Name: Obrazowanie adhezji molekularnej w walcowaniu komórek za pomocą testu śladu adhezyjnego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Poznaj test śladu adhezyjnego do badania zdarzeń adhezji podczas szybkiego walcowania komórek. Ta metoda umożliwia ilościowe określenie sił molekularnych przy użyciu mikroskopii TIRF.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Canada Foundation of Innovation (CFI 35492), Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grant (RGPIN-2017-04407), New Frontiers in Research Fund (NFRFE-2018-00969), Michael Smith Foundation for Health Research (SCH-2020-0559) oraz University of British Columbia Eminence Fund.

<ol><li>McEver, R. P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rolling+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Rolling cell adhesion.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 26 (1), 363-396 (2010).</li>
<li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+to+the+site+of+inflammation%3A+The+leukocyte+adhesion+cascade+updated%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Getting to the site of inflammation: The leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nature Reviews Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).</li>
<li>Zarbock, A., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+adhesion+and+activation+under+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Neutrophil adhesion and activation under flow.</a> Microcirculation. 16 (1), 31-42 (2009).</li>
<li>Etzioni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+molecules+-+Their+role+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Research%22%5BJournal%5D)">Adhesion molecules - Their role in health and disease.</a> Pediatric Research. 39 (2), 191-198 (1996).</li>
<li>van de Vijver, E., vanden Berg, T. K., Kuijpers, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+adhesion+deficiencies%5BTitle%5D)+AND+%22Hematology%2FOncology+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Leukocyte adhesion deficiencies.</a> Hematology/Oncology Clinics of North America. 27 (1), 101-116 (2013).</li>
<li>Hanna, S., Etzioni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+adhesion+deficiencies%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Leukocyte adhesion deficiencies.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1250 (1), 50-55 (2012).</li>
<li>Geng, Y., Marshall, J. R., King, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycomechanics+of+the+metastatic+cascade%3A+Tumor+cell-endothelial+cell+interactions+in+the+circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Glycomechanics of the metastatic cascade: Tumor cell-endothelial cell interactions in the circulation.</a> Annals of Biomedical Engineering. 40 (4), 790-805 (2012).</li>
<li>Yasmin-Karim, S., King, M. R., Messing, E. M., Lee, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-selectin+ligand-1+controls+circulating+prostate+cancer+cell+rolling%2Fadhesion+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">E-selectin ligand-1 controls circulating prostate cancer cell rolling/adhesion and metastasis.</a> Oncotarget. 5 (23), 12097-12110 (2014).</li>
<li>Marshall, B. T., Long, M., Piper, J. W., Yago, T., McEver, R. P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+catch+bonds+involving+cell-adhesion+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct observation of catch bonds involving cell-adhesion molecules.</a> Nature. 423 (6936), 190-193 (2003).</li>
<li>Hammer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesive+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Adhesive dynamics.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 136 (2), 021006(2014).</li>
<li>Yasunaga, A. B., Murad, Y., Kapras, V., Menard, F., Li, I. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+interpretation+of+cell+rolling+velocity+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Quantitative interpretation of cell rolling velocity distribution.</a> Biophysical Journal. 120 (12), 2511-2520 (2021).</li>
<li>Li, I. T. S., Ha, T., Chemla, Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+cell+surface+adhesion+by+rotation+tracking+and+adhesion+footprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Mapping cell surface adhesion by rotation tracking and adhesion footprinting.</a> Scientific Reports. 7 (1), 44502(2017).</li>
<li>Yasunaga, A. B., Li, I. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+fast+molecular+adhesion+by+fluorescence+footprinting%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Quantification of fast molecular adhesion by fluorescence footprinting.</a> Science Advances. 7 (34), (2021).</li>
<li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nature Methods. 8 (12), 1027-1040 (2011).</li>
<li>Zhu, M., Lerum, M. Z., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+prepare+reproducible%2C+homogeneous%2C+and+hydrolytically+stable+aminosilane-derived+layers+on+silica%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">How to prepare reproducible, homogeneous, and hydrolytically stable aminosilane-derived layers on silica.</a> Langmuir. 28 (1), 416-423 (2012).</li>
<li>Chandradoss, S. D., Haagsma, A. C., Lee, Y. K., Hwang, J. H., Nam, J. M., Joo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+passivation+for+single-molecule+protein+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Surface passivation for single-molecule protein studies.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e50549(2014).</li>
<li>Schnitzbauer, J., Strauss, M. T., Schlichthaerle, T., Schueder, F., Jungmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+microscopy+with+DNA-PAINT%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Super-resolution microscopy with DNA-PAINT.</a> Nature Protocols. 12 (6), 1198-1228 (2017).</li>
<li>Chalfoun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MIST%3A+Accurate+and+scalable+microscopy+image+stitching+tool+with+stage+modeling+and+error+minimization%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">MIST: Accurate and scalable microscopy image stitching tool with stage modeling and error minimization.</a> Scientific Reports. 7 (1), 4988(2017).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constructing+modular+and+universal+single+molecule+tension+sensor+using+protein+G+to+study+mechano-sensitive+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Constructing modular and universal single molecule tension sensor using protein G to study mechano-sensitive receptors.</a> Scientific Reports. 6, 1-10 (2016).</li>
<li>Crockett-Torabi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selectins+and+mechanisms+of+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Selectins and mechanisms of signal transduction.</a> Journal of Leukocyte Biology. 63 (1), 1-14 (1998).</li>
<li>Ye, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+P-selectin+and+PSGL-1+axis+accelerates+atherosclerosis+via+activation+of+dendritic+cells+by+the+TLR4+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Disease%22%5BJournal%5D)">The P-selectin and PSGL-1 axis accelerates atherosclerosis via activation of dendritic cells by the TLR4 signaling pathway.</a> Cell Death and Disease. 10 (7), 507(2019).</li>
<li>Saha, K., Bender, F., Gizeli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+IgG+binding+to+proteins+G+and+A%3A+Nonequilibrium+kinetic+and+binding+constant+determination+with+the+acoustic+waveguide+device%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Comparative study of IgG binding to proteins G and A: Nonequilibrium kinetic and binding constant determination with the acoustic waveguide device.</a> Analytical Chemistry. 75 (4), 835-842 (2003).</li>
<li>Murad, Y., Li, I. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+molecular+forces+with+serially+connected+force+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Quantifying molecular forces with serially connected force sensors.</a> Biophysical Journal. 116 (7), 1282-1291 (2019).</li>
<li>Yasunaga, A. B., Murad, Y., Li, I. T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+molecular+tension-classifications%2C+interpretations+and+limitations+of+force+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantifying molecular tension-classifications, interpretations and limitations of force sensors.</a> Physical Biology. 17 (1), 011001(2020).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Test śladu adhezyjnego umożliwia wizualizację zdarzeń adhezji molekularnej między PSGL-1 a selektyną P podczas adhezji toczenia komórek. Proces ten jest inicjowany przez wychwytywanie za pośrednictwem selektyny P, a następnie toczenie pod wpływem płynnego naprężenia ścinającego. Potencjalne problemy podczas eksperymentu zwykle obejmują słabe zwijanie komórek lub brak ścieżek fluorescencyjnych, nawet jeśli komórki toczą się dobrze. Problemy te często wynikają z kontroli jakości na krytycznych etapach protokołu, zgodnie z ...

Kaskada adhezji opisuje, w jaki sposób krążące komórki łączą się ze ścianą naczynia krwionośnego i toczą się wzdłuż niej1. Pasywne rolowanie odbywa się głównie za pośrednictwem selektyn, głównej klasy komórkowych cząsteczek adhezyjnych (CAM)1. Pod ścinającym przepływem krwi leukocyty eksprymujące ligand-1 glikoproteiny selektyny P (PSGL-1) tworzą wysoce przejściowe wiązania z selektyną P, które mogą ulegać ekspresji na powierzchni komórek śródbłonka objętych stanem zapalnym. Proces ten ma kluczowe znaczenie dla migracji leukocytów do miejsca zapalenia2. Ponadto, PSGL-1 jest również mechanowrażliwym receptorem zdolnym do wyzwalania kolejnego etapu mocnej adhezji toczącej się kaskady adhezyjnej po jego zaangażowaniu z P-selectin3.
Mutacje genetyczne wpływające na funkcję CAM mogą poważnie wpływać na układ odpornościowy, np. w rzadkiej chorobie niedoboru adhezji leukocytów (LAD), gdzie nieprawidłowe działanie cząsteczek adhezyjnych pośredniczących w toczeniu prowadzi do osób z poważnie obniżoną odpornością4,5,6. Ponadto wykazano, że krążące komórki nowotworowe migrują w podobny sposób w procesie toczenia, co prowadzi do przerzutów7,8. Ponieważ jednak zwijanie komórek jest szybkie i dynamiczne, konwencjonalne eksperymentalne metody mechanobiologiczne nie nadają się do badania interakcji molekularnych podczas walcowania komórek. Podczas gdy metody manipulacji pojedynczymi komórkami i pojedynczymi cząsteczkami, takie jak mikroskopia sił atomowych i pęseta optyczna, były w stanie badać interakcje molekularne, takie jak zależna od siły interakcja selektyny P z PSGL-1 na poziomie pojedynczej cząsteczki9, nie nadają się one do badania zdarzeń adhezji na żywo podczas walcowania komórek. Dodatkowo, oddziaływanie scharakteryzowane in vitro nie może bezpośrednio odpowiedzieć na pytanie o adhezję molekularną in vivo. Na przykład, jaki zakres napięcia molekularnego jest biologicznie istotny, gdy komórki funkcjonują w swoim naturalnym środowisku? Metody obliczeniowe, takie jak symulacja dynamiki adhezji10 lub prosty model stanu ustalonego11 uchwyciły pewne szczegóły molekularne i ich wpływ na zachowanie toczenia, ale są w dużym stopniu zależne od dokładności parametrów i założeń modelowania. Inne techniki, takie jak mikroskopia sił trakcyjnych, mogą wykrywać siły podczas migracji komórek, ale nie zapewniają wystarczającej rozdzielczości przestrzennej ani informacji ilościowych na temat napięcia molekularnego. Żadna z tych technik nie może zapewnić bezpośrednich obserwacji eksperymentalnych dynamiki czasowej, rozkładu przestrzennego i niejednorodności wielkości sił molekularnych, które bezpośrednio odnoszą się do funkcji i zachowania komórek w ich naturalnym środowisku.
Dlatego implementacja czujnika siły molekularnej zdolnego do dokładnego pomiaru oddziaływań za pośrednictwem selektoryny jest kluczowa dla lepszego zrozumienia adhezji toczenia. W tym miejscu opisujemy protokół testu śladu adhezyjnego12, w którym koraliki powlekane PSGL-1 są walcowane na powierzchni prezentującej selektorowane p-selectin uwięzi napinające (TGT)13. Te TGT są nieodwracalnymi czujnikami siły opartymi na DNA, które skutkują stałą historią zdarzeń pęknięcia w postaci odczytu fluorescencji. Osiąga się to poprzez pęknięcie TGT (dsDNA), a następnie znakowanie pękniętego TGT (ssDNA) fluorescencyjnie znakowaną nicią komplementarną. Jedną z głównych zalet tego systemu jest jego kompatybilność zarówno z obrazowaniem o ograniczonej dyfrakcji, jak i z obrazowaniem superrozdzielczym. Znakowana fluorescencyjnie nić komplementarna może być trwale związana (>12 pz) w przypadku obrazowania o ograniczonej dyfrakcji lub przejściowo związana (7-9 pz) w przypadku obrazowania w superrozdzielczości za pomocą DNA PAINT. Jest to idealny system do badania przyczepności tocznej, ponieważ TGT pękają podczas aktywnego walcowania, ale odczyt fluorescencji jest analizowany po walcowaniu. Obie metody obrazowania zapewniają również użytkownikowi większą swobodę w badaniu przyczepności tocznej. Zazwyczaj obrazowanie z ograniczoną dyfrakcją jest przydatne do wyodrębniania siły rozrywania molekularnego poprzez intensywność fluorescencji13, podczas gdy obrazowanie o wysokiej rozdzielczości pozwala na ilościową analizę gęstości receptorów. Dzięki możliwości zbadania tych właściwości adhezji tocznej, podejście to stanowi obiecującą platformę do zrozumienia mechanizmu regulacji siły w adhezji molekularnej komórek toczących się pod wpływem przepływu ścinającego.

<table><tbody><tr><td>4-kanałowa prowadnica wiertła</td><td>Wykonany</td><td></td><td>na zamówienie druk 3D z</td></tr><tr><td>4-otworową prowadnicą</td> z włókna ABS Wykonany <td></td><td>na zamówienie</td><td>Wywierć czysty szkiełko mikroskopowe za pomocą Dremel z wiertłami z powłoką diamentową na 4-kanałowej prowadnicy wiertarskiej, która ma układ pasujący do środków 8-32 gwintowanych otworów na aluminiowym zacisku.</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>VWR</td><td>BDH1101-4LP</td><td></td></tr><tr><td>Przekładka akrylowa</td><td>Wykonane</td><td></td> na zamówienie <td>Wytnij dwa bloki arkuszy akrylowych o wymiarze 40 mm x 30 mm x 2,5 mm. Na każdym bloku wywierć dwa otwory o średnicy 3 mm, które są dokładnie wyrównane z 4-40 otworami w aluminiowym uchwycie.</td></tr><tr><td>Aluminiowy uchwyt na wióry</td><td>Wykonany</td><td></td> na zamówienie <td>Blok aluminiowy anodowany maszynowo w uchwycie w kształcie litery C o wymiarze zewnętrznym 640 mm x 500 mm x 65 mm i wymiarze otworu 400 mm x 380 mm x 65 mm. Wloty i wyloty są gwintowane gwintem 8-32.</td></tr><tr><td>Aminosilan</td><td>AlfaAesar</td><td>L14043</td><td>CAS 1760-24-3</td></tr><tr><td>Antybiotyk/roztwór przeciwgrzybiczy</td><td>Cytiva HyClone</td><td>SV3007901</td><td>Pen/Strep/Fungiezone</td></tr><tr><td>Koraliki, polistyren powlekany ProtG</td><td>Spherotech</td><td>PGP-60-5</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>VWR</td><td>332</td><td></td></tr><tr><td>Bufor FARBA</td><td></td><td></td><td>0,05% Tween-20, 5 mM Tris, 75 mM MgCl2, 1 mM bufor EDTA</td></tr><tr><td>, T50M5</td><td></td><td></td><td>10mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2</td></tr><tr><td>Buffer, Rolling</td><td></td><td></td><td>HBSS with 2mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM Hepes, 0.1% bufor BSA</td></tr><tr><td>, Wash</td><td></td><td></td><td>10 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2 i 2 mM CaCl2, 0,05% Tween 20</td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>VWR</td><td>BDH9224</td><td></td></tr><tr><td>Kolby do hodowli komórkowych</td><td>VWR</td><td>10062-868</td><td></td></tr><tr><td>Stężony kwas siarkowy</td><td>VWR</td><td>BDH3072-2.5LG</td><td>95-98%</td></tr><tr><td>Pęseta do trzymania szkiełek nakrywkowych</td><td>Techni-Tool</td><td>758TW150</td><td></td></tr><tr><td>Wiertło z powłoką diamentową bity</td><td>Technologia ścierna</td><td>C5250510</td><td>0,75 mm wiertło diamentowe</td></tr><tr><td>DNA, amina-ssDNA (górna nić)</td> <td>IDT DNA</td><td>Niestandardowy oligo</td><td>CCGGGCGACGCAGGAGGG /3AmMO/</td></tr><tr><td>DNA, biotyna-ssDNA (dolna nić)</td><td>IDT DNA</td><td>Niestandardowy oligo</td><td>/5BiotinTEG/ TTTTT CCCTCCTGCGTCGCCCGG</td></tr><tr><td>DNA, nić imager do DNA-PAINT</td><td>IDT DNA</td><td>Niestandardowy oligo</td><td>GAGGGAAA TT/3Cy3Sp/</td></tr><tr><td>DNA, nić do obrazowania do trwałego znakowania</td><td>IDT DNA</td><td>Niestandardowy oligo</td><td>CCGGGCGACGCAGG /3Cy3Sp/</td></tr><tr><td>Taśma dwustronna</td><td>Scotch</td><td>237</td><td>3/4 cala szerokość, trwała taśma dwustronna</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Thermofisher</td><td>15575020</td><td>0,5 M EDTA, pH 8,0</td></tr><tr><td>Epoksydowy</td><td>Goryl</td><td>42001</td><td>5-minutowy czas utwardzania</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Avantor</td><td>97068-085</td><td></td></tr><tr><td>GelGreen</td><td>Biotium</td><td>41005</td><td></td></tr><tr><td>Lodowaty kwas octowy</td><td>VWR</td><td>BDH3094-2.5LG</td><td></td></tr><tr><td>Szkło, Szkiełka nakrywkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5P</td><td></td></tr><tr><td>Szkło, Szkiełko mikroskopowe</td><td>VWR</td><td>48300-026</td><td>75 mm x 25 mm x 1 mm</td></tr><tr><td>Szkło, Słoik do barwienia</td><td>VWR</td><td>74830-150</td><td>Słoik do barwienia Wheaton (900620)</td></tr><tr><td>Zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS)</td><td>Lonza</td><td>04-315Q</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometr</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z359629-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Ogniwa HL-60</td><td>ATCC</td><td>CCL-240</td><td></td></tr><tr><td>Wspornik przesuwny komory wilgotnościowej</td><td>Wykonany na zamówienie</td><td></td><td>druk 3D z filamentem ABS</td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru</td><td>VWR</td><td>BDH7690-1</td><td>30%</td></tr> <tr><td>Imidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2399</td><td></td></tr><tr><td>Wloty / wyloty</td><td>Wykonane</td><td></td> na zamówienie <td>Przewierć osiem dociskowych 8-32 za pomocą wierteł kobaltowych. Wkład 1,5 cm&nbsp; rurki polietylenowe (Tygon, ID 1/32" Ø 3/32") do każdej pustej dociskowej</td></tr><tr><td>Iscove Modified Dulbecco Media (IMDM)</td><td>Lonza</td><td>12-722F</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>VWR</td><td>BDH9244</td><td></td></tr><tr><td>Magnetyczne kulki Ni-NTA</td><td>Invitrogen</td><td>10103D</td><td></td></tr><tr><td>Rurki pocztowe</td><td>EMS</td><td>EMS71406-10</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>VWR</td><td>BDH1135-4LP</td><td></td></tr><tr><td>Micro Bio-Spin P-6 Kolumny żelowe</td><td>Biorad</td><td>7326200</td><td>W buforze SSC</td></tr><tr><td>PEG</td><td>Laysan Bio</td><td>MPEG-SVA-5000</td><td></td></tr><tr><td>PEG-biotyna</td><td>Laysan Bio</td><td>Biotyna-PEG-SVA-5000</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek potasu</td><td>VWR</td><td>470302-132</td><td></td></tr><tr><td>Białko, białko G</td><td>Abcam</td><td>ab155724</td><td>N-końcowy His-Tag i C-końcowy Białko cysteiny</td></tr><tr><td>, selektyna P-Fc</td><td>R& D System</td><td>137-PS</td><td>Rekombinowana ludzka selektyna P/CD62P Fc Chimera białko</td></tr>, <tr><td>białko CF, streptawidyna</td><td>Cedarlan</td><td>CL1005-01-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Pompa Strzykawka</td><td>Aparat Harvard</td><td>704801</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Ward' s Science</td><td>470302-444</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>VWR</td><td>97061-274</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-SMCC</td><td>Thermofisher</td><td>22322</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka</td><td>Hamilton</td><td>81520</td><td>Strzykawki z PTFE luer lock, 5 mL</td></tr><tr><td>Igły strzykawkowe</td><td>BD</td><td>305115</td><td>Precision Glide 26 g, długość 5/8 cala</td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4706-2G</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>VWR</td><td>BDH4502-500GP</td><td></td></tr><tr><td>Przewody, adapter</td><td>Tygon</td><td>ABW00001</td><td>Formulacja 3350, średnica wewnętrzna 1/32"; średnica zewnętrzna 3/32"</td></tr><tr><td>Przewody polietylenowe</td><td>BD Intramedic</td><td>427406</td><td>Intramedic (PE20) średnica wewnętrzna 0,38mm; średnica zewnętrzna 1,09mm</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93773</td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie adhezji molekularnej w walcowaniu komórek za pomocą testu śladu adhezyjnego

Imaging Molecular Adhesion in Cell Rolling by Adhesion Footprint Assay

Zrost toczny, ułatwiony przez interakcje za pośrednictwem selekcji, jest wysoce dynamiczną, pasywną ruchliwością w rekrutacji leukocytów do miejsca zapalenia. Zjawisko to występuje w żyłkach zakapilarnych, w których przepływ krwi popycha leukocyty ruchem tocznym na komórki śródbłonka. Stabilne walcowanie wymaga delikatnej równowagi między tworzeniem wiązań adhezyjnych a ich mechanicznie napędzaną dysocjacją, dzięki czemu ogniwo pozostaje przyczepione do powierzchni podczas toczenia się w kierunku przepływu. W przeciwieństwie do innych procesów adhezji zachodzących w stosunkowo statycznych środowiskach, adhezja walcowa jest bardzo dynamiczna, ponieważ komórki toczne przemieszczają się przez tysiące mikronów z prędkością kilkudziesięciu mikronów na sekundę. W związku z tym konwencjonalne metody mechanobiologiczne, takie jak mikroskopia sił trakcyjnych, nie nadają się do pomiaru poszczególnych zdarzeń adhezji i związanych z nimi sił molekularnych ze względu na krótki czas i wymaganą wysoką czułość. W tym miejscu opisujemy naszą najnowszą implementację testu śladu adhezyjnego do obrazowania interakcji selektyny P: PSGL-1 w adhezji tocznej na poziomie molekularnym. Metoda ta wykorzystuje nieodwracalne linki napinające na bazie DNA w celu wytworzenia trwałej historii zdarzeń adhezji molekularnej w postaci ścieżek fluorescencyjnych. Ścieżki te można obrazować na dwa sposoby: (1) zszywając ze sobą tysiące obrazów ograniczonych dyfrakcją, aby uzyskać duże pole widzenia, umożliwiając ekstrakcję śladu adhezyjnego każdej toczącej się komórki o długości tysięcy mikronów, (2) wykonując DNA-PAINT w celu zrekonstruowania obrazów o wysokiej rozdzielczości ścieżek fluorescencyjnych w małym polu widzenia. W tym badaniu test śladu adhezyjnego został wykorzystany do zbadania komórek HL-60 toczących się przy różnych naprężeniach ścinających. W ten sposób byliśmy w stanie zobrazować rozkład przestrzenny oddziaływania selektyny P: PSGL-1 i uzyskać wgląd w ich siły molekularne poprzez intensywność fluorescencji. W związku z tym metoda ta stanowi podstawę do ilościowego badania różnych interakcji komórka-powierzchnia zaangażowanych w adhezję toczną na poziomie molekularnym.

Powyższy protokół opisuje procedurę eksperymentalną testu odcisków adhezyjnych (adhesion footprint assay). Ogólny schemat doświadczenia przedstawiono na Rysunku 1, od montażu komory przepływowej (Rysunek 1A), poprzez funkcjonalizację powierzchni (Rysunek 1B), aż po etapy przeprowadzania eksperymentu i obrazowania (Rysunek 1C).
Rysunek 2 przedstaw...

Ten protokół przedstawia eksperymentalne procedury przeprowadzania testu śladu adhezyjnego w celu zobrazowania zdarzeń adhezji podczas szybkiej adhezji toczenia komórek.

Obrazowanie adhezji molekularnej w walcowaniu komórek za pomocą testu śladu adhezyjnego

Rolling adhesion, facilitated by selectin-mediated interactions, is a highly dynamic, passive motility in recruiting leukocytes to the site of ...

Protokół ten pomaga ustalić związek między siłą molekularną a zachowaniem toczenia komórek, a także umożliwia przestrzenne mapowanie i ilościowe określanie adhezji walcowej na poziomie molekularnym. Technika ta pozwala na badanie indywidualnych zdarzeń adhezji podczas rzeczywistego toczenia komórek, co pozwala nam na bezpośredni pomiar fizjologicznie odpowiedniej siły adhezji molekularnej. Przygotowanie powierzchni przy użyciu odpowiedniego stężenia i czasu inkubacji na każdym etapie ma kluczowe znaczenie dla osiągnięcia wysokiej jakości funkcjonalizacji powierzchni.Kluczowa jest również jakość biokoniugacji i odpowiednie warunki. Demonstracja wizualna ma kluczowe znaczenie, aby pomóc naukowcom odtworzyć ten protokół. W szczególności etapy, takie jak montaż komory przepływowej i przetwarzanie końcowe obrazów, będą bardzo korzystne dzięki wizualnej demonstracji.Zacznij od cienkiego rozprowadzenia niewielkiej ilości żywicy epoksydowej po obu stronach taśmy dwustronnej za pomocą żyletki. Za pomocą lasera przetnij taśmę pokrytą żywicą epoksydową, aby utworzyć cztery kanały. Utwórz chip przepływowy, umieszczając taśmę epoksydową między czterootworową prowadnicą a szkiełkiem nakrywkowym PEG.Za pomocą końcówki pipety delikatnie dociśnij wzdłuż kanałów, aby uzyskać dobre uszczelnienie, a następnie utwardź żywicę epoksydową przez co najmniej godzinę. Wyrównaj chip tak, aby otwór każdego kanału znajdował się w środku adaptera. Następnie umieść dwie przezroczyste akrylowe przekładki na wierzchu chipa.Mocno dociśnij środek bloku i przykręć końce każdej przekładki. Wkręć wloty w gwintowane otwory po drugiej stronie wspornika i monitoruj stan uszczelnienia przez przezroczysty blok akrylowy. Wlej 200 mikrolitrów buforu do płukania do komory, aby sprawdzić, czy nie ma wycieków.Jeśli w kanale utworzą się bąbelki, agresywnie wepchnij dodatkowe 200 mikrolitrów buforu do mycia, aby usunąć pęcherzyki. Dodaj 40 mikrolitrów BSA do komory przepływowej, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu i inkubować przez 10 minut w komorze wilgotnościowej. Po inkubacji dodać 40 mikrolitrów w Tween 20 do komory przepływowej i ponownie inkubować przez 10 minut, aby jeszcze bardziej zmniejszyć niespecyficzne wiązanie.Następnie umyj kanał 200 mikrolitrami buforu do mycia, aby usunąć wszystkie środki pasywacyjne. W celu funkcjonalizacji powierzchni komory dodać 40 mikrolitrów streptawidyny do komory przepływowej i inkubować przez 20 minut, a następnie umyć komorę 200 mikrolitrami buforu do mycia. Teraz dodaj 40 mikrolitrów hybrydyzowanego białka G-TGT do komory przepływowej i inkubuj przez 20 minut.Po umyciu buforem do płukania dodać 40 mikrolitrów górnej nici białka G-TGT i inkubować przez 20 minut, aby uzupełnić wszelkie niehybrydyzowane dolne pasmo TGT na powierzchni, a następnie przemyć buforem do mycia. Na koniec dodać 40 mikrolitrów P-selectin-Fc do komory przepływowej i inkubować przez 60 minut przed przemyciem buforem do mycia. Napełnij szklaną strzykawkę o pojemności pięciu mililitrów buforem do toczenia i postukaj w boki strzykawki, aby usunąć i wypchnąć pęcherzyki, gdy unoszą się w kierunku końcówki.Po wprowadzeniu sterylnej igły do 200-milimetrowego kawałka rurki polietylenowej, podłącz igłę do szklanej strzykawki. Zamocować strzykawkę na pompie strzykawkowej i przechylić pompkę strzykawkową tak, aby strona tłoka była podniesiona, aby zapobiec przedostawaniu się pęcherzyków powietrza do kanału. Włóż koniec rurki do wlotu komory przepływowej.Włóż jeden koniec innego 200-milimetrowego kawałka rurki polietylenowej do wylotu i zanurz drugi koniec w zlewce na odpady. Weź od jednego do dwóch mililitrów próbki zawiesiny komórek i odwiruj, aby osadzać komórki. Usunąć pożywkę i delikatnie zawiesić komórki w 500 mikrolitrach buforu do toczenia.Ostrożnie odłączyć rurkę od wlotów i wylotu i odpipetować 40 mikrolitrów zawiesiny ogniw do komory przepływowej. Podłącz ponownie rurkę zgodnie z wcześniejszym opisem, upewniając się, że pęcherzyki nie zostały wprowadzone do kanału przepływowego. Rozpocznij eksperyment z toczeniem komórek, uruchamiając pompę strzykawkową przy żądanych natężeniach przepływu.Obserwuj toczenie się komórek za pomocą mikroskopu ciemnego pola z obiektywem 10X. Po zakończeniu eksperymentu usuń komórki z kanału, podając bufor rolkowy w ilości 100 mililitrów na godzinę, aż powierzchnia będzie wolna od komórek. W celu zobrazowania lokalnych ścieżek za pomocą DNA-PAINT, dodaj do kanału 40 mikrolitrów nici imagera DNA-PAINT przygotowanej w buforze DNA-PAINT.Wykonać mikroskopię fluorescencyjną całkowitego wewnętrznego odbicia, stosując warunki wymienione w manuskrypcie tekstowym. Lokalizuj i renderuj obrazy w super rozdzielczości. W celu zobrazowania długich ścieżek przez trwałe etykietowanie, dodaj stałą nić imagera i inkubuj przez 120 sekund w buforze T50M5.Następnie umyj kanał, wlewając 200 mikrolitrów buforu do mycia. Nagraj obraz z wyłączonym laserem wzbudzającym, aby uzyskać szum kamery w tle. Zobrazuj duży obszar we wzorze siatki za pomocą mikroskopii TIRF.Zaprogramuj mikroskop tak, aby skanował obszar 400 na 50 obrazów i podziel surowe dane na indywidualne pliki TIP, z których każdy zawiera maksymalnie 10 000 obrazów za pomocą programu ImageJ. Spłaszcz wszystkie obrazy za pomocą profilu oświetlenia i użyj wtyczki MIST, aby zszyć obrazy. Wynik charakterystyki biokoniugacji białka G ssDNA wykazał prawie jeden stosunek białka G do ssDNA, w którym białko G Maleimid ssDNA i bufor elucji imidazolu widma od podstawy ortogonalnej do dopasowania do spektrum produktów biokoniugacji.Natywny PAGE został wykorzystany do potwierdzenia biokoniugacji pokazującej jasnozielone prążki pokrywające się z pasmem monomerycznego białka G, co wskazuje na udaną koniugację i dobrą wydajność. Profil oświetlenia TIRF wprowadzony ze światłowodu jednomodowego jest na ogół jaśniejszy w środku pola widzenia i ciemniejszy na krawędziach. Aby skompensować nierównomierne oświetlenie i spłaszczyć obrazy do analizy ilościowej, profil oświetlenia został określony poprzez uśrednienie tysięcy pojedynczych klatek.Spłaszczone obrazy uzyskano poprzez odjęcie szumu aparatu zarówno od profilu RAW, jak i profilu oświetlenia, a następnie znormalizowanie przez profil oświetlenia. Surowe zszywanie wykazywało wyraźne okresowe wzory odpowiadające nieskorygowanym obrazom, podczas gdy to samo pole widzenia zszyte ze spłaszczonych obrazów tworzyło płaskie tło. Do określenia zakresu naprężeń ścinających powodujących toczenie komórek i ścieżki fluorescencji plastyczności, wykorzystano profil narastania przepływu, pod którym można było zobaczyć typowy ślad adhezyjny pojedynczej komórki.Pokazano nieoptymalne i optymalne wyniki ścieżek fluorescencyjnych o niewystarczającym kontraście, nadmiernej gęstości ścieżek, optymalnej gęstości i kontraście ścieżek oraz obrazowaniu ograniczonym dyfrakcją i DNA-PAINT. Czas inkubacji powyżej 60 minut zapewnia funkcjonalizację powierzchni, a prawidłowa konstrukcja komory zapobiega przedostawaniu się pęcherzyków, które uszkadzają funkcjonalizowaną powierzchnię. Procedura ta ma zastosowanie do ilościowej analizy siły molekularnej zaangażowanej w adhezję toczenia i pozwala naukowcom zrozumieć zachowanie toczenia różnych typów komórek.Technika ta pozwala naukowcom badać nowe pytania dotyczące szybkich zdarzeń adhezji, co prowadzi do dalszego postępu w badaniach nad pojedynczymi cząsteczkami i mechanobibiologią.

imaging-molecular-adhesion-in-cell-rolling-by-adhesion-footprint-assay

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisujemy protokół obserwacji i analizy trajektorii toczenia się komórek na podłożach z asymetrycznym wzorem receptorów. Uzyskane dane są przydatne przy projektowaniu podłoży z wzorem receptorów do bezznakowej separacji i analizy komórek.

Badanie trajektorii toczenia się komórek na asymetrycznych wzorach receptorów

Opisano test częstotliwości adhezji służący do pomiaru kinetyki oddziaływań receptor-ligand w sytuacjach, gdy obie cząsteczki są zakotwiczone na powierzchniach oddziałujących komórek. Ten oparty na mechanice test został zilustrowany z wykorzystaniem ludzkiego erytrocyta poddanego ciśnieniu za pomocą mikropipety jako sensora adhezji oraz integryny αLβ2 i cząsteczki adhezyjnej międzykomórkowej 1 jako oddziałujących receptorów i ligandów.

Analiza częstotliwości adhezji w celu badania kinetyki in situ międzykomórkowych oddziaływań molekularnych w obrębie złączy komórkowych

Opisano metodę montażu adhezyjnych i rozpuszczalnych gradientów w komorze mikroskopowej do badań migracji żywych komórek. Zaprojektowane środowisko łączy powierzchnie przeciwporostowe i ścieżki adhezyjne z gradientami roztworu, a tym samym pozwala określić względne znaczenie wskazówek naprowadzających.

Tworzenie adhezyjnych i rozpuszczalnych gradientów do obrazowania migracji komórek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

To badanie wykorzystało wielodołkowy system mikroprzepływowy, znacznie zwiększając przepustowość badań toczenia komórek pod fizjologicznie istotnym przepływem ścinającym. Biorąc pod uwagę znaczenie zwijania komórek w wieloetapowej kaskadzie naprowadzania komórek oraz znaczenie naprowadzania komórek po ogólnoustrojowym dostarczeniu egzogennych populacji komórek u pacjentów, system ten oferuje potencjał jako platforma przesiewowa w celu ulepszenia terapii opartej na komórkach.

Systematyczna analiza walcowania komórek in vitro przy użyciu systemu mikroprzepływowego z wielodołkową płytką

Statyczny test adhezji to potężne narzędzie, które może być użyte do modelowania interakcji między limfocytami T a innymi typami komórek. Interakcje są generowane przez wstrzykiwanie znakowanych limfocytów T do studzienek pokrytych cząsteczkami adhezyjnymi, podczas gdy czytnik płytek służy do ilościowego określania liczby przylegających komórek po seryjnym płukaniu.

Statyczny test adhezyjny do badania aktywacji integryny w limfocytach T

Mechaniczna sztywność w mikrośrodowisku guza odgrywa kluczową rolę w napędzaniu złośliwych zachowań poprzez zwiększanie aktywności inwadopodii i kurczliwości aktomiozyny. Za pomocą żeli poliakrylamidowych (PAA), testy inwadopodiów i siły trakcyjnej można wykorzystać do badania właściwości inwazyjnych i kurczliwych komórek rakowych w odpowiedzi na sztywność matrycy.

Żele poliakryloamidowe do oznaczania inwadopodiów i siły trakcyjnej na komórkach nowotworowych

Ten test adhezji przepływu dostarcza prostego, bardzo efektownego modelu interakcji limfocytów T z komórkami nabłonkowymi. Pompa strzykawkowa służy do generowania naprężeń ścinających, a mikroskopia konfokalna rejestruje obrazy w celu określenia ilościowego. Celem tych badań jest skuteczne ilościowe określenie adhezji limfocytów T przy użyciu warunków przepływu.

Test adhezji pod wpływem naprężenia ścinającego do badania oddziaływań cząsteczki adhezyjnej limfocytów T

Zrosty powierzchniowe komórek są kluczowe w mechanotransdukcji, ponieważ przenoszą napięcie mechaniczne i inicjują szlaki sygnałowe zaangażowane w homeostazę i rozwój tkanek. W tym miejscu przedstawiamy protokół preparowania szlaków biochemicznych, które są aktywowane w odpowiedzi na napięcie, przy użyciu mikrokulek magnetycznych pokrytych ligandem i przyłożenia siły do receptorów adhezyjnych.

Analiza remodelingu adhezji powierzchni komórek w odpowiedzi na naprężenia mechaniczne za pomocą kulek magnetycznych

Dynamiczne przyleganie komórek odpornościowych do ściany naczynia jest warunkiem wstępnym dla naprowadzania jelit. W tym miejscu przedstawiamy protokół funkcjonalnego testu in vitro do analizy wpływu przeciwciał antyintegrynowych, chemokin lub innych czynników na dynamiczną adhezję komórek ludzkich za pomocą naczyń włosowatych pokrytych adresiną.

Dynamiczny test adhezyjny do analizy funkcjonalnej terapii przeciwadhezyjnych w nieswoistych zapaleniach jelit

Zaprezentowany zostanie zaawansowany mikroskop, który pozwala na szybkie i wysokorozdzielcze obrazowanie zarówno izolowanej błony plazmatycznej, jak i otaczającej jej objętości wewnątrzkomórkowej. Integracja mikroskopii fluorescencyjnej z wirującym dyskiem i całkowitym odbiciem wewnętrznym w jednym zestawieniu umożliwia eksperymenty obrazowania na żywo z dużą szybkością akwizycji do 3,5 s na stos obrazów.

Wizualizacja powstawania adhezji w komórkach za pomocą zaawansowanej mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym odbiciem wewnętrznym

Artykuł opisuje ilościowe określenie 1) wielkości i liczby zrostów ogniskowych oraz 2) wskaźnika kształtu komórki i jego rozkładu na podstawie obrazów konfokalnych zlewających się monowarstw komórek MCF7.

Kwantyfikacja obszaru adhezji komórka-substrat i rozkładu kształtu komórki w monowarstwach komórek MCF7

Poznaj test śladu adhezyjnego do badania zdarzeń adhezji podczas szybkiego walcowania komórek. Ta metoda umożliwia ilościowe określenie sił molekularnych przy użyciu mikroskopii TIRF.

Obrazowanie adhezji molekularnej w walcowaniu komórek za pomocą testu śladu adhezyjnego

Przeglądaj więcej filmów