Name: Wykrywanie indel po mutagenezie CRISPR/Cas9 przy użyciu analizy stopienia w wysokiej rozdzielczości u komara Aedes aegypti (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-10T14:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 30 s
Description: Naucz się wykrywać mutacje indel po edycji CRISPR/Cas9 u komara Aedes aegypti przy użyciu analizy stopienia w wysokiej rozdzielczości. Ta metoda umożliwia szybką identyfikację mutantów w ciągu kilku godzin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wszystkie figurki zostały stworzone za pomocą Biorender.com na podstawie licencji Texas A&M University. Prace te były wspierane przez fundusze z Narodowego Instytutu Alergii i Chorób Zakaźnych (AI137112 i AI115138 do Z.N.A.), Texas A&M AgriLife Research w ramach programu grantowego Insect Vectored Disease Grant Program oraz USDA National Institute of Food and Agriculture, projekt Hatch 1018401.

1. Skanowanie w poszukiwaniu polimorfizmów pojedynczych nukleotydów (SNP), projektowanie starterów HRMA i walidacja starterów
<ol>
	<li>Identyfikacja SNP u komarów z kolonii laboratoryjnych typu dzikiego
	<ol>
		<li>Wybierz docelowy ekson, aby zakłócić prawidłową translację polipeptydów. 
		UWAGA: Cel powinien znajdować się blisko kodonu start lub wśród kluczowych reszt wymaganych do funkcjonowania białka. Im krótszy ekson (np. ≤200 zasad), tym trudniej jest go namierzyć i przeanalizować. Unikaj edycji blisko granic eksonu, ponieważ zmusza to jeden ze starterów HRMA do przejścia przez intron lub znalezienia się w intronie. Jest to niepożądane, ponieważ wskaźniki SNP są zwykle znacznie wyższe w tych regionach.</li>
		<li>Wzór podkładu
		<ol>
			<li>Wejdź na stronę NCBI Blast - Primer Blast class15, skopiuj i wklej wybrany ekson w polu u góry strony | wybierz rozmiar produktu PCR (upewnij się, że obejmuje większość eksonu) | wybierz organizm.</li>
			<li>Kliknij Parametry zaawansowane | Wybierz (dla produktu PCR Tm) i dodaj 60 (dla optymalnej temperatury 60 °C) | Zdobądź podkłady. Pozostałe parametry należy zachować jako domyślne.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Uzyskaj genomowe DNA (gDNA) z kolonii laboratoryjnej typu dzikiego. Odłóż na bok 10 komarów, znieczul je CO2 i umieść na szalce Petriego na lodzie, aby były nieaktywne. Ustawić 10 probówek zawierających 0,5 μl odczynnika do uwalniania DNA z tkanki i 20 μl buforu do rozcieńczania, oba dostarczone w zestawie do uwalniania DNA sugerowanym w Tabeli Materiałów.</li>
		<li>Usunąć jedną nogę z pojedynczego komara za pomocą kleszczy i umieścić ją w odpowiedniej probówce z rozcieńczonym roztworem odczynnika uwalniającego DNA (od kroku 1.1.3), całkowicie zanurzając nogę w roztworze. Powtórz ten krok z pozostałymi komarami, wycierając kleszcze 70% etanolem przed przejściem do następnego.</li>
		<li>Roztwór zawierający nogę inkubować w temperaturze pokojowej przez 2-5 minut, a następnie w temperaturze 98 °C przez 2 minuty i pozostawić do ostygnięcia, przygotowując reakcję PCR. 
		UWAGA: Płytki zawierające uwolnione gDNA mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C, a protokół może zostać w tym momencie wstrzymany.</li>
		<li>Przygotować 10 probówek zawierających 10 μl 2x PCR Master Mix, startery do końcowego stężenia 0,5 μM i wodę molekularną do końcowej objętości 20 μl i przenieść 1 μl rozcieńczonej próbki do każdej probówki. Wykonać PCR zgodnie z następującymi parametrami cyklicznymi: 98 °C 5 min, 40 cykli po 98 °C przez 5 s, 60 °C 30 s, 72 °C 20 s na kb; końcowe przedłużenie temperatury 72 °C przez 1 min.</li>
		<li>Oczyść produkty PCR enzymem w celu degradacji pozostałych starterów PCR i defosforylacji nadmiaru dNTP lub dowolnego zestawu do czyszczenia kolumny. Kontynuuj sekwencjonowanie próbek.</li>
		<li>Przeanalizuj każdy elektroferogram pod kątem obecności podwójnych pików/niejednoznacznych zasad i dostosuj wywołania podstawowe ręcznie w każdej sekwencji przy użyciu odpowiedniego zdegenerowanego kodu podstawowego. 
		UWAGA: Ten krok należy wykonać przed wyrównaniem wielu sekwencji, ponieważ często zdarza się, że oprogramowanie do wywoływania baz wybiera bardziej widoczny szczyt jako "prawdziwe" wywołanie podstawowe, dając fałszywe wrażenie braku SNP.</li>
		<li>Wykonaj wyrównanie wielu sekwencji za pomocą oprogramowania do wyrównywania SeqMan Pro, wymienionego w Tabeli materiałów lub innego oprogramowania do wyrównywania typu open source, takiego jak ClustalW16 lub T-Coffee17.
		<ol>
			<li>Otwórz oprogramowanie do wyrównywania | kliknij Dodaj sekwencje | wybierz żądane sekwencje i kliknij Dodaj | po wybraniu wszystkich sekwencji kliknij Gotowe.</li>
			<li>Kliknij Zmontuj, aby wykonać wyrównanie. Aby otworzyć wyrównanie, kliknij Contig 1 i przeanalizuj wyrównanie oraz zidentyfikuj SNP (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). 
			UWAGA: Jako alternatywę dla kroków 1.1.3-1.1.6, PCR można przeprowadzić z izolowanego genomowego DNA uzyskanego z próbek zbiorczych (pochodzących od >10 osób). Sekwencjonowane amplikony mogą być analizowane bezpośrednio pod kątem obecności SNP pojawiających się jako podwójne piki w elektroferogramie, chociaż rzadkie SNP będą trudniejsze do wykrycia.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zaprojektuj 3-5 pojedynczych przewodnikowych RNA (sgRNA), unikając regionów zawierających jakiekolwiek SNP określone powyżej, zgodnie z protokołem opisanym w18.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Konstrukcja podkładu HRMA
	<ol>
		<li>Przetestuj sekwencję eksonów pod kątem możliwego tworzenia się struktur drugorzędowych podczas PCR za pomocą mFold19.
		<ol>
			<li>Przejdź do serwera WWW UNAFold | kliknij na mFold | w menu rozwijanym kliknij na Aplikacje | Forma fałdowania DNA.</li>
			<li>Wprowadź nazwę sekwencji w polu i wklej ekson.</li>
			<li>Zmień temperaturę składania na 60 °C; w warunkach jonowych zmień [Mg++] na 1,5 i włącz Jednostki przełącz na mM; kliknij Złóż DNA.</li>
			<li>Na Wyjściu, poniżej Struktura 1, kliknij pdf, aby otworzyć Wykresy struktury kołowej. </li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przejdź do NCBI Blast - Primer Blast15 do projektowania podkładu.</li>
		<li>Skopiuj i wklej wybraną sekwencję eksonów określoną przez sekwencjonowanie w kroku 1.1 (sekwencja, która zawiera najmniejszą liczbę SNP lub brak SNP) w polu u góry strony.</li>
		<li>Użyj symbolu < >, aby oznaczyć i wykluczyć sekwencje zawierające SNP, miejsce docelowe i regiony, w których możliwe jest utworzenie struktury drugorzędowej.</li>
		<li>Wybierz rozmiar produktu PCR w zakresie od 80 do 150 pz i wybierz organizm. 
		UWAGA: Z powodzeniem można stosować większe rozmiary fragmentów (~300 pz). Jednak dłuższe amplikony mogą zmniejszać czułość między sekwencjami różniącymi się jedną lub tylko kilkoma parami zasad.</li>
		<li>Kliknij Pobierz podkłady. Wybierz 2–3 pary starterów do przetestowania (najlepiej, aby miejsca starterów były oddalone o ≥20–50 pz od wszelkich miejsc docelowych CRISPR).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Walidacja podkładu
	<ol>
		<li>Wykonaj gradientowy PCR przy użyciu gDNA od jednej osoby.
		<ol>
			<li>Przygotować mieszankę wzorcową i usunąć jedną próbkę do kontroli bez matrycy (NTC) w oddzielnej probówce. Dodać szablon do pozostałej mieszanki wzorcowej i podwielokrotność do płytki 96-dołkowej.</li>
			<li>Postępuj zgodnie z parametrami cyklu: 98 °C 30 s, 34 cykle po 98 °C przez 10 s, 55–65 °C 30 s, 72 °C 15 s; końcowe wydłużenie 72 °C przez 10 min.</li>
			<li>Generuj termiczne profile stopu według parametrów: etap denaturacji 95 °C przez 1 min, wyżarzanie 60 °C przez 1 min, wykrywanie krzywej topnienia między 75 °C a 95 °C w krokach co 0,2 °C, z czasem podtrzymania 10 s w każdej temperaturze. 
			UWAGA: Należy stosować tylko temperatury wyżarzania z pojedynczym profilem termicznym stopu.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kontynuuj generowanie zmutowanych linii za pomocą wstrzyknięć zarodków zgodnie z opisem w12.</li>
</ol>
2. Przygotowanie genomowego DNA z nóg komara
<ol>
	<li>Oddziel komary G1 według płci na etapie poczwarki, tak aby nie łączyły się w pary przed genotypowaniem, i upewnij się, że komary kontrolne typu dzikiego w tym samym wieku będą dostępne do wykorzystania do celów referencyjnych i krzyżówek wstecznych. Płeć rozdzieli ich podobnie.</li>
	<li>Zbierz potrzebne materiały (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2A) i przygotuj 96-dołkową płytkę PCR z 0,5 μl odczynnika do uwalniania DNA i 20 μl buforu do rozcieńczania (z zestawu do uwalniania gDNA) na osobę do genotypowania (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2B) i pozostaw ją na lodzie. Zarezerwuj dwie reakcje dla NTC.</li>
	<li>Oznaczyć tackę na fiolki z komarami (fiolki z Drosophila) tak, aby każda studzienka na płytce 96 odpowiadała odpowiedniej fiolce na komary w tacy.</li>
	<li>Znieczulij komary G1 CO2 i umieść je na szklanej szalce Petriego, aby utrzymać je w stanie uspokojenia (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2C, D). Znieczul i umieść 8 komarów typu dzikiego na drugiej szalce Petriego.</li>
	<li>Przetrzyj pęsetę 70% etanolem i usuń jedną z tylnych nóg komara (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2E,F).</li>
	<li>Zanurz nogę w roztworze odczynnika uwalniającego DNA, umieść komara w odpowiedniej fiolce i zamknij ją gąbką (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2G, H).</li>
	<li>Ponownie przetrzyj pęsetę 70% etanolem i przystąp do usuwania nogi z następnego komara. Powtarzaj kroki 2.5-2.7, aż 96-dołkowa płytka zostanie ukończona. 
	UWAGA: Ważne jest, aby przetrzeć pęsetę 70% etanolem. Minimalizuje to zanieczyszczenie krzyżowe DNA.</li>
	<li>Uszczelnić płytkę za pomocą optycznej płytki PCR (<silna klasa="xfig">Rysunek 2I) i inkubować 96-dołkową płytkę zawierającą nogi w temperaturze pokojowej (RT) przez 2-5 minut, a następnie w temperaturze 98 °C przez 2 minuty. Poczekaj, aż płytka ostygnie do temperatury pokojowej podczas przygotowywania mieszanki PCR. 
	UWAGA: Cały proces trwa zazwyczaj 3-4 godziny. Jeśli komary muszą być trzymane w fiolkach dłużej niż oczekiwany czas (szczególnie ≥1 dzień), umieść mały kawałek rodzynek (lub źródło cukru i wody) z każdym komarem, aby zapewnić przetrwanie komarów podczas przedłużonej inkubacji.</li>
</ol>
3. HRMA
<ol>
	<li>Wykonaj PCR.
	<ol>
		<li>Przygotować mieszankę wzorcową zawierającą następujące składniki na każdą reakcję: 10 μL 2x buforu (z zestawu do uwalniania gDNA), 0,5 μM każdego startera, 1 μL barwnika EvaGreen, 0,4 μL polimerazy (z zestawu do uwalniania gDNA) i uzupełnić do 19 μL wodą molekularną.</li>
		<li>Za pomocą pipety wielokanałowej przenieść 19 μl mieszanki wzorcowej do każdej studzienki. Przenieść 1 μl roztworu uwalniającego DNA zawierającego DNA komara przygotowanego w sekcji 2 na płytkę (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3A). Uszczelnij płytkę za pomocą optycznej uszczelki PCR.</li>
		<li>Wykonać PCR zgodnie z parametrami cyklu: 98 °C przez 5 min, 39 cykli po 98 °C przez 10 s, wybrana temperatura wyżarzania (72 °C) przez 30 s; końcowe przedłużenie 72 °C przez 2 min.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Generuj termiczne profile stopu według parametrów: etap denaturacji 95 °C przez 1 min, wyżarzanie 60 °C przez 1 min, wykrywanie krzywej topnienia między 75 °C a 95 °C w krokach co 0,2 °C, z czasem podtrzymania 10 s w każdej temperaturze. Zapoznaj się z materiałem uzupełniającym i rysunkiem uzupełniającym S1-S5, aby uzyskać szczegółowy opis konfiguracji oprogramowania do uruchamiania HRMA przy użyciu systemu czasu rzeczywistego CFX96.</li>
	<li>Zbadaj profile stopu (<silna klasa="xfig">Rysunek 3B). Przypisywanie formantu typu dzikiego do klastra referencyjnego. 
	UWAGA: Oprogramowanie (patrz Tabela materiałów) automatycznie normalizuje dane i wyznacza klastry kolorami dla różnych krzywych topnienia.</li>
	<li>Zaznacz różne klastry odpowiednimi kolorami na 96-dołkowym szablonie (<silna klasa="xfig">Rysunek 3C).</li>
	<li>Wybierz osoby z interesującymi Cię krzywymi, usuń je z rurek i krzyżuj wstecznie (<silna klasa="xfig">Rysunek 3D). Nakarm krwią kryte samice i zbierz jajaG2.</li>
</ol>
4. Weryfikacja sekwencji za pomocą sekwencjonowania Sangera
<ol>
	<li>Oczyścić produkt PCR z dołków z wybranymi komarami (z płytki przygotowanej w sekcji 3.1), używając enzymu do degradacji pozostałych starterów PCR i odfosforylować nadmiar dNTP. Alternatywnie można użyć dowolnego zestawu do czyszczenia kolumn i przystąpić do sekwencjonowania próbek. 
	UWAGA: Sekwencjonowanie bezpośrednie może być trudniejsze, gdy rozmiar produktu PCR jest mały (≤200 pz). W takich przypadkach należy zaprojektować startery do amplifikacji większych fragmentów obejmujących miejsce docelowe (≥250 pz) i amplifikacji metodą PCR przy użyciu DNA w 96-dołkowej płytce (krok 2.2).</li>
	<li>Przeanalizuj i zidentyfikuj indele za pomocą oprogramowania do przeglądania śladów (Rysunek 4). Alternatywnie, oprogramowanie Poly Peak Parser20 może pomóc w wykryciu mutacji u osób heterozygotycznych.
	<ol>
		<li>Przejdź do witryny Poly Peak Parser, wybierz sekwencję z zmutowanych osobników w menu Przeglądaj, a następnie skopiuj i wklej sekwencję referencyjną w polu. 
		UWAGA: Wyrównanie między alternatywnym allelem a odniesieniem pojawi się automatycznie po prawej stronie ekranu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dengue+Guidelines+for+diagnosis%2C+treatment%2C+prevention+and+control%5BTitle%5D)+AND+%22WHO%22%5BJournal%5D)">Dengue Guidelines for diagnosis, treatment, prevention and control.</a> WHO. , Report No. 978 160(2009).</li>
<li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+epidemiology+update%5BTitle%5D)+AND+%22WHO%22%5BJournal%5D)">Zika epidemiology update.</a> WHO. , 1-13 (2019).</li>
<li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+prevention+and+control+of+Chikungunya+fever%5BTitle%5D)+AND+%22WHO%22%5BJournal%5D)">Guidelines for prevention and control of Chikungunya fever.</a> WHO. , (2009).</li>
<li>WHO. World malaria report 2020: 20 years of global progress and challenges. World Health Organization. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.who.int/publications/i/item/9789240015791">https://www.who.int/publications/i/item/9789240015791</a> (2020).</li>
<li>Qiu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+detection+using+Surveyor+nuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Mutation detection using Surveyor nuclease.</a> Biotechniques. 36 (4), 702-707 (2004).</li>
<li>Babon, J. J., McKenzie, M., Cotton, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+resolvases+T4+endonuclease+VII+and+T7+endonuclease+I+in+mutation+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">The use of resolvases T4 endonuclease VII and T7 endonuclease I in mutation detection.</a> Molecular Biotechnology. 23 (1), 73-81 (2003).</li>
<li>Erali, M., Voelkerding, K. V., Wittwer, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+melting+applications+for+clinical+laboratory+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+Molecular+Pathology%22%5BJournal%5D)">High resolution melting applications for clinical laboratory medicine.</a> Experimental and Molecular Pathology. 85 (1), 50-58 (2008).</li>
<li>Reed, G. H., Wittwer, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitivity+and+specificity+of+single-nucleotide+polymorphism+scanning+by+high-resolution+melting+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Sensitivity and specificity of single-nucleotide polymorphism scanning by high-resolution melting analysis.</a> Clinical Chemistry. 50 (10), 1748-1754 (2004).</li>
<li>Parant, J. M., George, S. A., Pryor, R., Wittwer, C. T., Yost, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+efficient+method+of+genotyping+zebrafish+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">A rapid and efficient method of genotyping zebrafish mutants.</a> Developmental Dynamics. 238 (12), 3168-3174 (2009).</li>
<li>Tong, S. Y., Giffard, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbiological+applications+of+high-resolution+melting+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Microbiological applications of high-resolution melting analysis.</a> Journal of Clinical Microbiology. 50 (11), 3418-3421 (2012).</li>
<li>Simko, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+DNA+melting+analysis+in+plant+research%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">High-resolution DNA melting analysis in plant research.</a> Trends in Plant Science. 21 (6), 528-537 (2016).</li>
<li>Basu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+of+end-joining+repair+for+efficient+site-specific+gene+insertion+after+TALEN%2FCRISPR+mutagenesis+in+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Silencing of end-joining repair for efficient site-specific gene insertion after TALEN/CRISPR mutagenesis in Aedes aegypti.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (13), 4038-4043 (2015).</li>
<li>O'Leary, S., Adelman, Z. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+knockout+of+female-biased+genes+AeAct-4+or+myo-fem+in+Ae.+aegypti+results+in+a+flightless+phenotype+in+female%2C+but+not+male+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 knockout of female-biased genes AeAct-4 or myo-fem in Ae. aegypti results in a flightless phenotype in female, but not male mosquitoes.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 14 (12), 0008971(2020).</li>
<li>Kojin, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aedes+aegypti+SGS1+is+critical+for+Plasmodium+gallinaceum+infection+of+both+the+mosquito+midgut+and+salivary+glands%5BTitle%5D)+AND+%22Malaria+Journal%22%5BJournal%5D)">Aedes aegypti SGS1 is critical for Plasmodium gallinaceum infection of both the mosquito midgut and salivary glands.</a> Malaria Journal. 20 (1), 11(2021).</li>
<li>Ye, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer-BLAST%3A+a+tool+to+design+target-specific+primers+for+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction.</a> BMC Bioinformatics. 13, 134(2012).</li>
<li>Larkin, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clustal+W+and+Clustal+X+version+2.0%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Clustal W and Clustal X version 2.0.</a> Bioinformatics. 23 (21), 2947-2948 (2007).</li>
<li>Notredame, C., Higgins, D. G., Heringa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-Coffee%3A+A+novel+method+for+fast+and+accurate+multiple+sequence+alignment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">T-Coffee: A novel method for fast and accurate multiple sequence alignment.</a> Journal of Molecular Biology. 302 (1), 205-217 (2000).</li>
<li>Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+targeted+mutagenesis+of+Drosophila+with+the+CRISPR%2FCas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system.</a> Cell Reports. 6 (6), 1178-1179 (2014).</li>
<li>Zuker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mfold+web+server+for+nucleic+acid+folding+and+hybridization+prediction%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction.</a> Nucleic Acids Research. 31 (13), 3406-3415 (2003).</li>
<li>Hill, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly+peak+parser%3A+Method+and+software+for+identification+of+unknown+indels+using+sanger+sequencing+of+polymerase+chain+reaction+products%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Poly peak parser: Method and software for identification of unknown indels using sanger sequencing of polymerase chain reaction products.</a> Developmental Dynamics. 243 (12), 1632-1636 (2014).</li>
<li>Tsujimoto, H., Anderson, M. A. E., Myles, K. M., Adelman, Z. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+candidate+iron+transporters+from+the+ZIP%2FZnT+gene+families+in+the+mosquito+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Identification of candidate iron transporters from the ZIP/ZnT gene families in the mosquito Aedes aegypti.</a> Frontiers in Physiology. 9, 380(2018).</li>
<li>Slomka, M., Sobalska-Kwapis, M., Wachulec, M., Bartosz, G., Strapagiel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+melting+%28HRM%29+for+high-throughput+genotyping-limitations+and+caveats+in+practical+case+studies%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">High resolution melting (HRM) for high-throughput genotyping-limitations and caveats in practical case studies.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2316(2017).</li>
<li>Vouillot, L., Thelie, A., Pollet, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+T7E1+and+surveyor+mismatch+cleavage+assays+to+detect+mutations+triggered+by+engineered+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Comparison of T7E1 and surveyor mismatch cleavage assays to detect mutations triggered by engineered nucleases.</a> G3. 5 (3), 407-415 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Analiza stopienia o wysokiej rozdzielczości oferuje proste i szybkie rozwiązanie do identyfikacji indeli generowanych przez technologię CRISPR/Cas9 w wektorze komara Ae. aegypti. Zapewnia elastyczność, umożliwiając genotypowanie komarów zmutowanych dla szerokiego zakresu genów, od mięśni ucieczki po metabolizm żelaza i nie tylko 13,14. HRMA można wykonać w ciągu zaledwie kilku godzin od pobrania próbki do końcowych analiz. Dodatkowy czas jest wymagany do...

Jako wektory patogenów, takich jak wirusy denga1, Zika2 i chikungunya3, a także pasożyty malarii4, komary stanowią poważne zagrożenie dla zdrowia publicznego ludzi. W przypadku wszystkich tych chorób interwencja transmisyjna kładzie się duży nacisk na zwalczanie komarów-wektorów. Badanie genów ważnych na przykład w odniesieniu do pobłażliwości wobec patogenów, przystosowania komarów, przeżywalności, reprodukcji i odporności na środki owadobójcze ma kluczowe znaczenie dla opracowania nowych strategii zwalczania komarów. W tym celu edycja genomu u komarów staje się powszechną praktyką, zwłaszcza wraz z rozwojem technologii takich jak HE, ZFN, TALENs, a ostatnio CRISPR with Cas9. Tworzenie szczepów z edytowanymi genami zazwyczaj obejmuje krzyżowanie wsteczne osobników niosących pożądane mutacje przez kilka pokoleń w celu zminimalizowania efektów off-target i założyciela (wąskiego gardła), a następnie krzyżowanie osobników heterozygotycznych w celu wytworzenia linii homozygotycznych lub trans-heterozygotycznych. W przypadku braku markera dominującego, genotypowanie molekularne jest konieczne w tym procesie, ponieważ w wielu przypadkach nie można wykryć wyraźnych cech fenotypowych dla mutantów heterozygotycznych.
Chociaż sekwencjonowanie jest złotym standardem w charakterystyce genotypowej, przeprowadzanie tego na setkach, a nawet tysiącach osób, wiąże się ze znacznymi kosztami, pracą i czasem potrzebnym do uzyskania wyników, co jest szczególnie ważne dla organizmów o krótkiej długości życia, takich jak komary. Powszechnie stosowanymi alternatywami są test nukleazy Surveyor5 (SNA), test T7E16 i analiza topnienia w wysokiej rozdzielczości (HRMA, przejrzana w7). Zarówno SNA, jak i T7E1 używają endonukleaz, które rozszczepiają tylko niedopasowane zasady. Kiedy zmutowany region heterozygotycznego zmutowanego genomu jest amplifikowany, fragmenty DNA ze zmutowanych i dzikich alleli są wyżarzane w celu wytworzenia niedopasowanego dwuniciowego DNA (dsDNA). SNA wykrywa obecność niedopasowań poprzez trawienie za pomocą endonukleazy specyficznej dla niezgodności i prostą elektroforezę w żelu agarozowym. Alternatywnie, HRMA wykorzystuje właściwości termodynamiczne dsDNA wykryte przez barwniki fluorescencyjne wiążące dsDNA, przy czym temperatura dysocjacji barwnika zmienia się w zależności od obecności i rodzaju mutacji. HRMA został wykorzystany między innymi do wykrywania polimorfizmów pojedynczego nukleotydu (SNPs)8, genotypowania mutantów ryb danio pręgowanego9, zastosowań mikrobiologicznych10 oraz badań genetycznych roślin11.
Ten artykuł opisuje HRMA, prostą metodę molekularnego genotypowania dla zmutowanych komarów generowaną przez technologię CRISPR/Cas9. Zalety HRMA w porównaniu z alternatywnymi technikami obejmują: 1) elastyczność, ponieważ udowodniono, że jest przydatna dla różnych genów, szeroki zakres rozmiarów indel, a także rozróżnienie między różnymi rozmiarami indel oraz różnicowaniem heterozygotycznym, homozygotycznym i trans-heterozygotycznym12,13,14, 2) koszt, ponieważ opiera się na powszechnie stosowanych odczynnikach PCR, oraz 3) oszczędność czasu, ponieważ można go wykonać w ciągu zaledwie kilku godzin. Ponadto protokół wykorzystuje małą część ciała (nogę) jako źródło DNA, co pozwala komarowi przetrwać proces genotypowania, co pozwala na ustanowienie i utrzymanie zmutowanych linii.

<table><tbody><tr><td>70% etanol</td><td></td><td></td><td>70% roztwór etanolu w wodzie</td></tr><tr><td>96-dołkowe płytki do PCR i PCR w czasie rzeczywistym</td><td>VWR</td><td>82006-636</td><td>Do uzyskiwania genomowego DNA (z nogi komara)</td></tr><tr><td>Szablony</td><td></td><td></td> płytek 96-dołkowych <td>Drukowane w domu, do rejestracji genotypu</td></tr><tr><td>Bio Rad CFX96</td><td>Maszyna Bio Rad</td><td></td><td>PCR z możliwością</td></tr> <tr><td>gradientu i HRMAZróżnicowane zbiorniki odczynników biotechnologicznych</td><td>VWR</td><td>490006-896</td><td></td></tr><tr><td>Exo-Zestaw do szybkiego czyszczenia PCR</td><td>New England Biolabs</td><td>E1050S</td><td></td></tr><tr><td>Szklana szalka Petriego</td><td>VWR</td><td>89001-246</td><td>150 mm x 20 mm</td></tr><tr><td>Cienkościenne 96-dołkowe płytki PCR z twardą skorupą</td><td>Bio-rad</td><td>HSP9665</td><td>Do</td></tr><tr><td>HRMA Pipetor wielokanałowy (P10)</td><td>Integra Biosciences</td><td>4721</td><td></td></tr><tr><td>Pipetor wielokanałowy (P300)</td><td>Integra Biosciences</td><td>4723</td><td></td></tr><tr><td>Taśma uszczelniająca z poliolefiny i akrylanu Nunc, Thermo Scientific</td><td>VWR</td><td>37000-548</td><td>Do użytku z 96-dołkiem&nbsp; Płytki PCR do otrzymywania genomowego DNA</td></tr><tr><td>Optyczny taśma uszczelniająca</td><td>Bio-rad</td><td>2239444</td><td>Do użytku z 96-dołkowymi płytkami PCR z osłoną do zestawu do</td></tr><tr><td>bezpośredniego PCR tkanek zwierzęcych HRMA Phire (bez narzędzi do pobierania próbek)</td><td>Thermo Fisher</td><td>F140WH</td><td>Do uzyskiwania genomowego DNA i wykonywania</td></tr><tr><td>PCR Plastikowe dzielniki fiolek na muchy</td><td>Genesee</td><td>59-128W</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do precyzyjnej analizy stopu</td><td>Bio Rad</td><td>1845025</td><td>Służy do genotypowania próbek DNA komarów i analizy właściwości denaturacji termicznej dwuniciowego DNA (patrz krok protokołu 3.3)</td></tr><tr><td>Oprogramowanie</td><td></td> SeqMan Pro <td>DNAstar Lasergene</td><td>Do wyrównywania wielu sekwencji</td></tr><tr><td>Pipetor jednokanałowy</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pęseta Dumont #5 11 cm</td><td>WPI</td><td>14098</td><td></td></tr><tr><td>Białe zatyczki piankowe</td><td>VWR</td><td>60882-189</td><td></td></tr><tr><td>Szerokie fiolki Drosophila, polistyren</td><td>Genesee</td><td>32-117</td><td></td></tr><tr><td>Szeroka tacka na fiolki na muchy, niebieska</td><td>Genesee</td><td>59-164B</td><td></td></tr></tbody></table>

wykrywanie indel po mutagenezie crispr/cas9 przy użyciu analizy stopienia w wysokiej rozdzielczości u komara aedes aegypti

Indel Detection following CRISPR/Cas9 Mutagenesis using High-resolution Melt Analysis in the Mosquito Aedes aegypti

Edycja genów komarów stała się rutyną w wielu laboratoriach wraz z ustanowieniem takich systemów jak nukleazy efektorowe podobne do aktywatora transkrypcji (TALENs), nukleazy palców cynkowych (ZFNs) i endonukleazy naprowadzające (HEs). Niedawno, technologia CRISPR/białko 9 (Cas9) związane z regularnymi odstępami między sobą (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9) zaoferowała łatwiejszą i tańszą alternatywę dla precyzyjnej inżynierii genomu. Po działaniu nukleazy szlaki naprawy DNA naprawiają uszkodzone końce DNA, często wprowadzając indele. Te mutacje poza ramką są następnie wykorzystywane do zrozumienia funkcji genów w organizmach docelowych. Wadą jest jednak to, że zmutowane osobniki nie są nosicielami dominującego markera, co sprawia, że identyfikacja i śledzenie zmutowanych alleli jest trudne, zwłaszcza w skali potrzebnej do wielu eksperymentów. 
Analiza topnienia w wysokiej rozdzielczości (HRMA) jest prostą metodą identyfikacji zmian w sekwencjach kwasów nukleinowych i wykorzystuje krzywe topnienia PCR do wykrywania takich zmian. Ta metoda analizy post-PCR wykorzystuje fluorescencyjne dwuniciowe barwniki wiążące DNA z oprzyrządowaniem, które ma zdolność przechwytywania danych kontroli rampy temperatury i można je łatwo skalować do formatów płytek 96-dołkowych. Opisano tutaj prosty przepływ pracy wykorzystujący HRMA do szybkiego wykrywania indeli indukowanych przez CRISPR/Cas9 i ustanawiania zmutowanych linii u komara Ae. aegypti. Co najważniejsze, wszystkie etapy można wykonać przy użyciu niewielkiej ilości tkanki nogi i nie wymagają poświęcania organizmu, co pozwala na przeprowadzenie krzyżówek genetycznych lub testów fenotypowania po genotypowaniu.

Komary z mutacjami w genach AaeZIP11 (domniemany transporter żelaza21) oraz myo-fem (gen miozyny wykazujący preferencję u samic, związany z mięśniami lotnymi13) uzyskano przy użyciu technologii CRISPR/Cas9, poddano genotypowaniu metodą HRMA oraz weryfikacji sekwencyjnej (Rysunek 5). Rysunek 5A oraz Rysunek 5C przedstawiają znormalizowaną intensywność fluorescencji z k...

Ten artykuł opisuje protokół szybkiej identyfikacji indeli indukowanych przez CRISPR/Cas9 i selekcji linii mutantów u komara Aedes aegypti za pomocą analizy topnienia w wysokiej rozdzielczości.

Wykrywanie indel po mutagenezie CRISPR/Cas9 przy użyciu analizy stopienia w wysokiej rozdzielczości u komara Aedes aegypti

Mosquito gene editing has become routine in several laboratories with the establishment of systems such as transcription-activator-like effector nucleases ...

Protokół ten jest bardzo prostym i skutecznym sposobem wykrywania mutantów generowanych przez technologię CRISPR/Cas9 od wielu osób. Dwie główne zalety tej techniki to to, że można ją wykonać w ciągu kilku godzin i że można ją zastosować do wielu organizmów. Projektowanie starterów może być wyzwaniem dla niektórych genów, a wiele rund projektowania i weryfikacji starterów może być wymaganych, aby HRMA było skuteczne.Aby wykonać gradientowy PCR, zacznij od przygotowania mieszanki wzorcowej. Następnie usunąć 19 mikrolitrów mieszanki wzorcowej do kontroli bez matrycy lub NTC na płytce 96-dołkowej. Następnie dodaj szablon do pozostałego miksu głównego.Podwielokrotność 20 mikrolitrów próbki wymieszać z płytką 96-dołkową. Wykonaj PCR zgodnie z parametrami cyklicznymi, a następnie wygeneruj profile termicznego topnienia przy użyciu parametrów wymienionych w manuskrypcie. Po zebraniu całego wymaganego materiału należy przygotować mieszankę wzorcową z 0,5 mikrolitra odczynnika uwalniającego DNA i 20 mikrolitrami buforu rozcieńczającego na osobę, która ma być genotypowana.Za pomocą pipety wielokanałowej przesypać 20 mikrolitrów mieszanki na płytkę do PCR i pozostawić płytkę PCR na lodzie. Następnie umieść znieczulone komary G1 na szklanej szalce Petriego, aby je uspokoić, a następnie umieść osiem komarów typu dzikiego na drugiej szalce Petriego. Przetrzyj pęsetę 70% etanolem i użyj zdezynfekowanej pęsety, aby usunąć jedną z tylnych nóg komara.Następnie zanurz nogę w roztworze odczynnika uwalniającego DNA. Umieścić komara w odpowiedniej fiolce i zamknąć fiolkę gąbką. Po zakończeniu przetrzyj pęsetę 70% etanolem przed przystąpieniem do usuwania nogi z następnego komara, aż 96-dołkowa płytka zostanie ukończona.Następnie uszczelnić płytkę optyczną uszczelką PCR i inkubować płytkę PCR zawierającą nogi w temperaturze pokojowej przez dwie do pięciu minut, a następnie inkubować w temperaturze 98 stopni Celsjusza przez dwie minuty. Poczekaj, aż talerz ostygnie do temperatury pokojowej. W przypadku PCR należy przygotować mieszaninę wzorcową zawierającą preferowane składniki, a następnie za pomocą pipety wielokanałowej przenieść 19 mikrolitrów mieszanki wzorcowej do każdego dołka płytki 96-dołkowej.Po przeniesieniu na płytkę jednego mikrolitra roztworu uwalniającego DNA zawierającego wcześniej przygotowane DNA komara, należy uszczelnić płytkę uszczelką optyczną PCR. Wykonaj PCR z odpowiednimi parametrami cyklicznymi, aby wygenerować profile termicznego topnienia zgodnie z parametrami opisanymi w manuskrypcie, a następnie zbadaj profile stopu, przypisując kontrolę typu dzikiego do klastra referencyjnego. Zaznacz różne klastry odpowiednimi kolorami na 96-dołkowym szablonie.Następnie wybierz osoby z interesującymi Cię krzywymi i usuń wybrane osoby z rurek do krzyżowania wstecznego. Krew karmi samice, a następnie zbiera G2A. W analizie reprezentatywnej przedstawiono analizę sekwencji mutanta ZIP11 Aedes aegypti.Elektroferogram heterozygotycznych mutantów Aedes aegypti ZIP11 wskazał pozycję nukleotydu, w której wystąpił indel. Indel jest reprezentowany przez przesunięcie od pojedynczych do podwójnych pików, ponieważ pozycje polimorficzne pokazują oba nukleotydy jednocześnie. Na koniec serii liczba usuniętych lub wstawionych par zasad została obliczona poprzez zliczenie pojedynczych pików.Komary zawierające mutacje w genach Aedes aegypti ZIP11 i myo-fem poddano genotypowaniu i sekwencjonowaniu zweryfikowano za pomocą wysokorozdzielczej analizy stopienia HRMA. Sygnały fluorescencyjne próbek zostały znormalizowane do względnych wartości od jednego do zera. Dodatkowo każda krzywa została odjęta od odniesienia typu dzikiego i oznaczona odpowiednim powiększeniem.Nieudane automatyczne przypisanie klastra jest pokazane w reprezentatywnych wynikach, w których nie dokonano prawidłowego rozróżnienia między grupami. Ponadto każda próbka była analizowana indywidualnie i przypisywana do odpowiednich grup na podstawie podobieństwa do próbek referencyjnych heterozygot, homozygot i transheterozygot. Po wykonaniu HRMA konieczne jest sekwencjonowanie DNA od zmutowanych osobników w celu analizy indeli i zidentyfikowania innych mutacji w docelowej sekwencji.

indel-detection-following-crisprcas9-mutagenesis-using-high

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Ten film pokazuje rolę cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy kropelkowej w identyfikacji mutacji indel w próbce DNA. Wysoka precyzja i czułość ddPCR umożliwiają dokładne i spójne wykrywanie rzadkich mutacji obecnych w próbce, nawet przy niskich poziomach. Może identyfikować i określać ilościowo mutacje indel w różnych regionach genomu, dostarczając cennych informacji na temat mechanizmów mutacji i funkcjonalnych konsekwencji tych mutacji.

Cyfrowa reakcja łańcuchowa polimerazy kropelkowej do wykrywania mutacji indel w genach docelowych

Ten film demonstruje gradientową reakcję łańcuchową polimerazy w celu optymalizacji temperatury wyżarzania podkładów, która ustawia gradientową temperaturę wyżarzania wzdłuż studni. Wpływ różnych temperatur wyżarzania zależy od wydajności amplifikowanych produktów, co pomaga zoptymalizować warunki reakcji.

Gradientowa reakcja łańcuchowa polimerazy w celu określenia optymalnej temperatury wyżarzania

Ten protokół opisuje przebieg pracy systemu edycji genów opartego na CRISPR/Cas9 do naprawy mutacji punktowych w komórkach ssaków. W tym przypadku stosujemy kombinatoryczne podejście do edycji genów ze szczegółową strategią eksperymentalną do pomiaru powstawania indel w miejscu docelowym - w istocie, analizując mutagenezę na miejscu.

Standardowa metodologia badania mutagenności na miejscu w funkcji naprawy mutacji punktowej katalizowanej przez CRISPR/Cas9 i SsODN w komórkach ludzkich

Ten protokół opisuje procedury mikroiniekcji dla zarodków Culex quinquefasciatus, które są zoptymalizowane do pracy z narzędziami do edycji genów CRISPR/Cas9. Technika ta może skutecznie generować specyficzne dla danego miejsca, dziedziczne mutacje linii zarodkowej, które można wykorzystać do budowy technologii genetycznych w tym niedostatecznie zbadanym wektorze choroby.

Techniki mikroiniekcji zarodków w celu skutecznej mutagenezy specyficznej dla miejsca w Culex quinquefasciatus

CRISPR/Cas9 jest coraz częściej używany do charakteryzowania funkcji genów w organizmach niemodelowych. Protokół ten opisuje, w jaki sposób generować linie nokautujące Culex pipiens, od przygotowania mieszanek iniekcyjnych, po pozyskiwanie i wstrzykiwanie zarodków komarów, a także jak hodować, krzyżować i badać przesiewowo komary, którym wstrzyknięto implanty i ich potomstwo pod kątem pożądanych mutacji.

Przygotowanie i wstrzykiwanie zarodków komarów Culex w celu wygenerowania mutacji zerowych przy użyciu CRISPR/Cas9

Prezentowany tutaj jest protokół mikroiniekcji zarodka Helicoverpa armigera (Hübner) i identyfikacji mutantów nokautujących, stworzony przez edycję genomu CRISPR/Cas9. Zmutowane owady umożliwiają dalsze badania funkcji genów i interakcji między różnymi genami in vivo.

Mikroiniekcja zarodka i identyfikacja mutanta nokautującego Helicoverpa armigera z edytowanym genomem CRISPR/Cas9 (Hübner)

Protokół opisuje, jak dokonać zmian w genomie komarów malarii Anopheles za pomocą systemu φC31. Opisane modyfikacje obejmują zarówno integrację, jak i wymianę transgenicznych kaset w genomie linii dokujących zawierających attP.

Ukierunkowana na miejsce integracja za pośrednictwem φC31 i wymiana kaset w wektorach Anopheles malarii

Ten protokół zapewnia kroki od ekstrakcji DNA do eksperymentalnego przygotowania do cyfrowego PCR kropelkowego (ddPCR), w tym analizę do identyfikacji i kwantyfikacji zdarzeń niehomologicznego łączenia końców (NHEJ) w miejscach docelowych po indukowanym przez gRNA rozszczepieniu Cas9 i naprawie DNA. Inne zastosowania tej metody obejmują takie zastosowania, jak wykrywanie polimorfizmu i weryfikacja wariantów edycji genów.

Cyfrowa kropelkowa reakcja PCR w celu wykrycia mutacji indeli w genetycznie zmodyfikowanych populacjach komarów Anopheline

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół edycji genomu poprzez mikroiniekcję embrionalną u komara A. aegypti przy użyciu technologii CRISPR-Cas9.

Edycja genomu u komara Aedes aegypti z żółtą febrą przy użyciu CRISPR-Cas9

Optogenetyczna mutageneza losowa z wykorzystaniem histonów-miniSOG u C. elegans

Naucz się wykrywać mutacje indel po edycji CRISPR/Cas9 u komara Aedes aegypti przy użyciu analizy stopienia w wysokiej rozdzielczości. Ta metoda umożliwia szybką identyfikację mutantów w ciągu kilku godzin.

Wykrywanie indel po mutagenezie CRISPR/Cas9 przy użyciu analizy stopienia w wysokiej rozdzielczości u komara Aedes aegypti

Przeglądaj więcej filmów