Respirometria o wysokiej rozdzielczości do oceny bioenergetyki w komórkach i tkankach za pomocą respirometrów komorowych i płytkowych

Mitochondria dostarczają energię komórkową poprzez fosforylację oksydacyjną, przyczyniając się do prawie wszystkich procesów zachodzących w komórce. W związku z tym dysfunkcje mitochondriów są związane z szerokim spektrum chorób. Główną zaletą tej techniki jest pomiar bioenergetyki mitochondriów w czasie rzeczywistym poprzez zużycie tlenu, a co za tym idzie, dokładna ocena całkowitego metabolizmu energii komórkowej.

Respirometria o wysokiej rozdzielczości pozwala na bezpośrednią ocenę tego, co w systemie fosforylacji oksydacyjnej zawodzi, potencjalnie dostarczając wskazówek diagnostycznych w pierwotnych chorobach mitochondrialnych i wtórnych dysfunkcjach mitochondriów związanych z wieloma zaburzeniami. Procedurę zademonstruje Ryan Awadhpersad, doktorant w moim laboratorium. Aby rozpocząć, wykonaj kalibrację tlenu, uruchamiając respirometry w 2,1 mililitra mitochondrialnego podłoża oddechowego w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez ponad 45 minut i kontynuuj, jeśli odchylenie od wartości wyjściowej mieści się w granicach czterech pikoboli na sekundę.

Hodowla komórek HEK293 w DMEM o wysokiej zawartości glukozy uzupełnionej 10% aktywowanym termicznie FBS, GlutaMAX, aminokwasami endogennymi, pirogronianem sodu i urydyną w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. W dniu eksperymentu zbierz i policz komórki, a następnie ponownie zawieś 2,5 miliona komórek w 2,5 mililitrowym pożywce oddechowej. Aby ocenić rutynowe oddychanie, dodaj do komory 2,3 mililitra zawiesiny komórek ciepłego podłoża do oddychania.

Uruchom komory w temperaturze 37 stopni Celsjusza i prędkości mieszania 700 obr./min. Odczekaj co najmniej trzy minuty, aby media mogły się odgazować, a następnie zamknij komory, przekręcając korek ruchem obrotowym. Następnie zassać nadmiar płynu na wierzchu korka.

Po 10 minutach uzyskaj stabilny sygnał strumienia tlenu, aby zarejestrować rutynowe lub stan I oddychania. Aby przeprowadzić analizę OXPHOS w nienaruszonych komórkach, dodaj dwa mikrolitry 0,01-milimolowej oligomycyny, aby uzyskać końcowe stężenie 10-nanomolowe. Miareczkować FCCP z dwumilimolowego materiału wyjściowego, dodając 0,6 mikrolitra w krokach co 0,2 mikrolitra, aż nie zaobserwuje się wzrostu oddychania i oddychanie zostanie maksymalnie rozłączone.

Następnie dodaj jeden mikrolitr jednomilimolowego rotenonu, aby uzyskać końcowe stężenie 0,5-mikromolowego. Następnie dodaj dwa mikrolitry po jednym miligramie na mililitr antymycyny, aby uzyskać końcowe stężenie jednego mikrograma na mililitr. Ponownie natlenić komorę do tego samego poziomu tlenu, około 150 mikromolowych, podnosząc tłok.

Następnie dodaj pięć mikrolitrów 0,8-molowego askorbinianu, aby uzyskać końcowe stężenie dwumilimolowe. Następnie natychmiast dodaj pięć mikrolitrów 0,2-molowego TMPD, aby uzyskać końcowe stężenie 0,5-milimolowe i oceń aktywność kompleksu dożylnego. Gdy szczytowy strumień tlenu zostanie osiągnięty za pomocą TMPD, dodaj pięć mikrolitrów lub czteromolowy azydek, aby uzyskać końcowe stężenie 10 milimolów.

Następnie kontynuuj bieg przez co najmniej pięć minut, aby oznaczyć autoutlenianie TMPD w celu obliczenia złożonego dożylnego poziomu zasadowego. Po przebiegu należy pobrać jeden mililitr zawiesiny próbki z każdej komory i odwirować przy 1 000 G dla komórek przepuszczalnych lub przy 20 000 G dla lizatu tkankowego. Następnie wyrzuć supernatant i zamroź osad w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do dalszej analizy.

Najpierw zasiej komórki zgodnie z tempem wzrostu poszczególnych linii komórkowych. Rozcieńczyć oligomycynę, FCCP, rotenon i antymycynę w trzech mikrolitrach pożywki testowej do końcowego stężenia odpowiednio 1,5 mikromola, 1,125 mikromola i jednego mikromola. Następnie napełnij je osobnymi portami.

Przestrzegać otworów iniekcyjnych, aby zapewnić równomierne ładowanie próbek. Włącz system oparty na mikropłytce i komputer i równoważ je w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez co najmniej trzy godziny. W dniu testu opartego na mikropłytkach należy sprawdzić zbieżność płytki hodowli komórkowej, morfologię komórek i upewnić się, że studzienki tła są puste.

Następnie usuń wszystko z wyjątkiem 20 mikrolitrów pożywki hodowlanej z każdej studzienki. Następnie umyj każdą studzienkę 90 mikrolitrami pożywki testowej i dodaj 100 mikrolitrów pożywki testowej, aby uzyskać końcową objętość do 120 mikrolitrów. Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze bez dwutlenku węgla przez 60 minut.

Po wyjęciu płytki z inkubatora zdejmij pokrywę i umieść mikropłytkę w szczelinie. Kliknij Kontynuuj, aby rozpocząć bieg. Po zakończeniu serii wyjmij płytkę i usuń pozostałą pożywkę testową, nie naruszając komórek.

Następnie zamroź całą płytkę w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Po przeprowadzeniu eksperymentów z przepuszczalnością i oddychaniem digitoniny zarejestrowano ślady zużycia surowego tlenu w komórkach HEK293 typu dzikiego i komórkach HEK293 z nokautem genu za pośrednictwem CRISPR, co spowodowało liczne niedobory OXPHOS. Uzyskano nałożone na siebie ślady zużycia tlenu znormalizowane na wejściu komórki.

Nokaut CRISPR 1 pokazuje upośledzone oddychanie, a nokaut CRISPR 2 nie wykazuje oddychania w porównaniu z typem dzikim po znormalizowaniu do liczby komórek. Ilości białka określono ilościowo, a wartości oddychania znormalizowano do ilości białka w celu określenia wartości bezwzględnych stanów oddechowych i odpowiednich współczynników kontroli strumienia. Stwierdzono, że wskaźniki zakwaszenia zewnątrzkomórkowego wzrosły w przypadku niedoboru OXPHOS w nokaucie CRISPR 2, co sugeruje kompensację niedoboru fosforylacji oksydacyjnej mitochondriów w komórkach HEK293 poprzez zwiększoną glikolizę.

Ponadto oznaczono wartości oddychania w obecności oligomycyny, FCCP i rotenonu, a uzyskane wartości znormalizowano do ilości białka. Badano znormalizowane białko ślady zużycia tlenu w komórkach HEK293 typu dzikiego i komórkach HEK293 z niedoborem translacji mitochondrialnej za pośrednictwem CRISPR, powodującym wielokrotny niedobór OXPHOS. Uzyskano znormalizowane tkankowo ślady zużycia tlenu w móżdżku myszy i mięśniu płaszczkowatym myszy.

Mięśnie płaszczkowate wykazują trzykrotnie wyższy OXPHOS i wydolność oddechową niż móżdżek. W przypadku respirometrii komorowej ważne jest, aby pracować szybko, ponieważ funkcja mitochondriów pogorszy się w momencie pobrania próbek, a w przypadku respirometrii opartej na płytkach kluczowe znaczenie ma uzyskanie optymalnej gęstości wysiewu, aby zminimalizować zmienność. W celu dalszej analizy możliwa jest kwantyfikacja białka lub immunoblotting.

To może określić, czy zmiana w mitochondrialnej funkcji oddechowej była spowodowana obfitością kompleksów OXPHOS, czy ilością mitochondriów. Już sto lat temu odkryto, że komórki rakowe wykonują glikolizę beztlenową oprócz mitochondrialnego OXPHOS. Podkreśla to potrzebę przeprowadzenia badań bioenergetyki mitochondrialnej.

Tutaj zademonstrowaliśmy dwa respirometry uważane za dzisiejszy złoty standard.