Połączona mechaniczna i enzymatyczna dysocjacja tkanki hipokampa mózgu myszy
21 października 2021
Ten protokół dysocjacji komórek nerwowych jest przeznaczony dla próbek z małą ilością materiału wyjściowego i daje wysoce żywotną zawiesinę pojedynczej komórki do dalszej analizy, z opcjonalnymi etapami utrwalania i barwienia.
Skuteczna dysocjacja niewielkich ilości tkanki nerwowej może wyposażyć laboratoria w narzędzia do uzyskania specyficznego dla struktury wglądu w skuteczność leczenia, funkcje komórkowe, a także choroby i mechanizmy działania leczenia. Ten protokół dysocjacji neuronalnej konsekwentnie daje wysoce żywotną i rzeczywistą zawiesinę pojedynczej komórki. Ponadto możemy przetwarzać próbki, które stanowią tylko ułamek tych, do których przeznaczone są zestawy komercyjne.
Właściwe planowanie i przygotowanie są kluczem do pomyślnego wyniku tej techniki. Korzystne byłoby przeprowadzenie kilku rund treningowych w celu zapoznania się z protokołem. Po znieczuleniu sześciomiesięcznej samicy myszy C57BL/6J, uszczypnij dolną część brzucha i unieś skórę za pomocą kleszczy.
Następnie za pomocą nożyczek przetnij futro i skórę do dna klatki piersiowej. Wykonaj dwa ukośne nacięcia, zaczynając poniżej klatki piersiowej i przesuwając się w kierunku każdego ramienia. Następnie ostrożnie wytnij przeponę i klatkę piersiową, aby odsłonić serce.
Po ostrożnym usunięciu tkanki łącznej wokół serca, użyj nożyczek, aby przyciąć prawy przedsionek. Następnie należy wyłączyć dopływ izofluranu do odpowietrznika. Trzymając serce stabilnie za pomocą kleszczy i skosem igły motylkowej skierowanym do góry, przebij lewą komorę, trzymając igłę poziomo i równolegle do zwierzęcia.
Następnie, przytrzymując igłę na miejscu, włącz pompę i przelej co najmniej 30 mililitrów roztworu soli fizjologicznej lub heparyny, aż płyn opuszczający serce stanie się nieprzezroczysty, a wątroba i płuca będą blade. Po perfuzji wyłącz pompę, wyjmij igłę i przenieś mysz do obszaru sekcji. Po ścięciu głowy odetnij futro od tyłu głowy do oczu i oderwij skórę z powrotem, aby odsłonić czaszkę.
Następnie przypnij czaszkę między oczami i wykonaj dwa nacięcia z tyłu czaszki w pozycjach godziny 10 i 2. Następnie wykonaj jedno długie cięcie wzdłuż linii środkowej czaszki do oryginalnego nacięcia między oczami. Następnie za pomocą kleszczy oderwij dwie połówki czaszki na boki.
Następnie za pomocą szpatułki usuń mózg i umieść go na 60-milimetrowej szklanej szalce Petriego wypełnionej zimnym DPBS i trzymanej na lodzie. Za pomocą skalpela lub brzytwy oddziel każdą półkulę i usuń opuszki węchowe i móżdżek. Następnie usuń śródmózgowie, aż hipokamp zostanie odsłonięty.
Następnie zabezpiecz mózg kleszczami. Następnie, używając drugiego zestawu kleszczy, delikatnie wysuń hipokamp z każdej półkuli. Przenieś oba hipokampy do oznaczonej 1,5-mililitrowej rurki zawierającej zimny DPBS i umieść rurkę na lodzie.
Za pomocą kleszczy przenieś kawałki tkanki hipokampa do rurki C i dodaj 30 mikrolitrów mieszanki enzymów 2 do probówki. Po przekręceniu nakrętki i dokręceniu aż do kliknięcia należy umieścić rurkę w dysocjatorze i uruchomić odpowiedni program. Podczas działania programu należy wstępnie zwilżyć sitko o średnicy 70 mikronów umieszczone na stożkowej rurce o pojemności 50 mililitrów z dwoma mililitrami buforu BSA.
Po zakończeniu programu dysocjacji dodaj cztery mililitry buforu BSA do zdysocjowanej tkanki i przefiltruj mieszaninę przez sitko komórkowe na 50-mililitrowej stożkowej probówce. Następnie dodaj 10 mililitrów DPBS do rurki C. Następnie zamknij probówkę, delikatnie zamieszaj roztwór i przefiltruj go przez sitko komórkowe na stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów.
Przefiltrowaną zawiesinę komórkową odwirować, wyrzucić supernatant bez naruszania osadu i przechowywać osad. W celu usunięcia zanieczyszczeń ponownie zawiesić granulat z 1 550 mikrolitrami zimnego DPBS i przenieść zawiesinę do oznakowanej stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów. Następnie dodaj 450 mikrolitrów zimnego roztworu do usuwania zanieczyszczeń i pipetuj w górę iw dół.
Delikatnie nałóż zawiesinę komórek na jeden mililitr zimnego DPBS, przytrzymując końcówkę przy ściance stożkowej rurki. Powtarzaj procedurę, aż całkowita nakładka wyniesie dwa mililitry. Następnie odwirować zawiesinę pod ciśnieniem 3 000 razy G przez 10 minut z pełnym przyspieszeniem i pełną przerwą.
Zassać najwyższą warstwę, a następnie przesunąć końcówkę pipety w przód i w tył, aby zassać białą środkową warstwę. Usuń jak najwięcej środkowej warstwy, nie naruszając najniższej warstwy. Następnie dodaj dwa mililitry zimnego DPBS i pipetuj w górę iw dół, aby wymieszać.
Następnie odwirować zawiesinę pod ciśnieniem 1000 razy G przez 10 minut z pełnym przyspieszeniem i pełną przerwaniem. Po odwirowaniu wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrowym buforze BSA. Po zliczeniu komórek odwirować pozostałą zawiesinę komórek i ponownie zawiesić osad w 50 mikrolitrach rozcieńczonej żywej martwej plamy.
Następnie przenieść próbkę do oznakowanej rurki przepływowej i inkubować w temperaturze pokojowej przez 8 do 10 minut w ciemności. Po inkubacji dodać 500 mikrolitrów buforu BSA i powtórzyć etap wirowania. Następnie wyrzucić supernatant, pozostawiając niewielką ilość buforu w probówce.
Bramka pierwotna wykluczyła szczątki na wykresach rozproszenia przedniego i bocznego, a następnie wykluczono martwe komórki. Druga bramka wykluczyła komórki dodatnie na obecność zasadowego białka mieliny. A z pozostałych komórek utworzono wykresy gęstości komórek dodatnich dla każdego fluorochromu.
Częstość występowania każdej populacji komórek nerwowych została obliczona z trzeciej bramy. Próbki przetworzone z ręczną dysocjacją mechaniczną i trawieniem enzymatycznym dały znacznie niższą populację komórek będących przedmiotem zainteresowania, podczas gdy zarówno świeże, jak i stałe próbki przetworzone za pomocą automatycznej dysocjacji mechanicznej i trawienia enzymatycznego wykazały kilkakrotnie większą populację komórek będących przedmiotem zainteresowania. Podczas gdy etapy perfuzji i usuwania zanieczyszczeń mogą być początkowo trudne, utrzymanie gładkiej i stabilnej ręki może pomóc w zapewnieniu sukcesu.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje metodę dysocjacji niewielkich ilości tkanki nerwowej, umożliwiającą badaczom uzyskanie wysokiej jakości zawiesin pojedynczych komórek o wysokiej żywotności do dalszych analiz. Proces ten jest szczególnie przydatny w badaniach specyficznych dla danej struktury w zakresie skuteczności leczenia oraz funkcji komórkowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
Wstęp
- Standardowe zestawy komercyjne są przeznaczone dla większych ilości próbek, dzięki czemu niniejszy protokół jest korzystny w przypadku próbek o niskiej wydajności.
- Podkreśla się znaczenie odpowiedniego planowania i zapoznania się z protokołem w celu zapewnienia pomyślnych rezultatów.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnej metody dysocjacji tkanki nerwowej przy użyciu minimalnej ilości materiału wyjściowego.
- Umożliwienie szczegółowej analizy funkcji komórkowych i mechanizmów terapeutycznych w konkretnych strukturach mózgu.
Zastosowane metody
- Protokół wykorzystuje trawienie enzymatyczne, po którym następuje dysocjacja mechaniczna.
- Do procesu wykorzystuje się izolowane hipokampy myszy C57BL/6J.
- Obejmuje etapy takie jak perfuzja, wirowanie i usuwanie zanieczyszczeń w celu uzyskania czystej zawiesiny komórkowej.
- Wirowanie i resuspensja są kluczowe dla uzyskania żywych populacji komórek.
Główne wyniki
- Metoda ta pozwala na uzyskanie wyższej wydajności żywych komórek w porównaniu z manualnymi i mniej zoptymalizowanymi procedurami.
- Umożliwia ona obliczenie częstotliwości populacji komórkowych wskazujących na skład neuronów po dysocjacji.
- Wyniki wskazują, że zarówno tkanki świeże, jak i utrwalone, dawały znacznie lepsze rezultaty niż metody stosowane wcześniej.
Wnioski
- Niniejsze badanie waliduje protokół, który rozszerza możliwości przeprowadzania analiz komórkowych z ograniczonej ilości tkanki nerwowej.
- Wnioski mogą mieć zastosowanie w zrozumieniu zachowań komórkowych w różnych badaniach i terapiach neurologicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Uzyskanie wysokiej żywotności zawiesin pojedynczych komórek z ograniczonej ilości tkanki nerwowej umożliwia analizę skuteczności leczenia i funkcji komórkowych w odniesieniu do konkretnych struktur w przedklinicznych badaniach neuronaukowych. Niniejszy protokół rozwiązuje kluczowy problem w walidacji celów terapeutycznych, zapewniając powtarzalną dysocjację niewielkich próbek hipokampa, co wspiera mechanistyczną ocenę ryzyka we wczesnej fazie odkrywania leków. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną w przypadku dalszych analiz, takich jak cytometria przepływowa i sekwencjonowanie pojedynczych komórek, podczas pracy z ograniczoną ilością materiału tkankowego.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia analizę populacji neuronów hipokampa w celu oceny stopnia związania z celem oraz modulacji szlaków sygnałowych.
- Wartość operacyjna: Zmniejsza zmienność w przetwarzaniu próbek poprzez standaryzację dysocjacji ograniczonych ilości tkanki.
- Wartość prognostyczna: Zwiększa pewność wyników testów komórkowych poprzez minimalizację ilości zanieczyszczeń i maksymalizację uzysku żywych komórek.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowanie wysokiej jakości zawiesin pojedynczych komórek do dalszych zastosowań, w tym do immunofenotypowania i przesiewów funkcjonalnych.
- Wartość operacyjna: Wsparcie standaryzacji testów poprzez zapewnienie stałej żywotności komórek (>90%) i niskiego poziomu zanieczyszczeń (debris).
- Skalowalność: Umożliwienie przetwarzania próbek o objętości mniejszej niż przewidziana w zestawie, co zwiększa przepustowość w przypadku cennych lub ograniczonych modeli przedklinicznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Zachowuje integralność tkanki hipokampa w celu analizy biomarkerów specyficznych dla danej struktury w warunkach świeżych i utrwalonych.
- Minimalizacja ryzyka mechanistycznego: Redukuje ryzyko wyników fałszywie ujemnych podczas walidacji celu poprzez poprawę odzysku neuronów w porównaniu z metodami manualnymi.
- Istotność modelu przedklinicznego: Wspiera badania hipokampa w kontekście chorób u myszy C57BL/6J dzięki niezawodnemu generowaniu materiału komórkowego.
Integracja potoku i procesu pracy
Metoda ta wpisuje się w proces badawczy – od przygotowania tkanek po odczyt analityczny – umożliwiając wiarygodne generowanie materiału wejściowego do testów komórkowych w badaniach nad hipokampem.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez poprzez dostarczanie żywych populacji neuronów do analiz funkcjonalnych i fenotypowych.
- Przesiewanie: Dostarcza standaryzowane zawiesiny o wysokiej żywotności, odpowiednie do przesiewania opartego na przeciwciałach oraz zastosowań cytometrycznych.
- Analityka: Umożliwia ilościowy pomiar subpopulacji neuronów za pomocą cytometrii przepływowej i wykreślania gęstości.
- Badania translacyjne: Ułatwia dopasowanie biomarkerów poprzez zachowanie składu komórkowego hipokampa do analiz porównawczych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia powtarzalny protokół dysocjacji tkanki nerwowej do zastosowania w wielu projektach przedklinicznych.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność walidacji celu poprzez poprawę wydajności uzyskiwania neuronów i ograniczenie strat próbek.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność dzięki ustandaryzowanym enzymatycznym i mechanicznym etapom dysocjacji.
- Wartość strategiczna: Wspiera decyzje typu go/no-go, umożliwiając przeprowadzanie wiarygodnych analiz komórkowych z ograniczonej ilości próbek przedklinicznych.
- Wpływ na portfolio: Poprawia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez zwiększenie jakości danych uzyskanych z tkanki nerwowej o niskiej wydajności.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w sekcji myszy, perfuzji oraz sterylnym obchodzeniu się z tkankami.
- Zależność od dostępu do dysocjatora mechanicznego, wirówki i sprzętu do przesiewania komórek.
- Konieczność standaryzacji objętości mieszanki enzymatycznej oraz czasów inkubacji dla wszystkich użytkowników.
- Obejmuje etapy manualne, takie jak wypreparowanie hipokampa, które wymagają szkolenia i praktyki.
- Efektywność może różnić się w zależności od stanu utrwalenia tkanki, co wymaga optymalizacji protokołu dla próbek archiwalnych.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:50
Perfusion
2:01
Dissection
3:11
Adult Brain Dissociation
4:15
Debris Removal
5:28
Live and Dead Staining
6:00
Results: Flow Cytometry Analysis Following Automated Mechanical Dissociation and Enzymatic Digestion of Mouse Brain Hippocampal Tissue
6:51
Conclusion
