Name: Respirometria o wysokiej rozdzielczości do oceny bioenergetyki w komórkach i tkankach za pomocą respirometrów komorowych i płytkowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Poznaj respirometrię o wysokiej rozdzielczości do oceny bioenergetyki mitochondrialnej w komórkach HEK293 i tkankach. Ta metoda umożliwia pomiar zużycia tlenu w czasie rzeczywistym i diagnostykę chorób mitochondrialnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez fundusze z Akademii Fińskiej (C.B.J), Fundacji Magnusa Ehrnroota (C.B.J) oraz stypendium doktoranckie Integrated Life Sciences Graduate School (R.A.).

Brak konfliktu interesów do ujawnienia.

Tradycyjnie, bioenergetyka mitochondriów była badana za pomocą elektrod tlenowych typu Clark. Brak rozdzielczości i przepustowości gwarantował jednak postęp technologiczny. Do tej pory O2k (określany jako cHRR) i analizator strumienia Seahorse XF96 (określany jako mHRR) były szeroko stosowane w dziedzinie bioenergetyki komórkowej. W tym miejscu przedstawiamy zrozumiały zbiór protokołów analizy metabolizmu energii komórkowej poprzez ocenę oddychania mitochondrialnego za pomocą cHRR lub mHRR, omawiamy kluczowe zalety każde...

Mitochondria pełnią kluczową rolę w dostarczaniu energii i są organellami przedziałowymi uczestniczącymi w niezbędnych komórkowych procesach bioenergetycznych i metabolicznych, takich jak anabolizm nukleotydów, lipidów i aminokwasów oraz biogeneza klastrów żelazo-siarka, a także biorą udział w sygnalizacji, m.in. w kontrolowanej śmierci komórki1,2,3. Bioenergetyka mitochondrialna oparta na fosforylacji oksydacyjnej zasila niemal wszystkie procesy wewnątrzkomórkowe, w związku z czym dysfunkcje mitochondriów pochodzenia pierwotnego lub wtórnego są powiązane z szerokim spektrum stanów chorobowych4,5. Dysfunkcja mitochondrialna obejmuje nie tylko zmiany w strukturze lub gęstości mitochondriów, ale także w jakości i regulacji układu oddechowego6. Ten element jakościowy obejmuje kontrolę substratową, charakterystykę sprzęgania, modyfikacje potranslacyjne, dynamikę grzebieni oraz superkompleksy oddechowe7,8. Dlatego też dokładna analiza bioenergetyki mitochondrialnej w podejściach eksperymentalnych i diagnostycznych do oceny metabolizmu energetycznego komórki jest istotna zarówno w stanach zdrowia, jak i choroby.
Mitochondrialna fosforylacja oksydacyjna (OXPHOS) to sekwencja reakcji w obrębie łańcucha oddechowego lub systemu transportu elektronów (ETS), służąca do generowania energii komórkowej w postaci trifosforanu adenozyny (ATP)9. Wieloenzymatyczny etap pozyskiwania energii z przepływu elektronów przez kompleksy I i II do kompleksu IV generuje elektrochemiczny gradient protonowy przez wewnętrzną błonę mitochondrialną, który jest następnie wykorzystywany do fosforylacji difosforanu adenozyny (ADP) do ATP za pośrednictwem kompleksu V (syntazy ATP F1FO) (Rysunek 1A).
Po pierwsze, podczas cyklu kwasu cytrynowego (TCA), glikolizy i utleniania pirogronianu generowane są dwa przenośniki elektronów: nikotynamidoadeninowy dinukleotyd (NADH) oraz dihydroflawinoadeninowy dinukleotyd (FADH2). NADH jest utleniany w kompleksie I (dehydrogenaza NADH), podczas czego dwa elektrony są przekazywane do koenzymu Q (chinon zostaje zredukowany do chinolu), a protony są pompowane do przestrzeni międzybłonowej (IMS). Po drugie, kompleks II (dehydrogenaza bursztynianu) utlenia FADH2 i przekazuje elektrony do koenzymu Q bez pompowania protonów. Po trzecie, w kompleksie III (cytochrom c reduktaza), elektrony z koenzymu Q są przenoszone na cytochrom c, podczas gdy protony są pompowane do IMS. Po czwarte, cytochrom c przenosi elektrony do kompleksu IV (oksydaza cytochromu c), który jest ostatnim kompleksem pompującym protony i w którym tlen pełni funkcję akceptora elektronów w celu asymilacji protonów, co ostatecznie prowadzi do powstania wody. To właśnie ten tlen jest zużywany przez mitochondria, co można zmierzyć za pomocą oksygrafu. Na koniec, protony generowane przez kompleks I, kompleks III i kompleks IV są wykorzystywane do napędzania rotacji kompleksu V, co prowadzi do syntezy ATP9.
Co istotne, transport elektronów nie odbywa się wyłącznie w sposób liniowy, określany mianem łańcucha transportu elektronów. Zamiast tego elektrony mogą być przekazywane do puli koenzymu Q poprzez wiele szlaków oddechowych, co umożliwia zbieżny przepływ elektronów. Na przykład substraty NADH oraz bursztynian mogą wchodzić w proces odpowiednio poprzez kompleks I i kompleks II. Elektrony pochodzące z utleniania kwasów tłuszczowych mogą być przekazywane za pośrednictwem kompleksu białka przenoszącego elektrony (etf). W rzeczywistości kompleksowa analiza OXPHOS wymaga holistycznego podejścia z zastosowaniem odpowiednich substratów energetycznych (Rysunek 1A).
<img alt="Schemat mitochondrialnego OXPHOS z wykresami zużycia tlenu w eksperymentach komórkowych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63000/63000fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Mitochondrialna fosforylacja oksydacyjna oraz specyficzne protokoły dla substratów i inhibitorów. (A) Mitochondrium i schemat systemu transportu elektronów (CI-CIV) oraz mitochondrialnej syntazy ATP F1F0 (CV). Wszystkie struktury pochodzą z PDB. Na rysunkach przedstawiono wyłącznie substraty i inhibitory opisane w niniejszym badaniu). (B) Przykładowy zapis przepływu tlenu w nienaruszonych komórkach HEK293 z zastosowaniem standardowego protokołu w urządzeniu mHRR. (C) Przykładowy zapis przepływu tlenu w nienaruszonych komórkach HEK293 z zastosowaniem standardowego protokołu w urządzeniu cHRR. (D) Przykładowy zapis przepływu tlenu w permeabilizowanych fibroblastach ludzkich od zdrowego dawcy z odpowiednim protokołem SUIT. Skróty: 1 = respiracja rutynowa nienaruszonych komórek; 2 = stan 2; 3 = stan 3(I); 4 = stan 3(I) z cytC; 5 = stan 3 (I+II); 6 = przeciek(OM); 7 = wydajność ETS; 8 = S(ROT); 9 = ROX; 10 = TMPD; 11 = Az. ROT = rotenon, AM = antymycyna, ATP = trifosforan adenozyny, Az = azydek, OM = oligomycyna, FCCP = karbonylocyjanid p-trifluorometoksyfenylohydrazon; Asc = askorbinian, TMPD = N,N,N′,N′-tetrametylop-fenylendiamina, Succ = bursztynian, M = jabłczan, P = pirogronian, ADP = difosforan adenozyny, NAD = nikotynamidoadeninowy dinukleotyd, IMS = przestrzeń międzybłonastowa, FAD = flawinoadeninowy dinukleotyd. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63000/63000fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Analiza wydajności mitochondrialnego OXPHOS za pomocą HRR stała się kluczową metodą biochemiczną o wartości diagnostycznej nie tylko w przypadku pierwotnych wad mitochondrialnych10,11, ale także w innych obszarach biologii, takich jak nowotwory i procesy starzenia12. HRR umożliwia oznaczenie oddychania komórkowego poprzez analizę wydajności mitochondrialnego OXPHOS, co bezpośrednio odzwierciedla niedobory poszczególnych lub połączonych kompleksów oddechowych mitochondriów, a pośrednio wiąże się z dysfunkcją komórkową i zaburzeniami metabolizmu energetycznego9. Metodologicznie pomiary oddychania przeprowadza się z wykorzystaniem komórek, tkanek lub izolowanych mitochondriów11,13,14, podczas gdy materiał zamrożony jest tylko częściowo odpowiedni15,16. Wykazano, że tkanka zamrożona posiada nienaruszony ETS z zachowaną stabilnością superkompleksów15. W związku z tym, w przeciwieństwie do tradycyjnych produktów pośrednich TCA, odpowiednie substraty są dostarczane bezpośrednio do ETS. Jednakże sprzężenie między ETS a syntezą ATP zostaje utracone, ponieważ integralność błony zostaje naruszona w wyniku uszkodzeń mroźniczych (tworzenia się kryształków lodu).
Doświadczenia dotyczące oddychania zazwyczaj przeprowadzane są w temperaturze fizjologicznej 37 °C dla organizmów endotermicznych, z wykorzystaniem komórek lub tkanek niepermeabilizowanych lub permeabilizowanych. Podczas gdy pierwsze uwzględniają metaboliczny kontekst cytozolowy, drugie pozwalają na określenie wkładu energetycznego poszczególnych kompleksów OXPHOS orazt ATPase poprzez dodawanie specyficznych substratów (i inhibitorów). Sekwencja i zmienność substratów oraz inhibitorów doprowadziły do opracowania szerokiego wachlarza protokołów SUIT17 i testów18 służących do odpowiedzi na różne pytania naukowe dotyczące funkcji OXPHOS (przegląd w12). Podstawowy protokół oddychania komórkowego ocenia cztery różne stany: i) oddychanie rutynowe – oddychanie w odpowiednim medium oddechowym bez dodatku substratów lub inhibitorów, z wykorzystaniem wyłącznie substratów endogennych. Stan ten może ujawnić ogólne defekty OXPHOS lub wtórnie indukowane defekty oddychania spowodowane na przykład zmienionymi profilami metabolitów. Następnie dodanie oligomycyny, inhibitora ATPase, pozwala określić przepuszczalność wewnętrznej błony mitochondrialnej dla protonów, co definiuje się jako ii) oddychanie przeciekowe (leak respiration). Kolejna miareczkowanie protonofora, takiego jak odsprzęgacz karbonylowy cyjanek p-trifluorometoksyfenylohydrazona (FCCP), pozwala wyznaczyć stan, w którym pojemność ETS jest maksymalna w trybie otwartego obwodu protonowego przez błonę, definiowany jako iii) oddychanie odsprzęgane. Co ważne, stan odsprzęgany może również wystąpić w wyniku interwencji eksperymentalnych poprzez nadmierne uszkodzenia mechaniczne błon mitochondrialnych. Z kolei stan niesprzęgany odnosi się do odsprzęgania oddechowego przez mechanizm wewnętrzny, który jest kontrolowany fizjologicznie. Na koniec, całkowite zahamowanie ETS poprzez dodanie antymycyny (inhibitora kompleksu III) oraz rotenonu (inhibitora kompleksu I) pozwala wyznaczyć pozostałe zużycie tlenu (ROX) pochodzące z niemitochondrialnych procesów zużywających tlen (Rysunek 1A-C).
Bioenergetyka mitochondrialna składa się z pięciu odrębnych stanów oddychania19,20. Oddychanie w stanie 1 odbywa się bez dodatkowych substratów lub ADP, poza tymi, które są dostępne endogennie. Po dodaniu ADP, ale wciąż bez substratów, osiągane jest oddychanie w stanie 2. Po dodaniu substratów, umożliwiających transfer elektronów i syntezę ATP, następuje oddychanie w stanie 3. W tym stanie można zdefiniować wydajność OXPHOS przy nasycających stężeniach ADP, fosforanu nieorganicznego, tlenu oraz substratów związanych z NADH i bursztynianem. Oddychanie w stanie 4 lub oddychanie LEAK można zdefiniować jako stan bez ADP lub z chemicznie zahamowaną syntazą ATP przy jednoczesnej dostępności odpowiedniej ilości substratów. Na koniec, gdy cały tlen zostanie wyczerpany (warunki anoksyczne) w układzie z zamkniętą komorą, obserwuje się oddychanie w stanie 5.
Istnieje kilka metod oceny stanów energetycznych komórek14, przy czym w aktualnej ocenie OXPHOS w czasie rzeczywistym dominują dwa urządzenia analizujące zużycie tlenu, mierzone jako funkcja spadku zawartości tlenu w czasie w systemie z zamkniętą komorą, których zastosowanie zależy od modelu eksperymentalnego i pytania badawczego: respirometr wysokiej rozdzielczości Oroboros 2k oraz analizator strumieni zewnątrzkomórkowych Seahorse XF. Oba urządzenia rejestrują szybkość zużycia tlenu jako spadek w pikomolach (pmol) tlenu (O2) na sekundę jako wartość bezwzględną wewnątrz komory lub dołka mikropłytki. Specyficzne zużycie tlenu w przeliczeniu na masę uzyskuje się poprzez normalizację odpowiedniego zużycia tlenu w konkretnym buforze w stosunku do liczby komórek (miliony), masy tkanki (mg) lub ilości białka.
O2k (Oroboros Instruments) to zamknięty system dwukomorowy wyposażony w polarygraficzny czujnik tlenu (skrótowo określany jako komorowy respirometr wysokiej rozdzielczości: cHRR). Każda komora eksperymentalna mieści 2 mL cieczy, która jest utrzymywana w stanie jednorodnym za pomocą mieszadeł magnetycznych. Polarygraficzny czujnik tlenu wykorzystuje metodę amperometryczną do pomiaru tlenu: zawiera on złotą katodę, anodę srebrowo-chlorkową, a pomiędzy nimi roztwór KCl, tworząc ogniwo elektrochemiczne, do którego przyłożone jest napięcie (0.8 V). Tlen z medium assay dyfunduje przez 25 µm membranę z fluorowanego etylenu propylenu (przepuszczalną dla O2) i ulega redukcji na katodzie, tworząc nadtlenek wodoru. Na anodzie srebro utlenia się pod wpływem nadtlenku wodoru, generując prąd elektryczny. Prąd elektryczny (ampery) jest liniowo powiązany z ciśnieniem parcjalnym tlenu. Do obliczenia stężenia tlenu wykorzystuje się ciśnienie parcjalne tlenu oraz współczynnik rozpuszczalności tlenu w medium assay. Ponieważ ciśnienie parcjalne tlenu zależy od temperatury eksperymentalnej, a pomiary polarygraficzne są wrażliwe na temperaturę, wahania temperatury wymagają precyzyjnej regulacji (±0.002 °C) za pomocą bloku grzewczego Peltiera. Temperaturę można kontrolować w zakresie od 4 °C do 47 °C.
Analizator przepływu zewnątrzkomórkowego Seahorse XF (Agilent) jest systemem opartym na płytkach w formacie mikropłytek 24- lub 96-dołkowych, w którym trzy elektrody fluorescencyjne mierzą zużycie tlenu w czasie w każdym dołku (skrótowo określany jako respirometr wysokiej rozdzielczości oparty na mikropłytkach: mHRR). W kasecie analitycznej dostępnych jest maksymalnie cztery porty do zautomatyzowanego wtryskiwania podczas analizy. Analiza składa się z wielu cykli, z których każdy obejmuje trzy fazy: 1) mieszania, 2) oczekiwania oraz 3) pomiaru. W fazie pomiaru sondy czujników są opuszczane do mikropłytki, tworząc tymczasowo zamkniętą komorę o objętości 7-10 µL w celu pomiaru emitowanego światła. Światło to jest emitowane przez fluorofory zatopione w polimerze na końcówkach sond czujników, które wykrywają O2 na podstawie wygaszania fosforescencji. Intensywność sygnału fluorescencyjnego jest proporcjonalna do poziomu O2 i zależy od temperatury czujnika oraz medium analitycznego. W związku z tym dokładna ocena poziomu tlenu wymaga podejścia względnego z wykorzystaniem dołka kontrolnego (tła) bez próbki. Przywracanie stężenia tlenu następuje w fazie mieszania, gdy czujnik porusza się w górę i w dół, aby wymieszać objętość nad tymczasową komorą. Każdy cykl oblicza jedną wartość szybkości zużycia tlenu. Temperaturę można kontrolować w zakresie od 16 °C do 42 °C.
HRR jest złotym standardem w ocenie bioenergetyki komórkowej w pierwotnych chorobach związanych z mitochondriami oraz w ogólnym metabolizmie komórkowym. W niniejszym badaniu przedstawiono podstawowe protokoły HRR służące do oceny funkcji OXPHOS w komórkach i tkankach.
<img alt="Schemat protokołu z diagramem chHRR i mHRR, komórkami ssaków, etapami przygotowania tkanek i konfiguracją płytki." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63000/63000fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Schemat przygotowania komórek i tkanek do respirometrii cHRR oraz przygotowania komórek do respirometrii mHRR. (A) Przegląd dostarczonych protokołów. (B) Komórki ssaków (krok 1.2): osad komórek HEK293 odpowiadający 3 x 106 komórkom (lewy panel). Tkanka niefibryczna (krok 1.3): przygotowanie lizatu móżdżku mysiego w teflonowym homogenizatorze pottera o pojemności 2 mL (środkowy panel). Permeabilizacja mięśni szkieletowych indukowana saponiną (krok 1.4, prawy panel) do respirometrii cHRR. (C) Standardowy układ wysiewu na mikro płytkę (krok 2.4) i kontrola konfluencji dla analizy komórek eukariotycznych (HEK293) do respirometrii mHRR. (D, E) Schemat ładowania portu wtryskowego do respirometrii mHRR (krok 2.4). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63000/63000fig02large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

<table><tbody><tr><td>2 ml Potter-Elvehjem Szkło/PTFE Młynek/homogenizator</td><td>Omni International</td><td>07-358029</td><td></td></tr><tr><td>95% mieszaniny gazów medycznych O2, 5% CO2</td><td>Potter do mielenia tkanek</td>ADP Sigma A 4386 Antymycyna A Sigma A 8674 Chemiczny askorbinian Merck <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>PHR1279-1G</td><td>Chemiczny, rozpuszcza się w etanolu</td></tr><tr><td>BSA (bez tłuszczów)</td> <td>Sigma</td><td>A 6003</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td>CaCO3</td><td>Sigma</td><td>C 4830</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td>Cytochrom c</td><td>Sigma</td><td>C 7752</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td>Digitonina</td><td>Sigma</td><td>D 5628</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td>Ditiotreitol</td><td>Sigma</td><td>D 0632</td><td>Chemiczny, rozpuścić w DMSO</td></tr><tr><td>D-sacharoza</td><td>Roth</td><td>4621.1</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s medium (wysoka glukoza)</td><td>Fisher Scientific</td><td>41965-039</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s średni&nbsp; (bez glukozy)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A14430-01</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E 4378</td><td></td></tr><tr><td>Etomoxir</td><td>Sigma</td><td>E1905</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Falcon 15 ml Stożkowe probówki wirówkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM12500</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>Falcon 50 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM12501</td><td></td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Sigma</td><td>C 2920</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td>Chemiczna, rozpuszcza się w etanolu</td></tr><tr><td>Glutaminian</td><td>Sigma</td><td>G 1626</td><td>Chemiczna</td></tr><tr><td>GlutaMax&nbsp;( 100x)&nbsp; (200 nM&nbsp; Dipeptyd L-alanylo-L-glutaminy)</td><td>Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td>Chemical</td></tr><tr><td>HEK293 komórki</td><td>ATTC</td><td>CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometr</td><td>Fisher Scientific</td><td>0267151B</td><td>Przyrząd do liczenia komórek</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma H</td><td>7523</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Fluka</td><td>56750</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>1.04936</td><td>Chemiczna</td></tr><tr><td>L-karnityna</td><td>Sigma</td><td>C0283</td><td></td></tr><tr><td>Jabłczan</td> chemiczny <td>Sigma</td><td>M 1000</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td>hydrat MES</td><td>Sigma</td><td>M8250</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M 9272</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td>Na2ATP</td><td>Sigma</td><td>A 2383</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td>Na2Fosfokreatyna</td><td>Sigma</td><td>P 7936</td><td>Chemiczna</td></tr><tr><td>Na-pirogronian&nbsp;( 100 mM)&nbsp; (100x)</td><td>Fisher Scientific</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>NEAA&nbsp;( Aminokwasy endogenne) 100x</td><td>Fisher Scientific</td><td>11140035</td><td></td></tr><tr><td>Normal FBS&nbsp;( 10x)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>O2k-Core: Oxygraph-2k</td><td>Oroboros Instruments</td><td>10000-02</td><td>Przyrząd do respirometrii o wysokiej rozdzielczości</td></tr><tr><td>O2k-Zestaw do miareczkowania</td><td>Oroboros Instruments</td><td>20820-03</td><td>Strzykawki Hamilton do wstrzykiwań chemicznych</td></tr><tr><td>Oligomycyna</td><td>Sigma</td><td>O 4876</td><td>Substancja chemiczna, rozpuszczać w etanolu</td></tr><tr><td>Palmitoylkarnityna</td><td>Sigma</td><td>P 4509</td><td>Chemiczna</td></tr><tr><td>penicylina-streptomycyna</td><td>Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Zestaw do oznaczania białek</td><td>Fisher Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian</td><td>Sigma</td><td>P 2256</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td>bufor RIPA</td><td>Fisher Scientific</td><td>89900</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td>Rotenon</td><td>Sigma</td><td>R 8875</td><td>Substancja chemiczna, rozpuszczona w etanolu</td></tr><tr><td>Saponina</td><td>Sigma</td><td>S7900</td><td>Chemical</td></tr><tr><td> Seahorse XF DMEM Test DMEM opakowanie średnie, pH 7,4</td><td> Agilent, Santa Clara, CA</td><td>103680-100</td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 Analizator strumienia zewnątrzkomórkowego</td><td> Agilent, Santa Clara, CA</td><td></td><td>Wysokoprzepustowy przyrząd do respirometrii</td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 FluxPak</td><td> Agilent, Santa Clara, CA</td><td></td><<td>br/> Zawiera płytki testowe, wkłady, prowadnice ładowania do przenoszenia związków do wkładu testowego oraz roztwór kalibru.</td></tr><tr><td>Małe nożyczki</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-951-20</td><td></td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Bursztynian</td> chemiczny <td>Sigma</td><td>S 2378</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td>Tauryna</td><td>Sigma</td><td>T 8691</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td>TMPD</td><td>Sigma</td><td>T 3134</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td>roztwór błękitu trypanowego</td><td>Merck</td><td>72-57-1</td><td>Chemiczny</td></tr><tr><td>Trypsyna 0,25% EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Dwa kleszcze cienkokrawędziowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-000-122</td><td></td></tr><tr><td>Kolba urydynowa (500x)</td><td>Sigma</td><td>U3750</td><td>Chemical</td></tr></tbody></table>

respirometria o wysokiej rozdzielczości do oceny bioenergetyki w komórkach i tkankach za pomocą respirometrów komorowych i płytkowych

High-Resolution Respirometry to Assess Bioenergetics in Cells and Tissues Using Chamber- and Plate-Based Respirometers

Respirometria o wysokiej rozdzielczości (HRR) umożliwia monitorowanie fosforylacji oksydacyjnej w czasie rzeczywistym w celu analizy indywidualnych stanów energetycznych komórek i oceny kompleksów oddechowych przy użyciu zróżnicowanych protokołów miareczkowania substrat-rozprzęgacz-inhibitor (SUIT). Zademonstrowano tutaj zastosowanie dwóch urządzeń do respirometrii o wysokiej rozdzielczości oraz przedstawiono podstawowy zbiór protokołów mających zastosowanie do analizy hodowanych komórek, włókien mięśnia szkieletowego i mięśnia sercowego oraz tkanek miękkich, takich jak mózg i wątroba. Protokoły dla hodowanych komórek i tkanek są dostępne dla respirometru komorowego i hodowanych komórek dla respirometru opartego na mikropłytkach, przy czym oba obejmują standardowe protokoły oddychania. Do celów porównawczych z obydwoma urządzeniami wykorzystuje się komórki HEK293 z niedoborem translacji mitochondrialnej powodujące wieloraki niewydolność układu oddechowego, aby wykazać defekty komórkowe w oddychaniu. Oba respirometry pozwalają na kompleksowy pomiar oddychania komórkowego wraz z ich odpowiednimi zaletami technicznymi i przydatnością w zależności od pytania badawczego i badanego modelu.

W niniejszym materiale przedstawiamy protokoły służące do wyznaczania bioenergetyki mitochondrialnej w komórkach eukariotycznych, tkance niewłóknistej (np. móżdżku) oraz tkance włóknistej (np. mięśniu szkieletowym). W przypadku komórek eukariotycznych, pomiarów komórek HEK293 z CRISPR-wymierzoną eliminacją dwóch różnych białek związanych z translacją mitochondrialną, co skutkuje wielokrotnym (CRISPRKO1) lub ciężkim/całkowitym niedoborem OXPHOS (CRISPRKO2), przeprowadzono przy użyciu cHRR (<strong cl...

Ocena fosforylacji oksydacyjnej za pomocą respirometrów o wysokiej rozdzielczości stała się integralną częścią analizy funkcjonalnej mitochondriów i metabolizmu energii komórkowej. W tym miejscu przedstawiamy protokoły analizy metabolizmu energii komórkowej za pomocą respirometrów komorowych i mikropłytkowych o wysokiej rozdzielczości oraz omawiamy kluczowe zalety każdego urządzenia.

Respirometria o wysokiej rozdzielczości do oceny bioenergetyki w komórkach i tkankach za pomocą respirometrów komorowych i płytkowych

High-resolution respirometry (HRR) allows monitoring oxidative phosphorylation in real-time for analysis of individual cellular energy states and ...

Mitochondria dostarczają energię komórkową poprzez fosforylację oksydacyjną, przyczyniając się do prawie wszystkich procesów zachodzących w komórce. W związku z tym dysfunkcje mitochondriów są związane z szerokim spektrum chorób. Główną zaletą tej techniki jest pomiar bioenergetyki mitochondriów w czasie rzeczywistym poprzez zużycie tlenu, a co za tym idzie, dokładna ocena całkowitego metabolizmu energii komórkowej.Respirometria o wysokiej rozdzielczości pozwala na bezpośrednią ocenę tego, co w systemie fosforylacji oksydacyjnej zawodzi, potencjalnie dostarczając wskazówek diagnostycznych w pierwotnych chorobach mitochondrialnych i wtórnych dysfunkcjach mitochondriów związanych z wieloma zaburzeniami. Procedurę zademonstruje Ryan Awadhpersad, doktorant w moim laboratorium. Aby rozpocząć, wykonaj kalibrację tlenu, uruchamiając respirometry w 2,1 mililitra mitochondrialnego podłoża oddechowego w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez ponad 45 minut i kontynuuj, jeśli odchylenie od wartości wyjściowej mieści się w granicach czterech pikoboli na sekundę.Hodowla komórek HEK293 w DMEM o wysokiej zawartości glukozy uzupełnionej 10% aktywowanym termicznie FBS, GlutaMAX, aminokwasami endogennymi, pirogronianem sodu i urydyną w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. W dniu eksperymentu zbierz i policz komórki, a następnie ponownie zawieś 2,5 miliona komórek w 2,5 mililitrowym pożywce oddechowej. Aby ocenić rutynowe oddychanie, dodaj do komory 2,3 mililitra zawiesiny komórek ciepłego podłoża do oddychania.Uruchom komory w temperaturze 37 stopni Celsjusza i prędkości mieszania 700 obr./min. Odczekaj co najmniej trzy minuty, aby media mogły się odgazować, a następnie zamknij komory, przekręcając korek ruchem obrotowym. Następnie zassać nadmiar płynu na wierzchu korka.Po 10 minutach uzyskaj stabilny sygnał strumienia tlenu, aby zarejestrować rutynowe lub stan I oddychania. Aby przeprowadzić analizę OXPHOS w nienaruszonych komórkach, dodaj dwa mikrolitry 0,01-milimolowej oligomycyny, aby uzyskać końcowe stężenie 10-nanomolowe. Miareczkować FCCP z dwumilimolowego materiału wyjściowego, dodając 0,6 mikrolitra w krokach co 0,2 mikrolitra, aż nie zaobserwuje się wzrostu oddychania i oddychanie zostanie maksymalnie rozłączone.Następnie dodaj jeden mikrolitr jednomilimolowego rotenonu, aby uzyskać końcowe stężenie 0,5-mikromolowego. Następnie dodaj dwa mikrolitry po jednym miligramie na mililitr antymycyny, aby uzyskać końcowe stężenie jednego mikrograma na mililitr. Ponownie natlenić komorę do tego samego poziomu tlenu, około 150 mikromolowych, podnosząc tłok.Następnie dodaj pięć mikrolitrów 0,8-molowego askorbinianu, aby uzyskać końcowe stężenie dwumilimolowe. Następnie natychmiast dodaj pięć mikrolitrów 0,2-molowego TMPD, aby uzyskać końcowe stężenie 0,5-milimolowe i oceń aktywność kompleksu dożylnego. Gdy szczytowy strumień tlenu zostanie osiągnięty za pomocą TMPD, dodaj pięć mikrolitrów lub czteromolowy azydek, aby uzyskać końcowe stężenie 10 milimolów.Następnie kontynuuj bieg przez co najmniej pięć minut, aby oznaczyć autoutlenianie TMPD w celu obliczenia złożonego dożylnego poziomu zasadowego. Po przebiegu należy pobrać jeden mililitr zawiesiny próbki z każdej komory i odwirować przy 1 000 G dla komórek przepuszczalnych lub przy 20 000 G dla lizatu tkankowego. Następnie wyrzuć supernatant i zamroź osad w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do dalszej analizy.Najpierw zasiej komórki zgodnie z tempem wzrostu poszczególnych linii komórkowych. Rozcieńczyć oligomycynę, FCCP, rotenon i antymycynę w trzech mikrolitrach pożywki testowej do końcowego stężenia odpowiednio 1,5 mikromola, 1,125 mikromola i jednego mikromola. Następnie napełnij je osobnymi portami.Przestrzegać otworów iniekcyjnych, aby zapewnić równomierne ładowanie próbek. Włącz system oparty na mikropłytce i komputer i równoważ je w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez co najmniej trzy godziny. W dniu testu opartego na mikropłytkach należy sprawdzić zbieżność płytki hodowli komórkowej, morfologię komórek i upewnić się, że studzienki tła są puste.Następnie usuń wszystko z wyjątkiem 20 mikrolitrów pożywki hodowlanej z każdej studzienki. Następnie umyj każdą studzienkę 90 mikrolitrami pożywki testowej i dodaj 100 mikrolitrów pożywki testowej, aby uzyskać końcową objętość do 120 mikrolitrów. Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze bez dwutlenku węgla przez 60 minut.Po wyjęciu płytki z inkubatora zdejmij pokrywę i umieść mikropłytkę w szczelinie. Kliknij Kontynuuj, aby rozpocząć bieg. Po zakończeniu serii wyjmij płytkę i usuń pozostałą pożywkę testową, nie naruszając komórek.Następnie zamroź całą płytkę w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Po przeprowadzeniu eksperymentów z przepuszczalnością i oddychaniem digitoniny zarejestrowano ślady zużycia surowego tlenu w komórkach HEK293 typu dzikiego i komórkach HEK293 z nokautem genu za pośrednictwem CRISPR, co spowodowało liczne niedobory OXPHOS. Uzyskano nałożone na siebie ślady zużycia tlenu znormalizowane na wejściu komórki.Nokaut CRISPR 1 pokazuje upośledzone oddychanie, a nokaut CRISPR 2 nie wykazuje oddychania w porównaniu z typem dzikim po znormalizowaniu do liczby komórek. Ilości białka określono ilościowo, a wartości oddychania znormalizowano do ilości białka w celu określenia wartości bezwzględnych stanów oddechowych i odpowiednich współczynników kontroli strumienia. Stwierdzono, że wskaźniki zakwaszenia zewnątrzkomórkowego wzrosły w przypadku niedoboru OXPHOS w nokaucie CRISPR 2, co sugeruje kompensację niedoboru fosforylacji oksydacyjnej mitochondriów w komórkach HEK293 poprzez zwiększoną glikolizę.Ponadto oznaczono wartości oddychania w obecności oligomycyny, FCCP i rotenonu, a uzyskane wartości znormalizowano do ilości białka. Badano znormalizowane białko ślady zużycia tlenu w komórkach HEK293 typu dzikiego i komórkach HEK293 z niedoborem translacji mitochondrialnej za pośrednictwem CRISPR, powodującym wielokrotny niedobór OXPHOS. Uzyskano znormalizowane tkankowo ślady zużycia tlenu w móżdżku myszy i mięśniu płaszczkowatym myszy.Mięśnie płaszczkowate wykazują trzykrotnie wyższy OXPHOS i wydolność oddechową niż móżdżek. W przypadku respirometrii komorowej ważne jest, aby pracować szybko, ponieważ funkcja mitochondriów pogorszy się w momencie pobrania próbek, a w przypadku respirometrii opartej na płytkach kluczowe znaczenie ma uzyskanie optymalnej gęstości wysiewu, aby zminimalizować zmienność. W celu dalszej analizy możliwa jest kwantyfikacja białka lub immunoblotting.To może określić, czy zmiana w mitochondrialnej funkcji oddechowej była spowodowana obfitością kompleksów OXPHOS, czy ilością mitochondriów. Już sto lat temu odkryto, że komórki rakowe wykonują glikolizę beztlenową oprócz mitochondrialnego OXPHOS. Podkreśla to potrzebę przeprowadzenia badań bioenergetyki mitochondrialnej.Tutaj zademonstrowaliśmy dwa respirometry uważane za dzisiejszy złoty standard.

high-resolution-respirometry-to-assess-bioenergetics-cells-tissues

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wysokiej rozdzielczości respirometria służy do określania zużycia tlenu w mitochondriach. Jest to prosta technika określania częstości oddechów mitochondrialnych kompleksów łańcucha oddechowego (I-IV), maksymalnej pojemności mitochondrialnego systemu transportu elektronów i integralności mitochondrialnej błony zewnętrznej.

Respirometria o wysokiej rozdzielczości do oceny funkcji mitochondriów w przepuszczalnych i nienaruszonych komórkach

Celem tego protokołu jest zmierzenie wpływu zmian w oddychaniu mitochondrialnym za pośrednictwem glukozy w obecności naturalnych związków na nienaruszone komórki beta 832/13 za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości.

Respirometria o wysokiej rozdzielczości do pomiaru funkcji mitochondriów nienaruszonych komórek beta w obecności naturalnych związków

Ten protokół opisuje kalorespirometrię, bezpośredni i jednoczesny pomiar zarówno rozpraszania ciepła, jak i oddychania, co zapewnia nieinwazyjne podejście do oceny metabolizmu energetycznego. Technika ta służy do oceny udziału ścieżek tlenowych i beztlenowych w wykorzystaniu energii poprzez monitorowanie całkowitego przepływu energii komórkowej.

Kalorespirometria: potężne, nieinwazyjne podejście do badania metabolizmu energii komórkowej

Status metaboliczny ludzkich komórek nabłonka barwnikowego siatkówki (H-RPE) odzwierciedla ich zdrowie i funkcję. Przedstawiono zoptymalizowany protokół badania strumienia metabolicznego H-RPE w czasie rzeczywistym za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości.

Analiza bioenergetyki w czasie rzeczywistym w pierwotnych komórkach nabłonka barwnikowego ludzkiej siatkówki przy użyciu respirometrii o wysokiej rozdzielczości

Analiza funkcji mitochondriów plemników za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości pozwala na pomiar zużycia tlenu przez swobodnie poruszające się plemniki w systemie zamkniętym komorowym. Technika ta może być stosowana do pomiaru oddychania w plemnikach ludzkich, co dostarcza informacji na temat cech mitochondriów i integralności plemników.

Respirometria o wysokiej rozdzielczości do oceny funkcji mitochondriów w plemnikach ludzkich

Izolowane komórki jednojądrzaste krwi obwodowej mogą być używane do analizy funkcji i zaburzeń immunologicznych, chorób metabolicznych lub funkcji mitochondriów. W niniejszej pracy opisujemy znormalizowaną metodę przygotowania PBMC z krwi pełnej i późniejszej krioprezerwacji. Kriokonserwacja sprawia, że ten czas i miejsce są niezależne.

Kriokonserwacja i ocena bioenergetyczna ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej

Tutaj pokazujemy, że komora 0,5 ml do respirometrii o wysokiej rozdzielczości pokazuje wyniki, które są zgodne z komorą 2,0 ml, jeśli zastosuje się odpowiednią instrumentalną korekcję tłaO2. Wymaga mniejszej próbki, co jest korzystne w przypadku badań o ograniczonej dostępności lub niskiej wydolności oddechowej.

Respirometria o wysokiej rozdzielczości w komorze o małej objętości

W niniejszym opracowaniu przedstawiamy protokół przeprowadzania restrykcji dietetycznej na sztywnym podłożu u C. elegans z wykorzystaniem zabitych bakterii.

Ograniczenie kaloryczne na stałym podłożu u Caenorhabditis elegans

PCR w połączeniu z analizą topnienia w wysokiej rozdzielczości (HRMA) jest pokazane jako szybka i skuteczna metoda genotypowania danio pręgowanego.

Szybkie i wydajne genotypowanie danio pręgowanego za pomocą PCR z analizą topnienia w wysokiej rozdzielczości

Zaburzenia metaboliczne należą do najczęstszych chorób u ludzi. Genetycznie podatny organizm modelowy D. melanogaster może być wykorzystany do identyfikacji nowych genów regulujących metabolizm. W artykule opisano stosunkowo prostą metodę, która pozwala na badanie tempa przemiany materii u much poprzez pomiar ich produkcji CO2 .

Pomiar tempa przemiany materii u Drosophila za pomocą respirometrii

Poznaj respirometrię o wysokiej rozdzielczości do oceny bioenergetyki mitochondrialnej w komórkach HEK293 i tkankach. Ta metoda umożliwia pomiar zużycia tlenu w czasie rzeczywistym i diagnostykę chorób mitochondrialnych.

Respirometria o wysokiej rozdzielczości do oceny bioenergetyki w komórkach i tkankach za pomocą respirometrów komorowych i płytkowych (Wideo) | JoVE Journal

Respirometria o wysokiej rozdzielczości do oceny bioenergetyki w komórkach i tkankach za pomocą respirometrów komorowych i płytkowych

Przeglądaj więcej filmów