Obrazowanie adhezji molekularnej w walcowaniu komórek za pomocą testu śladu adhezyjnego

Ten protokół przedstawia eksperymentalne procedury przeprowadzania testu śladu adhezyjnego w celu zobrazowania zdarzeń adhezji podczas szybkiej adhezji toczenia komórek.

Protokół ten pomaga ustalić związek między siłą molekularną a zachowaniem toczenia komórek, a także umożliwia przestrzenne mapowanie i ilościowe określanie adhezji walcowej na poziomie molekularnym. Technika ta pozwala na badanie indywidualnych zdarzeń adhezji podczas rzeczywistego toczenia komórek, co pozwala nam na bezpośredni pomiar fizjologicznie odpowiedniej siły adhezji molekularnej. Przygotowanie powierzchni przy użyciu odpowiedniego stężenia i czasu inkubacji na każdym etapie ma kluczowe znaczenie dla osiągnięcia wysokiej jakości funkcjonalizacji powierzchni.

Kluczowa jest również jakość biokoniugacji i odpowiednie warunki. Demonstracja wizualna ma kluczowe znaczenie, aby pomóc naukowcom odtworzyć ten protokół. W szczególności etapy, takie jak montaż komory przepływowej i przetwarzanie końcowe obrazów, będą bardzo korzystne dzięki wizualnej demonstracji.

Zacznij od cienkiego rozprowadzenia niewielkiej ilości żywicy epoksydowej po obu stronach taśmy dwustronnej za pomocą żyletki. Za pomocą lasera przetnij taśmę pokrytą żywicą epoksydową, aby utworzyć cztery kanały. Utwórz chip przepływowy, umieszczając taśmę epoksydową między czterootworową prowadnicą a szkiełkiem nakrywkowym PEG.

Za pomocą końcówki pipety delikatnie dociśnij wzdłuż kanałów, aby uzyskać dobre uszczelnienie, a następnie utwardź żywicę epoksydową przez co najmniej godzinę. Wyrównaj chip tak, aby otwór każdego kanału znajdował się w środku adaptera. Następnie umieść dwie przezroczyste akrylowe przekładki na wierzchu chipa.

Mocno dociśnij środek bloku i przykręć końce każdej przekładki. Wkręć wloty w gwintowane otwory po drugiej stronie wspornika i monitoruj stan uszczelnienia przez przezroczysty blok akrylowy. Wlej 200 mikrolitrów buforu do płukania do komory, aby sprawdzić, czy nie ma wycieków.

Jeśli w kanale utworzą się bąbelki, agresywnie wepchnij dodatkowe 200 mikrolitrów buforu do mycia, aby usunąć pęcherzyki. Dodaj 40 mikrolitrów BSA do komory przepływowej, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu i inkubować przez 10 minut w komorze wilgotnościowej. Po inkubacji dodać 40 mikrolitrów w Tween 20 do komory przepływowej i ponownie inkubować przez 10 minut, aby jeszcze bardziej zmniejszyć niespecyficzne wiązanie.

Następnie umyj kanał 200 mikrolitrami buforu do mycia, aby usunąć wszystkie środki pasywacyjne. W celu funkcjonalizacji powierzchni komory dodać 40 mikrolitrów streptawidyny do komory przepływowej i inkubować przez 20 minut, a następnie umyć komorę 200 mikrolitrami buforu do mycia. Teraz dodaj 40 mikrolitrów hybrydyzowanego białka G-TGT do komory przepływowej i inkubuj przez 20 minut.

Po umyciu buforem do płukania dodać 40 mikrolitrów górnej nici białka G-TGT i inkubować przez 20 minut, aby uzupełnić wszelkie niehybrydyzowane dolne pasmo TGT na powierzchni, a następnie przemyć buforem do mycia. Na koniec dodać 40 mikrolitrów P-selectin-Fc do komory przepływowej i inkubować przez 60 minut przed przemyciem buforem do mycia. Napełnij szklaną strzykawkę o pojemności pięciu mililitrów buforem do toczenia i postukaj w boki strzykawki, aby usunąć i wypchnąć pęcherzyki, gdy unoszą się w kierunku końcówki.

Po wprowadzeniu sterylnej igły do 200-milimetrowego kawałka rurki polietylenowej, podłącz igłę do szklanej strzykawki. Zamocować strzykawkę na pompie strzykawkowej i przechylić pompkę strzykawkową tak, aby strona tłoka była podniesiona, aby zapobiec przedostawaniu się pęcherzyków powietrza do kanału. Włóż koniec rurki do wlotu komory przepływowej.

Włóż jeden koniec innego 200-milimetrowego kawałka rurki polietylenowej do wylotu i zanurz drugi koniec w zlewce na odpady. Weź od jednego do dwóch mililitrów próbki zawiesiny komórek i odwiruj, aby osadzać komórki. Usunąć pożywkę i delikatnie zawiesić komórki w 500 mikrolitrach buforu do toczenia.

Ostrożnie odłączyć rurkę od wlotów i wylotu i odpipetować 40 mikrolitrów zawiesiny ogniw do komory przepływowej. Podłącz ponownie rurkę zgodnie z wcześniejszym opisem, upewniając się, że pęcherzyki nie zostały wprowadzone do kanału przepływowego. Rozpocznij eksperyment z toczeniem komórek, uruchamiając pompę strzykawkową przy żądanych natężeniach przepływu.

Obserwuj toczenie się komórek za pomocą mikroskopu ciemnego pola z obiektywem 10X. Po zakończeniu eksperymentu usuń komórki z kanału, podając bufor rolkowy w ilości 100 mililitrów na godzinę, aż powierzchnia będzie wolna od komórek. W celu zobrazowania lokalnych ścieżek za pomocą DNA-PAINT, dodaj do kanału 40 mikrolitrów nici imagera DNA-PAINT przygotowanej w buforze DNA-PAINT.

Wykonać mikroskopię fluorescencyjną całkowitego wewnętrznego odbicia, stosując warunki wymienione w manuskrypcie tekstowym. Lokalizuj i renderuj obrazy w super rozdzielczości. W celu zobrazowania długich ścieżek przez trwałe etykietowanie, dodaj stałą nić imagera i inkubuj przez 120 sekund w buforze T50M5.

Następnie umyj kanał, wlewając 200 mikrolitrów buforu do mycia. Nagraj obraz z wyłączonym laserem wzbudzającym, aby uzyskać szum kamery w tle. Zobrazuj duży obszar we wzorze siatki za pomocą mikroskopii TIRF.

Zaprogramuj mikroskop tak, aby skanował obszar 400 na 50 obrazów i podziel surowe dane na indywidualne pliki TIP, z których każdy zawiera maksymalnie 10 000 obrazów za pomocą programu ImageJ. Spłaszcz wszystkie obrazy za pomocą profilu oświetlenia i użyj wtyczki MIST, aby zszyć obrazy. Wynik charakterystyki biokoniugacji białka G ssDNA wykazał prawie jeden stosunek białka G do ssDNA, w którym białko G Maleimid ssDNA i bufor elucji imidazolu widma od podstawy ortogonalnej do dopasowania do spektrum produktów biokoniugacji.

Natywny PAGE został wykorzystany do potwierdzenia biokoniugacji pokazującej jasnozielone prążki pokrywające się z pasmem monomerycznego białka G, co wskazuje na udaną koniugację i dobrą wydajność. Profil oświetlenia TIRF wprowadzony ze światłowodu jednomodowego jest na ogół jaśniejszy w środku pola widzenia i ciemniejszy na krawędziach. Aby skompensować nierównomierne oświetlenie i spłaszczyć obrazy do analizy ilościowej, profil oświetlenia został określony poprzez uśrednienie tysięcy pojedynczych klatek.

Spłaszczone obrazy uzyskano poprzez odjęcie szumu aparatu zarówno od profilu RAW, jak i profilu oświetlenia, a następnie znormalizowanie przez profil oświetlenia. Surowe zszywanie wykazywało wyraźne okresowe wzory odpowiadające nieskorygowanym obrazom, podczas gdy to samo pole widzenia zszyte ze spłaszczonych obrazów tworzyło płaskie tło. Do określenia zakresu naprężeń ścinających powodujących toczenie komórek i ścieżki fluorescencji plastyczności, wykorzystano profil narastania przepływu, pod którym można było zobaczyć typowy ślad adhezyjny pojedynczej komórki.

Pokazano nieoptymalne i optymalne wyniki ścieżek fluorescencyjnych o niewystarczającym kontraście, nadmiernej gęstości ścieżek, optymalnej gęstości i kontraście ścieżek oraz obrazowaniu ograniczonym dyfrakcją i DNA-PAINT. Czas inkubacji powyżej 60 minut zapewnia funkcjonalizację powierzchni, a prawidłowa konstrukcja komory zapobiega przedostawaniu się pęcherzyków, które uszkadzają funkcjonalizowaną powierzchnię. Procedura ta ma zastosowanie do ilościowej analizy siły molekularnej zaangażowanej w adhezję toczenia i pozwala naukowcom zrozumieć zachowanie toczenia różnych typów komórek.

Technika ta pozwala naukowcom badać nowe pytania dotyczące szybkich zdarzeń adhezji, co prowadzi do dalszego postępu w badaniach nad pojedynczymi cząsteczkami i mechanobibiologią.