Name: Połączona mechaniczna i enzymatyczna dysocjacja tkanki hipokampa mózgu myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-21T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: Poznaj metodę dysocjacji tkanki hipokampa myszy C57BL/6J łączącą trawienie enzymatyczne z mechanicznym rozdrabnianiem. Protokół zapewnia wysoką wydajność żywych komórek do analiz jednokomórkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Aimee Rogers za zapewnienie praktycznego szkolenia i ciągłe wsparcie produktu. Dziękujemy dr Amandzie Burke za ciągłe rozwiązywanie problemów i wyjaśnianie dyskusji. Dziękujemy Meredith Joheim i Grupie Komunikacji Naukowej UAMS za redakcję gramatyczną i formatowanie tego manuskryptu. Badanie to było wspierane przez NIH R25GM083247 i NIH 1R01CA258673 (ARA).

Eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie ze standardami etycznymi zatwierdzonymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na UAMS. 6-miesięczne samice myszy typu dzikiego C57Bl6/J zostały zakupione i trzymane w grupie (4 myszy w klatce) w stałym 12-godzinnym cyklu światło/ciemność.
1. Przygotowanie odczynników
<ol>
	<li>Przygotować możliwy do utrwalenia roztwór wyjściowy z żywych/martwych plam. Rozpuść barwienie fluorescencyjne w 20 μl dimetylosulfotlenku (DMSO).</li>
	<li>Zawinąć fiolkę w folię, oznaczyć jako "Odtworzona" i przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do sześciu miesięcy.</li>
	<li>Przygotuj 0,9% roztwór soli fizjologicznej z heparyną. Rozcieńczyć zawartość jednej fiolki heparyny sodowej (10 000 jednostek USP na 10 ml) w 1 litrze podwójnie destylowanej wody (ddH2O).</li>
	<li>Przygotować wystarczającą ilość na około 45 ml na zwierzę i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do jednego tygodnia.</li>
	<li>Zrób 1% paraformaldehydu (PFA).
	<ol>
		<li>W dygestorium podgrzej płytę grzejną do 50 °C. W kuchence mikrofalowej podgrzej 100 ml ddH2O w szklanej zlewce do temperatury około 60 °C. Dodaj mieszadło magnetyczne i przenieś na płytę grzejną.</li>
		<li>W dygestorium odważyć 1 g PFA i dodać do zlewki ddH2O. Dodać 0,1125 g kryształów NaOH i mieszać aż do rozpuszczenia (5-10 min).</li>
		<li>Dodać 0,4 g NaPO4- monobasic i mieszać do rozpuszczenia (2-5 min). Przefiltrować próżniowo roztwór i dostosować pH do 7,4 za pomocą HCl i NaOH.</li>
		<li>Schłodzić na lodzie lub w temperaturze 4°C przez 30 minut przed przechowywaniem. 
		UWAGA: Podwielokrotności 1,5 ml można przechowywać w temperaturze -20 °C przez jeden rok. Unikaj cykli zamrażania i rozmrażania. Jeśli po rozmrożeniu roztwór stanie się mętny lub wytrąci się osad, nie należy go stosować. 
		UWAGA: Toksyczny, łatwopalny. Zawsze pracuj z PFA pod wentylowanym kapturem, nosząc odpowiednie środki ochrony osobistej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zawiesić liofilizowany enzym A w 1 ml buforu A. Nie mieszaj roztworu. 
	UWAGA: Enzym A i bufor A oraz A, Y i Z są odczynnikami w komercyjnym zestawie do dysocjacji mózgu dla dorosłych17.</li>
	<li>Podzielić enzym P na podwielokrotności po 50 μl i ponownie zawiesić enzym A na 10 μl podwielokrotności. Zgodnie z instrukcją zestawu przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do sześciu miesięcy. Unikaj cykli zamrażania i rozmrażania.</li>
</ol>
2. Dzień eksperymentu
<ol>
	<li>Schłodzić wirówkę stołową do temperatury 4 °C.</li>
	<li>Umieść porcję (porcje) PFA w lodówce do stopniowego rozmrażania.</li>
	<li>Umieść odtworzoną żywą/martwą plamę w ciemności (np. w szufladzie) do rozmrożenia w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przygotować bufor do albuminy surowicy bydlęcej (BSA). Dodać 0,5 g BSA do 100 ml 1x buforowany fosforanem roztwór Dulbecco bez wapnia i magnezu (D-PBS), pH 7,2.</li>
	<li>Dodaj mieszadło i mieszaj na talerzu mieszającym przez 30 minut. Przenieść do stożkowych probówek o pojemności 50 ml i przechowywać w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Zawsze używaj świeżo przygotowanego bufora BSA.</li>
	<li>Przygotować rozcieńczenie robocze żywej/martwej plamy. Dodać 1 μl odtworzonego roztworu podstawowego żywej/martwej plamy do 360 μL D-PBS i przechowywać w ciemności (np. w szufladzie lub pudełku) w temperaturze pokojowej. Przygotować 50 μl roztworu roboczego na próbkę.</li>
</ol>
3. Perfuzja
<ol>
	<li>Umieść roztwór soli fizjologicznej z heparyną na lodzie.</li>
	<li>Włącz tlen, ustaw kulkę wskaźnika przepływomierza na parowniku do znieczulenia dla małych zwierząt na 1 l/min. Upewnij się, że ciśnienie tlenu i izofluran są odpowiednie.</li>
	<li>Ustaw pokrętło parownika na 3.5% (w celu indukcji i konserwacji).</li>
	<li>Zalać przewody pompy perfuzyjnej roztworem soli fizjologicznej/heparyny. Ustaw prędkość na 6 ml/min.</li>
	<li>Umieść mysz w komorze indukcyjnej, włącz odpowietrznik i odczekaj kilka minut, aż mysz przestanie reagować. Upewnij się, że głębokość znieczulenia jest wystarczająca dzięki braku wycofania pedału do szkodliwego szczypania.</li>
	<li>Połóż mysz na plecach na tacy sekcyjnej z nosem w stożku nosowym. Wykonaj wtórne potwierdzenie pełnego znieczulenia poprzez brak wycofania pedału do szkodliwego uszczypnięcia. Przypnij wszystkie cztery łapy do tacy.</li>
	<li>Spryskaj brzuch zwierzęcia 20% etanolem.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy uszczypnij dolną część brzucha i unieś skórę. Użyj nożyczek, aby przeciąć futro i skórę do dna klatki piersiowej.</li>
	<li>Wykonaj dwa ukośne nacięcia od spodu klatki piersiowej w kierunku każdego ramienia.</li>
	<li>Ostrożnie wyciąć przeponę (omijając płuca i serce). Wytnij klatkę piersiową, aby odsłonić serce.</li>
	<li>Ostrożnie odetnij tkankę łączną wokół serca. 
	UWAGA: Kroki 3.10-3.11 są krytyczne; Wykonuj z wprawą i zręcznością.</li>
	<li>Użyj nożyczek, aby przyciąć prawy przedsionek (ciemny płat w lewym górnym rogu serca). Wyłączyć dopływ izofluranu do odpowietrznika.</li>
	<li>Trzymaj serce stabilnie za pomocą kleszczy. Ze skosem igły motylkowej skierowanym do góry, przebij lewą komorę, trzymając igłę poziomo i równolegle do zwierzęcia.</li>
	<li>Przytrzymaj igłę na miejscu, włącz pompę i przelej co najmniej 30 ml roztworu soli fizjologicznej/heparyny, aż płyn opuszczający serce stanie się nieprzezroczysty, a wątroba i płuca będą blade. 
	UWAGA: Kroki 3.13-3.14 są krytyczne; Wykonuj z wprawą i zręcznością.</li>
	<li>Wyłącz pompę, wyjmij igłę i przenieś mysz do obszaru sekcji.</li>
</ol>
4. Sekcja
<ol>
	<li>Za pomocą dużych nożyczek chirurgicznych odetnij głowę.</li>
	<li>Wytnij futro od tyłu głowy do oczu. Oderwij skórę z powrotem, aby odsłonić czaszkę.</li>
	<li>Przytnij czaszkę między oczami. Wykonaj dwa nacięcia z tyłu czaszki, na godzinie 10 i 2, a następnie wykonaj jedno długie cięcie (trzymaj końcówki w górze, aby uniknąć uszkodzenia mózgu) wzdłuż linii środkowej czaszki do pierwotnego nacięcia między oczami.</li>
	<li>Użyj kleszczy, aby oderwać dwie połówki czaszki na boki. Użyj szpatułki, aby usunąć mózg i umieść go na szklanej szalce Petriego o średnicy 60 mm na lodzie wypełnionym zimnym D-PBS (<silna klasa="xfig">Ryc. 1).</li>
	<li>Użyj skalpela lub brzytwy, aby oddzielić każdą półkulę. Następnie usuń opuszki węchowe i móżdżek.</li>
	<li>Użyj kleszczy, aby usunąć śródmózgowie, aż hipokamp zostanie odsłonięty.</li>
	<li>Zabezpiecz mózg kleszczami. Używając drugiego zestawu kleszczy, delikatnie wysuń hipokamp z każdej półkuli i przenieś oba hipokampy do oznaczonej 1,5 ml probówki zawierającej zimny D-PBS.</li>
	<li>Umieścić probówkę z próbką zawierającą dwa hipokampy myszy na lodzie.</li>
</ol>
5. Przygotuj mieszankę enzymów 1 i 2 dla każdej próbki
UWAGA: Dla objętości większych niż 2 ml użyj pipety serologicznej 10 ml; dla objętości 200 μL-2 ml użyj pipety 1000 μL; dla objętości 21-199 μL użyj pipety 200 μL; dla objętości 2-20 μL, użyj pipety 20 μL; dla objętości poniżej 2 μL, użyj pipety 0-2 μL.
<ol>
	<li>Dla każdej próbki rozmrozić po jednej porcji enzymu P i enzymu A w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>W przypadku mieszanki enzymatycznej 1 połącz 50 μl enzymu P i 1900 μl buforu Z w oznakowanej probówce C (tabela materiałów).</li>
	<li>W przypadku mieszaniny enzymów 2 dodać 20 μl buforu Y do rozmrożonych 10 μl podwielokrotności enzymu A.</li>
</ol>
6. Protokół dysocjacji mózgu osoby dorosłej17
UWAGA: Podczas pracy z próbkami, probówki powinny być umieszczone w stojaku na probówki w temperaturze pokojowej, podczas gdy BSA i D-PBS pozostają na lodzie, chyba że zaznaczono inaczej.
<ol>
	<li>Włącz dysocjator.</li>
	<li>Użyj kleszczy, aby przenieść fragmenty tkanki hipokampa do rurki C.</li>
	<li>Przenieś 30 μl mieszanki enzymów 2 do probówki C. Przekręć nakrętkę, aż poczujesz napięcie, a następnie dokręć, aż usłyszysz kliknięcie.</li>
	<li>Umieść rurkę C do góry nogami w pozycji dysocjatora; próbce zostanie przypisany status Wybrany (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2). Przymocuj grzejnik do rurki C.</li>
	<li>Naciśnij ikonę folderu, wybierz folder Ulubione, przewiń i wybierz 37C_ABDK_02 program. Kliknij OK, aby zastosować program do wszystkich wybranych lamp C, a następnie dotknij Start (Rysunek 2).</li>
	<li>Oznaczyć jedną stożkową probówkę o pojemności 50 ml na próbkę.</li>
	<li>Umieścić sitko o pojemności 70 μm na każdej stożkowej probówce o pojemności 50 ml i zwilżyć 2 ml buforu BSA.</li>
	<li>Po zakończeniu programu wyjmij grzałkę i rurkę C z dysocjatora.</li>
	<li>Dodać 4 ml buforu BSA do próbki i nanieść mieszaninę na sitko do komórek na stożkowej probówce o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Dodaj 10 ml D-PBS do probówki C, zamknij ją i delikatnie zamieszaj roztwór. Nałóż go na sitko do komórek na stożkowej probówce o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Wyrzuć sitko do komórek i rurkę C. Odwirować zawiesinę o sile 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Następnie odessać i wyrzucić supernatant.</li>
</ol>
7. Usuwanie gruzu
<ol>
	<li>Zawiesić osad w 1550 μl zimnego D-PBS i przenieść zawiesinę do oznakowanej stożkowej probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Dodać 450 μl zimnego roztworu do usuwania zanieczyszczeń i pipetować w górę iw dół (nie wirować). 
	UWAGA: Roztwór do usuwania zanieczyszczeń jest odczynnikiem w komercyjnym zestawie dysocjacyjnym Adult Brian Dissociation Kit17.</li>
	<li>Delikatnie nałóż 1 ml zimnego D-PBS na zawiesinę komórkową, przytrzymując końcówkę przy ściance stożkowej rurki. Powtarzaj, aż całkowita ilość nakładki wyniesie 2 ml. 
	UWAGA: Ten krok ma kluczowe znaczenie; Wykonuj z wprawą i zręcznością.</li>
	<li>Wirować przy 3000 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C z pełnym przyspieszeniem i pełnym hamowaniem. 
	UWAGA: Jeśli fazy nie są wyraźnie oddzielone, powtórz kroki 7.2-7.3. Odwirować po raz ostatni przy 1000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zawieszenie powinno teraz składać się z trzech odrębnych warstw (<silna klasa="xfig">Rysunek 3). Zassać najwyższą warstwę. Przesuwaj końcówkę pipety w przód i w tył, aby zassać białą środkową warstwę. Usuń jak najwięcej środkowej warstwy, nie naruszając najniższej warstwy. 
	UWAGA: Ten krok ma kluczowe znaczenie; Wykonuj z wprawą i zręcznością.</li>
	<li>Dodaj 2 ml zimnego D-PBS i pipetuj w górę iw dół, aby wymieszać.</li>
	<li>Wirować przy 1000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C przy pełnym przyspieszeniu i pełnym hamowaniu. Odessać i wyrzucić supernatant. Zawiesić osad w 1 ml buforu BSA. 
	UWAGA: W tym momencie komórki można ponownie zawiesić w odpowiednim buforze, a następnie znakować magnetycznie i izolować w ramach przygotowań do sekwencjonowania pojedynczych komórek.</li>
</ol>
8. Liczba komórek
<ol>
	<li>Zliczanie komórek należy przeprowadzić zgodnie z protokołem producenta dostępnego licznika ogniw (jedna opcja jest zaznaczona w tabeli materiałów)</li>
</ol>
9. Żywa/martwa plama
<ol>
	<li>Pozostałe 900 μl (od 7.7) odwirować przy 1000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C przy pełnym przyspieszeniu i pełnym hamowaniu.</li>
	<li>Podczas wirowania próbki oznacz jedną rurkę przepływową na próbkę i zawiń ją w folię, aby ograniczyć ekspozycję na światło.</li>
	<li>Odessać i wyrzucić supernatant.</li>
	<li>Zawiesić osad w 50 μl rozcieńczonej żywej/martwej plamy (wcześniej przygotowanej). 
	UWAGA: Ten krok należy wykonać przy słabym oświetleniu. Aby to osiągnąć, wyłącz górne światła w pomieszczeniu.</li>
	<li>Przenieść każdą próbkę do odpowiedniej oznakowanej rurki przepływowej i inkubować w temperaturze pokojowej przez 8-10 minut w ciemności (np. w szufladzie lub pudełku).</li>
	<li>Dodać 500 μl buforu BSA i odwirować przy 1000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C przy pełnym przyspieszeniu i pełnym hamowaniu.</li>
	<li>Odessać i wyrzucić supernatant. 
	UWAGA: Pellet może nie być widoczny; Pozostawić niewielką ilość bufora, aby przypadkowo nie zassać osadu. W tym momencie komórki można ponownie zawiesić w odpowiednim buforze, zablokować i wybarwić przeciwciałami specyficznymi dla komórki. Zobacz plik uzupełniający 1, aby zapoznać się z przykładowym protocol18.</li>
</ol>
10. Fiksacja (opcjonalnie)
<ol>
	<li>Zawiesić granulat w 200 μL 1% PFA (wcześniej przygotowany). Inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przemyć przez dodanie 500 μl D-PBS i odwirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odessać supernatant. 
	UWAGA: Pellet może nie być widoczny; Pozostawić niewielką ilość bufora, aby przypadkowo nie zassać osadu.</li>
	<li>Zawiesić osad w 200 μl D-PBS i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 3 dni.</li>
</ol>
11. Cytometria przepływowa
<ol>
	<li>Oznacz nasadki filtrów na nowych probówkach.</li>
	<li>Za pomocą pipety o pojemności 1 ml odpipetuj każdą próbkę na nasadkę filtra.</li>
	<li>Odwirować krótko przy 200 x g w temperaturze 4 °C, pozwalając wirówce osiągnąć tylko 200 x g przed zatrzymaniem pracy.</li>
	<li>Przejdź do rdzenia cytometrii przepływowej w celu dalszej analizy.</li>
</ol>

<ol><li>Andersen, P., Morris, R., Amaral, D., Bliss, T., O'Keefe, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAndersen%2C+P+%22The+Hippocampus+Book%22">The Hippocampus Book</a>. , Oxford University Press, Inc. (2007).</li>
<li>Kempermann, G., Kuhn, H. G., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+influence+on+neurogenesis+in+the+dentate+gyrus+of+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Genetic influence on neurogenesis in the dentate gyrus of adult mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 10409-10414 (1997).</li>
<li>Zhao, C., Deng, W., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+Functional+Implications+of+Adult+Neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and Functional Implications of Adult Neurogenesis.</a> Cell. 132, 645-660 (2008).</li>
<li>Kempermann, G., Song, H., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+in+the+adult+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis in the adult hippocampus.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, 018812(2015).</li>
<li>Bond, A. M., Ming, G. L., Song, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+mammalian+neural+stem+cells+and+neurogenesis%3A+Five+decades+later%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Adult mammalian neural stem cells and neurogenesis: Five decades later.</a> Cell Stem Cell. 17, 385-395 (2015).</li>
<li>Sato, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+microglia+on+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Effects of microglia on neurogenesis.</a> Glia. 63, 1394-1405 (2015).</li>
<li>Lee, V. M., Scientist, S., Louis, S. A., Reynolds, B. A. Neural stem cells. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.stemcell.com/media/files/minireview/MR29019-Neural_Stem_Cells.pdf">http://www.stemcell.com/media/files/minireview/MR29019-Neural_Stem_Cells.pdf</a> (2015).</li>
<li>Mu, Y., Lee, S. W., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+in+adult+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Signaling in adult neurogenesis.</a> Current Opinion in Neurobiology. 20, 416-423 (2010).</li>
<li>Fares, J., Diab, Z. B., Nabha, S., Fares, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+in+the+adult+hippocampus%3A+history%2C+regulation%2C+and+prospective+roles%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis in the adult hippocampus: history, regulation, and prospective roles.</a> International Journal of Neuroscience. 129, 598-611 (2018).</li>
<li>Tosun, M., Semerci, F., Maletic-Savatic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+stem+cells+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of stem cells in the hippocampus.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1169, 31-53 (2019).</li>
<li>Abbott, L. C., Nigussie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neurogenesis+in+the+mammalian+dentate+gyrus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Veterinary+Medicine+Series+C%3A+Anatomia+Histologia+Embryologia%22%5BJournal%5D)">Adult neurogenesis in the mammalian dentate gyrus.</a> Journal of Veterinary Medicine Series C: Anatomia Histologia Embryologia. 49, 3-16 (2020).</li>
<li>Rodrigues, G. M., Fernandes, T. G., Rodrigues, C. A., Cabral, J. M., Diogo, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+neural+precursors+using+magnetic+activated+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Purification of human induced pluripotent stem cell-derived neural precursors using magnetic activated cell sorting.</a> Methods in Molecular Biology. 1283, Clifton, N.J. 137-145 (2015).</li>
<li>Ko, I. K., Kato, K., Iwata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+analysis+of+multiple+surface+markers+expressed+on+rat+neural+stem+cells+using+antibody+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Parallel analysis of multiple surface markers expressed on rat neural stem cells using antibody microarrays.</a> Biomaterials. 26, 4882-4891 (2005).</li>
<li>Jager, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+enzymatic+and+mechanical+methods+of+dissociation+on+neural+progenitor+cells+derived+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Effect of enzymatic and mechanical methods of dissociation on neural progenitor cells derived from induced pluripotent stem cells.</a> Advances in Medical Sciences. 61 (1), 78-84 (2017).</li>
<li>Volovitz, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-aggressive%2C+highly+efficient%2C+enzymatic+method+for+dissociation+of+human+brain-tumors+and+brain-tissues+to+viable+single-cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A non-aggressive, highly efficient, enzymatic method for dissociation of human brain-tumors and brain-tissues to viable single-cells.</a> BMC Neuroscience. 17, 1-10 (2016).</li>
<li>Reiß, S., Herzig, I., Schmitz, J., Bosio, A., Pennartz, S. Semi-automated tissue dissociation and preserved epitope integrity optimize immunomagnetic sorting of neural cells. , Available from: 
 <a target="_blank" href="www.miltenyibiotec.com">www.miltenyibiotec.com</a> (2021).</li>
<li>Adult brain dissociation kit: mouse and rat. Miltenyi Biotec. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.miltenyibiotec.com/upload/assets/IM0011920.pdf">https://www.miltenyibiotec.com/upload/assets/IM0011920.pdf</a> (2020).</li>
<li>Cell surface flow cytometry staining protocol. Miltenyi Biotec. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.miltenyibiotec.com/US-en/applications/all-protocols/cell-surface-flow-cytometry-straining-protocol-pbs-bsa-1-50.html">https://www.miltenyibiotec.com/US-en/applications/all-protocols/cell-surface-flow-cytometry-straining-protocol-pbs-bsa-1-50.html</a> (2021).</li>
<li>Finak, G., Jiang, W., Gottardo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CytoML+for+cross-platform+cytometry+data+sharing%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%3A+The+Journal+of+the+International+Society+for+Analytical+Cytology%22%5BJournal%5D)">CytoML for cross-platform cytometry data sharing.</a> Cytometry Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 93, 1189-1196 (2018).</li>
<li>Turaç, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+flow+cytometric+analysis+of+surface+and+intracellular+antigens+reveals+surface+molecule+markers+of+human+neuropoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Combined flow cytometric analysis of surface and intracellular antigens reveals surface molecule markers of human neuropoiesis.</a> PLoS One. 8, 1-14 (2013).</li>
<li>Schwarz, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+fluorescence+activated+cell+sorting+to+examine+cell-type-specific+gene+expression+in+rat+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Using fluorescence activated cell sorting to examine cell-type-specific gene expression in rat brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52537(2015).</li>
<li>Brummelman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((application+and+computational+analysis+of+high-dimensional+fluorescent+antibody+panels+for+single-cell+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">application and computational analysis of high-dimensional fluorescent antibody panels for single-cell flow cytometry.</a> Nature Protocols. 14, 1946-1969 (2019).</li>
<li>Recommended controls for flow cytometry. Abcam. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.abam.com/protocols/recommended-conntrols-for-flow-cytometry">https://www.abam.com/protocols/recommended-conntrols-for-flow-cytometry</a> (2021).</li>
<li>Fixing cells with paraformaldehyde (PFA) for flow cytometry. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://flowcytometry.utoronto.ca/wp-content/uploads/2016/02/FixingCells_PFA.pdf">https://flowcytometry.utoronto.ca/wp-content/uploads/2016/02/FixingCells_PFA.pdf</a> (2021).</li>
<li>Stewart, J. C., Villasmil, M. L., Frampton, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+fluorescence+intensity+of+selected+leukocyte+surface+markers+following+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%3A+The+Journal+of+the+International+Society+for+Analytical+Cytology%22%5BJournal%5D)">Changes in fluorescence intensity of selected leukocyte surface markers following fixation.</a> Cytometry Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 71, 379-385 (2007).</li>
<li>Armand, E. J., Li, J., Xie, F., Luo, C., Mukamel, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+sequencing+of+brain+cell+transcriptomes+and+epigenomes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Single-cell sequencing of brain cell transcriptomes and epigenomes.</a> Neuron. 109, 11-26 (2021).</li>
<li>Ho, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+single-cell+transcriptomics+in+adult+rodent+brain%3A+The+medium+spiny+neuron+transcriptome+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A guide to single-cell transcriptomics in adult rodent brain: The medium spiny neuron transcriptome revisited.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 1-16 (2018).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+technologies+in+studying+brain+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Oxidative+Medicine+and+Cellular+Longevity%22%5BJournal%5D)">Novel technologies in studying brain immune response.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2021, 6694566(2021).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methylation+atlas+of+the+mouse+brain+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">DNA methylation atlas of the mouse brain at single-cell resolution.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Mattei, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+dissociation+induces+transcriptional+and+proteotype+bias+in+brain+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Enzymatic dissociation induces transcriptional and proteotype bias in brain cell populations.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21, 1-20 (2020).</li>
<li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociation+of+microdissected+mouse+brain+tissue+for+artifact+free+single-cell+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Dissociation of microdissected mouse brain tissue for artifact free single-cell RNA sequencing.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100590(2021).</li>
<li>Delmonte, O. M., Fleisher, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry%3A+Surface+markers+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry: Surface markers and beyond.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 143, 528-537 (2019).</li>
<li>O'Connor, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relevance+of+flow+cytometry+for+biochemical+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">The relevance of flow cytometry for biochemical analysis.</a> IUBMB Life. 51, 231-239 (2001).</li>
<li>Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+protocols+for+surface+and+intracellular+antigen+analyses+of+neural+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized.+Experiments%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types.</a> Journal of Visualized. Experiments. (94), e52241(2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Kilka kroków w tym protokole dysocjacji neuronalnej wymaga biegłej techniki i zręczności - perfuzja, aspiracja supernatantu i usunięcie mieliny. Przez cały proces perfuzji narządy wewnętrzne muszą pozostać nienaruszone (poza usunięciem przepony i przycięciem serca); Obejmuje to unikanie górnych komór serca za pomocą igły motylkowej. Podczas gdy potrzebna ilość soli fizjologicznej z heparyną jest różna, przezroczysty płyn wypływający z serca wskazuje, że proces został zakończony. Mózg musi być całkowicie i prawidłowo ukrw...

Hipokamp został po raz pierwszy opisany przez bolońskiego anatoma, Giulio Cesare Aranzio, w 1500 roku w klasie sup<sup="xref">1. Nazywając tę nowo odkrytą strukturę, Aranzio prawdopodobnie zainspirował się jej niesamowitym podobieństwem do konika morskiego z rodzaju Hippocampus1. Hipokamp bierze udział w reakcjach na stres, ale jest powszechnie znany ze swojej roli w uczeniu się i pamięci. Mówiąc dokładniej, hipokamp jest odpowiedzialny za kodowanie i pobieranie pamięci deklaratywnej i przestrzennej1.
Hipokamp, czyli hipokamp właściwy, jest podzielony na podpola CA1 (cornu ammonis), CA2 i CA31. W porównaniu z resztą układu nerwowego, hipokamp ma kilka unikalnych cech definiujących, w tym plastyczność i potencjał dla trwającej neurogenezy2. Neurogeneza to proces proliferacji i różnicowania nerwowych komórek macierzystych, po którym następuje ich integracja z istniejącą wcześniej siecią neuronalną. Neurogeneza jest ograniczona do strefy podziarnistej zakrętu zębatego i strefy podkomorowej komór bocznych (i opuszki węchowej)3. Chociaż neurogeneza jest obfita w embriogenezie, jest to proces trwający całe życie3,4. W związku z tym dyskusja ta skupi się na neurogenezie dorosłych w hipokampie.
Strefy podkomorowe i subziarniste to nisze neurogenne zawierające komórki wyściółki i naczyń krwionośnych, a także niedojrzałe i dojrzałe linie nerwowych komórek macierzystych5. Mikroglej przyczynia się do powstania tych nisz jako komórki odpornościowe regulujące neurogenezę6. Neuronalne komórki progenitorowe są niemacierzystymi progeniami nerwowych komórek macierzystych7. W strefie podkomorowej obecne są trzy typy neuronalnych komórek progenitorowych: promieniste komórki glejowe typu B, komórki progenitorowe typu C wzmacniające tranzyt i neuroblasty typu A3,8. Wolno dzielące się nerwowe komórki progenitorowe typu B w strefie podkomorowej mogą różnicować się w szybko dzielące się komórki typu C8. Następnie komórki typu C różnicują się w komórki typu A8. Te neuroblasty migrują przez rostralny strumień migracyjny do opuszki węchowej, zanim zróżnicują się w interneurony lub oligodendrocyty9. Te interneurony opuszki węchowej są kluczem do krótkotrwałej pamięci węchowej i uczenia się asocjacyjnego, podczas gdy oligodendrocyty mielinizują aksony ciała modzelowatego9. Większość neurogenezy u dorosłych zachodzi w strefie podziarnistej zakrętu zębatego, gdzie znajdują się promieniowe progenitory neuronalne typu 1 i niepromieniowe typu 23. Większość nerwowych komórek progenitorowych jest przeznaczona do przekształcenia się w zębate ziarniste neurony i astrocyty10. Połączone połączeniami szczelinowymi, astrocyty tworzą sieci modulujące plastyczność, aktywność synaptyczną i pobudliwość neuronów5. Jako główny neuron pobudzający zakrętu zębatego, komórki ziarniste dostarczają dane wejściowe z kory śródwęchowej do regionu CA311.
Populacje neuronalnych komórek macierzystych mogą być izolowane za pomocą strategii izolacji immunomagnetycznej lub immunofluorescencyjnej12,13. Tkanka nerwowa jest szczególnie trudna do dysocjacji; Wysiłki w tym kierunku często skutkują próbkami o słabej żywotności komórek i/lub niewytworzeniem niezbędnej zawiesiny jednokomórkowej do dalszej analizy. Dysocjacja neuronalna może być przeprowadzona poprzez dysocjację mechaniczną (np. przy użyciu filtrów, technik siekania lub trituracji pipet), trawienie enzymatyczne lub kombinację technik14,15. W badaniu oceniającym metody dysocjacji neuronalnej porównano żywotność i jakość ręcznej dysocjacji mechanicznej za pomocą rozcierania pipet w porównaniu z kombinacjami rozcierania pipet i trawienia za pomocą różnych enzymów15. Jakość została oceniona na podstawie ilości grudek komórkowych i DNA lub szczątków subkomórkowych w przygotowanej zawiesinie15. Zawiesiny guzów glejowych poddanych samej ręcznej dysocjacji mechanicznej miały znacznie niższą żywotność komórek niż leczenie dyspazą lub kombinacją DNazy, kolagenazy i hialuronidazy15. Volovitz i in. uznali różnice w żywotności i jakości między różnymi metodami i podkreślili, że nieodpowiednia dysocjacja może zmniejszyć dokładność dalszej analizy15.
W osobnym badaniu, autorzy porównali ponad 60 różnych metod i kombinacji dysocjacji hodowanych komórek neuronalnych14. Metody te obejmowały osiem różnych wariantów ręcznej dysocjacji mechanicznej za pomocą trituracji pipet, porównanie inkubacji z pięcioma pojedynczymi enzymami w trzech różnych odstępach czasu oraz różne kombinacje dysocjacji mechanicznej z trawieniem enzymatycznym lub kombinacją dwóch enzymów14. Żadna z metod mechanicznych nie pozwoliła na uzyskanie zawiesiny jednokomórkowej14. Cztery z pojedynczych zabiegów enzymatycznych, dziesięć z kombinowanych zabiegów enzymatycznych i cztery kombinacje dysocjacji mechanicznej z trawieniem enzymatycznym dały zawiesinę pojedynczej komórki14. Trawienie enzymatyczne z TrypLE, a następnie Trypsyna-EDTA najskuteczniej dysocjowane próbki14. Nawiasem mówiąc, próbki potraktowane TrypLE i/lub Trypsin-EDTA miały tendencję do tworzenia galaretowatych grudek14. Chociaż badanie to zostało przeprowadzone na hodowanych komórkach, mówi o niedociągnięciach samego rozcierania pipetami lub trawienia enzymatycznego.
Brakuje bezpośrednich porównań ręcznej i automatycznej dysocjacji mechanicznej. Jednak jedna grupa przeprowadziła cytometrię przepływową, aby porównać ręczną i półautomatyczną mechaniczną dysocjację całych mózgów myszy w połączeniu z komercyjnymi zestawami do dysocjacji enzymatycznej papainy lub trypsyny16. Przetwarzanie za pomocą dysocjatora w bardziej spójny sposób dawało żywe komórki16. Po dysocjacji autorzy wyizolowali również komórki Prominin-1, neuronalne komórki prekursorowe i mikroglej16. W przypadku dwóch z trzech izolowanych populacji komórek czystość izolowanych komórek była nieco wyższa, gdy próbki były przetwarzane za pomocą dysocjatora, w porównaniu z manually16. Reiß i wsp. zauważyli, że zmienność między osobami w technice pipetowania utrudnia odtwarzalność plonów populacji żywotnych komórek w dysocjacji tkanek16. Autorzy doszli do wniosku, że zautomatyzowana dysocjacja mechaniczna standaryzuje przetwarzanie próbek16.
Metoda dysocjacji opisana w tym manuskrypcie to połączenie w pełni zautomatyzowanej dysocjacji mechanicznej i trawienia enzymatycznego, przy użyciu roztworów towarzyszących komercyjnemu zestawowi do dysocjacji mózgu dla dorosłych17. W przeciwieństwie do standardowych protokołów, ten zoptymalizowany protokół ogranicza manipulację próbką, daje wysoce żywotną zawiesinę jednokomórkową i jest przeznaczony do przetwarzania minimalnych ilości tkanki wyjściowej.

<table><tbody><tr><td>Probówki do mikrowirówek 1,5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-682-003</td><td>Basix, różne kolory</td></tr><tr><td>15 ml probówek Falcon</td><td>Becton Dickinson Labware Europe</td><td>352009</td><td>Polistyren</td></tr><tr><td>25 ml Pipety serologiczne</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-235</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Probówka z polistyrenu o okrągłym dnie</td><td>Falcon</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>500 ml Filtr próżniowy/ Przechowywanie System butelek</td><td>Corning</td><td>431097</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m Sitko do komórek</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do dysocjacji mózgu dla dorosłych</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>&nbsp; 130-107-677</td><td>Zawiera enzym P, bufor Z, bufor Y, enzym A, bufor A, roztwór do usuwania zanieczyszczeń</td></tr><tr><td>Folia aluminiowa</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-213-105</td><td></td></tr><tr><td>Anti-ACSA-2-PE-Vio770, mysz, klon REA969</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-116-246</td><td></td></tr><tr><td>Podstawowe białko antymielinowe</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3821-100UG</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PSA-NCAM-PE, człowiek, mysz i szczur, klon 2-2B</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-117-394</td><td></td></tr><tr><td>BD LSRFortessa</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-50G</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-VioBlue, mysz, klon REA592</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-113-810</td><td></td></tr><tr><td>CD31 Przeciwciało</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-111-541</td><td></td></tr><tr><td>Ceramiczne mieszadło z płytą grzejną</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-100-100SH</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Pharmco firmy Greenfield Global</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 ml stożkowe probówki wirówkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>- Sharp</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-09</td><td></td></tr><tr><td>Perfusion FlowJo</td><td>BD</td><td></td> <td>(v10.7.0)</td></tr><tr><td>Rurki GentleMACS C</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>GentleMACS Octo Dysocjator z grzałkami</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-427</td><td></td></tr><tr><td>Gibco DPBS (1X)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Szklana zlewka</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-555-25A</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna sodowa</td><td>Fresenius Kabi</td><td>504011</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>L34965</td><td></td></tr><tr><td>Magnetyczny pręt do mieszania</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-513-51</td><td></td></tr><tr><td>Noyes Noyes Nożyczki sprężynowe</td><td>Fine Science Tools</td><td>15012-12</td><td>Rozwarstwienie</td></tr><tr><td>Paraformaldehydu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>441244-3KG</td><td>Prilled, 95%</td></tr> <tr><td>końcówki do pipet GP LTS 20 i mikro; L 960A/10</td><td>Końcówki</td> do pipet <td>Rainin 30389270</td><td></td></tr><tr><td>GP LTS 250 &micro; L 960A/10</td><td>Końcówki</td> do pipet <td>Rainin 30389277</td><td></td></tr><tr><td>RT LTS 1000 &micro; L FL 768A/8</td><td>Rainin</td><td>30389213</td><td></td></tr><tr><td>Rainin Pipet-Lite XLS (2, 20, 200, 1000 &mu; L)</td> <td>Rainin</td><td>30386597</td><td></td></tr><tr><td>RBXMO FITC XADS</td><td>Fisher Scientific</td><td>A16167</td><td></td></tr><tr><td>Okrągłe wiadro na lód z pokrywką</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-210-129</td><td></td></tr><tr><td>Probówki z okrągłym dnem z nasadką sitkową</td><td>Falcon</td><td>100-0087</td><td></td></tr><tr><td>S1 Napełniacze do pipet</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>9541</td><td></td></tr><tr><td>i szpatułka Sonda</td><td>Precyzyjne narzędzia naukowe</td><td>10090-13</td><td>Rozwarstwienie i </td></tr><tr><td>Zestaw do infuzji perfuzyjnej Surflo Winged 23 G x 3/4"</td><td>Termuno</td><td>SV-23BLK</td> Stojak na probówki z <td>igłą motylkową</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>14-809-37</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka Thermo Scientific Legend XTR</td><td>ThermoFisher</td><td>wycofana z produkcji</td><td>Lub inna standardowa wirówka stołowa</td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna o zmiennym przepływie</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-876-2</td><td>Model o niskim przepływie</td></tr><tr><td>Zestaw startowy VetFlo dla myszy</td><td>Kent Scientific</td><td>VetFlo-MSEKIT</td><td>Maska anestezjologiczna, rurka, komora indukcyjna, kanistry z węglem drzewnym</td></tr><tr><td>Waporyzator VetFlo Jednokanałowy system anestezjologiczny</td><td>Kent Scientific</td><td>VetFlo-1210S</td><td>0,2&ndash; 4 LPM</td></tr><tr><td>Vi-CELL XR Analizator żywotności komórek</td><td>Beckman Coulter Nauki przyrodnicze</td><td>731196</td><td>Liczenie komórek</td></tr><tr><td>Vi-CELL XR 4 worki fiolek na próbki</td><td>Beckman Coulter Nauki Przyrodnicze</td><td>383721</td><td>Liczenie komórek</td></tr></tbody></table>

połączona mechaniczna i enzymatyczna dysocjacja tkanki hipokampa mózgu myszy

Combined Mechanical and Enzymatic Dissociation of Mouse Brain Hippocampal Tissue

Ten protokół dysocjacji neuronalnej (adaptacja protokołu towarzyszącego komercyjnemu zestawowi do dysocjacji mózgu dla dorosłych) optymalizuje przetwarzanie tkanek w ramach przygotowań do szczegółowych analiz końcowych, takich jak cytometria przepływowa lub sekwencjonowanie pojedynczych komórek. Dysocjacja neuronalna może być prowadzona poprzez dysocjację mechaniczną (taką jak przy użyciu filtrów, technik siekania lub rozcierania pipet), trawienie enzymatyczne lub ich kombinację. Delikatna natura komórek nerwowych może komplikować wysiłki zmierzające do uzyskania wysoce żywotnej, prawdziwej zawiesiny pojedynczej komórki z minimalną ilością zanieczyszczeń komórkowych, które są wymagane do analizy pojedynczej komórki. Dane pokazują, że to połączenie zautomatyzowanej dysocjacji mechanicznej i trawienia enzymatycznego konsekwentnie daje wysoce żywotną (>90%) zawiesinę jednokomórkową, pokonując wyżej wymienione trudności. Podczas gdy niektóre kroki wymagają zręczności manualnej, kroki te zmniejszają obsługę próbki i potencjalną utratę komórek. Ten manuskrypt szczegółowo opisuje każdy etap procesu, aby wyposażyć inne laboratoria w skuteczne dysocjowanie niewielkich ilości tkanki nerwowej w ramach przygotowań do dalszej analizy.

Próbki opracowano przy użyciu cytometru przepływowego w jednostce centralnej, a uzyskane dane oceniono za pomocą pakietu oprogramowania do analizy przepływowej. Wcześniej przeanalizowano kontrole kompensacji – barwienie żywe/martwe oraz kontrolę negatywną. W przypadku użycia wielu fluorochromów dla każdego przeciwciała należy przygotować kontrole fluorescencji minus jeden (FMO) oraz kontrole jednobarwne. Kompensację nakładania się widm dla próbek doświadczalnych obliczono na podstawie przeanalizowanych kontroli. Do ident...

Ten protokół dysocjacji komórek nerwowych jest przeznaczony dla próbek z małą ilością materiału wyjściowego i daje wysoce żywotną zawiesinę pojedynczej komórki do dalszej analizy, z opcjonalnymi etapami utrwalania i barwienia.

Połączona mechaniczna i enzymatyczna dysocjacja tkanki hipokampa mózgu myszy

This neural dissociation protocol (an adaptation of the protocol accompanying a commercial adult brain dissociation kit) optimizes tissue processing in ...

Skuteczna dysocjacja niewielkich ilości tkanki nerwowej może wyposażyć laboratoria w narzędzia do uzyskania specyficznego dla struktury wglądu w skuteczność leczenia, funkcje komórkowe, a także choroby i mechanizmy działania leczenia. Ten protokół dysocjacji neuronalnej konsekwentnie daje wysoce żywotną i rzeczywistą zawiesinę pojedynczej komórki. Ponadto możemy przetwarzać próbki, które stanowią tylko ułamek tych, do których przeznaczone są zestawy komercyjne.Właściwe planowanie i przygotowanie są kluczem do pomyślnego wyniku tej techniki. Korzystne byłoby przeprowadzenie kilku rund treningowych w celu zapoznania się z protokołem. Po znieczuleniu sześciomiesięcznej samicy myszy C57BL/6J, uszczypnij dolną część brzucha i unieś skórę za pomocą kleszczy.Następnie za pomocą nożyczek przetnij futro i skórę do dna klatki piersiowej. Wykonaj dwa ukośne nacięcia, zaczynając poniżej klatki piersiowej i przesuwając się w kierunku każdego ramienia. Następnie ostrożnie wytnij przeponę i klatkę piersiową, aby odsłonić serce.Po ostrożnym usunięciu tkanki łącznej wokół serca, użyj nożyczek, aby przyciąć prawy przedsionek. Następnie należy wyłączyć dopływ izofluranu do odpowietrznika. Trzymając serce stabilnie za pomocą kleszczy i skosem igły motylkowej skierowanym do góry, przebij lewą komorę, trzymając igłę poziomo i równolegle do zwierzęcia.Następnie, przytrzymując igłę na miejscu, włącz pompę i przelej co najmniej 30 mililitrów roztworu soli fizjologicznej lub heparyny, aż płyn opuszczający serce stanie się nieprzezroczysty, a wątroba i płuca będą blade. Po perfuzji wyłącz pompę, wyjmij igłę i przenieś mysz do obszaru sekcji. Po ścięciu głowy odetnij futro od tyłu głowy do oczu i oderwij skórę z powrotem, aby odsłonić czaszkę.Następnie przypnij czaszkę między oczami i wykonaj dwa nacięcia z tyłu czaszki w pozycjach godziny 10 i 2. Następnie wykonaj jedno długie cięcie wzdłuż linii środkowej czaszki do oryginalnego nacięcia między oczami. Następnie za pomocą kleszczy oderwij dwie połówki czaszki na boki.Następnie za pomocą szpatułki usuń mózg i umieść go na 60-milimetrowej szklanej szalce Petriego wypełnionej zimnym DPBS i trzymanej na lodzie. Za pomocą skalpela lub brzytwy oddziel każdą półkulę i usuń opuszki węchowe i móżdżek. Następnie usuń śródmózgowie, aż hipokamp zostanie odsłonięty.Następnie zabezpiecz mózg kleszczami. Następnie, używając drugiego zestawu kleszczy, delikatnie wysuń hipokamp z każdej półkuli. Przenieś oba hipokampy do oznaczonej 1,5-mililitrowej rurki zawierającej zimny DPBS i umieść rurkę na lodzie.Za pomocą kleszczy przenieś kawałki tkanki hipokampa do rurki C i dodaj 30 mikrolitrów mieszanki enzymów 2 do probówki. Po przekręceniu nakrętki i dokręceniu aż do kliknięcia należy umieścić rurkę w dysocjatorze i uruchomić odpowiedni program. Podczas działania programu należy wstępnie zwilżyć sitko o średnicy 70 mikronów umieszczone na stożkowej rurce o pojemności 50 mililitrów z dwoma mililitrami buforu BSA.Po zakończeniu programu dysocjacji dodaj cztery mililitry buforu BSA do zdysocjowanej tkanki i przefiltruj mieszaninę przez sitko komórkowe na 50-mililitrowej stożkowej probówce. Następnie dodaj 10 mililitrów DPBS do rurki C. Następnie zamknij probówkę, delikatnie zamieszaj roztwór i przefiltruj go przez sitko komórkowe na stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów.Przefiltrowaną zawiesinę komórkową odwirować, wyrzucić supernatant bez naruszania osadu i przechowywać osad. W celu usunięcia zanieczyszczeń ponownie zawiesić granulat z 1 550 mikrolitrami zimnego DPBS i przenieść zawiesinę do oznakowanej stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów. Następnie dodaj 450 mikrolitrów zimnego roztworu do usuwania zanieczyszczeń i pipetuj w górę iw dół.Delikatnie nałóż zawiesinę komórek na jeden mililitr zimnego DPBS, przytrzymując końcówkę przy ściance stożkowej rurki. Powtarzaj procedurę, aż całkowita nakładka wyniesie dwa mililitry. Następnie odwirować zawiesinę pod ciśnieniem 3 000 razy G przez 10 minut z pełnym przyspieszeniem i pełną przerwą.Zassać najwyższą warstwę, a następnie przesunąć końcówkę pipety w przód i w tył, aby zassać białą środkową warstwę. Usuń jak najwięcej środkowej warstwy, nie naruszając najniższej warstwy. Następnie dodaj dwa mililitry zimnego DPBS i pipetuj w górę iw dół, aby wymieszać.Następnie odwirować zawiesinę pod ciśnieniem 1000 razy G przez 10 minut z pełnym przyspieszeniem i pełną przerwaniem. Po odwirowaniu wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w jednym mililitrowym buforze BSA. Po zliczeniu komórek odwirować pozostałą zawiesinę komórek i ponownie zawiesić osad w 50 mikrolitrach rozcieńczonej żywej martwej plamy.Następnie przenieść próbkę do oznakowanej rurki przepływowej i inkubować w temperaturze pokojowej przez 8 do 10 minut w ciemności. Po inkubacji dodać 500 mikrolitrów buforu BSA i powtórzyć etap wirowania. Następnie wyrzucić supernatant, pozostawiając niewielką ilość buforu w probówce.Bramka pierwotna wykluczyła szczątki na wykresach rozproszenia przedniego i bocznego, a następnie wykluczono martwe komórki. Druga bramka wykluczyła komórki dodatnie na obecność zasadowego białka mieliny. A z pozostałych komórek utworzono wykresy gęstości komórek dodatnich dla każdego fluorochromu.Częstość występowania każdej populacji komórek nerwowych została obliczona z trzeciej bramy. Próbki przetworzone z ręczną dysocjacją mechaniczną i trawieniem enzymatycznym dały znacznie niższą populację komórek będących przedmiotem zainteresowania, podczas gdy zarówno świeże, jak i stałe próbki przetworzone za pomocą automatycznej dysocjacji mechanicznej i trawienia enzymatycznego wykazały kilkakrotnie większą populację komórek będących przedmiotem zainteresowania. Podczas gdy etapy perfuzji i usuwania zanieczyszczeń mogą być początkowo trudne, utrzymanie gładkiej i stabilnej ręki może pomóc w zapewnieniu sukcesu.

combined-mechanical-enzymatic-dissociation-mouse-brain-hippocampal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Dysocjacja komórek z konkretnych typów tkanek wymaga zastosowania specyficznych parametrów agitacji tkanki, aby uzyskać wysoką liczbę żywych komórek zdolnych do hodowli. Urządzenie Miltenyi gentleMACS Dissociator optymalizuje to zadanie dzięki prostemu, praktycznemu protokołowi. W niniejszej publikacji wyjaśniono zastosowanie tego urządzenia w odniesieniu do tkanki nerwowej.

Przygotowanie zawiesin pojedynczych komórek z tkanki nerwowej myszy

Ten film demonstruje protokół uzyskiwania wysoce żywotnej zawiesiny jednokomórkowej z hipokampa mózgu myszy przy użyciu kombinacji automatycznej dysocjacji mechanicznej i mieszaniny enzymów wspomagających trawienie enzymatyczne.

Uzyskiwanie zawiesiny jednokomórkowej z tkanki hipokampa myszy

Ten film demonstruje protokół ekstrakcji komórek mikrogleju ze zmian demielinizacyjnych w mózgach myszy za pomocą magnetycznego sortowania komórek. Protokół obejmuje preparację uszkodzonej tkanki mózgowej zawierającej komórki mikrogleju, potraktowanie tkanki określonymi enzymami w celu uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki oraz wykorzystanie kulek magnetycznych specyficznych dla receptora mikrogleju do wyizolowania komórek mikrogleju.

Izolowanie mikrogleju ze zmian demielinizacyjnych w mózgu myszy za pomocą magnetycznego sortowania komórek aktywowanych

Ten film demonstruje protokół izolowania komórek z hipokampów szczurów, w tym neuronów, astrocytów i mikrogleju.

Uzyskiwanie różnych populacji komórek nerwowych z hipokampa szczura

Ten film pokazuje rejestrację rytmicznej aktywności sieci neuronalnej, znanej również jako oscylacje theta, w izolowanym hipokampie. Elektrody są umieszczane w różnych warstwach i pozycjach przestrzennych w celu wykrywania i analizowania oscylacji theta. Pokazuje to unikalny skład neuronalny i łączność sieci neuronalnej w różnych warstwach hipokampa.

Zapis in vitro oscylacji theta w hipokampie myszy

Pierwotne odłączone embrionalne kultury neuronów hipokampa są przydatne do badania mechanizmów sygnalizacyjnych związanych ze śmiercią neuronów. Określenie płci zarodków przed izolacją i dysocjacją hipokampa pozwala na przygotowanie oddzielnych kultur męskich i żeńskich, co umożliwia badaczowi zidentyfikowanie i zbadanie sygnalizacji komórkowej specyficznej dla płci.

Stratyfikowane kultura neuronów według płci w celu zbadania szlaków śmierci komórek niedokrwiennych

Opisano protokół generowania systemu kokulturowego składającego się z neuronów pochodzących z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC), pierwotnych neuronów korowych i astrocytów. Ten system kohodowli umożliwia wykrycie powstawania kontaktów i obwodów synaptycznych między nowymi neuronami pochodzącymi z iPSC a istniejącymi wcześniej neuronami korowymi wykazującymi ekspresję rodopsyny kanałowej-2.

Optogenetyczne podejście do oceny tworzenia połączeń neuronalnych w systemie kokulturowym

Ten protokół opisuje przygotowanie poziomych wycinków kory hipokampowo-śródwęchowej (HEC) od myszy wykazujących spontaniczną aktywność fal ostrych. Plastry są inkubowane w uproszczonej komorze przechowawczej, a nagrania są wykonywane w warunkach zanurzonych z szybko płynącym sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym, aby promować dotlenienie tkanek i spontaniczne pojawienie się aktywności na poziomie sieci.

Ostre krojenie mózgu myszy w celu zbadania spontanicznej aktywności sieci hipokampa

Ten artykuł ma na celu opisanie systematycznego protokołu uzyskiwania poziomych wycinków mózgu hipokampa u myszy. Celem tej metodologii jest zachowanie integralności szlaków włókien hipokampa, takich jak ścieżka perforantu i szlak włókien omszałych, w celu oceny procesów neurologicznych związanych z zakrętem zębatym.

Poziome wycinki hipokampa mózgu myszy

Tutaj pokazujemy, jak połączyć transfekcję pierwotnych neuronów gryzoni hipokampa z obrazowaniem konfokalnym żywych komórek, aby przeanalizować patologiczne efekty wywołane przez białka na transport aksonalny i zidentyfikować szlaki mechanistyczne pośredniczące w tych efektach.

Wykorzystanie obrazowania żywych komórek do pomiaru wpływu patologicznych białek na transport aksonalny w pierwotnych neuronach hipokampa

Obecny protokół opisuje, jak izolować i oczyszczać pierwotny mikroglej hipokampa od dorosłych myszy, a następnie instrukcje dotyczące przeprowadzania zapisów całokomórkowych na tych ostro izolowanych komórkach.

Izolacja i zapis całokomórkowy mikrogleju hipokampa od dorosłych myszy

Poznaj metodę dysocjacji tkanki hipokampa myszy C57BL/6J łączącą trawienie enzymatyczne z mechanicznym rozdrabnianiem. Protokół zapewnia wysoką wydajność żywych komórek do analiz jednokomórkowych.

Połączona mechaniczna i enzymatyczna dysocjacja tkanki hipokampa mózgu myszy

Przeglądaj więcej filmów