Wykrywanie indel po mutagenezie CRISPR/Cas9 przy użyciu analizy stopienia w wysokiej rozdzielczości u komara Aedes aegypti
10 września 2021
Ten artykuł opisuje protokół szybkiej identyfikacji indeli indukowanych przez CRISPR/Cas9 i selekcji linii mutantów u komara Aedes aegypti za pomocą analizy topnienia w wysokiej rozdzielczości.
Protokół ten jest bardzo prostym i skutecznym sposobem wykrywania mutantów generowanych przez technologię CRISPR/Cas9 od wielu osób. Dwie główne zalety tej techniki to to, że można ją wykonać w ciągu kilku godzin i że można ją zastosować do wielu organizmów. Projektowanie starterów może być wyzwaniem dla niektórych genów, a wiele rund projektowania i weryfikacji starterów może być wymaganych, aby HRMA było skuteczne.
Aby wykonać gradientowy PCR, zacznij od przygotowania mieszanki wzorcowej. Następnie usunąć 19 mikrolitrów mieszanki wzorcowej do kontroli bez matrycy lub NTC na płytce 96-dołkowej. Następnie dodaj szablon do pozostałego miksu głównego.
Podwielokrotność 20 mikrolitrów próbki wymieszać z płytką 96-dołkową. Wykonaj PCR zgodnie z parametrami cyklicznymi, a następnie wygeneruj profile termicznego topnienia przy użyciu parametrów wymienionych w manuskrypcie. Po zebraniu całego wymaganego materiału należy przygotować mieszankę wzorcową z 0,5 mikrolitra odczynnika uwalniającego DNA i 20 mikrolitrami buforu rozcieńczającego na osobę, która ma być genotypowana.
Za pomocą pipety wielokanałowej przesypać 20 mikrolitrów mieszanki na płytkę do PCR i pozostawić płytkę PCR na lodzie. Następnie umieść znieczulone komary G1 na szklanej szalce Petriego, aby je uspokoić, a następnie umieść osiem komarów typu dzikiego na drugiej szalce Petriego. Przetrzyj pęsetę 70% etanolem i użyj zdezynfekowanej pęsety, aby usunąć jedną z tylnych nóg komara.
Następnie zanurz nogę w roztworze odczynnika uwalniającego DNA. Umieścić komara w odpowiedniej fiolce i zamknąć fiolkę gąbką. Po zakończeniu przetrzyj pęsetę 70% etanolem przed przystąpieniem do usuwania nogi z następnego komara, aż 96-dołkowa płytka zostanie ukończona.
Następnie uszczelnić płytkę optyczną uszczelką PCR i inkubować płytkę PCR zawierającą nogi w temperaturze pokojowej przez dwie do pięciu minut, a następnie inkubować w temperaturze 98 stopni Celsjusza przez dwie minuty. Poczekaj, aż talerz ostygnie do temperatury pokojowej. W przypadku PCR należy przygotować mieszaninę wzorcową zawierającą preferowane składniki, a następnie za pomocą pipety wielokanałowej przenieść 19 mikrolitrów mieszanki wzorcowej do każdego dołka płytki 96-dołkowej.
Po przeniesieniu na płytkę jednego mikrolitra roztworu uwalniającego DNA zawierającego wcześniej przygotowane DNA komara, należy uszczelnić płytkę uszczelką optyczną PCR. Wykonaj PCR z odpowiednimi parametrami cyklicznymi, aby wygenerować profile termicznego topnienia zgodnie z parametrami opisanymi w manuskrypcie, a następnie zbadaj profile stopu, przypisując kontrolę typu dzikiego do klastra referencyjnego. Zaznacz różne klastry odpowiednimi kolorami na 96-dołkowym szablonie.
Następnie wybierz osoby z interesującymi Cię krzywymi i usuń wybrane osoby z rurek do krzyżowania wstecznego. Krew karmi samice, a następnie zbiera G2A. W analizie reprezentatywnej przedstawiono analizę sekwencji mutanta ZIP11 Aedes aegypti.
Elektroferogram heterozygotycznych mutantów Aedes aegypti ZIP11 wskazał pozycję nukleotydu, w której wystąpił indel. Indel jest reprezentowany przez przesunięcie od pojedynczych do podwójnych pików, ponieważ pozycje polimorficzne pokazują oba nukleotydy jednocześnie. Na koniec serii liczba usuniętych lub wstawionych par zasad została obliczona poprzez zliczenie pojedynczych pików.
Komary zawierające mutacje w genach Aedes aegypti ZIP11 i myo-fem poddano genotypowaniu i sekwencjonowaniu zweryfikowano za pomocą wysokorozdzielczej analizy stopienia HRMA. Sygnały fluorescencyjne próbek zostały znormalizowane do względnych wartości od jednego do zera. Dodatkowo każda krzywa została odjęta od odniesienia typu dzikiego i oznaczona odpowiednim powiększeniem.
Nieudane automatyczne przypisanie klastra jest pokazane w reprezentatywnych wynikach, w których nie dokonano prawidłowego rozróżnienia między grupami. Ponadto każda próbka była analizowana indywidualnie i przypisywana do odpowiednich grup na podstawie podobieństwa do próbek referencyjnych heterozygot, homozygot i transheterozygot. Po wykonaniu HRMA konieczne jest sekwencjonowanie DNA od zmutowanych osobników w celu analizy indeli i zidentyfikowania innych mutacji w docelowej sekwencji.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
W niniejszym artykule szczegółowo opisano protokół szybkiej identyfikacji insercji i delecji (indels) indukowanych przez CRISPR/Cas9 oraz selekcji linii mutantów u komara Aedes aegypti z wykorzystaniem analizy wysokorozdzielczego topnienia (HRM). Metoda ta jest wydajna i znajduje zastosowanie u różnych organizmów, umożliwiając szybkie wykrywanie mutantów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Genetyka
- Biologia molekularna
- Entomologia
Wstęp
- Technologia CRISPR/Cas9 jest powszechnie wykorzystywana do edycji genów.
- Efektywne identyfikowanie mutacji ma kluczowe znaczenie dla badań genetycznych.
- Analiza wysokorozdzielczego topnienia (HRMA) oferuje szybką metodę detekcji.
- Trudności w projektowaniu starterów mogą wpływać na wydajność HRMA.
Cel badania
- Zapewnienie protokołu identyfikacji mutacji indukowanych przez CRISPR.
- Wykazanie możliwości zastosowania HRMA u różnych organizmów.
- Usprawnienie procesu selekcji linii mutantów.
Zastosowane metody
- Przygotowanie mieszaniny master mix do PCR.
- Zastosowanie kontroli bez matrycy (NTC) na płytce 96-dołkowej.
- Gradientowy PCR w celu optymalizacji warunków.
- Analiza wysokorozdzielczego topnienia (HRM) do wykrywania indeli.
Główne wyniki
- Protokół umożliwia szybką identyfikację mutantów.
- Analizę HRMA można przeprowadzić w ciągu kilku godzin.
- Dla zapewnienia efektywności może być konieczne przeprowadzenie kilku rund projektowania starterów.
- Metoda ta jest uniwersalna i może być stosowana u różnych gatunków.
Wnioski
- Niniejszy protokół zwiększa efektywność wykrywania mutantów.
- Stanowi on wartościowe narzędzie w badaniach genetycznych komarów.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tej metodzie w celu szerszych zastosowań.
Najczęściej zadawane pytania
Zastosowanie w przemyśle
Szybka detekcja insercji i delecji (indels) indukowanych przez CRISPR/Cas9 umożliwia efektywną walidację celów w badaniach nad kontrolą wektorów, skracając czas trwania funkcjonalnych badań genetycznych. Analiza wysokorozdzielczego topnienia (HRM) pozwala na skalowalne genotypowanie bez konieczności uboju organizmów, co ułatwia późniejsze testy fenotypowe i krzyżowania genetyczne. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną w fazie wczesnego odkrywania poprzez zapewnienie ilościowego wykrywania mutacji z minimalnych próbek tkanek.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez szybkie wykrywanie indeli po mutagenezie CRISPR.
- Wartość operacyjna: Wspiera biologiczną redukcję ryzyka poprzez identyfikację alleli zmutowanych bez konieczności uboju organizmów, co pozwala na zachowanie próbek do dalszych analiz.
- Wpływ na portfolio: Przyspiesza procesy walidacji celów, umożliwiając szybszą priorytetyzację celów genowych w systemach istotnych dla przebiegu choroby.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie znormalizowanych krzywych topnienia fluorescencyjnego, co umożliwia ilościowe porównanie genotypów typu dzikiego i mutantów.
- Wartość operacyjna: Kompatybilność z formatami płytek 96-dołkowych wspiera przesiewanie osobników poddanych edycji z umiarkowaną przepustowością.
- Gotowość analizy: Generuje rozróżnialne profile topnienia dla heterozygot, homozygot i transheterozygot, co umożliwia niezawodne przypisanie do klastrów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Umożliwia genotypowanie, po którym następuje fenotypowanie lub karmienie krwią, co pozwala powiązać modyfikację genetyczną z wynikami funkcjonalnymi w modelach chorób.
- Minimalizacja ryzyka mechanistycznego: Ułatwia charakterystykę insercji i delecji (indel) poprzez sekwencjonowanie w dalszych etapach, potwierdzając efekty w miejscu docelowym i identyfikując potencjalne modyfikacje poza celem.
- Wsparcie dla modeli przedklinicznych: Umożliwia tworzenie linii mutantów Aedes aegypti, kluczowego wektora w badaniach nad transmisją arbrowirusów.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum odkryć, od mutagenezy CRISPR po identyfikację wiodących związków, stanowiąc punkt kontrolny genotypowania przed walidacją funkcjonalną.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez poprzez szybką identyfikację insercji i delecji (indeli), które zaburzają funkcję genów w badanych szlakach sygnałowych.
- Przesiewanie: Umożliwia standaryzację testów dzięki znormalizowanej analizie krzywych topnienia oraz grupowaniu w oparciu o referencje.
- Analityka: Generuje ilościowe przesunięcia profilu topnienia korelujące z wielkością indela, co umożliwia analizę porównawczą między próbkami.
- Badania translacyjne: Łączy modyfikację genetyczną z oceną fenotypową, umożliwiając wykorzystanie żywych organizmów po genotypowaniu.
- Zastosowania systemowe: Możliwość ponownego wykorzystania w różnych organizmach i genach, dzięki elastycznemu projektowaniu starterów wspierającemu szerokie zastosowanie w różnych celach.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów poprzez dostarczenie bezpośrednich dowodów na wyniki edycji genów.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność dzięki ustandaryzowanym protokołom PCR i analizy krzywych topnienia z wbudowanymi kontrolami.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową poprzez skrócenie czasu i zmniejszenie zasobów potrzebnych do przesiewania mutantów.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia dostosowanie postępów prac do ryzyka poprzez potwierdzenie obecności mutacji przed zainwestowaniem w testy fenotypowe.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w projektowaniu i optymalizacji starterów, ponieważ niektóre geny mogą wymagać wielokrotnych iteracji projektowych w celu zapewnienia wydajnej analizy HRMA.
- Zależne od aparatury z precyzyjną kontrolą rampy temperatury i detekcją fluorescencji niezbędną do wysokorozdzielczej analizy topnienia.
- Wymaga standaryzowanego przygotowania próbek z wykorzystaniem tkanki kończyny i odczynników do uwalniania DNA, aby zapewnić spójną jakość materiału wejściowego.
- Wymaga referencyjnych próbek typu dzikiego do dokładnego przypisania klastrów i normalizacji profilu topnienia.
- Ograniczone koniecznością przeprowadzenia sekwencjonowania po analizie HRMA w celu pełnej charakterystyki indeli oraz wykrycia dodatkowych mutacji w sekwencji docelowej.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:33
A Gradient PCR Using Genomic DNA (gDNA) from a Single Individual
1:09
Preparation of Genomic DNA from Mosquito Legs
2:31
Perform PCR
3:35
Results: Detection of CRISPR/Cas9-Induced Indels and the Establishment of Mutant Lines in the Mosquito Aedes aegypti
5:02
Conclusion
