Wykrywanie wirusa i białek ślinowych wektora skoczka liściowego w żywicielu rośliny

Protokół ten zapewnia technikę wykrywania białek śliny skoczków i żywicieli roślinnych w celu dalszego zbadania funkcji tych białek w żywicielach roślinnych. Ta technika jest łatwa do wykonania, a system jest stabilny i powtarzalny. Metoda ta może być również pomocna w wykrywaniu białek śliny innych pluskwiaków i żywicieli roślinnych.

Na początek hoduj dorosłe skoczki na sadzonkach ryżu w klatce o wymiarach 40 na 35 na 20 centymetrów. Utrzymuj jedną stronę klatki przykrytą siatką chroniącą przed owadami w celu wentylacji. Umieść klatki ze skoczkami w inkubatorze zawierającym wbudowany regulator wilgotności w temperaturze 26 stopni Celsjusza i wilgotności względnej od 60 do 75% podczas okresu fotograficznego trwającego 16 godzin światła i ośmiu godzin ciemności.

Raz w tygodniu za pomocą aspiratora delikatnie przenieś wszystkie dorosłe osoby z klatki do nowej klatki zawierającej świeże sadzonki ryżu. Pozwól ponad 200 dorosłym osobnikom połączyć się w pary i złożyć jaja w ryżu. Zachowaj stare siewki ryżu, aby nimfy mogły się wyłonić i wychowuj te nowe, niezjadliwe nimfy do drugiego stadium rozwojowego.

Za pomocą aspiratora ostrożnie przenieś niezjadliwe nimfy w drugim stadium rozwojowym do szklanej probówki hodowlanej na jedną do dwóch godzin w celu zagłodzenia. Następnie wypuść nimfy do klatki zawierającej zakażoną wirusem karłowatości ryżowej roślinę ryżu uprawianą w doniczce i pozwól nimfom żywić się zakażoną rośliną ryżu przez dwa dni. Po dwóch dniach ostrożnie przenieś te nimfy do nowej klatki, która zawiera świeże sadzonki ryżu wolne od wirusa i pozwól nimfom żywić się sadzonkami ryżu wolnymi od wirusa przez 12 dni, aby zakończyć okres transmisji wirusa karłowatego ryżu

Aby zebrać białka śliny, przygotuj pięć małych rurowych klatek do karmienia, pokrytych siatką chroniącą przed owadami na jednym końcu. Po zamknięciu od 15 do 20 skoczków w każdej klatce do karmienia, przykryj drugi koniec klatki cienką matą piankową. Przymocuj jedną sadzonkę ryżu między końcem klatki a matą piankową za pomocą taśm, upewniając się, że skoczki w klatce do karmienia mogą żywić się sadzonkami ryżu wystawionymi na działanie wnętrza klatki.

Zanurz korzenie sadzonek w wodzie, aby roślina ryżu pozostała żywa, i pozwól skoczkom żywić się nimi przez dwa dni. Po dwóch dniach wyjmij skoczki z klatek do karmienia i zbierz sadzonki ryżu, którymi żywiły się skoczki. Wytnij sadzonki na zewnątrz klatki i odzyskaj regiony żerowania sadzonek.

Przygotuj 1x bufor Tris-Glycine, rozcieńczając 200 mililitrów przygotowanego 5x buforu z 800 mililitrami sterylnej wody. Następnie przygotuj 10x bufor TBS i autoklaw roztwór w temperaturze 121 stopni Celsjusza przez 15 minut. Następnie przygotuj 4x bufor próbki białka.

Następnie przygotuj bufor transferowy, mieszając 800 mililitrów buforu Tris-Glycine z 200 mililitrami metanolu. Na koniec przygotuj roztwór TBST, dodając 100 mililitrów 10x TBS i trzy mililitry Tween od 20 do 900 mililitrów sterylnej wody. Aby wykryć białka śliny i wirusa, zmiel 0,1 grama próbek ryżu ciekłym azotem, aż tkanka stanie się proszkiem.

Następnie dodaj 200 mikrolitrów 4x buforu próbki białka do próbki i gotuj przez 10 minut. Odwirować próbki i przenieść supernatant do nowej fiolki. Załaduj 10 mikrolitrów próbki na żel SDS-PAGE i uruchom ją w buforze Tris-Glycine o napięciu 150 woltów przez 45 do 60 minut.

Podczas pracy żelu umieść membranę nitrocelulozową o grubości 0,45 mikrona i inne materiały warstwowe w buforze transferowym na 30 minut. Po zakończeniu pracy ułóż żel na warstwie i przenieś go na 90 do 120 minut przy napięciu 100 woltów w buforze transferowym. Po zakończeniu osuszania umieść membranę w 7% beztłuszczowym roztworze blokującym mleko w proszku w TBST i inkubuj przez 20 minut.

Następnie dodaj przeciwciało przeciwko wirusowi karłowatości ryżu P8 lub witellogeninie i inkubuj błonę przez dwie godziny lub noc. Po inkubacji przemyć membranę TBST trzy razy w pięciominutowej inkubacji między każdym myciem. Następnie dodaj kozią anty-króliczą IgG jako przeciwciało drugorzędowe i inkubuj błonę przez 60 do 90 minut.

Użyj zestawu ECL Western do detekcji chemiluminescencyjnej w mieszanych odczynnikach detekcyjnych jeden i dwa w zestawie w stosunku jeden do jednego. Umieść membranę na zmieszanym odczynniku i inkubuj blot przez pięć minut. Odcedź nadmiar odczynnika i wykonaj zdjęcie chemiluminescencyjne i kolorymetryczne membrany.

Połącz obrazki, aby zobaczyć te ostatnie z pasmami białkowymi. Analiza Western blot w celu wykrycia witellogeniny wykazała specyficzne i oczekiwane pasma około 220 kilodaltonów w żerujących roślinach ryżu i gruczołach ślinowych owadów. W przeciwieństwie do tego, nie zaobserwowano żadnego pasma u roślin niekarmionych, co wskazuje, że witellogenina była uwalniana w żywicielu roślinnym jako białko śliny.

Analiza Western blot w celu wykrycia białka P8 wirusa karłowatości ryżu wykazała specyficzne i oczekiwane pasmo około 46 kilodaltonów w żerujących roślinach i zjadliwych ciałach owadów. W przeciwieństwie do tego, nie zaobserwowano żadnego prążka w roślinach nieżerujących i niezjadliwych ciałach skoczków, co dowodzi, że białka wirusowe można również wykryć w roślinach żerujących. Podczas wykonywania tego protokołu należy wziąć pod uwagę ładunek wirusa w skoczkach, czas wykrywania i replikacje.

Metoda ta może być również stosowana do badania komarów przenoszących arbowirusy.