Name: Wykrywanie wirusa i białek ślinowych wektora skoczka liściowego w żywicielu rośliny (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Poznaj metodę wykrywania białek ślinowych skoczków liściowych i wirusów roślinnych w żywicielu rośliny. Technika SDS-PAGE i Western blot pozwala badać interakcje owad-roślina oraz mechanizmy transmisji wirusowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty z Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych Chin (31772124 i 31972239) oraz Uniwersytetu Rolnictwa i Leśnictwa Fujian (Grant KSYLX014).

Dorosłe skoczki nie będące wirusami wirusowymi były rozmnażane w Centrum Badań nad Wirusami Przenoszonymi przez Wektory na Uniwersytecie Rolnictwa i Leśnictwa Fujian w Chinach.
1. Hodowla owadów niewirusowatych
<ol>
	<li>Wychowuj dorosłe osobniki na sadzonkach ryżu w sześciennej klatce o wymiarach 40 cm x 35 cm x 20 cm (długość x szerokość x wysokość). Utrzymuj jedną stronę klatki przykrytą siatką chroniącą przed owadami w celu wentylacji.
	<ol>
		<li>Klatki ze skoczkami należy przechowywać w inkubatorze z wbudowanym regulatorem wilgotności w temperaturze 26 °C i wilgotności względnej 60–75% w okresie fotoperiodu 16 godzin światła i 8 godzin ciemności.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj aspiratora, aby delikatnie przenieść wszystkie dorosłe osoby z klatki do nowej klatki, która co tydzień zawiera świeże sadzonki ryżu.
	<ol>
		<li>Niech ponad 200 dorosłych łączy się w pary i składa jaja w ryżu.</li>
		<li>Zachowaj stare sadzonki ryżu, aby mogły się wyłonić nimfy. Wyhoduj te nowe nimfy niewiruliferalne do stadium 2-instar.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Pozyskiwanie wirusów i zbieranie wirusowych owadów
<ol>
	<li>Ostrożnie przenieś 2-instar niewirusodajne nimfy do szklanej probówki hodowlanej (2,5 cm średnicy i 15 cm wysokości) na 1-2 godziny w celu zagłodzenia za pomocą aspiratora.
	<ol>
		<li>Wypuść nimfy do klatki, w której znajduje się zakażona RDV roślina ryżu uprawiana w doniczce.</li>
		<li>Pozwól nimfom żerować na zainfekowanej roślinie ryżu przez 2 dni. 
		UWAGA: Ostrożnie podlej roślinę ryżu i unikaj zmywania nimf. Nimfy 2-instar mają około 1,6-2 mm długości.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ostrożnie przenieś te nimfy do nowej klatki, która zawiera świeże, wolne od wirusów sadzonki ryżu o wilgotności względnej 60-75% w fotoperiodzie 16 godzin światła i 8 godzin ciemności. Pozwól nimfom żerować na zakażonej roślinie ryżu przez 12 dni, aby zakończyć okres transmisji RDV w krążeniu.</li>
</ol>
3. Pobieranie białek śliny za pomocą klatki do karmienia
<ol>
	<li>Przygotuj pięć małych rurowych klatek do karmienia (2,5 cm średnicy i 4 cm wysokości), w których jeden koniec jest pokryty siatką chroniącą przed owadami.</li>
	<li>Umieść 15-20 skoczków w każdej klatce do karmienia, a następnie przykryj drugi koniec klatki cienką matą piankową.
	<ol>
		<li>Przymocuj jedną sadzonkę ryżu (o wysokości 5-6 cm) między końcem klatki a matą piankową za pomocą taśm. Upewnij się, że skoczki w klatce do karmienia mogą żywić się sadzonkami ryżu wystawionymi na działanie wnętrza klatki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zanurz korzenie sadzonek w wodzie, aby roślina ryżu pozostała żywa. Pozwól skoczkom żerować na nich przez 2 dni.</li>
	<li>Wyjmij skoczki z klatek do karmienia i zbierz sadzonki ryżu, na których żerowały. Wytnij części sadzonek na zewnątrz klatki i odzyskaj obszary żerowania sadzonek. 
	UWAGA: Próbka ta może być przechowywana w temperaturze -80 °C maksymalnie przez 3 miesiące, jeśli nie zostanie natychmiast użyta do wykrywania.</li>
</ol>
4. Przygotowanie odczynnika
<ol>
	<li>Rozpuścić 15,1 g Tris-base, 94 g glicyny i 5 g SDS w 1 l sterylnej wody, aby przygotować 5xTris-glicine buffer. Rozcieńczyć 200 ml buforu 5xTris-glicyna w 800 ml sterylnej wody, aby przygotować 1xbufor Tris-glicyny (patrz Tabela 1 dla składu buforu).</li>
	<li>Rozpuścić 80 g NaCl, 30 g Tris-base i 2 g KCl w 1 l sterylnej wody, aby przygotować 10 soli fizjologicznej (TBS). Roztwór należy sterylizować w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 15 minut.</li>
	<li>Rozpuścić 8 g SDS, 4 ml ß-merkaptoetanolu, 0,02 g błękitu bromofenolowego i 40 ml glicerolu w 40 ml 0,1 M Tris-HCl (pH 6,8), aby przygotować 4x bufor próbki białka.</li>
	<li>Zmieszać 800 ml buforu tris-glicynowego z 200 ml metanolu, aby przygotować bufor transferowy.</li>
	<li>Dodać 100 ml roztworu 10xTBS i 3 ml Tween 20 do 900 ml sterylnej wody, aby przygotować bufor TBS z roztworem Tween 20 (TBST).</li>
</ol>
5. Western blot do wykrywania śliny i białek wirusowych
<ol>
	<li>Zmielić 0,1 g próbek ryżu ciekłym azotem, aż tkanka stanie się proszkiem. Dodać 200 μl 4x buforu do próbki białka i gotować przez 10 minut. Odwirować próbki o masie 12 000 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
	<ol>
		<li>Usunąć supernatant i umieścić go w nowej fiolce. Załadować 10 μl próbki do żelu SDS-PAGE i uruchomić ją w buforze tris-glicyny pod napięciem 150 V przez 45-60 min. 
		UWAGA: Pozostałość po odwirowaniu można wyrzucić.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść membranę nitrocelulozową 0,45 μm i inne materiały warstwowe w buforze transferowym na 30 min. 
	UWAGA: Ten krok można wykonać przed zakończeniem biegu żelu.</li>
	<li>Ułóż żel warstwowo i przenieś go przez 90-120 minut pod napięciem 100 V do bufora transferowego.</li>
	<li>Pobrać membranę i umieścić ją w 7% beztłuszczowym roztworze blokującym mleko w proszku w roztworze TBST na 20 minut. Dodać specyficzne przeciwciało przeciwko RDV P8 lub Vg do 7% roztworu odtłuszczonego mleka w proszku w TBST. Inkubować z przeciwciałem do barwienia błony przez 2 godziny lub przez noc.</li>
	<li>Przemyć membranę roztworem TBST trzy razy, za każdym razem po 5 minutach mycia.</li>
	<li>Dodać kozie przeciwciało anty-królicze IgG jako przeciwciało drugorzędowe do 7% beztłuszczowego mleka w proszku z TBST. Inkubować z przeciwciałem przez 60-90 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przemyć membranę roztworem TBST trzy razy przez 5 minut za każdym razem.</li>
	<li>Do metody chemiluminescencyjnej należy użyć zestawu ECL Western. Wymieszaj odczynniki do wykrywania 1 i 2 w zestawie w stosunku 1:1 w probówce. Umieść zmieszany odczynnik na membranie i inkubuj blot przez 5 minut.</li>
	<li>Odcedź nadmiar odczynnika i wykonaj zdjęcie kolorymetryczne obrazu chemiluminescencyjnego. Połącz je, aby zobaczyć drabinę z pasmami białkowymi.</li>
</ol>

<ol><li>Hogenhout, S. A., Ammar el, D., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+vector+interactions+with+persistently+transmitted+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Insect vector interactions with persistently transmitted viruses.</a> Annual Review of Phytopathology. 46, 327-359 (2008).</li>
<li>Cranston, P. S., Gullan, P. J. Phylogeny of insects. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCranston%2C+PS+%22Encyclopedia+of+Insects%22">Encyclopedia of Insects</a>. Resh, V. H., Carde, R. T. , Academic. Amsterdam. (2003).</li>
<li>Ammar el, D., Tsai, C. W., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G., Hogenhout, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+aspects+of+rhabdovirus+interactions+with+insect+and+plant+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Entomology%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular aspects of rhabdovirus interactions with insect and plant hosts.</a> Annual Review of Entomology. 54, 447-468 (2009).</li>
<li>Wei, T., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rice+reoviruses+in+insect+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Rice reoviruses in insect vectors.</a> Annual Review of Phytopathology. 54, 99-120 (2016).</li>
<li>Hattori, M., Konishi, H., Tamura, Y., Konno, K., Sogawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laccase-type+phenoloxidase+in+salivary+glands+and+watery+saliva+of+the+green+rice+leafhopper%2C+Nephotettix+cincticeps%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Laccase-type phenoloxidase in salivary glands and watery saliva of the green rice leafhopper, Nephotettix cincticeps.</a> Journal of Insect Physiology. 51 (12), 1359-1365 (2005).</li>
<li>Ma, R., Reese, J. C., William, I. V., Bramel-Cox, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+pectinesterase+and+polygalacturonase+from+salivary+secretions+of+living+greenbugs%2C+schizaphis+graminum+%28Homoptera%3A+aphididae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Detection of pectinesterase and polygalacturonase from salivary secretions of living greenbugs, schizaphis graminum (Homoptera: aphididae).</a> Journal of Insect Physiology. 36 (7), 507-512 (1990).</li>
<li>Miles, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+aspects+of+the+chemical+relation+between+the+rose+aphid+and+rose+buds%5BTitle%5D)+AND+%22Entomologia+Experimentalis+et+Applicata%22%5BJournal%5D)">Dynamic aspects of the chemical relation between the rose aphid and rose buds.</a> Entomologia Experimentalis et Applicata. 37 (2), 129-135 (2011).</li>
<li>Urbanska, A., Tjallingii, W. F., Dixon, A., Leszczynski, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenol+oxidising+enzymes+in+the+grain+aphid%27s+saliva%5BTitle%5D)+AND+%22Entomologia+Experimentalis+et+Applicata%22%5BJournal%5D)">Phenol oxidising enzymes in the grain aphid's saliva.</a> Entomologia Experimentalis et Applicata. 86 (2), 197-203 (1998).</li>
<li>Miles, P. W., Peng, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+salivary+physiology+of+plant+bugs%3A+detoxification+of+phytochemicals+by+the+salivary+peroxidase+of+aphids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Studies on the salivary physiology of plant bugs: detoxification of phytochemicals by the salivary peroxidase of aphids.</a> Journal of Insect Physiology. 35 (11), 865-872 (1989).</li>
<li>Will, T., van Bel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+and+chemical+interactions+between+aphids+and+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Physical and chemical interactions between aphids and plants.</a> Journal of Experimental Botany. 57 (4), 729-737 (2006).</li>
<li>Ma, R. Z., Reese, J. C., Black, W. C., Bramel-Cox, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlorophyll+loss+in+a+greenbug-susceptible+sorghum+due+to+pectinases+and+pectin+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Kansas+Entomological+Society%22%5BJournal%5D)">Chlorophyll loss in a greenbug-susceptible sorghum due to pectinases and pectin fragments.</a> Journal of the Kansas Entomological Society. 71 (1), 51-60 (1998).</li>
<li>Madhusudhan, V. V., Miles, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mobility+of+salivary+components+as+a+possible+reason+for+differences+in+the+responses+of+alfalfa+to+the+spotted+alfalfa+aphid+and+pea+aphid%5BTitle%5D)+AND+%22Entomologia+Experimentalis+et+Applicata%22%5BJournal%5D)">Mobility of salivary components as a possible reason for differences in the responses of alfalfa to the spotted alfalfa aphid and pea aphid.</a> Entomologia Experimentalis et Applicata. 86 (1), 25-39 (1998).</li>
<li>Funk, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alkaline+phosphatase+activity+in+whitefly+salivary+glands+and+saliva%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Insect+Biochemistry+%26+Physiology%22%5BJournal%5D)">Alkaline phosphatase activity in whitefly salivary glands and saliva.</a> Archives of Insect Biochemistry & Physiology. 46 (4), 165-174 (2010).</li>
<li>Hogenhout, S. A., Bos, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effector+proteins+that+modulate+plant-insect+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Effector proteins that modulate plant-insect interactions.</a> Current Opinion in Plant Biology. 14 (4), 422-428 (2011).</li>
<li>Tomkins, M., Kliot, A., Maree, A. F., Hogenhout, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multi-layered+mechanistic+modelling+approach+to+understand+how+effector+genes+extend+beyond+phytoplasma+to+modulate+plant+hosts%2C+insect+vectors+and+the+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">A multi-layered mechanistic modelling approach to understand how effector genes extend beyond phytoplasma to modulate plant hosts, insect vectors and the environment.</a> Current Opinion in Plant Biology. 44, 39-48 (2018).</li>
<li>Huang, H. J., Lu, J. B., Li, Q., Bao, Y. Y., Zhang, C. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+transcriptomic%2Fproteomic+analysis+of+salivary+gland+and+secreted+saliva+in+three+planthopper+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Combined transcriptomic/proteomic analysis of salivary gland and secreted saliva in three planthopper species.</a> Journal of Proteomics. , (2018).</li>
<li>Hogenhout, S. A., Bos, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effector+proteins+that+modulate+plant--insect+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Effector proteins that modulate plant--insect interactions.</a> Current Opinion in Plant Biology. 14 (4), 422-428 (2011).</li>
<li>Sun, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mosquito+salivary+protein+promotes+flavivirus+transmission+by+activation+of+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A mosquito salivary protein promotes flavivirus transmission by activation of autophagy.</a> Nature Communications. 11 (1), 260(2020).</li>
<li>Sri-In, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+salivary+protein+of+Aedes+aegypti+promotes+dengue-2+virus+replication+and+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A salivary protein of Aedes aegypti promotes dengue-2 virus replication and transmission.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 111, 103181(2019).</li>
<li>Conway, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aedes+aegypti+D7+saliva+protein+inhibits+dengue+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Aedes aegypti D7 saliva protein inhibits dengue virus infection.</a> Plos Neglected Tropical Diseases. 10 (9), 0004941(2016).</li>
<li>Wang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+whitefly+effector+Bsp9+targets+host+immunity+regulator+WRKY33+to+promote+performance%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+of+London.+Series+B%2C+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">A whitefly effector Bsp9 targets host immunity regulator WRKY33 to promote performance.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 374 (1767), 20180313(2019).</li>
<li>Omura, T., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+outer+capsid+proteins+in+transmission+of+phytoreovirus+by+insect+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Virus+Research%22%5BJournal%5D)">Role of outer capsid proteins in transmission of phytoreovirus by insect vectors.</a> Advances in Virus Research. 54, 15-43 (1999).</li>
<li>Chen, Q., Liu, Y., Long, Z., Yang, H., Wei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+release+threshold+in+the+salivary+gland+of+leafhopper+vector+mediates+the+intermittent+transmission+of+rice+dwarf+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Viral release threshold in the salivary gland of leafhopper vector mediates the intermittent transmission of rice dwarf virus.</a> Frontiers in Microbiology. 12, 639445(2021).</li>
<li>Fukushi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Further+studies+on+the+dwarf+disease+of+rice+plant%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Faculty+of+Agriculture%2C+Hokkaido+Imperial+University%22%5BJournal%5D)">Further studies on the dwarf disease of rice plant.</a> Journal of the Faculty of Agriculture, Hokkaido Imperial University. 45 (3), 83-154 (1940).</li>
<li>Miyazaki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+organization+of+the+internal+components+of+rice+dwarf+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The functional organization of the internal components of rice dwarf virus.</a> Journal of Biochemistry. 147, 843-850 (2010).</li>
<li>Wei, T., Shimizu, T., Hagiwara, K., Kikuchi, A., Omura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pns12+protein+of+rice+dwarf+virus+is+essential+for+formation+of+viroplasms+and+nucleation+of+viral-assembly+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Pns12 protein of rice dwarf virus is essential for formation of viroplasms and nucleation of viral-assembly complexes.</a> Journal of General Virology. 87, 429-438 (2006).</li>
<li>Chen, Q., Zhang, L., Chen, H., Xie, L., Wei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonstructural+protein+Pns4+of+rice+dwarf+virus+is+essential+for+viral+infection+in+its+insect+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Virology+Journal%22%5BJournal%5D)">Nonstructural protein Pns4 of rice dwarf virus is essential for viral infection in its insect vector.</a> Virology Journal. 12, 211(2015).</li>
<li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonstructural+protein+Pns12+of+rice+dwarf+virus+is+a+principal+regulator+for+viral+replication+and+infection+in+its+insect+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Research%22%5BJournal%5D)">Nonstructural protein Pns12 of rice dwarf virus is a principal regulator for viral replication and infection in its insect vector.</a> Virus Research. 210, 54-61 (2015).</li>
<li>Chen, Q., Zhang, L., Zhang, Y., Mao, Q., Wei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tubules+of+plant+reoviruses+exploit+tropomodulin+to+regulate+actin-based+tubule+motility+in+insect+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Tubules of plant reoviruses exploit tropomodulin to regulate actin-based tubule motility in insect vector.</a> Scientific Reports. 7, 38563(2017).</li>
<li>Wei, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spread+of+Rice+dwarf+virus+among+cells+of+its+insect+vector+exploits+virus-induced+tubular+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">The spread of Rice dwarf virus among cells of its insect vector exploits virus-induced tubular structures.</a> Journal of Virology. 80 (17), 8593-8602 (2006).</li>
<li>Mao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insect+bacterial+symbiont-mediated+vitellogenin+uptake+into+oocytes+to+support+egg+development%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Insect bacterial symbiont-mediated vitellogenin uptake into oocytes to support egg development.</a> mBio. 11 (6), 01142(2020).</li>
<li>Tufail, M., Takeda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characteristics+of+insect+vitellogenins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Molecular characteristics of insect vitellogenins.</a> Journal of Insect Physiology. 54 (12), 1447-1458 (2008).</li>
<li>Sappington, T. W., Raikhel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characteristics+of+insect+vitellogenins+and+vitellogenin+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular characteristics of insect vitellogenins and vitellogenin receptors.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 28 (5-6), 277-300 (1998).</li>
<li>Ji, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitellogenin+from+planthopper+oral+secretion+acts+as+a+novel+effector+to+impair+plant+defenses%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Vitellogenin from planthopper oral secretion acts as a novel effector to impair plant defenses.</a> New Phytologist. , (2021).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Ślina bezpośrednio wydzielana przez gruczoły ślinowe owadów ssących kłucie odgrywa kluczową rolę, ponieważ wstępnie trawi i detoksykuje tkanki gospodarza i czynniki biologiczne wektorów między królestwami do gospodarzy 1,3,4. Czynniki biologiczne między królestwami, w tym elicytory, efektory i małe RNA, mają kluczowe znaczenie dla komunikacji między owadamia gospodarzami 14,15,16.<sup class="xr...

Sposób transmisji wektor-gospodarz arbowirusów, fundamentalny problem, jest na granicy nauk biologicznych. Wiele wirusów roślinnych o znaczeniu rolniczym jest przenoszonych horyzontalnie przez wektory owadów1. Ponad połowa wirusów roślinnych jest przenoszona przez owady pluskwiaka, w tym mszyce, mączliki, skoczki, skoczki i wciornastki. Owady te mają wyraźne cechy, które umożliwiają im skuteczne przenoszenie wirusów roślinnych1. Posiadają przeszywająco-wysysające aparaty gębowe i żywią się sokiem z łyka i ksylemu oraz wydzielają ślinę1,2,3,4. Wraz z rozwojem i ulepszaniem technik, identyfikacja i analiza funkcjonalna składników śliny stają się nowym celem intensywnych badań. Znane białka śliny w ślinie obejmują liczne enzymy, takie jak pektinesterazy, celulaza, peroksydaza, fosfataza alkaliczna, oksydaza polifenolowa i sacharaza, między innymi5,6,7,8,9,10,11,12, 13. Białka w ślinie zawierają również elicytory, które wyzwalają odpowiedź obronną gospodarza, zmieniając w ten sposób działanie owadów, oraz efektory, które tłumią obronę gospodarza, co zwiększa przydatność owadów i składniki wywołujące patologiczne reakcje gospodarza14,15,16,17. Dlatego białka śliny są niezbędnymi materiałami do komunikacji między owadami a gospodarzami. Podczas przenoszenia wirusów ślina wydzielana przez gruczoły ślinowe owadów wirusowatych przekłuwająco-ssących również zawiera białka wirusowe. Składniki wirusowe wykorzystują przepływ śliny do uwalniania ich z owada do gospodarza rośliny. Dlatego ślina owada łączy tritroficzną interakcję wirus-wektor-gospodarz. Badanie biologicznej funkcji białek śliny wydzielanych przez owady wiruliożerne pomaga zrozumieć relację wirus-wektor-gospodarz.
Dla wirusów zwierzęcych podaje się, że ślina komarów pośredniczy w przenoszeniu i chorobotwórczości wirusa Zachodniego Nilu (WNV) i wirusa dengi (DENV). Białko śliny AaSG34 wspomaga replikację i transmisję wirusa dengi-2, podczas gdy białko śliny AaVA-1 wspomaga transmisję wirusa DENV i Zika (ZIKV) poprzez aktywację autofagii18,19. Białko śliny D7 komarów może hamować zakażenie DENV in vitro i in vivo poprzez bezpośrednią interakcję z wirionami DENV i rekombinowanym białkiem otoczki DENV20. W wirusach roślinnych wirus żółtej kędzierzawości liści pomidora (TYLCV) indukuje białko śliny mączlika Bsp9, które hamuje odporność gospodarza roślinnego za pośrednictwem WRKY33, aby zwiększyć preferencję i wydajność mączlików, ostatecznie zwiększając przenoszenie wirusów21. Ponieważ badania nad rolą, jaką białka śliny owadów odgrywają w żywicielach roślinnych, pozostają w tyle za badaniami gospodarzy zwierzęcych, pilnie potrzebny jest stabilny i niezawodny system wykrywania białek śliny w żywicielach roślinnych.
Wirus roślinny znany jako wirus karłowatości ryżowej (RDV) jest przenoszony przez skoczka Nephotettix cincticeps (Hemiptera: Cicadellidae) z wysoką wydajnością i w sposób uporczywie się rozmnażający22,23. Po raz pierwszy doniesiono, że RDV jest przenoszony przez owada wektora i powoduje ciężką chorobę ryżu w Azji24,25. Wirion jest dwudziestościenny i dwuwarstwowy kulisty, a zewnętrzna warstwa zawiera białko P8 zewnętrznego kapsydu22. Okres transmisji RDV w obiegu w N. cincticeps wynosi 14 dni26,27,28,29,30. Kiedy RDV dociera do gruczołów ślinowych, wiriony są uwalniane do jam gruczołów ślinowych przechowywanych w ślinie za pomocą mechanizmu podobnego do egzocytozy23. Witellogenina (Vg) jest prekursorem białka żółtka niezbędnym do rozwoju oocytów u samic owadów31,32,33. Większość gatunków owadów ma co najmniej jeden transkrypt Vg o wielkości 6-7 kb, który koduje białko prekursorowe o wielkości około 220 kDa. Prekursory białkowe Vg mogą być zwykle rozszczepione na duże (140 do 190 kDa) i małe (<50 kDa) fragmenty przed wejściem do jajnika18,19. Wcześniejsza analiza proteomiczna wykazała obecność peptydów pochodzących z Vg w wydzielanej ślinie skoczka Recilia dorsalis, chociaż ich funkcja jest nieznana (dane niepublikowane). Niedawno doniesiono, że Vg, który jest wydzielany doustnie przez skoczki, działa jako efektor uszkadzający obronę roślin34. Nie wiadomo, czy Vg N. cincticeps może być również uwalniany do żywiciela rośliny wraz z przepływem śliny, a następnie może odgrywać rolę w roślinie, zakłócając mechanizmy obronne rośliny. Aby ustalić, czy N. cincticeps wykorzystuje białka śliny, takie jak Vg, do hamowania lub aktywowania mechanizmów obronnych roślin, pierwszym krokiem jest zidentyfikowanie białek uwalnianych do rośliny podczas karmienia. Zrozumienie metody identyfikacji białek śliny obecnych w roślinie jest potencjalnie niezbędne do wyjaśnienia funkcji białek śliny i interakcji między Hemiptera a roślinami.
W przedstawionym tutaj protokole, N. cincticeps jest używany jako przykład, aby dostarczyć metody badania obecności białek śliny w żywicielu roślinnym wprowadzonym przez karmienie owadów. Protokół przede wszystkim szczegółowo opisuje zbieranie i wykrywanie białek śliny i jest pomocny w dalszych badaniach na większości pluskwiaków.

<table><tbody><tr><td><silne>odczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Roche</td><td>D609K69032</td><td>Dla 5 i razy; Bufor tris-glicynowy i 10&razy; TBS preparat buforowy</td></tr><tr><td>glicyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WXBD0677V</td><td>Na 5& razy; Preparat buforowy tris-glicyny</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLCB4394</td><td>Na 5 razy; Preparat buforowy tris-glicyny</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10019318</td><td>Dla 10 i razy; Przygotowanie buforu TBS</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10016318</td><td>Dla 10 i razy; Przygotowanie buforu TBS</td></tr> <tr><td>&szlig;-merkaptoetanol</td><td>Odczynnik Xiya</td><td>B14492</td><td>Do 4 i krotnego przygotowania buforu próbki białka</td></tr><tr><td>błękit bromofenol</td><td></td><td>SHBL3668</td><td>Do 4 i krotnego przygotowania buforu próbki białka</td></tr><tr><td>glicerol</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10010618</td><td>Do 4 i razy; przygotowanie buforu próbki białka</td></tr><tr><td>metanol</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10014118</td><td>Do przygotowania buforu transferowego</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Coolaber NAUKA& TeCHNoLoGY</td><td>CT30111220</td><td>Do przygotowania TBST</td></tr><tr><td>odtłuszczone mleko w proszku</td><td>Becton.Dickinso i spółka</td><td>252038</td><td>Do blokowania błony, rozcieńczanie przeciwciał</td></tr><tr><td>koza anty-królik IgG</td><td>Sangon Biotech</td><td>D110058-0001</td><td>Rozpoznanie pierwotnego itibody</td></tr><tr><td>ECL Western kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>32209</td><td>Podłoże chemiluminescencyjne</td></tr><tr><td>nitroceluloza membrana</td><td>Pall Corporation</td><td>25312915</td><td>Do przenoszenia białek</td></tr><tr><td><silne>i roztwory</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buffer</td><td>Skład</td><td></td><td>Komentarze/Opis</td></tr><tr><td>&nbsp; 5 i razy; Bufor tris-glicynowy</td><td>15,1 g Tris baza 94 g glicyna &nbsp; 5 g SDS w 1 l sterylnej wody</td><td></td><td>&nbsp; Roztwór podstawowy</td></tr><tr><td>1 i razy; Bufor tris-glicynowy</td><td>200 ml 5&razy; Bufor tris-glicynowy 800 ml sterylnej wody</td><td></td><td>Roztwór roboczy, dla SDS-PAGE</td></tr><tr><td>10 i razy; Bufor soli fizjologicznej buforowany trisem (TBS)</td><td>80 g NaCl 30 g Tris zasada 2 g KCl w 1 l sterylnej wody</td><td></td><td>Roztwór podstawowy</td></tr><tr><td>TBS z roztworem Tween 20 (TBST)</td><td>100 ml 10 razy; TBS roztwór 3 ml Tween 20 900 ml sterylnej wody</td><td></td><td>Roztwór roboczy</td></tr><tr><td>4 i razy bufor próbki białka</td><td>8 g SDS 4 ml &szlig;-merkaptoetanolu 0,02 g błękitu bromofenolowego 40 ml glicerolu w 40 ml 0,1 M Tris-HCl (pH 6,8)</td><td></td><td>Do ekstrakcji białek</td></tr><tr><td>Bufor transferowy</td><td>800 ml Bufor tris-glicynowy 200 ml metanolu</td><td></td><td>Do transfer białek</td></tr> <tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Bromophenol blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SHBL3668</td><td>Do przygotowania buforu 4x próbki białka</td></tr><tr><td>Inkubator o stałej temperaturze</td><td>Ningbo Saifu Experimental Instrument Co., Ltd.</td><td>PRX-1200B</td><td>Do hodowli skoczków</td></tr><tr><td>Elektroforeza</td><td>Tanon Science & Technologia Co., Sp. z o.o.</td><td>Tanon EP300</td><td>Dla SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Moduł rdzenia do transferu elektroforetycznego</td><td>BIO-RAD</td><td>1703935</td><td>Dla SDS-PAGE</td></tr><tr><td>glicerol</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10010618</td><td>Do przygotowania buforu 4x próbki białka</td></tr><tr><td>glicyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WXBD0677V</td><td>Do przygotowania buforu Tris-glicyny</td></tr><tr><td>koza anty-królik IgG</td><td>Sangon Biotech</td><td>D110058-0001</td><td>Rozpoznanie pierwotnego i tibody</td></tr><tr><td>Wysokoprzepustowego przyrządu do mielenia tkanek</td><td>Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd.</td><td>JXFSIPRP-24</td><td>Do mielenia tkanek roślinnych</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10016318</td><td>Do 10x TBS przygotowania buforu</td></tr><tr><td>metanolu</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10014118</td><td>Do przygotowania buforu transferowego</td></tr><tr><td>Mini mokra rynna wymiany ciepła</td><td>BIO-RAD</td><td>1703930</td><td>Dla SDS-PAGE</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd</td><td>10019318</td><td>Do przygotowania buforu 10x TBS</td></tr><tr><td>membrana nitrocelulozowa</td><td>Pall Corporation</td><td>25312915</td><td>Do przenoszenia białek</td></tr><tr><td>beztłuszczowe mleko w proszku</td><td>Becton.Dickinso i spółka</td><td>252038</td><td>Do blokowania błony, rozcieńczania przeciwciał</td></tr><tr><td>Pierce ECL Western kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>32209</td><td>Podłoże chemiluminescencyjne</td></tr><tr><td>Przyrząd do barwienia białek</td><td>GE Opieka zdrowotna nauki biologiczne AB</td><td>Amersham lmager 600</td><td>Do wykrywania białek</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLCB4394</td><td>Do 5x preparatu buforu Tris-glicyny</td></tr><tr><td>Baza Tris</td><td>Roche</td><td>D609K69032</td><td>Do 5x Bufor Tris-glicyny i 10&razy; Przygotowanie bufora TBS</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Coolaber NAUKA& TeCHNoLoGY</td><td>CT30111220</td><td>Do przygotowania TBST</td></tr><tr><td>Pionowy zbiornik do elektroforezy płytowej</td><td>BIO-RAD</td><td>1658001</td><td>Do SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Łaźnia wodna</td><td>Shanghai Jinghong Sprzęt eksperymentalny Co., Ltd.</td><td>XMTD-8222</td><td>Do gotowania próbek białek</td></tr> <tr><td>i beta;-merkaptoetanolu</td><td>Odczynnik Xiya</td><td>B14492</td><td>Do przygotowania buforu 4x próbki białka</td></tr></tbody></table>

wykrywanie wirusa i białek ślinowych wektora skoczka liściowego w żywicielu rośliny

Detecting Virus and Salivary Proteins of a Leafhopper Vector in the Plant Host

Wektory owadów przenoszą poziomo wiele wirusów roślinnych o znaczeniu rolniczym. Ponad połowa wirusów roślinnych jest przenoszona przez owady pluskwiakowate, które mają aparat gębowy wysysający kolczyki. Podczas przenoszenia wirusa ślina owadów łączy wirusa-wektora-gospodarza, ponieważ ślina przenosi wirusy, a białka owadów wyzwalają lub tłumią odpowiedź immunologiczną roślin z owadów na gospodarzy roślin. Identyfikacja i analiza funkcjonalna białek śliny stają się nowym obszarem zainteresowania w dziedzinie badań nad interakcjami arbowirus-gospodarz. Protokół ten zapewnia system do wykrywania białek w ślinie skoczków za pomocą żywiciela roślinnego. Przykładem jest wektor skoczka Nephotettix cincticeps zakażony wirusem karłowatości ryżowej (RDV). Witellogenina i główne zewnętrzne białko kapsydowe P8 RDV przenoszone przez ślinę N. cincticeps mogą być wykryte jednocześnie w roślinie ryżu, którą żywi się N. cincticeps. Metoda ta ma zastosowanie do badania białek śliny, które są przejściowo zatrzymywane w żywicielu roślinnym po karmieniu owadów. Uważa się, że ten system wykrywania przyniesie korzyści w badaniu interakcji pluskwiak-wirus-roślina lub hemipteran-roślina.

Rysunek 1 przedstawia wszystkie etapy niniejszego protokołu: hodowlę owadów, pozyskiwanie wirusa, pobieranie białek ślinianek poprzez żerowanie na ryżu oraz analizę western blot. Wyniki western blot wykazały, że w próbkach ryżu, na którym żerowały owady, oraz w gruczołach ślinowych owadów, na membranie inkubowanej z przeciwciałami przeciwko Vg, zaobserwowano specyficzne i oczekiwane prążki o masie około 220 kDa. W przeciwieństwie do tego, w próbce ryżu, na którym nie żerowały owady,...

Ten protokół pokazuje, jak używać gospodarza roślinnego do wykrywania białek ślinowych skoczka i wirusów roślinnych uwalnianych przez wektory skoczków.

Wykrywanie wirusa i białek ślinowych wektora skoczka liściowego w żywicielu rośliny

Insect vectors horizontally transmit many plant viruses of agricultural importance. More than one-half of plant viruses are transmitted by hemipteran ...

Protokół ten zapewnia technikę wykrywania białek śliny skoczków i żywicieli roślinnych w celu dalszego zbadania funkcji tych białek w żywicielach roślinnych. Ta technika jest łatwa do wykonania, a system jest stabilny i powtarzalny. Metoda ta może być również pomocna w wykrywaniu białek śliny innych pluskwiaków i żywicieli roślinnych.Na początek hoduj dorosłe skoczki na sadzonkach ryżu w klatce o wymiarach 40 na 35 na 20 centymetrów. Utrzymuj jedną stronę klatki przykrytą siatką chroniącą przed owadami w celu wentylacji. Umieść klatki ze skoczkami w inkubatorze zawierającym wbudowany regulator wilgotności w temperaturze 26 stopni Celsjusza i wilgotności względnej od 60 do 75% podczas okresu fotograficznego trwającego 16 godzin światła i ośmiu godzin ciemności.Raz w tygodniu za pomocą aspiratora delikatnie przenieś wszystkie dorosłe osoby z klatki do nowej klatki zawierającej świeże sadzonki ryżu. Pozwól ponad 200 dorosłym osobnikom połączyć się w pary i złożyć jaja w ryżu. Zachowaj stare siewki ryżu, aby nimfy mogły się wyłonić i wychowuj te nowe, niezjadliwe nimfy do drugiego stadium rozwojowego.Za pomocą aspiratora ostrożnie przenieś niezjadliwe nimfy w drugim stadium rozwojowym do szklanej probówki hodowlanej na jedną do dwóch godzin w celu zagłodzenia. Następnie wypuść nimfy do klatki zawierającej zakażoną wirusem karłowatości ryżowej roślinę ryżu uprawianą w doniczce i pozwól nimfom żywić się zakażoną rośliną ryżu przez dwa dni. Po dwóch dniach ostrożnie przenieś te nimfy do nowej klatki, która zawiera świeże sadzonki ryżu wolne od wirusa i pozwól nimfom żywić się sadzonkami ryżu wolnymi od wirusa przez 12 dni, aby zakończyć okres transmisji wirusa karłowatego ryżu.Aby zebrać białka śliny, przygotuj pięć małych rurowych klatek do karmienia, pokrytych siatką chroniącą przed owadami na jednym końcu. Po zamknięciu od 15 do 20 skoczków w każdej klatce do karmienia, przykryj drugi koniec klatki cienką matą piankową. Przymocuj jedną sadzonkę ryżu między końcem klatki a matą piankową za pomocą taśm, upewniając się, że skoczki w klatce do karmienia mogą żywić się sadzonkami ryżu wystawionymi na działanie wnętrza klatki.Zanurz korzenie sadzonek w wodzie, aby roślina ryżu pozostała żywa, i pozwól skoczkom żywić się nimi przez dwa dni. Po dwóch dniach wyjmij skoczki z klatek do karmienia i zbierz sadzonki ryżu, którymi żywiły się skoczki. Wytnij sadzonki na zewnątrz klatki i odzyskaj regiony żerowania sadzonek.Przygotuj 1x bufor Tris-Glycine, rozcieńczając 200 mililitrów przygotowanego 5x buforu z 800 mililitrami sterylnej wody. Następnie przygotuj 10x bufor TBS i autoklaw roztwór w temperaturze 121 stopni Celsjusza przez 15 minut. Następnie przygotuj 4x bufor próbki białka.Następnie przygotuj bufor transferowy, mieszając 800 mililitrów buforu Tris-Glycine z 200 mililitrami metanolu. Na koniec przygotuj roztwór TBST, dodając 100 mililitrów 10x TBS i trzy mililitry Tween od 20 do 900 mililitrów sterylnej wody. Aby wykryć białka śliny i wirusa, zmiel 0,1 grama próbek ryżu ciekłym azotem, aż tkanka stanie się proszkiem.Następnie dodaj 200 mikrolitrów 4x buforu próbki białka do próbki i gotuj przez 10 minut. Odwirować próbki i przenieść supernatant do nowej fiolki. Załaduj 10 mikrolitrów próbki na żel SDS-PAGE i uruchom ją w buforze Tris-Glycine o napięciu 150 woltów przez 45 do 60 minut.Podczas pracy żelu umieść membranę nitrocelulozową o grubości 0,45 mikrona i inne materiały warstwowe w buforze transferowym na 30 minut. Po zakończeniu pracy ułóż żel na warstwie i przenieś go na 90 do 120 minut przy napięciu 100 woltów w buforze transferowym. Po zakończeniu osuszania umieść membranę w 7% beztłuszczowym roztworze blokującym mleko w proszku w TBST i inkubuj przez 20 minut.Następnie dodaj przeciwciało przeciwko wirusowi karłowatości ryżu P8 lub witellogeninie i inkubuj błonę przez dwie godziny lub noc. Po inkubacji przemyć membranę TBST trzy razy w pięciominutowej inkubacji między każdym myciem. Następnie dodaj kozią anty-króliczą IgG jako przeciwciało drugorzędowe i inkubuj błonę przez 60 do 90 minut.Użyj zestawu ECL Western do detekcji chemiluminescencyjnej w mieszanych odczynnikach detekcyjnych jeden i dwa w zestawie w stosunku jeden do jednego. Umieść membranę na zmieszanym odczynniku i inkubuj blot przez pięć minut. Odcedź nadmiar odczynnika i wykonaj zdjęcie chemiluminescencyjne i kolorymetryczne membrany.Połącz obrazki, aby zobaczyć te ostatnie z pasmami białkowymi. Analiza Western blot w celu wykrycia witellogeniny wykazała specyficzne i oczekiwane pasma około 220 kilodaltonów w żerujących roślinach ryżu i gruczołach ślinowych owadów. W przeciwieństwie do tego, nie zaobserwowano żadnego pasma u roślin niekarmionych, co wskazuje, że witellogenina była uwalniana w żywicielu roślinnym jako białko śliny.Analiza Western blot w celu wykrycia białka P8 wirusa karłowatości ryżu wykazała specyficzne i oczekiwane pasmo około 46 kilodaltonów w żerujących roślinach i zjadliwych ciałach owadów. W przeciwieństwie do tego, nie zaobserwowano żadnego prążka w roślinach nieżerujących i niezjadliwych ciałach skoczków, co dowodzi, że białka wirusowe można również wykryć w roślinach żerujących. Podczas wykonywania tego protokołu należy wziąć pod uwagę ładunek wirusa w skoczkach, czas wykrywania i replikacje.Metoda ta może być również stosowana do badania komarów przenoszących arbowirusy.

detecting-virus-salivary-proteins-leafhopper-vector-plant

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Mszyce są skutecznymi wektorami wirusów roślinnych. Mikroiniekcja wirusa do mszycy, procedura którą zaprezentujemy dzisiaj, jest techniką pozwalającą badaczom na wstrzykiwanie wirusa bezpośrednio do hemocelu mszycy, z pominięciem jelita, które stanowi jedną z dwóch głównych barier w cyrkulacyjnym przekazywaniu wirusa. Ta sama technika jest również stosowana do wstrzykiwania dsRNA w celu wywołania RNAi.

Badanie fizjologicznych barier transmisji wirusów u mszyc z wykorzystaniem mikroiniekcji

Source: Zhang, L., et al. Immunofluorescent Labeling of Plant Virus and Insect Vector Proteins in Hemipteran Guts. J. Vis. Exp. (2021)The video demonstrates the preparation of gut tissue from a plant virus–infected insect vector for fluorescence imaging. Fixed guts were washed, permeabilized, and incubated with two fluorescent antibodies in a blocking solution—one targeting a viral antigen in vesicles, the other a vesicle-associated membrane protein. The tissue was counterstained for actin...

Immunostaining to Visualize Viral Antigen and Host Protein Colocalization in the Insect Gut

Opisujemy tutaj prostą metodę fluorescencji in situ (FISH) do lokalizacji wirusów i bakterii w tkankach owadów i roślin. Protokół ten można rozszerzyć o wizualizację mRNA w całych ujęciach i przekrojach mikroskopowych.

Fluorescencyjne hybrydyzacje in situ (FISH) do lokalizacji wirusów i bakterii endosymbiotycznych w tkankach roślinnych i owadzich

Połączenia międzykomórkowe roślin, plazmodesmaty (Pd), odgrywają kluczową rolę w fizjologii roślin i interakcjach między roślinami a wirusami. Kluczowe znaczenie dla transportu Pd mają sygnały sortujące, które kierują białka do Pd. Jednak nasza wiedza na temat tych sekwencji jest wciąż w powijakach. Opisujemy strategię identyfikacji sygnałów lokalizacji Pd w białkach docelowych Pd.

Identyfikacja sekwencji lokalizacji plazmodesmalnej w białkach w Planta

Tutaj prezentujemy protokół do zbadania rozkładu tkanki gospodarza, sposobu transmisji i wpływu na dopasowanie gospodarza densowirusa w obrębie gatunku lepidoptera, robaka bawełnianego. Protokół ten może być również wykorzystany do badania interakcji między innymi wirusami przenoszonymi drogą pokarmową a ich owadzimi gospodarzami.

Protokoły badania rozmieszczenia tkanki gospodarza, trybu transmisji i wpływu na kondycję gospodarza densowirusa w robaku bawełnianym

Tutaj prezentujemy nowe podejście do identyfikacji wirusów roślinnych za pomocą dwuniciowych genomów DNA. Stosujemy standardowe metody ekstrakcji DNA i RNA z zakażonych liści oraz przeprowadzamy sekwencjonowanie nowej generacji. Narzędzia bioinformatyczne łączą sekwencje w kontigi, identyfikują kontigi reprezentujące genomy wirusów i przypisują genomy do grup taksonomicznych.

Połączenie analizy DNA w surowej ekstrakcji wirionu z analizą RNA z zakażonych liści w celu odkrycia nowych genomów wirusów

Tutaj prezentujemy protokoły identyfikacji 1) kodowanych przez wirusa immunomodulatorów, które promują replikację arbowirusa i 2) eukariotycznych czynników gospodarza, które ograniczają replikację arbowirusa. Te metody oparte na fluorescencji i luminescencji pozwalają naukowcom szybko uzyskać ilościowe odczyty replikacji arbowirusa w uproszczonych testach o niskim stosunku sygnału do szumu.

Zakażenia arbowirusem jako narzędzia przesiewowe do identyfikacji immunomodulatorów wirusa i czynników przeciwwirusowych gospodarza

Tutaj prezentujemy zmodyfikowaną metodę przesiewową, która może być szeroko stosowana do szybkiego badania przesiewowego supresorów wyciszających RNA u patogenów roślinnych.

Badania przesiewowe i identyfikacja supresorów wyciszających RNA z wydzielanych efektorów patogenów roślinnych

Ten protokół immunofluorescencyjnego znakowania zarówno białek wirusa roślinnego, jak i białek wektorów owadów w wyciętych jelitach owadów może być używany do badania interakcji między wirusem a owadami-wektorami, funkcji białek owadów i mechanizmów molekularnych leżących u podstaw transmisji wirusa.

Znakowanie immunofluorescencyjne białek wektorów wirusów roślinnych i owadów w jelitach pluskwiaka

Obecny protokół opisuje metodę zbierania wystarczającej ilości śliny od owadów wysysających za pomocą sztucznego podłoża. Jest to wygodna metoda zbierania śliny owadów i badania funkcji śliny pod kątem zachowań żywieniowych owadów i przenoszenia wirusa przenoszonego przez wektory.

Dwuwarstwowa metoda kanapkowa z membraną do zbierania śliny Laodelphax striatellus

Opisujemy metodę skutecznego zbierania mierzalnych hemolimfów od małych stawonogów do późniejszej analizy.

Precyzyjna i wymierna metoda zbierania hemolimfy z małych stawonogów

Poznaj metodę wykrywania białek ślinowych skoczków liściowych i wirusów roślinnych w żywicielu rośliny. Technika SDS-PAGE i Western blot pozwala badać interakcje owad-roślina oraz mechanizmy transmisji wirusowej.

Wykrywanie wirusa i białek ślinowych wektora skoczka liściowego w żywicielu rośliny

Przeglądaj więcej filmów