Produkcja nanocząstek lipidowych obciążonych siRNA za pomocą urządzenia mikroprzepływowego
22 marca 2022
Metody produkcji nanocząsteczek lipidowych (LNP) oparte na mikroprzepływach przyciągnęły uwagę w systemach dostarczania leków (DDS), w tym w dostarczaniu RNA. Protokół ten opisuje procesy wytwarzania, produkcji LNP (LNP ładowanego siRNA) i oceny LNP przy użyciu naszego oryginalnego urządzenia mikroprzepływowego o nazwie iLiNP.
Wielkość nanocząstek lipidów wpływa na biodystrybucję, działanie przeciwnowotworowe i wyciszanie genów. W związku z tym metoda kontroli wielkości LNP jest skuteczną techniką wytwarzania nanoleków, w tym systemów dostarczania RNA. To oryginalne urządzenie mikroprzepływowe, nazwane urządzeniem iLiNP, było w stanie kontrolować rozmiar LNP w zakresie od 20 do 100 nanometrów w odstępach 10 nanometrów.
Urządzenie iLiNP może wytwarzać nie tylko LNP załadowane siRNA, ale także wszystkie LNP załadowane mRNA i LNP załadowane rybonukleoproteiną. Na początek weź roztwory etanolu lipidowego i wytwórz LNP naładowane siRNA, mieszając roztwory DOTAP, DSPC, cholesterolu i DMG-PEG2k w stosunku molowym od 50 do 10 do 38,5 do 1,5. Dostosuj całkowite stężenie lipidów do ośmiu milimolów.
Następnie pobrać wodne roztwory 154 milimolowego roztworu soli fizjologicznej i 25 milimolowego buforu octanowego o pH 4 i przefiltrować je przez filtry membranowe 0,2 mikrometra lub filtry strzykawkowe. Przygotować roztwór buforowy siRNA, rozpuszczając 70 mikrogramów siGL4 w jednym mililitrze 25-milimolowego buforu octanu. Napełnij jednomililitrowe szklane strzykawki odpowiednio roztworami lipidowymi i wodnymi.
Podłączyć szklane strzykawki do kapilary pikowej za pomocą łączników strzykawkowych, następnie ustawić natężenie przepływu roztworów lipidowych i wodnych i wprowadzić roztwory lipidowe i wodne oddzielnie do urządzenia iLiNP za pomocą pomp strzykawkowych. Zebrać zawiesiny LNP w mikroprobówce z wylotu urządzenia iLiNP. Zawiesinę LNP należy dializować za pomocą membrany dializacyjnej o masie cząsteczkowej od 12 do 14 kilodaltonów przy czterech stopniach Celsjusza przez noc w stosunku do soli fizjologicznej lub DPBS odpowiednio dla POPC LNP i LNP obciążonych siRNA.
Zebrać dializowane zawiesiny LNP w mikroprobówkach, a następnie odpipetować od 20 do 30 mikrolitrów zawiesiny LNP do mikroogniwa kwarcowego. Na koniec zmierz rozmiar LNP, rozkład wielkości LNP i wskaźnik dyspersyjności poli za pomocą dynamicznego rozpraszania światła. Rozkład wielkości POPC LNP wytwarzany w różnych warunkach przepływu, taki jak całkowite natężenie przepływu i współczynniki natężenia przepływu, jest pokazany tutaj.
Za pomocą tego urządzenia iLiNP można kontrolować precyzyjne rozmiary LNP w zakresie od 20 do 100 nanometrów. LNP o małych rozmiarach powstają w warunkach dużego całkowitego natężenia przepływu. Ponadto rozmiary LNP, które są formowane przy FRR 5, są mniejsze niż te z FRR 3, niezależnie od całkowitego natężenia przepływu.
Rozkład wielkości LNP załadowanych siRNA jest pokazany tutaj. siRNA są zamykane w LNP przez oddziaływanie elektrostatyczne między kationowym lipidem DOTAP a ujemnie naładowanymi siRNA. Urządzenie iLiNP wyprodukowało kationowe LNP o długości 90 nanometrów i wąskim rozkładzie naładowane siRNA.
Skuteczność enkapsulacji siRNA wyniosła 95% ze względu na oddziaływanie elektrostatyczne między lipidem kationowym a ujemnie naładowanymi siRNA. Oceniono cytotoksyczność i aktywność wyciszania genów LNP obciążonych siRNA o długości 19 nanometrów. LNP załadowane siRNA wykazywały cytotoksyczność przy dawce od 10 do 100 nanomolowych siRNA.
Poziom ekspresji lucyferazy był zmniejszony w zależności od stężenia siRNA. LNP załadowane siRNA hamowały 80% ekspresję lucyferazy w dawce 100 nanomolowych siRNA. Optymalizacje warunków przepływu są najważniejszymi krokami w protokole w celu uzyskania pożądanych rozmiarów LNP.
Metoda produkcji LNP oparta na mikroprzepływach, w tym urządzenie iLiNP, nie wymaga żadnej skomplikowanej procedury i oczekuje się, że będzie stosowana jako standardowa metoda produkcji LNP.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół produkcji nanocząsteczek lipidowych (LNP) obciążonych siRNA z wykorzystaniem urządzenia mikroprzepływowego o nazwie iLiNP. Metoda ta pozwala na precyzyjną kontrolę rozmiaru LNP, co ma kluczowe znaczenie dla efektywnych systemów dostarczania leków.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Systemy dostarczania leków
- Nanocząstki lipidowe
- Mikrofluidyka
Wstęp
- Rozmiar nanocząsteczek lipidowych wpływa na biodystrybucję i skuteczność terapeutyczną.
- Kontrola rozmiaru LNP jest niezbędna do optymalizacji dostarczania RNA.
- Urządzenie iLiNP umożliwia kontrolę rozmiaru w zakresie od 20 do 100 nanometrów.
- Oddziaływania elektrostatyczne ułatwiają enkapsulację siRNA w LNP.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnej metody produkcji LNP obciążonych siRNA.
- Ocena wpływu rozmiaru LNP na wydajność wyciszania genów.
- Optymalizacja warunków przepływu w celu uzyskania pożądanych właściwości LNP.
Zastosowane metody
- Przygotowanie roztworów lipidowych i wodnych do produkcji LNP.
- Użycie urządzenia iLiNP do mieszania i formowania LNP.
- Dializa zawiesin LNP w celu usunięcia nadmiaru materiałów.
- Dynamiczne rozpraszanie światła w celu pomiaru rozmiaru i rozkładu LNP.
Główne wyniki
- Urządzenie iLiNP pozwoliło na wytworzenie LNP obciążonych siRNA o rozmiarze 90 nanometrów i wydajności enkapsulacji wynoszącej 95%.
- Małe LNP formowały się w warunkach wysokiego całkowitego natężenia przepływu.
- LNP obciążone siRNA wykazały cytotoksyczność oraz skuteczne wyciszanie genów.
- Zoptymalizowane warunki przepływu były kluczowe dla uzyskania pożądanych rozmiarów LNP.
Wnioski
- Metoda mikroprzepływowa z wykorzystaniem urządzenia iLiNP upraszcza produkcję LNP.
- Oczekuje się, że podejście to znormalizuje produkcję LNP w badaniach naukowych.
- Dalsze badania mogą zgłębić zastosowanie tej metody w różnych systemach dostarczania RNA.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Precyzyjna kontrola rozmiaru nanocząsteczek lipidowych (LNP) jest kluczowa dla optymalizacji biodystrybucji, skuteczności terapeutycznej oraz wydajności wyciszania genów w systemach dostarczania leków opartych na RNA. Mikroprzepływowe urządzenie iLiNP umożliwia powtarzalną produkcję LNP o regulowanym rozmiarze od 20 do 100 nanometrów, wspierając wczesne etapy weryfikacji celów terapeutycznych oraz procesy identyfikacji wiodących cząsteczek. Możliwość ta zwiększa wiarygodność prognostyczną w modelach przedklinicznych poprzez redukcję zmienności w działaniu nanocząsteczek, co stanowi kluczowy czynnik w ograniczaniu ryzyka podczas rozwoju translacyjnego.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie biologicznej aktywności zależnej od rozmiaru w przypadku LNP obciążonych siRNA w badaniach walidacji celu.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzowane formulacje LNP w celu zredukowania szumu w przesiewach fenotypowych oraz badaniach służących ograniczaniu ryzyka mechanistycznego.
Przesiewy i opracowanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na otrzymywanie monodyspersyjnych LNP-siRNA o określonym rozmiarze i 95% wydajności enkapsulacji, co umożliwia wiarygodną ocenę związków.
- Wartość operacyjna: Wspiera standaryzację testów poprzez powtarzalną kontrolę rozmiaru LNP dzięki regulacji szybkości przepływu w urządzeniu iLiNP.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Umożliwia korelację rozmiaru LNP z efektywnością wyciszania genów oraz cytotoksycznością w systemach istotnych dla przebiegu choroby.
- Wartość operacyjna: Umożliwia skalowalną produkcję LNP obciążonych mRNA, siRNA oraz rybonukleoproteinami na potrzeby ciągłości badań przedklinicznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Mikrofluidyczna metoda iLiNP wpisuje się w proces badawczy, obejmujący etapy od wczesnej walidacji celu, poprzez identyfikację związku wiodącego, aż po rozwój przedkliniczny, co jest szczególnie istotne w przypadku terapeutyków opartych na RNA, gdzie zależność dostarczania od rozmiaru wpływa na skuteczność.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez umożliwienie systematycznej zmiany wielkości LNP w celu oceny wpływu na wchłanianie komórkowe i oddziaływanie z celem.
- Przesiewanie: Dostarcza sformułowania LNP gotowe do analizy, charakteryzujące się spójnym rozkładem wielkości i wysoką enkapsulacją siRNA, co pozwala na powtarzalne przesiewanie związków.
- Analityka: Dostarcza ilościowe dane dotyczące wielkości, polidyspersyjności i potencjału zeta za pomocą dynamicznego rozpraszania światła, co pozwala na podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań.
- Badania translacyjne: Łączy optymalizację LNP w fazie odkrywczej z oceną przedkliniczną poprzez zastosowanie standaryzowanych nanoleków o kontrolowanej wielkości.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku platformę do produkcji różnych LNP obciążonych RNA (siRNA, mRNA, RNP) w ramach wielu projektów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność co do celu poprzez powiązanie właściwości fizykochemicznych LNP z wynikami funkcjonalnymi, takimi jak wyciszanie genów.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i skalowalność produkcji LNP dzięki precyzji mikroprzepływowej.
- Wartość strategiczna: Zmniejsza ryzyko biologiczne na późnych etapach poprzez umożliwienie wczesnej oceny i redukcji ryzyka dotyczącego wydajności nośnika dostarczającego.
- Wpływ na portfolio: Pozwala na ustalenie priorytetów dla kandydatów na terapeutyki RNA w oparciu o efektywność dostarczania, z uwzględnieniem dostosowania do ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie formulowania lipidów, obsługi mikroprzepływowej oraz wprowadzania kwasów nukleotowych.
- Zależny od pomp strzykawkowych, strzykawek szklanych oraz infrastruktury dializacyjnej do oczyszczania LNP.
- Konieczna jest standaryzacja stosunków przepływów i całkowitych warunków przepływu pomiędzy zespołami.
- Wymaga dostosowania parametrów przy zmianie składu lipidów lub rodzaju ładunku RNA.
- Ograniczony koniecznością przeprowadzenia dializy po produkcji oraz kontroli jakości za pomocą dynamicznego rozpraszania światła.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:54
Preparation of Lipid Solutions and the siRNA/ Buffer Solution
1:58
Set-Up of the iLiNP Device and Production of LNPs
2:35
Dialysis of the LNP Suspension and LNP Size Measurement
3:24
Results: POPC LNP Size Distributions Produced by the iLiNP Device at Different Flow Rate Ratios and Characterization and Cytotoxicity of siRNA-Loaded LNPs
5:22
Conclusion
