Połączona mechaniczna i enzymatyczna dysocjacja tkanki hipokampa mózgu myszy

Ten protokół dysocjacji komórek nerwowych jest przeznaczony dla próbek z małą ilością materiału wyjściowego i daje wysoce żywotną zawiesinę pojedynczej komórki do dalszej analizy, z opcjonalnymi etapami utrwalania i barwienia.

Skuteczna dysocjacja niewielkich ilości tkanki nerwowej może wyposażyć laboratoria w narzędzia do uzyskania specyficznego dla struktury wglądu w skuteczność leczenia, funkcje komórkowe, a także choroby i mechanizmy działania leczenia. Ten protokół dysocjacji neuronalnej konsekwentnie daje wysoce żywotną i rzeczywistą zawiesinę pojedynczej komórki. Ponadto możemy przetwarzać próbki, które stanowią tylko ułamek tych, do których przeznaczone są zestawy komercyjne.

Właściwe planowanie i przygotowanie są kluczem do pomyślnego wyniku tej techniki. Korzystne byłoby przeprowadzenie kilku rund treningowych w celu zapoznania się z protokołem. Po znieczuleniu sześciomiesięcznej samicy myszy C57BL/6J, uszczypnij dolną część brzucha i unieś skórę za pomocą kleszczy.

Następnie za pomocą nożyczek przetnij futro i skórę do dna klatki piersiowej. Wykonaj dwa ukośne nacięcia, zaczynając poniżej klatki piersiowej i przesuwając się w kierunku każdego ramienia. Następnie ostrożnie wytnij przeponę i klatkę piersiową, aby odsłonić serce.

Po ostrożnym usunięciu tkanki łącznej wokół serca, użyj nożyczek, aby przyciąć prawy przedsionek. Następnie należy wyłączyć dopływ izofluranu do odpowietrznika. Trzymając serce stabilnie za pomocą kleszczy i skosem igły motylkowej skierowanym do góry, przebij lewą komorę, trzymając igłę poziomo i równolegle do zwierzęcia.

Następnie, przytrzymując igłę na miejscu, włącz pompę i przelej co najmniej 30 mililitrów roztworu soli fizjologicznej lub heparyny, aż płyn opuszczający serce stanie się nieprzezroczysty, a wątroba i płuca będą blade. Po perfuzji wyłącz pompę, wyjmij igłę i przenieś mysz do obszaru sekcji. Po ścięciu głowy odetnij futro od tyłu głowy do oczu i oderwij skórę z powrotem, aby odsłonić czaszkę.

Następnie przypnij czaszkę między oczami i wykonaj dwa nacięcia z tyłu czaszki w pozycjach godziny 10 i 2. Następnie wykonaj jedno długie cięcie wzdłuż linii środkowej czaszki do oryginalnego nacięcia między oczami. Następnie za pomocą kleszczy oderwij dwie połówki czaszki na boki.

Następnie za pomocą szpatułki usuń mózg i umieść go na 60-milimetrowej szklanej szalce Petriego wypełnionej zimnym DPBS i trzymanej na lodzie. Za pomocą skalpela lub brzytwy oddziel każdą półkulę i usuń opuszki węchowe i móżdżek. Następnie usuń śródmózgowie, aż hipokamp zostanie odsłonięty.

Następnie zabezpiecz mózg kleszczami. Następnie, używając drugiego zestawu kleszczy, delikatnie wysuń hipokamp z każdej półkuli. Przenieś oba hipokampy do oznaczonej 1,5-mililitrowej rurki zawierającej zimny DPBS i umieść rurkę na lodzie.

Za pomocą kleszczy przenieś kawałki tkanki hipokampa do rurki C i dodaj 30 mikrolitrów mieszanki enzymów 2 do probówki. Po przekręceniu nakrętki i dokręceniu aż do kliknięcia należy umieścić rurkę w dysocjatorze i uruchomić odpowiedni program. Podczas działania programu należy wstępnie zwilżyć sitko o średnicy 70 mikronów umieszczone na stożkowej rurce o pojemności 50 mililitrów z dwoma mililitrami buforu BSA.

Po zakończeniu programu dysocjacji dodaj cztery mililitry buforu BSA do zdysocjowanej tkanki i przefiltruj mieszaninę przez sitko komórkowe na 50-mililitrowej stożkowej probówce. Następnie dodaj 10 mililitrów DPBS do rurki C. Następnie zamknij probówkę, delikatnie zamieszaj roztwór i przefiltruj go przez sitko komórkowe na stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów.

Przefiltrowaną zawiesinę komórkową odwirować, wyrzucić supernatant bez naruszania osadu i przechowywać osad. W celu usunięcia zanieczyszczeń ponownie zawiesić granulat z 1 550 mikrolitrami zimnego DPBS i przenieść zawiesinę do oznakowanej stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów. Następnie dodaj 450 mikrolitrów zimnego roztworu do usuwania zanieczyszczeń i pipetuj w górę iw dół.

Delikatnie nałóż zawiesinę komórek na jeden mililitr zimnego DPBS, przytrzymując końcówkę przy ściance stożkowej rurki. Powtarzaj procedurę, aż całkowita nakładka wyniesie dwa mililitry. Następnie odwirować zawiesinę pod ciśnieniem 3 000 razy G przez 10 minut z pełnym przyspieszeniem i pełną przerwą.

Zassać najwyższą warstwę, a następnie przesunąć końcówkę pipety w przód i w tył, aby zassać białą środkową warstwę. Usuń jak najwięcej środkowej warstwy, nie naruszając najniższej warstwy. Następnie dodaj dwa mililitry zimnego DPBS i pipetuj w górę iw dół, aby wymieszać.

Następnie odwirować zawiesinę pod ciśnieniem 1000 razy G przez 10 minut z pełnym przyspieszeniem i pełną przerwaniem. Po odwirowaniu wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrowym buforze BSA. Po zliczeniu komórek odwirować pozostałą zawiesinę komórek i ponownie zawiesić osad w 50 mikrolitrach rozcieńczonej żywej martwej plamy.

Następnie przenieść próbkę do oznakowanej rurki przepływowej i inkubować w temperaturze pokojowej przez 8 do 10 minut w ciemności. Po inkubacji dodać 500 mikrolitrów buforu BSA i powtórzyć etap wirowania. Następnie wyrzucić supernatant, pozostawiając niewielką ilość buforu w probówce.

Bramka pierwotna wykluczyła szczątki na wykresach rozproszenia przedniego i bocznego, a następnie wykluczono martwe komórki. Druga bramka wykluczyła komórki dodatnie na obecność zasadowego białka mieliny. A z pozostałych komórek utworzono wykresy gęstości komórek dodatnich dla każdego fluorochromu.

Częstość występowania każdej populacji komórek nerwowych została obliczona z trzeciej bramy. Próbki przetworzone z ręczną dysocjacją mechaniczną i trawieniem enzymatycznym dały znacznie niższą populację komórek będących przedmiotem zainteresowania, podczas gdy zarówno świeże, jak i stałe próbki przetworzone za pomocą automatycznej dysocjacji mechanicznej i trawienia enzymatycznego wykazały kilkakrotnie większą populację komórek będących przedmiotem zainteresowania. Podczas gdy etapy perfuzji i usuwania zanieczyszczeń mogą być początkowo trudne, utrzymanie gładkiej i stabilnej ręki może pomóc w zapewnieniu sukcesu.