Name: Przygotowanie próbki do trójwymiarowej wizualizacji naczyń kończyn tylnych myszy w oparciu o tomografię komputerową (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 35 s
Description: Poznaj metodę wizualizacji naczyń kończyn tylnych myszy za pomocą mikrotomografii komputerowej. Technika umożliwia kompleksową ocenę układu krwionośnego w badaniach biologii naczyniowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Yasuyo Kimurze, Megumi Nagahiro i Saeko Tokunaga za doskonałe wsparcie techniczne w eksperymentach na zwierzętach.

Wszystkie procedury zostały wykonane zgodnie z wytycznymi Uniwersytetu Kumamoto dotyczącymi opieki nad zwierzętami (numer referencyjny zatwierdzenia M30-040/A2020-105), które są zgodne z amerykańskim Przewodnikiem National Institutes of Health dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych (publikacja nr 85-23, poprawiona w 2011 roku).
1. Przygotowanie
<ol>
	<li>Przygotować aparat perfuzyjny i bufor rozszerzający naczynia krwionośne (4 mg/l chlorowodorek papaweryny, 4 g/l; adenozyna, 1 g/l; heparyna, 1 j./ml w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS)). 
	UWAGA: Odczynniki do pomiaru refluksu i leków rozszerzających naczynia krwionośne są takie same, jak te zgłoszone przez Weyers et al.5.</li>
	<li>Podłączyć cewnik 22 G, rurkę przedłużającą 2 ml i trójdrożny kran (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A). 
	UWAGA: Dostosuj miernik do wielkości zwierzęcia. Dla dorosłych myszy C57BL/6 optymalna jest wartość 22 G.</li>
	<li>Napełnij aparat perfuzyjny ciśnieniem buforem rozszerzającym naczynia krwionośne (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A). 
	UWAGA: Należy unikać tworzenia się pęcherzyków powietrza, aby zapobiec zakłóceniom w napełnianiu środka kontrastowego.</li>
</ol>
2. Perfuzja
<ol>
	<li>Wstrzyknąć 1 j/g heparyny w PBS do jamy dootrzewnowej 30 minut przed operacją.</li>
	<li>Całkowicie znieczulić mysz izofluranem i poddać ją eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy.</li>
	<li>Po dekapitacji wykonaj nacięcie w linii środkowej mostka i przymocuj otwartą klatkę piersiową za pomocą szpilek. 
	UWAGA: Aby uniknąć wycieku kontrastu, należy unikać uszkodzenia membrany.</li>
	<li>Przetnij aortę wstępującą i usuń serce.</li>
	<li>Usunąć płuco i odsłonić aortę zstępującą. 
	UWAGA: Nie uszkadzaj aorty zstępującej.</li>
	<li>Przetnij aortę zstępującą po przekątnej, aby odsłonić przekrój poprzeczny (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B). 
	UWAGA: Nie odklejaj aorty; Przekrój ukośny jest lepszy do wprowadzenia cewnika.</li>
	<li>Wprowadzić cewnik 22 G do aorty zstępującej, jednocześnie uruchamiając bufor rozszerzający naczynia krwionośne. 
	UWAGA: Wprowadzenie cewnika podczas pracy buforu rozszerzającego naczynia krwionośne pozwala uniknąć zanieczyszczenia powietrza.</li>
	<li>Przypnij korzeń cewnika (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C).</li>
	<li>Zrób węzeł, aby zapobiec wyciekom z powodu przepływu wstecznego.</li>
	<li>Roztworu rozszerzającego naczynia krwionośne (chlorowodorek papaweryny, 4 g/l; adenozyna, 1 g/l; heparyna, 1 μ/ml) przez 3 minuty pod stałym ciśnieniem między 13 a 15 kPa.</li>
	<li>Roztworować roztwór 4% paraformaldehydu w (PBS) przez 3 min. 
	UWAGA: Powodzenie mocowania można potwierdzić ruchem stopy (<silna klasa="xfig">Rysunek 1D).</li>
	<li>Przygotuj środek kontrastowy tuż przed perfuzją. 
	UWAGA: Dostosuj szybkość rozcieńczania w zależności od próbki; W przypadku dorosłych myszy wymieszaj plamę i rozcieńczalnik w stosunku 1:1.</li>
	<li>Zatrzymaj perfuzję i napełnij rurkę przedłużającą 2 ml rozcieńczonego środka kontrastowego (<silna klasa="xfig">Rysunek 1E). 
	UWAGA: Środek kontrastowy należy wstrzykiwać powoli, aby uniknąć uszkodzenia naczyń krwionośnych.</li>
	<li>Środek kontrastowy należy przelać pod stałym ciśnieniem od 13 do 15 kPa.
	<ol>
		<li>Aby uwidocznić tętnice, sprawdź paznokieć u nogi, aby upewnić się, że środek kontrastowy dotarł do tętnicy (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1F).</li>
		<li>Aby uwidocznić wszystkie naczynia, sprawdź żyłę główną dolną przepony, aby potwierdzić pełne krążenie środka kontrastowego. 
		UWAGA: Na początku kontrast zawiera roztwór rozszerzający naczynia krwionośne; Stąd niezbędne jest jego prawidłowe krążenie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zamknij trójdrogowy kran i wyjmij rurkę (<silna klasa="xfig">Rysunek 1G). 
	UWAGA: Jeśli zawór trójdrożny nie jest zamknięty, kontrast będzie płynął do tyłu.</li>
	<li>Inkubować próbkę przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usuń skórę i utrwal ją w 10% roztworze formaldehydu.</li>
</ol>
3. Wizualizacja
UWAGA: Protokoły wizualizacji różnią się w zależności od tomografu komputerowego. W protokole tym zastosowano tomograf komputerowy z mikroogniskowym promieniowaniem rentgenowskim. Konieczne jest zoptymalizowanie metody obrazowania w zależności od każdego tomografu komputerowego.
<ol>
	<li>Umieścić próbkę w probówce o pojemności 50 ml zawierającej PBS.</li>
	<li>Umieść probówkę z próbką na stole.</li>
	<li>Zeskanuj próbkę pod napięciem 50 kV i prądem 600 μA, zapewniając odległość od ostrości do środka 75,2 mm. 
	UWAGA: Wymiar 1 woksela wynosił 28,7 μm x 28,7 μm x 28,7 μm w tym ustawieniu.</li>
	<li>Załaduj pozyskane dane obrazu za pomocą Fidżi, platformy open source do analizy obrazów biologicznych.</li>
	<li>Określ wartość woksela mięśniowego za pomocą mięśnia brzuchatego łydki.
	<ol>
		<li>Wybierz mięsień brzuchaty łydki za pomocą narzędzia prostokąta.</li>
		<li>Sprawdź średnią i odchylenie standardowe (SD) od histogramu (Analizuj | Histogram).</li>
		<li>Zdefiniuj gęstość wokseli mięśniowych jako średnią + 2SD mięśnia brzuchatego łydki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustaw gęstość wokseli mięśniowych jako dolny poziom progowy (Obraz | dostosuj | Próg | Zestaw | dolny poziom progowy). 
	UWAGA: Obszar naczyniowy i obszar kości pozostają w danych binaryzowanych po ustawieniu progu.</li>
</ol>

<ol><li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis.</a> Annual Review of Medicine. 57, 1-18 (2006).</li>
<li>Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+in+cancer%2C+vascular%2C+rheumatoid+and+other+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease.</a> Nature Medicine. 1 (1), 27-31 (1995).</li>
<li>Kochi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+arterial+anatomy+of+the+murine+hindlimb%3A+functional+role+in+the+design+and+understanding+of+ischemia+models%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterization of the arterial anatomy of the murine hindlimb: functional role in the design and understanding of ischemia models.</a> PLoS One. 8 (12), 84047(2013).</li>
<li>Limbourg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+postnatal+arteriogenesis+and+angiogenesis+in+a+mouse+model+of+hind-limb+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Evaluation of postnatal arteriogenesis and angiogenesis in a mouse model of hind-limb ischemia.</a> Nature Protocols. 4 (12), 1737-1746 (2009).</li>
<li>Weyers, J. J., Carlson, D. D., Murry, C. E., Schwartz, S. M., Mahoney, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+perfusion+and+filling+of+mouse+coronary+vasculature+as+preparation+for+micro+computed+tomography+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Retrograde perfusion and filling of mouse coronary vasculature as preparation for micro computed tomography imaging.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (60), e3740(2012).</li>
<li>Arima, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+collateral+source+characteristics+with+3-dimensional+analysis+using+micro-X-ray+computed+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Heart+Association%22%5BJournal%5D)">Evaluation of collateral source characteristics with 3-dimensional analysis using micro-X-ray computed tomography.</a> Journal of the American Heart Association. 7 (6), 007800(2018).</li>
<li>Tian, T., Yang, Z., Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing+technique%3A+Recent+progress+and+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing technique: Recent progress and biomedical applications.</a> Journal of Anatomy. 238 (2), 489-507 (2021).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CUBIC+protocols+for+whole-brain+and+whole-body+clearing+and+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging.</a> Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).</li>
<li>Fernandez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+in+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis in liver disease.</a> Journal of Hepatology. 50 (3), 604-620 (2009).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+in+pancreatic+cancer%3A+current+research+status+and+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis in pancreatic cancer: current research status and clinical implications.</a> Angiogenesis. 22 (1), 15-36 (2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

W tym raporcie przedstawiono zaawansowaną metodę wizualizacji naczyń krwionośnych w dolnej części ciała. W tym procesie składa się kilka krytycznych etapów: pierwszym z nich jest preperfuzja przed wstrzyknięciem środka kontrastowego. Jeśli nie zostanie usunięta wystarczająca ilość krwi, kontrast nie wypełni systemu. Dodatkowo włączenie pęcherzyków powietrza zaburza wypełnienie kontrastu; W związku z tym powietrze w obwodzie musi zostać całkowicie usunięte. Ponadto, ponieważ środek kontrastowy nie krzepnie natychmiast po wstrzyknięciu, próbka nie powinna być nadmiernie przesuwana.
Ta metoda jest przydatna do oceny zwiększonego tworzenia naczyń krwionośnych i krążenia, takiego jak krążenie oboczne. I odwrotnie, jako ograniczenie, trudno jest ocenić zwężone naczynia krwionośne, ponieważ rozróżnienie między zwężeniem a sztucznym zmniejszeniem środka kontrastowego jest trudne. Ponadto ocena naczyń krwionośnych w kościach jest trudna, ponieważ oddzielenie krwi od kości jest trudne.
Alternatywną metodą wizualizacji 3D jest barwienie immunologiczne. Korzystając z techniki oczyszczania tkanek, dostępnych jest kilka metod obrazowania 3D7. Barwienie immunologiczne jest korzystne, ponieważ umożliwia barwienie określonych białek za pomocą przeciwciał. Niedawny raport kwestionuje obrazowanie całego ciała oparte na barwieniu immunologicznym8; jednak obrazowanie oparte na tomografii komputerowej nie wymaga żadnego wstępnego oczyszczania tkanek. 
Metoda ta umożliwia uwidocznienie wszystkich naczyń poniżej przepony, w tym narządów jamy brzusznej. Angiogeneza w obrębie narządów jamy brzusznej ma silny wpływ na utrzymanie homeostazy i rozwój chorób 9,10. Ponieważ protokół ten został zoptymalizowany pod kątem oceny naczyń kończyn dolnych, przygotowanie specyficzne dla narządu umożliwiłoby wizualizację angiogenezy związanej z dowolnym czynnikiem, takim jak stan zapalny lub nowotwory.

Naczynia krwionośne to skomplikowane sieci o strukturze przypominającej drzewa. Angiogeneza i tworzenie nowych naczyń krwionośnych odgrywają istotną rolę w utrzymaniu homeostazy narządów1. Angiogeneza jest regulowana w leczeniu chorób niedokrwiennych i nowotworowych2. Dlatego tak ważne jest zrozumienie mechanizmów leżących u podstaw angiogenezy. Mysie naczynia kończyn tylnych są często używane jako użyteczny model do badań naczyniowych3; Ipsilateralne podwiązanie tętnicy biodrowej lub udowej jest znanym modelem niedokrwienia kończyn tylnych używanym do oceny angiogenezy i przebudowy naczyń w fizjologicznej i patologicznej angiogenezie<klasa SUP="xref">4. Jednak ocena angiogenezy jest przeprowadzana głównie za pomocą barwienia skrawków, a metody oceny morfologii naczyń 3D są szczególnie ograniczone.
W porównaniu z barwieniem przekrojów, CT umożliwia wizualizację 3D. Niedawno Weyers i wsp. opisali zaawansowany protokół odpowiedni do obrazowania CT, umożliwiający wizualizację mysiego dorosłego układu krążenia wieńcowego5. Zmodyfikowaliśmy ich metodę, aby stworzyć metodę przygotowania próbki odpowiednią do obrazowania CT naczyń krwionośnych kończyn dolnych6. W tym przypadku przez aortę zstępującą wstrzykuje się żywicę nieprzezroczystą przed promieniowaniem, a naczynia w kończynach dolnych wypełnia się barwnikiem. Dostosowując czas wstrzykiwania barwnika, możliwe jest również wypełnienie specyficzne dla tętnicy, a próbki można uzyskać za pomocą dowolnego urządzenia do tomografii komputerowej mikrorentgenowskiej. Ta metoda kontrastowa stanowi podstawową technikę oceny 3D mysich naczyń krwionośnych poniżej przepony oraz w narządach jamy brzusznej i kończynach dolnych.

<table><tbody><tr><td>1 ml strzykawka</td><td>TERUMO</td><td>SS-01T</td><td></td></tr><tr><td>10% roztwór formaliny</td><td>Fujifilm-Wako</td><td>068-03841</td><td></td></tr><tr><td>10x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (-) (PBS)</td><td>Fujifilm-Wako</td><td>163-25265</td><td>Przygotuj 1x cewnik PBS</td></tr><tr><td>22 G (22 G S5 x 1" V(F))</td><td>MEDIKIT</td><td>HP2140</td><td>Używany jest tylko cewnik.</td></tr><tr><td>Igła 23 G</td><td>TERUMO</td><td>NN-2325R</td><td>Użyj jako szpilki</td></tr><tr><td>4% paraformaldehydu w PBS</td> Strzykawka <td></td><td></td> Fujifilm-Wako 163-20145 <td></td></tr><tr><td>5 ml</td> 5-0 Szew z igłą Alfresa Pharma Corporation ER1205SB45 Adenozyna Sigma-aldrich A9251-5G Do roztworu rozszerzającego naczynia krwionośne Dumont #55 Kleszcze <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>FST</td><td>No.11255-20</td><td></td></tr><tr><td>Rurka przedłużająca</td><td>TOP</td><td>X2-FL50</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 mL tubka</td><td>CORNING</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Graefe Kleszcze</td><td>FST</td><td>No.11051-10</td><td></td></tr><tr><td>Heparyna Sód 5,000 jednostek/5 ml</td><td>Mochida Co., Ltd.</td><td></td><td></td>224122458</tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Fujifilm-Wako</td><td>099-06571</td><td></td></tr><tr><td>Związki iniekcyjne do mikrofilów</td><td>Flow Tech Inc.</td><td>MV-117</td><td>Mieszaj płynny związek MV (plama) i rozcieńczalnik MV 1: 1</td></tr><tr><td>Chlorowodorek papaweryny</td><td>Fujifilm</td><td>164-18002</td><td>Do roztworu rozszerzającego naczynia krwionośne</td></tr><tr><td>Środek znieczulający dla małych zwierząt</td><td>Muromachi Kikai Co., Ltd.</td><td>MK-A100ecoW-ST</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe - kątowe na bok</td><td>FST</td><td>No.15006-09</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki chirurgiczne - ostro-tępe</td><td>FST</td><td>nr 14001-12</td><td></td></tr><tr><td>trójdrożny kurek</td><td>TERUMO</td><td>TS-TR1K</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta transferowa</td><td>SAMCO SCIENTIFIC</td><td>SM262-1S</td><td>Służy do mieszania środka kontrastowego</td></tr><tr><td>CT</td> rentgenowskiego <td>Toshiba IT & Korporacja Systemów Sterowania</td><td>TOSHIBA TOSCANNER 32300 FPD</td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie próbki do trójwymiarowej wizualizacji naczyń kończyn tylnych myszy w oparciu o tomografię komputerową

Sample Preparation for Computed Tomography-based Three-dimensional Visualization of Murine Hind-limb Vessels

Naczynia krwionośne to skomplikowane sieci o strukturach przypominających drzewa, a sieci naczyniowe są niezbędne do utrzymania zarówno krążenia, jak i utrzymania funkcji narządów. Wyjaśnienie mechanizmu powstawania naczyń krwionośnych jest zatem niezwykle przydatne w wyjaśnianiu procesów rozwojowych i mechanizmów patologicznych. Mysie naczynia kończyn tylnych są często wykorzystywane jako model fizjologicznej i patologicznej angiogenezy. Ocena odbywa się głównie metodą dwuwymiarową z wykorzystaniem skrawków tkanek. Jednak metody oceny trójwymiarowej (3D) morfologii naczyń krwionośnych są szczególnie ograniczone. W artykule przedstawiono metodę wizualizacji mysich kończyn tylnych za pomocą tomografii komputerowej (CT). Przez aortę zstępującą wstrzykuje się żywicę nieprzezroczystą promieniowanie, a całe naczynia wypełnia się barwnikiem. Dostosowując czas wstrzykiwania barwnika, możliwe jest również wypełnienie specyficzne dla tętnicy, a próbki można uzyskać za pomocą dowolnego urządzenia do mikrorentgenowskiej tomografii komputerowej. Ta metoda kontrastowa stanowi podstawową technikę oceny 3D mysich naczyń krwionośnych kończyn dolnych. Ponadto metoda ta może być stosowana do wizualizacji wszystkich naczyń krwionośnych poniżej przepony i oceny naczyń krwionośnych w narządach jamy brzusznej.

Wszystkie naczynia w kończynach dolnych mogą zostać zwizualizowane, jeśli protokół zostanie prawidłowo przeprowadzony (Rycina 2A). W modelu niedokrwienia kończyny tylnej niepodwiązana tętnica udowa biegnie równolegle do żyły udowej (Rycina 2B), a podwiązanie tętnicy udowej można potwierdzić poprzez przerwanie ciągłości środka kontrastowego (Rycina 2C). Wyniki wykazały rozwój naczyństw pobocznych (Rycina 2D). Krążenie oboczne tworzy się między tętnicami proksymalnie względem podwiązanej tętnicy a tętnicą w obrębie podudzia oraz po stronie brzusznej i grzbietowej tętnicy udowej. Tętnica pośladkowa dolna – rozpoczynająca się po stronie grzbietowej miednicy i przebiegająca po bocznej stronie uda – ulega znacznemu rozszerzeniu po stronie niedokrwionej.
Naczynia wypełnione kontrastem są wypełnione środkiem kontrastowym (Rysunek 2E); przerwy w kontraście wskazują na zmieszanie z mediami bezkontrastowymi (np. krwią, buforem rozszerzającym naczynia lub pęcherzykami powietrza) lub niewystarczającą perfuzję kontrastu (Rysunek 2F). Rozszerzenie naczyń i fiksacja nie przebiegłyby prawidłowo, gdyby naczynia krwionośne uległy skurczeniu. Chociaż obrazowanie CT pozwala na wizualizację jedynie środka kontrastowego, możliwe jest oglądanie tętnic na powierzchni ciała za pomocą obserwacji makroskopowej lub stereomikroskopowej (Rysunek 2G). W związku z tym łatwiej jest ocenić defekty przy użyciu środka kontrastowego (Rysunek 2H).
<img alt="Eksperyment perfuzji zwierząt przedstawiający konfigurację cewnika i procedurę chirurgiczną na modelu gryzoni." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63009/63009fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schemat procedury. (A) Aparatura do perfuzji ciśnieniowej i cewnik 22 G połączone za pomocą rurki przedłużającej 2 mL i trójdrożnego kranu. (B) Aorta wstępująca jest przecięta ukośnie, aby odsłonić przekrój poprzeczny (żółta strzałka). (C) Cewnik został zamocowany za pomocą dwóch szpilek (żółte strzałki). (D) Ustabilizowane kończyny dolne są wyprostowane po zamocowaniu (żółte strzałki). (E) Wstrzykiwanie kontrastu przez trójdrożny kran. Kierunek wstrzykiwania wskazany jest żółtą strzałką. (F) Łóżysko paznokcia kończyny tylnej wypełnione jest kontrastem (żółta strzałka). (G) Kran zostaje zamknięty i odłączony od aparatury do perfuzji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63009/63009fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat obrazowania naczyniowego CT przedstawiający struktury tętnicze, rekonstrukcja 3D, oznaczone sekcje naczyń." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63009/63009fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Obrazy naczyń. (A) Pełny obraz kości i naczyń kończyny tylnej. (B) Tętnica udowa (czerwona strzałka) i żyła udowa (niebieska strzałka). (C) Podwiązana tętnica udowa (żółta strzałka). Obwód jest przerwany przez przeszkodę (żółta przerywana linia). (D) Naczynia poboczne po stronie podwiązanej (żółte strzałki). Żółta przerywana linia reprezentuje przerwaną tętnicę udową. (E) Dobrze wypełniona próbka tętnicy odłogowej (czerwona strzałka) i żyły odłogowej (niebieska strzałka). (F) Niewystarczająca perfuzja prowadzi do przerwania naczyń odłogowych (żółta przerywana linia). (G) Obserwacja stereomikroskopowa reprezentatywnej próbki. Prawa tętnica udowa (żółta strzałka) jest wypełniona środkiem kontrastowym. (H) Obserwacja stereomikroskopowa nieudanej próbki. W prawej tętnicy udowej (żółta strzałka) brakuje środka kontrastowego. Paski skali = 1 mm (B-F), 2 mm (G, H), 10 mm (A). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63009/63009fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Tutaj opisujemy metodę wizualizacji i kwantyfikacji naczyń mysich kończyn tylnych za pomocą mikrorentgenowskiej tomografii komputerowej.

Przygotowanie próbki do trójwymiarowej wizualizacji naczyń kończyn tylnych myszy w oparciu o tomografię komputerową

Blood vessels are complex networks with tree-like structures, and vascular networks are essential for maintaining both circulation and maintaining organ ...

Możliwe jest wykonanie zdjęć CT naczyń krwionośnych kończyn dolnych i narządów jamy brzusznej przy użyciu protokołu krokowego. Metoda umożliwia kompleksową ocenę całych naczyń krwionośnych. Ponadto możliwa jest ocena samych tętnic lub jednocześnie tętnic i żył.Bardzo ważne jest, aby zapobiegać powstawaniu zakrzepów krwi, wyciekom lub studni krwi oraz unikać pęcherzyków powietrza. Przed operacją należy wstrzyknąć 1 jednostkę/gram heparyny w PBS do jamy dootrzewnowej myszy. Po 30 minutach wykonaj nacięcie w linii środkowej mostka myszy poddanej eutanazji i przymocuj otwartą klatkę piersiową za pomocą szpilek.Przetnij aortę wstępującą przed usunięciem serca, a następnie usuń płuco, aby odsłonić aortę zstępującą. Przetnij aortę zstępującą po przekątnej, aby odsłonić przekrój naczynia. Następnie wprowadź cewnik o rozmiarze 22 do aorty zstępującej, jednocześnie uruchamiając bufor rozszerzający naczynia krwionośne.Przypnij korzeń cewnika i zawiąż węzeł, aby zapobiec wyciekowi z powodu przepływu wstecznego. Po zakończeniu rozpocznij perfuzję podgrzanym roztworem rozszerzającym naczynia krwionośne pod stałym ciśnieniem od 13 do 15 kilopaskalów. Po trzech minutach perfuzjuj roztwór 4% paraformaldehydu w PBS przez 3 minuty.Zatrzymać perfuzję i napełnić rurkę przedłużającą podłączoną do cewnika 2 ml świeżo przygotowanego środka kontrastowego rozcieńczonego w stosunku 1:1 do perfuzji w ustalonym ciśnieniu od 13 do 15 kilopaskalów. Aby uwidocznić tętnice, sprawdź paznokieć u nogi jamy ustnej, aby upewnić się, że środek kontrastowy dotarł do tętnicy. W ten sam sposób sprawdź żyłę główną dolną przepony, aby potwierdzić pełne krążenie środka kontrastowego i uwidocznić wszystkie naczynia.Jeśli krążenie środka kontrastowego jest zakończone, zamknij zawór trójdrogowy i wyjmij rurkę. Próbkę inkubować przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza. W tym protokole uwidoczniono wszystkie naczynia w kończynach dolnych myszy.Wyniki badania modelu niedokrwienia kończyn tylnych potwierdziły, że niepodwiązana tętnica udowa biegła równolegle do żyły udowej. Przerwa w podawaniu środków kontrastowych ułatwiła również obserwację podwiązanej tętnicy udowej i rozwój naczyń pobocznych. Można było zobaczyć kilka naczyń wypełnionych środkiem kontrastowym.Z drugiej strony zauważono również zakłócenia w działaniu środków kontrastowych spowodowane mieszaniem się środków niekontrastowych lub niedostateczną perfuzją. Niemożliwe było oglądnięcie tętnic na powierzchni ciała za pomocą obserwacji mikroskopowej lub stereomikroskopowej środka kontrastowego, co ułatwiało ocenę ubytków w układzie naczyniowym. Bardzo ważne jest, aby podczas wprowadzania cewnika unikać pęcherzyków powietrza.Ponieważ ich narządy jamy brzusznej są również rozluźnione, możliwe jest wyjęcie z narządów i wykonanie tomografii komputerowej. Dzięki zastosowaniu tej metody udało nam się zidentyfikować nową ćwiartkę nasycenia.

sample-preparation-for-computed-tomography-based-three-dimensional

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Obrazowanie naczyń krwionośnych małych zwierząt z kontrastem za pomocą mikrotomografii komputerowej (microCT) jest szybką, kosztowo efektywną i wysokoprzepustową techniką do seryjnych badań in situ rozwoju guzów, analizy sieci naczyń krwionośnych je odżywiających oraz monitorowania odpowiedzi guzów na przedkliniczne interwencje terapeutyczne.

Obrazowanie naczyń z kontrastem przy użyciu mikrotomografii komputerowej (MicroCT)

Nieniszcząca wizualizacja objętościowa jest możliwa do uzyskania jedynie za pomocą technik tomograficznych, z których najefektywniejszą jest mikrotomografia komputerowa (CT) promieniami rentgenowskimi.

Wysokorozdzielcze obrazowanie 3D Ex-vivo Próbki biologiczne w mikro-tomografii komputerowej (mikro-CT)

Wizualizacja naczyń wieńcowych ma kluczowe znaczenie dla pogłębienia naszej wiedzy na temat chorób układu sercowo-naczyniowego. Opisujemy tutaj metodę perfuzji naczyń wieńcowych myszy radiologicznym silikonem (Microfil) w ramach przygotowania do obrazowania mikrotomografią komputerową (μCT).

Wsteczna perfuzja i wypełnianie naczyń wieńcowych myszy w ramach przygotowania do obrazowania mikrotomografią komputerową

Źródło: Kim, D., et. al. Połączone obrazowanie fluorescencyjne w bliskiej podczerwieni i mikrotomografia komputerowa do bezpośredniej wizualizacji zakrzepowej choroby zakrzepowo-zatorowej mózgu. J. Vis. Exp. (2016)Ten film przedstawia wizualizację skrzepliny mózgowej u myszy za pomocą obrazowania mikrotomografii komputerowej (mikro-CT). Mysi model zakrzepliny mózgowej jest wstrzykiwany z nanocząstkami złota ukierunkowanymi na fibrynę, działającymi jako środek kontrastujący. Mysz jest...

Wizualizacja skrzepliny mózgowej u myszy za pomocą obrazowania metodą mikrotomografii komputerowej

Analiza ex vivo zmian w tętnicach z modeli zwierzęcych chorób sercowo-naczyniowych klasycznie opiera się na technikach histologicznych i immunohistochemicznych. Zapewniają one 2-wymiarowe pomiary w 3-wymiarowych zmianach. W artykule opisano generowanie zmian tętniczych do analizy ilościowej w 3 wymiarach z wykorzystaniem optycznej tomografii projekcyjnej.

Generowanie i 3-wymiarowa ocena ilościowa zmian w tętnicach u myszy za pomocą optycznej tomografii projekcyjnej

Implantacja autologicznych i allogenicznych przeszczepów kostnych stanowi akceptowane metody leczenia dużych ubytków kości twarzoczaszki. Jednak wpływ składu przeszczepu na wzajemne oddziaływanie między neowaskularyzacją, różnicowaniem komórek i tworzeniem kości jest niejasny. Przedstawiamy protokół obrazowania multimodalnego, którego celem jest wyjaśnienie współzależności angiogenezy i osteogenezy w pobliżu przeszczepu.

Tomografia komputerowa i obrazowanie optyczne sprzężenia osteogeneza-angiogeneza w celu oceny integracji autoprzeszczepów kości czaszki i alloprzeszczepów

Ten artykuł opisuje szczegółową metodologię użycia nieprzepuszczającego promieni rentgenowskich kauczuku silikonowego na bazie ołowiu do perfuzji mysiego układu krwionośnego do ilościowego określenia średnicy aorty w mysim modelu tętniaka i rozwarstwienia aorty.

Ilościowa analiza aortapatii metodą mikro-CT w mysim modelu tętniaka i rozwarstwienia aorty wywołanego β-aminopropionitrylem

Tutaj prezentujemy protokół amputacji terminalnego paliczka dorosłej myszy w celu zbadania powstawania blastema u ssaków i kostnienia wewnątrzbłoniastego, analizowany za pomocą immunohistochemii fluorescencyjnej i sekwencyjnej tomografii mikrokomputerowej in vivo.

Amputacja i regeneracja palców dorosłych myszy : prosty model do badania powstawania blastemy i kostnienia śródbłoniastego u ssaków

Celem tej techniki jest wizualizacja ex vivo sieci tętnic płucnych u myszy wcześnie urodzonych i dorosłych poprzez napompowanie płuc i wstrzyknięcie przez tętnicę płucną nieprzezroczystego związku na bazie polimeru radiologicznego. Omówiono również potencjalne zastosowania tkanek odlewanych.

Odlew naczyniowy płuc myszy dorosłych i wczesnych po urodzeniu do obrazowania mikro-CT

Obecny protokół opisuje unikalny, klinicznie istotny model choroby tętnic obwodowych, który łączy elektrokoagulację tętnicy udowej i żyły z podawaniem inhibitora syntazy tlenku azotu w celu wywołania zgorzeli kończyn tylnych u myszy FVB. Perfuzja DiI dosercowa jest następnie wykorzystywana do trójwymiarowego obrazowania naczyń krwionośnych opuszki stopy w wysokiej rozdzielczości.

Trójwymiarowe obrazowanie unaczynienia opuszki stopy w wysokiej rozdzielczości w mysim modelu zgorzeli kończyn tylnych

W tym protokole omawiamy implementację modelu udanego ortotopowego przeszczepu wątroby (OLT) u myszy. Dodatkowo omówiono adiuwanty do dalszej analizy drożności przeszczepu allogenicznego po udanym OLT u myszy, w szczególności z wykorzystaniem skanów tomografii mikrokomputerowej (microCT).

Udany ortotopowy przeszczep wątroby u myszy z wykorzystaniem angiografii tomografii mikrokomputerowej

Poznaj metodę wizualizacji naczyń kończyn tylnych myszy za pomocą mikrotomografii komputerowej. Technika umożliwia kompleksową ocenę układu krwionośnego w badaniach biologii naczyniowej.

Przygotowanie próbki do trójwymiarowej wizualizacji naczyń kończyn tylnych myszy w oparciu o tomografię komputerową

Przeglądaj więcej filmów