Rysunku 5. LNP obciążone siRNA nie wykazały cytotoksyczności przy dawkach 10 i 100 nM siRNA. Potwierdzono również, że poziom ekspresji lucyferazy ulegał obniżeniu w zależności od stężenia siRNA. LNP obciążone siRNA zahamowały ekspresję lucyferazy w 80% przy dawce 100 nM siRNA. Wpływ rozmiaru LNP na aktywność wyciszania genów został opisany we wcześniejszych doniesieniach6,13,17.
<img alt="Schemat chipa mikroprzepływowego do otrzymywania zawiesiny LNP poprzez szybkie rozcieńczanie lipidów w etanolu i siRNA w buforze." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62999/62999fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: (A) Schematyczna ilustracja i (B) zdjęcie urządzenia iLiNP. Urządzenie iLiNP składa się z podłoży z PDMS i szkła. Urządzenie iLiNP jest połączone z kapilarami PEEK za pomocą superkleju. Roztwory lipidów oraz siRNA/buforu są wprowadzane oddzielnie do urządzenia iLiNP przy użyciu pomp strzykawkowych. Zawiesina LNP jest zbierana do mikroprobówki. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62999/62999fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Rozkład wielkości LNP, FRR 3 i 5; wykres pokazuje wpływ zmienności TFR na intensywność i wielkość." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62999/62999fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Rozkłady wielkości LNP z POPC otrzymanych za pomocą urządzenia iLiNP przy różnych stosunkach przepływów (FRR). Wielkość LNP z POPC zmierzono metodą dynamicznego rozpraszania światła (DLS). LNP z POPC przygotowano poprzez zmianę całkowitego przepływu i FRR: (A) FRR 3 oraz (B) FRR 5. Małe LNP powstawały w warunkach wysokiego całkowitego przepływu. Ponadto wielkość LNP utworzonych przy FRR 5 była mniejsza niż przy FRR 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62999/62999fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykresy charakterystyki LNP: rozkład wielkości, potencjał zeta i wyniki wydajności enkapsulacji siRNA." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62999/62999fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Charakterystyka LNP obciążonych siRNA. (A) Rozkład wielkości LNP obciążonych siRNA. siRNA (siGL4) są enkapsulowane w LNP poprzez oddziaływanie elektrostatyczne między lipidem kationowym (DOTAP) a ujemnie naładowanymi siRNA. (B) Potencjał zeta LNP obciążonych siRNA. Przed pomiarem zawiesinę LNP rozcieńczono buforem HEPES 10 mM (pH 7.4). Dane przedstawiono jako średnia ± SD (odchylenie standardowe). n = 3. (C) Wydajność enkapsulacji siRNA w LNP opartych na DOTAP. Wydajność enkapsulacji określono za pomocą testu RiboGreen. Dane przedstawiono jako średnia ± SD. n = 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62999/62999fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza żywotności komórek; wykres słupkowy; stężenia siGL4 w stosunku do kontroli; pomiary odpowiedzi komórkowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62999/62999fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Cytotoksyczność LNP obciążonych siRNA. LNP obciążone siRNA rozcieńczono w DMEM (FBS (-)), aby uzyskać stężenia siGL4 wynoszące 10 i 100 nM. Zawiesiny LNP dodano do komórek HeLa-dLuc i inkubowano przez 4 h w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2 . N.T.: Nieleczone (D-PBS(-)). Dane przedstawiono jako średnia ± SD. n = 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62999/62999fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres słupkowy ekspresji lucyferazy; odpowiedź siGL4 na dawkę 10, 100 nM w porównaniu z kontrolą N.T." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62999/62999fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Aktywność wyciszania genu lucyferazy po zastosowaniu LNP obciążonych siRNA. LNP obciążone siRNA przygotowano w ten sam sposób, co w teście żywotności komórek. Poziom ekspresji lucyferazy zmierzono przy użyciu systemu Dual-Glo Luciferase Assay System. N.T.: niepoddane traktowaniu (D-PBS(-)). Dane przedstawiono jako średnia ± SD. n = 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62999/62999fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Metody produkcji nanocząsteczek lipidowych (LNP) oparte na mikroprzepływach przyciągnęły uwagę w systemach dostarczania leków (DDS), w tym w dostarczaniu RNA. Protokół ten opisuje procesy wytwarzania, produkcji LNP (LNP ładowanego siRNA) i oceny LNP przy użyciu naszego oryginalnego urządzenia mikroprzepływowego o nazwie iLiNP.

Produkcja nanocząstek lipidowych obciążonych siRNA za pomocą urządzenia mikroprzepływowego

The development of functional lipid nanoparticles (LNPs) is one of the major challenges in the field of drug delivery systems (DDS). Recently, LNP-based ...

Wielkość nanocząstek lipidów wpływa na biodystrybucję, działanie przeciwnowotworowe i wyciszanie genów. W związku z tym metoda kontroli wielkości LNP jest skuteczną techniką wytwarzania nanoleków, w tym systemów dostarczania RNA. To oryginalne urządzenie mikroprzepływowe, nazwane urządzeniem iLiNP, było w stanie kontrolować rozmiar LNP w zakresie od 20 do 100 nanometrów w odstępach 10 nanometrów.Urządzenie iLiNP może wytwarzać nie tylko LNP załadowane siRNA, ale także wszystkie LNP załadowane mRNA i LNP załadowane rybonukleoproteiną. Na początek weź roztwory etanolu lipidowego i wytwórz LNP naładowane siRNA, mieszając roztwory DOTAP, DSPC, cholesterolu i DMG-PEG2k w stosunku molowym od 50 do 10 do 38,5 do 1,5. Dostosuj całkowite stężenie lipidów do ośmiu milimolów.Następnie pobrać wodne roztwory 154 milimolowego roztworu soli fizjologicznej i 25 milimolowego buforu octanowego o pH 4 i przefiltrować je przez filtry membranowe 0,2 mikrometra lub filtry strzykawkowe. Przygotować roztwór buforowy siRNA, rozpuszczając 70 mikrogramów siGL4 w jednym mililitrze 25-milimolowego buforu octanu. Napełnij jednomililitrowe szklane strzykawki odpowiednio roztworami lipidowymi i wodnymi.Podłączyć szklane strzykawki do kapilary pikowej za pomocą łączników strzykawkowych, następnie ustawić natężenie przepływu roztworów lipidowych i wodnych i wprowadzić roztwory lipidowe i wodne oddzielnie do urządzenia iLiNP za pomocą pomp strzykawkowych. Zebrać zawiesiny LNP w mikroprobówce z wylotu urządzenia iLiNP. Zawiesinę LNP należy dializować za pomocą membrany dializacyjnej o masie cząsteczkowej od 12 do 14 kilodaltonów przy czterech stopniach Celsjusza przez noc w stosunku do soli fizjologicznej lub DPBS odpowiednio dla POPC LNP i LNP obciążonych siRNA.Zebrać dializowane zawiesiny LNP w mikroprobówkach, a następnie odpipetować od 20 do 30 mikrolitrów zawiesiny LNP do mikroogniwa kwarcowego. Na koniec zmierz rozmiar LNP, rozkład wielkości LNP i wskaźnik dyspersyjności poli za pomocą dynamicznego rozpraszania światła. Rozkład wielkości POPC LNP wytwarzany w różnych warunkach przepływu, taki jak całkowite natężenie przepływu i współczynniki natężenia przepływu, jest pokazany tutaj.Za pomocą tego urządzenia iLiNP można kontrolować precyzyjne rozmiary LNP w zakresie od 20 do 100 nanometrów. LNP o małych rozmiarach powstają w warunkach dużego całkowitego natężenia przepływu. Ponadto rozmiary LNP, które są formowane przy FRR 5, są mniejsze niż te z FRR 3, niezależnie od całkowitego natężenia przepływu.Rozkład wielkości LNP załadowanych siRNA jest pokazany tutaj. siRNA są zamykane w LNP przez oddziaływanie elektrostatyczne między kationowym lipidem DOTAP a ujemnie naładowanymi siRNA. Urządzenie iLiNP wyprodukowało kationowe LNP o długości 90 nanometrów i wąskim rozkładzie naładowane siRNA.Skuteczność enkapsulacji siRNA wyniosła 95% ze względu na oddziaływanie elektrostatyczne między lipidem kationowym a ujemnie naładowanymi siRNA. Oceniono cytotoksyczność i aktywność wyciszania genów LNP obciążonych siRNA o długości 19 nanometrów. LNP załadowane siRNA wykazywały cytotoksyczność przy dawce od 10 do 100 nanomolowych siRNA.Poziom ekspresji lucyferazy był zmniejszony w zależności od stężenia siRNA. LNP załadowane siRNA hamowały 80% ekspresję lucyferazy w dawce 100 nanomolowych siRNA. Optymalizacje warunków przepływu są najważniejszymi krokami w protokole w celu uzyskania pożądanych rozmiarów LNP.Metoda produkcji LNP oparta na mikroprzepływach, w tym urządzenie iLiNP, nie wymaga żadnej skomplikowanej procedury i oczekuje się, że będzie stosowana jako standardowa metoda produkcji LNP.

production-sirna-loaded-lipid-nanoparticles-using-microfluidic

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Powtarzające się retro-orbitalne iniekcje kompleksów liposomów kationowych/siRNA/ITSN-1s u myszy, co 72 godziny przez 24 dni, skutecznie dostarczają duplex siRNA do mikrokrążenia płuc myszy, zmniejszając ekspresję mRNA i białka ITSN-1s o 75%. Technika ta jest wysoce powtarzalna w modelu zwierzęcym, nie ma żadnych skutków ubocznych i pozwala uniknąć ofiar śmiertelnych.

Długotrwałe wyciszanie intersectin-1 w płucach myszy poprzez wielokrotne dostarczanie specyficznego siRNA przez kationowe liposomy. Ocena efektów knockdown za pomocą mikroskopii elektronowej

W tym badaniu opisano metodę syntezy ultra-małych populacji biokompatybilnych nanocząstek, a także kilka metod in vitro, za pomocą których można ocenić ich interakcje komórkowe.

Stałe nanocząstki lipidowe (SLN) do zastosowań wewnątrzkomórkowych

Celem tego protokołu jest użycie kationowych/anionowych liposomów z peptydem neurotargetującym jako systemu dostarczania OUN, aby umożliwić siRNA przejście przez BBB.  Optymalizacja systemu dostarczania leków, takich jak siRNA, pozwoliłaby na więcej opcji leczenia prionów i innych chorób neurodegeneracyjnych.

Dostarczanie terapeutycznego siRNA do OUN za pomocą liposomów kationowych i anionowych

Tutaj opisujemy protokół generowania kationowych nanoliposomów, który opiera się na metodzie suchego filmu i może być wykorzystany do bezpiecznego i efektywnego dostarczania transkrybowanego in vitro informacyjnego RNA.

Wytwarzanie kationowych nanoliposomów w celu efektywnego dostarczania transkrybowanego in vitro informacyjnego RNA

Demonstrujemy syntezę fuzogennych porowatych nanocząsteczek krzemu do skutecznego dostarczania oligonukleotydów in vitro i in vivo. Porowate nanocząstki krzemu są ładowane siRNA w celu utworzenia rdzenia, który jest pokryty fuzogenicznymi lipidami poprzez wytłaczanie w celu utworzenia powłoki. Uwzględniono ugrupowanie celowe, funkcjonalizację i charakterystykę cząstek.

Synteza, funkcjonalizacja i charakterystyka fuzogennych porowatych nanocząstek krzemu do dostarczania oligonukleotydów

Przedstawiono metody przygotowania i scharakteryzowania właściwości fizykochemicznych i bioaktywności neutralnie naładowanych, reagujących na pH nanocząstek siRNA. Omówiono kryteria skutecznego stosowania nanoleków siRNA, takie jak rozmiar, morfologia, ładunek powierzchniowy, obciążenie siRNA i wyciszanie genów.

Przygotowanie neutralnie naładowanych, reagujących na pH nanocząstek polimerowych do dostarczania cytozolowego siRNA

Protokół przedstawia zoptymalizowane parametry przygotowania termoczułych liposomów za pomocą urządzenia mikrofluidycznego do mikromiksera w jodełkę. Umożliwia to również kokapsułkowanie doksorubicyny i zieleni indocyjaninowej do liposomów oraz fototermiczne uwalnianie doksorubicyny w celu kontrolowanego/wyzwalanego uwalniania leku.

Mikroprzepływowa produkcja liposomów wrażliwych na temperaturę zawierających lizolipidy

Nanocząsteczki lipidowe są opracowywane przy użyciu mikroprzepływowej platformy mieszania do enkapsulacji mRNA i DNA.

Formułowanie i charakteryzowanie nanocząstek lipidowych do dostarczania genów przy użyciu platformy mieszania mikroprzepływowego

Tutaj przedstawiono protokół tworzenia nanocząsteczek lipidowych (LNP), które zawierają mRNA kodujące lucyferazy świetlika. Te LNP zostały przetestowane pod kątem ich siły działania in vitro w komórkach HepG2 i in vivo u myszy C57BL / 6.

Testowanie skuteczności in vitro i in vivo nanocząstek mRNA-lipidów powstałych metodą mieszania mikroprzepływowego

Szczegółowy protokół syntezy nanocząsteczek lipidowych (LNP) przy użyciu technologii mieszalnika CIJ (Limited Impinging Jet), w tym dwustrumieniowego CIJ i czterostrumieniowego mieszalnika wirowego z wieloma wlotami (μMIVM), jest zademonstrowany. Mieszalniki CIJ generują powtarzalne, turbulentne środowiska mikromieszania, co skutkuje produkcją monodyspersyjnych LNP.

Synteza nanocząstek lipidowych przez przepływ turbulentny w ograniczonych mieszalnikach strumieniowych z uderzeniem

Poznaj metodę produkcji nanocząstek lipidowych obciążonych siRNA za pomocą urządzenia mikroprzepływowego iLiNP. Technika umożliwia precyzyjną kontrolę wielkości od 20 do 100 nm, co jest kluczowe dla efektywności dostarczania leków.

Produkcja nanocząstek lipidowych obciążonych siRNA za pomocą urządzenia mikroprzepływowego

Przeglądaj więcej filmów