Name: Generowanie transgeników i nokautów u gatunków Strongyloides za pomocą mikroiniekcji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-07T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Poznaj metodę mikroiniekcji do generowania transgeników i nokautów u nicieni Strongyloides stercoralis i S. ratti. Ta technika umożliwia badanie rozwoju i mechanizmów pasożytnictwa tych organizmów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

pPV540 i pPV402 były miłymi prezentami od dr Jamesa Loka z University of Pennsylvania. Dziękujemy Astrze Bryant za pomocne komentarze do manuskryptu. Praca ta została sfinansowana przez Burroughs-Wellcome Fund Investigators in the Pathogenesis of Disease Award, Howard Hughes Medical Institute Faculty Scholar Award oraz National Institutes of Health R01 DC017959 (E.A.H.).

<ol><li>Krolewiecki, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+public+health+response+against+Strongyloides+stercoralis%3A+time+to+look+at+soil-transmitted+helminthiasis+in+full%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">A public health response against Strongyloides stercoralis: time to look at soil-transmitted helminthiasis in full.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (5), 2165(2013).</li>
<li>Buonfrate, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+global+prevalence+of+Strongyloides+stercoralis+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens%22%5BJournal%5D)">The global prevalence of Strongyloides stercoralis infection.</a> Pathogens. 9 (6), 468(2020).</li>
<li>Castelletto, M. L., Gang, S. S., Hallem, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+functional+genomics+for+parasitic+nematodes+of+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Recent advances in functional genomics for parasitic nematodes of mammals.</a> Journal of Experimental Biology. 223, Pt Suppl 1 206482(2020).</li>
<li>Evans, T. C., et al. Transformation and microinjection. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEvans%2C+TC+%22WormBook%22">WormBook</a>. , ed. The C. elegans Research Communnity (2006).</li>
<li>Lok, J. B., Unnasch, T. R., et al. Transgenesis in animal parasitic nematodes: Strongyloides spp. and Brugia spp. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLok%2C+JB+%22WormBook%22">WormBook</a>. , ed. The C. elegans Research Communnity (2013).</li>
<li>Shao, H. G., Li, X. S., Lok, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heritable+genetic+transformation+of+Strongyloides+stercoralis+by+microinjection+of+plasmid+DNA+constructs+into+the+male+germline%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+for+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Heritable genetic transformation of Strongyloides stercoralis by microinjection of plasmid DNA constructs into the male germline.</a> International Journal for Parasitology. 47 (9), 511-515 (2017).</li>
<li>Schafer, T. W., Skopic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parasites+of+the+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Gastroenterology+Reports%22%5BJournal%5D)">Parasites of the small intestine.</a> Current Gastroenterology Reports. 8 (4), 312-320 (2006).</li>
<li>Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStiernagle%2C+T+%22The+C.+elegans+Research+Community%2C+WormBook%22">The C. elegans Research Community, WormBook</a>. , (2006).</li>
<li>Gang, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+mutagenesis+in+a+human-parasitic+nematode%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Targeted mutagenesis in a human-parasitic nematode.</a> PLoS Pathogens. 13 (10), 1006675(2017).</li>
<li>Lok, J. B. Strongyloides stercoralis: a model for translational research on parasitic nematode biology. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLok%2C+JB+%22The+C.+elegans+Research+Community%2C+WormBook%22">The C. elegans Research Community, WormBook</a>. , (2007).</li>
<li>Hawdon, J. M., Schad, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+storage+of+hookworm+infective+larvae+in+buffered+saline+solution+maintains+larval+responsiveness+to+host+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Helminthological+Society+of+Washington+%28USA%29%22%5BJournal%5D)">Long-term storage of hookworm infective larvae in buffered saline solution maintains larval responsiveness to host signals.</a> Proceedings of the Helminthological Society of Washington (USA). 58 (1), 140-142 (1991).</li>
<li>Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant-selective+genes+and+neurons+mediate+olfaction+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans.</a> Cell. 74 (3), 515-527 (1993).</li>
<li>Junio, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strongyloides+stercoralis%3A+cell-+and+tissue-specific+transgene+expression+and+co-transformation+with+vector+constructs+incorporating+a+common+multifunctional+3%27+UTR%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Strongyloides stercoralis: cell- and tissue-specific transgene expression and co-transformation with vector constructs incorporating a common multifunctional 3' UTR.</a> Experimental Parasitology. 118 (2), 253-265 (2008).</li>
<li>Gang, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemosensory+mechanisms+of+host+seeking+and+infectivity+in+skin-penetrating+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Chemosensory mechanisms of host seeking and infectivity in skin-penetrating nematodes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (30), 17913-17923 (2020).</li>
<li>Bryant, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+for+thermosensation+in+host+seeking+by+skin-penetrating+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">A critical role for thermosensation in host seeking by skin-penetrating nematodes.</a> Current Biology. 28 (14), 2338-2347 (2018).</li>
<li>Lok, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid+transfection+and+transgenesis+in+parasitic+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid transfection and transgenesis in parasitic nematodes.</a> Parasitology. 139 (5), 574-588 (2012).</li>
<li>Shao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon-mediated+chromosomal+integration+of+transgenes+in+the+parasitic+nematode+Strongyloides+ratti+and+establishment+of+stable+transgenic+lines%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Transposon-mediated chromosomal integration of transgenes in the parasitic nematode Strongyloides ratti and establishment of stable transgenic lines.</a> PLoS Pathogens. 8 (8), 1002871(2012).</li>
<li>Lok, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piggyBac%3A+a+vehicle+for+integrative+DNA+transformation+of+parasitic+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Mobile+Genetic+Elements%22%5BJournal%5D)">piggyBac: a vehicle for integrative DNA transformation of parasitic nematodes.</a> Mobile Genetic Elements. 3 (2), 24417(2013).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+transgenesis+of+the+parasitic+nematode+Strongyloides+stercoralis+requires+endogenous+non-coding+control+elements%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+for+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Successful transgenesis of the parasitic nematode Strongyloides stercoralis requires endogenous non-coding control elements.</a> International Journal for Parasitology. 36 (6), 671-679 (2006).</li>
<li>Bryant, A. S., Hallem, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Wild+Worm+Codon+Adapter%3A+a+web+tool+for+automated+codon+adaptation+of+transgenes+for+expression+in+non-Caenorhabditis+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">The Wild Worm Codon Adapter: a web tool for automated codon adaptation of transgenes for expression in non-Caenorhabditis nematodes.</a> G3. 3 (7), (2021).</li>
<li>Crane, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+measurements+reveal+a+single+5%27-intron+is+sufficient+to+increase+protein+expression+level+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">In vivo measurements reveal a single 5'-intron is sufficient to increase protein expression level in Caenorhabditis elegans.</a> Scientific Reports. 9 (1), 9192(2019).</li>
<li>Han, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+transgenesis+efficiency+and+CRISPR-associated+tools+through+codon+optimization+and+native+intron+addition+in+Pristionchus+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Improving transgenesis efficiency and CRISPR-associated tools through codon optimization and native intron addition in Pristionchus nematodes.</a> Genetics. 216 (4), 947-956 (2020).</li>
<li>Adams, S., Pathak, P., Shao, H., Lok, J. B., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposome-based+transfection+enhances+RNAi+and+CRISPR-mediated+mutagenesis+in+non-model+nematode+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Liposome-based transfection enhances RNAi and CRISPR-mediated mutagenesis in non-model nematode systems.</a> Scientific Reports. 9 (1), 483(2019).</li>
<li>Dulovic, A., Puller, V., Streit, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+culture+conditions+for+free-living+stages+of+the+nematode+parasite+Strongyloides+ratti%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Optimizing culture conditions for free-living stages of the nematode parasite Strongyloides ratti.</a> Experimental Parasitology. 168, 25-30 (2016).</li>
<li>Harvey, S. C., Gemmill, A. W., Read, A. F., Viney, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+control+of+morph+development+in+the+parasitic+nematode+Strongyloides+ratti%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">The control of morph development in the parasitic nematode Strongyloides ratti.</a> Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 267 (1457), 2057-2063 (2000).</li>
<li>Kim, A., Pyykko, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size+matters%3A+versatile+use+of+PiggyBac+transposons+as+a+genetic+manipulation+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Size matters: versatile use of PiggyBac transposons as a genetic manipulation tool.</a> Molecular and Cellular Biochemistry. 354 (1-2), 301-309 (2011).</li>
<li>Lok, J. B., Shao, H., Massey, H. C., Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenesis+in+Strongyloides+and+related+parasitic+nematodes%3A+historical+perspectives%2C+current+functional+genomic+applications+and+progress+towards+gene+disruption+and+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">Transgenesis in Strongyloides and related parasitic nematodes: historical perspectives, current functional genomic applications and progress towards gene disruption and editing.</a> Parasitology. 144 (3), 327-342 (2017).</li>
<li>Farboud, B., Meyer, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dramatic+enhancement+of+genome+editing+by+CRISPR%2FCas9+through+improved+guide+RNA+design%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Dramatic enhancement of genome editing by CRISPR/Cas9 through improved guide RNA design.</a> Genetics. 199 (4), 959-971 (2015).</li>
<li>Cheong, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+nuclear+receptor%2Fcoactivator+developmental+signaling+pathway+in+the+nematode+parasite+Strongyloides+stercoralis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Identification of a nuclear receptor/coactivator developmental signaling pathway in the nematode parasite Strongyloides stercoralis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (8), 2021864118(2021).</li>
<li>Nolan, T. J., Megyeri, Z., Bhopale, V. M., Schad, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strongyloides+stercoralis%3A+the+first+rodent+model+for+uncomplicated+and+hyperinfective+strongyloidiasis%2C+the+Mongolian+gerbil+%28Meriones+unguiculatus%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Strongyloides stercoralis: the first rodent model for uncomplicated and hyperinfective strongyloidiasis, the Mongolian gerbil (Meriones unguiculatus).</a> Journal of Infectious Diseases. 168 (6), 1479-1484 (1993).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenesis+in+the+parasitic+nematode+Strongyloides+ratti%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Transgenesis in the parasitic nematode Strongyloides ratti.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 179 (2), 114-119 (2011).</li>
<li>Viney, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+the+life+cycle+of+Strongyloides+ratti%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology+Today%22%5BJournal%5D)">Exploiting the life cycle of Strongyloides ratti.</a> Parasitology Today. 15 (6), 231-235 (1999).</li>
<li>Stoltzfus, J. D., Massey, H. C., Nolan, T. J., Griffith, S. D., Lok, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strongyloides+stercoralis+age-1%3A+a+potential+regulator+of+infective+larval+development+in+a+parasitic+nematode%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Strongyloides stercoralis age-1: a potential regulator of infective larval development in a parasitic nematode.</a> PLoS ONE. 7 (6), 38587(2012).</li>
<li>Castelletto, M. L., Massey, H. C., Lok, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+of+Strongyloides+stercoralis+infective+larvae+requires+the+DAF-16+ortholog+FKTF-1%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis of Strongyloides stercoralis infective larvae requires the DAF-16 ortholog FKTF-1.</a> PLoS Pathogens. 5 (4), 1000370(2009).</li>
<li>Douglas, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+expression+of+a+T+cell+epitope+in+Strongyloides+ratti+reveals+that+helminth-specific+CD4%2B+T+cells+constitute+both+Th2+and+Treg+populations%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Transgenic expression of a T cell epitope in Strongyloides ratti reveals that helminth-specific CD4+ T cells constitute both Th2 and Treg populations.</a> PLoS Pathogens. 17 (7), 1009709(2021).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Ten protokół mikroiniekcji szczegółowo opisuje metody wprowadzania konstruktów do transgenezy i mutagenezy za pośrednictwem CRISPR/Cas9 do S. stercoralis i S. ratti. Zarówno w przypadku S. stercoralis , jak i S. ratti, przeżycie po wstrzyknięciu oraz tempo transgenezy lub mutagenezy podlegają kilku zmiennym, które można precyzyjnie dostosować.
Pierwszą krytyczną kwestią dla udanej transgenezy jest to, jak zbudowane są transgeny plazmidowe. Wcześniejsze badan...

Strongyloides stercoralis przez długi czas był pomijany jako istotny patogen ludzki w porównaniu do szerzej znanych glistw i glisty Ascaris lumbricoides1. Poprzednie badania nad obciążeniem organizmu pasożytami często znacznie niedoszacowywały rozpowszechnienia S. stercoralis ze względu na niską czułość powszechnych metod diagnostycznych dla S. stercoralis2. W ostatnich latach badania epidemiologiczne oparte na ulepszonych narzędziach diagnostycznych pozwoliły oszacować, że rzeczywista zapadalność na infekcje S. stercoralis jest znacznie wyższa niż zgłaszano wcześniej i obejmuje około 610 milionów ludzi na całym świecie2.
Zarówno S. stercoralis, jak i inne gatunki Strongyloides, w tym blisko spokrewniony pasożyt szczurzy i powszechny model laboratoryjny S. ratti, charakteryzują się nietypowym cyklem życiowym, który jest korzystny dla eksperymentalnych badań genomicznych, ponieważ składa się on zarówno z pokoleń pasożytniczych, jak i wolnożyjących (środowiskowych)3 (Rysunek 1). W szczególności zarówno S. stercoralis, jak i S. ratti mogą przejść przez jedno pokolenie wolnożyjące. Pokolenie wolnożyjące składa się z larw popasożytniczych, które rozwijają się w wolnożyjące dorosłe samce i samice; całe potomstwo dorosłych osobników wolnożyjących rozwija się w larwy zakaźne, które muszą zainfekować gospodarza, aby kontynuować cykl życiowy. Ponadto to pokolenie środowiskowe lub wolnożyjące może być manipulowane eksperymentalnie w laboratorium. Ponieważ dorosłe osobniki wolnożyjące Strongyloides oraz dorosłe C. elegans mają podobną morfologię, techniki takie jak mikroiniekcje wewnątrzgonadalne, które zostały pierwotnie opracowane dla C. elegans, mogą zostać dostosowane do użytku u wolnożyjących dorosłych Strongyloides4,5. Chociaż DNA jest zazwyczaj wprowadzane do wolnożyjących dorosłych samic, mikroiniekcje u Strongyloides można wykonywać zarówno u samców, jak i samic6. W związku z tym dostępne są narzędzia genomiki funkcjonalnej pozwalające na badanie wielu aspektów biologii Strongyloides. Inne nicienie pasożytnicze nie posiadają pokolenia wolnożyjącego i w rezultacie nie są tak łatwo dostępne dla technik genomiki funkcjonalnej3.
<img alt="Schemat cyklu życiowego S. stercoralis; stadia pasożytnicze i wolnożyjące; autoinfekcja, screening transgeniczny." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63023/63023fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Cykl życiowy Strongyloides stercoralis. Pasożytnicze samice S. stercoralis bytują w jelicie cienkim swoich ssaczych gospodarzy (ludzi, naczelnych niebędących ludźmi, psów). Samice pasożytnicze rozmnażają się poprzez partenogenezę i składają jaja w jelicie cienkim. Jaja wykluwają się jeszcze wewnątrz gospodarza, przekształcając się w larwy postpasożytnicze, które następnie są wydalane do środowiska wraz z kałem. Jeśli larwy postpasożytnicze są samcami, rozwijają się w wolnożyjące dorosłe samce. Jeśli larwy postpasożytnicze są samicami, mogą rozwinąć się albo w wolnożyjące dorosłe samice (rozwój pośredni), albo w zakaźne larwy trzeciego stadium (iL3; rozwój bezpośredni). Wolnożyjące samce i samice rozmnażają się płciowo, tworząc potomstwo, które musi przekształcić się w iL3. W określonych warunkach S. stercoralis może również przejść autoinfekcję, podczas której część larw postpasożytniczych pozostaje w jelicie gospodarza zamiast zostać wydalona do środowiska z kałem. Larwy te mogą rozwinąć się w larwy autoinfekcyjne (L3a) wewnątrz gospodarza, przebić się przez ścianę jelita, migrować przez organizm i ostatecznie powrócić do jelita, aby stać się dorosłymi osobnikami zdolnymi do rozmnażania. Cykl życiowy S. ratti jest podobny, z wyjątkiem tego, że S. ratti infekuje szczury i nie posiada cyklu autoinfekcyjnego. Generacja środowiskowa jest kluczowa dla wykorzystania gatunków Strongyloides w badaniach genetycznych. Wolnożyjące dorosłe samice (P0) mogą być poddawane mikroiniekcji; ich potomstwo, z którego wszystkie staną się iL3, stanowi potencjalne transgeniczne pokolenie F1. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Castelletto et al.3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63023/63023fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
S. stercoralis wykazuje wiele cech biologicznych wspólnych z innymi nicieniami pasożytniczymi przewodu pokarmowego człowieka, w tym sposób wnikania do organizmu gospodarza oraz modulację jego odpowiedzi immunologicznej. Na przykład pasożytnicze nicienie haczykowate z rodzajów Necator i Ancylostoma również infekują poprzez penetrację skóry, przemieszczają się w podobny sposób w organizmie i ostatecznie bytują w formie dorosłych pasożytów w jelicie cienkim7. Zatem wiele nicieni układu pokarmowego prawdopodobnie wykorzystuje wspólne zachowania sensoryczne i techniki unikania odpowiedzi immunologicznej. W konsekwencji wiedza zdobyta na przykładzie rodzaju Strongyloides uzupełni wyniki badań nad innymi, mniej podatnymi na manipulacje genetyczne nicieniami i doprowadzi do pełniejszego zrozumienia tych złożonych i istotnych pasożytów.
Niniejszy protokół mikrowstrzykiwania opisuje metodę wprowadzania DNA do wolno żyjących dorosłych samic Strongyloides w celu uzyskania potomstwa transgenicznego i mutantów. Opisano wymagania dotyczące utrzymania szczepów, w tym czas rozwoju dorosłych nicieni pod kątem mikrowstrzykiwań oraz metodę zbierania potomstwa transgenicznego. Protokół zawiera demonstrację kompletnej techniki mikrowstrzykiwania oraz procedury hodowli i screeningu potomstwa transgenicznego, wraz z listą całego niezbędnego sprzętu i materiałów eksploatacyjnych.

<table><tbody><tr><td>(&minus;)-Nikotyna, &ge; 99% (GC), płynna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N3876-5ML</td><td>nikotyna na paraliżujące robaki</td></tr><tr><td>3-calowy żelazny zacisk C, 3" x 2" (pojemność x głębokość)</td><td>VWR</td><td>470121-790</td><td>C-clamp do bezpiecznego montażu na stole</td></tr><tr><td>Agaroza LE</td><td>Phenix</td><td>RBA-500</td><td>do szkiełek</td></tr><tr><td>Zwęglenie kostne, wiadro 4 lb, siatka 10 x 28 Węgiel</td> drzewny <td>Ebonex</td><td>n/a</td><td>do kultur</td></tr> <tr><td>kałowo-drzewnychZwęglenie kostne, granulki, siatka 10 x 28</td><td>Reade</td><td>bonechar10x28</td><td>węgiel drzewny do kultur kałowych (alternatywa dla powyższego)</td></tr><tr><td>Mikromanipulator gruboziarnisty</td><td>Narishige</td><td>MMN-1</td><td>mikromanipulator gruboziarnisty</td></tr><tr><td>Corning Costar Spin-X Filtry probówkowe do wirówek</td><td>Fisher</td><td>07-200-385</td><td></td></tr><tr><td>Szkło nakrywkowe, 48 x 60 mm, grubość nr 1</td> Szkiełka nakrywkowe <td>Brain Research Lab</td><td>4860-1</td><td> (48 x 60 mm)</td></tr><tr><td>Głębokie szalki Petriego, wersja ciężka z 6 otworami wentylacyjnymi, średnica 100 mm</td><td>VWR</td><td>82050-918</td><td>10 cm szalki Petriego (do kultur kału węgla drzewnego)</td></tr><tr><td>Podstawa retorty Eisco z prętem</td><td>Stojak Fisher</td><td>12-000-101</td><td>do aparatu Baermann</td></tr><tr><td>Eppendorf FemtoJet mikrowtryskiwacz końcówki do mikroładowarek</td><td>VWR</td><td>89009-310</td><td>do napełniania igieł do mikroiniekcji</td></tr><tr><td>Fisherbrand podkładki chłonne Fisherbrand</td><td>Fisher</td><td>14-206-62</td><td>papier stołowy (do przygotowania)</td></tr><tr><td>Pierścienie żeliwne Fisherbrand</td><td>Fisher</td><td>14-050CQ</td><td>O-ring Baermann</td></tr><tr><td>Fisherbrand trójkątne zlewki polipropylenowe Fisher</td><td></td><td>14-955-111F</td><td>Zlewka plastikowa (do mieszania)</td></tr><tr><td>Zlewki polipropylenowe trójkątne Fisherbrand</td><td>Fisher</td><td>14-955-111F</td><td>Zlewka plastikowa (do wiadra na wodę/wiadra na wodę)</td></tr><tr><td>Trójkątne zlewki polipropylenowe Fisherbrand</td><td>Fisher</td><td>14-955-111F</td><td>Plastikowa zlewka (x2) (do wykonania uchwytu)</td></tr><tr><td>Żywica epoksydowa Gorilla w strzykawce</td> Klej <td>McMaster-Carr</td><td>7541A51</td><td>(do mocowania rurki)</td></tr><tr><td>Olej halowęglowy 700</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8898-50ML</td> olej <td>halowęglowy</td></tr><tr><td>Wysokotemperaturowe rurki z gumy silikonowej do żywności i napojów, 1/2" ID, 5/8" OD</td><td>McMaster-Carr</td><td>3038K24</td><td>rurka (do lejka)</td></tr><tr><td>Lejki KIMAX, długi trzpień, 60&deg; Kąt, Kimble Chase</td><td>VWR</td><td>89001-414</td><td>Lejek Baermann</td></tr><tr><td>Kimberly-Clark Professional Ochraniacze stołowe Kimtech Science</td><td>Papier</td> stołowy Fisher <td>15-235-101</td><td>(do przygotowania)</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy Leica z fluorescencją Mikroskop stereoskopowy</td><td>Leica</td><td>M165 FC</td><td>GFP do identyfikacji i sortowania transgenicznych robaków</td></tr><tr><td>microINJECTOR mosiężny uchwyt na igłę z prostym ramieniem</td><td>Tritech</td><td>MINJ-4</td><td>uchwyt igły do mikroiniekcji</td></tr><tr><td>system mikrowtryskiwaczy</td><td>Tritech</td> System <td>mikroiniekcji</td><td>MINJ-1</td></tr><tr><td>Myszoskoczki mongolskie</td><td>Charles River Laboratories</td><td>213-myszoskoczki mongolskie</td><td>do utrzymania S. stercoralis, samce 4-6 tygodni</td></tr><tr><td>Worki łatwe do zamknięcia Nasco Whirl-Pak, 18 uncji</td> Worki na próbki <td>VWR</td><td>11216-776</td><td>Whirl-Pak</td></tr><tr><td>Tiul nylonowy (siateczka)</td><td>Tkaniny Jo-Ann</td><td>zprd_14061949a</td><td>siatka nylonowa do uchwytu Baermann</td></tr><tr><td>Drut platynowy, 36 Gauge, na cal</td><td>Drut platynowo-irydowy</td><td>Thomas Scientific</td><td>1233S72</td> do kilofów</tr><tr><td>ślimakowych Purytańskie depresory do języka, 152 mm (dł.) x 17,5 mm (szer.)</td> Pałeczki drewniane <td>VWR</td><td>62505-007</td><td>(do mieszania próbek)</td></tr><tr><td>Zestaw QIAprep Spin Miniprep (250)</td><td>Zestaw</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>do miniprepu QIAGEN 27106 QIAGENSzczury-Long Evans</td><td>Envigo</td><td>140 HsdBlu:LE Długie</td><td>szczury Evans do utrzymania S. ratti, samica 4-6 tygodni</td></tr><tr><td>Szczury-Sprague Dawley</td><td>Envigo</td><td>002 Hsd:Sprague Dawley SD</td><td>do utrzymania S. ratti, samica 4-6 tygodni</td></tr><tr><td>Naprawdę przydatne pudełka półprzezroczyste pudełka do przechowywania z pokrywkami, pojemność 1,6 l, 7-5/8" x 5-5/16" x 4-5/16" Office</td> <td>Depot</td><td>452369</td><td>plastikowe pudełka do komory</td></tr> <tr><td>nawilżanejTablica techniczna Shepherd, 8 x 16,5 cala</td><td>Newco</td><td>999589</td><td>techboard</td></tr><tr><td>Podłoga z drutu podniesionego ze stali nierdzewnej</td><td>Ancare</td><td>R20SSRWF</td><td>druciane dna klatki</td></tr><tr><td>Kompostowalne łyżki do sztućców StalkMarket, 6", białe, opakowanie 1,000</td><td>łyżek</td>do <td>9587303</td><td>Office Depot</td></tr><tr><td>Naczynie do studzienek, 37 x 25 mm</td><td>Carolina (Science)</td><td>741012</td><td>okulary do zegarków (małe, okrągłe)</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Motic</td><td>K-400</td><td>Luneta preparcyjna</td>LED</tr><tr><td>Torba do przechowywania, kolor przezroczysty/biały, wysokość zewnętrzna 4-7/8 cala, długość zewnętrzna 13-5/8 cala, Sterylizator</td><td>Grainger</td><td>53GN16</td><td>plastikowe pudełka do komory nawilżanej</td></tr><tr><td>Ściągacz do mikropipet Sutter P-30</td><td>Ściągacz</td> igieł Sutter <td>P-30/P</td><td>z filamentem platynowo-irydowym</td></tr><tr><td>Okulary do zegarków Syracuse</td><td>Fisher</td><td>S34826</td><td>okulary zegarkowe (duże, okrągłe)</td></tr><tr><td>Zaciski stałokątne Thermo Scientific Castaloy</td><td>Zaciski</td> lejkowe Fisher <td>05-769-2Q</td><td>(2x)</td></tr><tr><td>Trójosiowy mikromanipulator hydrolizacyjny z joystickiem wiszącym</td><td>Narishige</td><td>MM0-4</td><td>precyzyjny mikromanipulator</td></tr><tr><td>United Zaciski zaciskowe Mohr</td><td>Fisher</td><td>S99422</td><td>Zaciski zaciskowe (2x)</td></tr><tr><td>Wentylowane, szalki Petriego z ostrymi krawędziami (średnica 60 mm)</td><td>Tritech Research</td><td>T3308P</td><td>6 cm szalki Petriego (do małych kultur kału i węgla drzewnego)</td></tr><tr><td>Lekkie wycieraczki do tkanek VWR</td> Podszewka <td>VWR</td><td>82003-820</td> do szkiełka zegarka <td>z uchwytem Baermann</td></tr><tr><td>, kwadratowa, 1-5/8 w</td><td>Karolinie (Nauka)</td><td>Okulary zegarkowe 742300</td><td>(małe, kwadratowe)</td></tr><tr><td>Gładkie koła Whatman klasy jakościowej, klasa 1, średnica 5,5 cm</td><td>Bibuła</td> filtracyjna Fisher <td>09-805B</td><td>(do 6 cm Petriego naczynia)</td></tr><tr><td>Gładkie koła Whatman klasy jakościowej, klasa 1, średnica 9 cm</td> Bibuła filtracyjna <td>Fisher</td><td>09-805D</td><td>(na szalki Petriego 10 cm)</td></tr><tr><td>Kapilara ze szkła borokrzemianowego World Precision Instrument, 1,2 mm x 4 cale Kapilary</td> szklane <td>Fisher</td><td>50-821-813</td><td>do igieł do mikroiniekcji</td></tr><tr><td>Noże X-Acto, nr 1 Nóż z ostrzem nr 11 Office</td><td>Depot</td><td>238816</td><td>Noże X-Acto bez ostrzy do trzymania wykałaczek ślimakowych</td></tr><tr><td>Zeiss AxioObserver A1</td> Mikroskop <td>odwrócony</td> <td>Zeiss</td><td>n/a</td></tr></tbody></table>

generowanie transgeników i nokautów u gatunków strongyloides za pomocą mikroiniekcji

Generating Transgenics and Knockouts in Strongyloides Species by Microinjection

Rodzaj Strongyloides składa się z wielu gatunków nicieni penetrujących skórę o różnych zakresach żywicieli, w tym Strongyloides stercoralis i Strongyloides ratti. S. stercoralis jest pasożytniczym dla człowieka, penetrującym skórę nicieniem, który zakaża około 610 milionów ludzi, podczas gdy pasożyt szczurów S. ratti jest blisko spokrewniony z S. stercoralis i jest często używany jako model laboratoryjny dla S. stercoralis. Zarówno S. stercoralis, jak i S. ratti są łatwo podatne na generowanie transgeników i nokautów za pomocą techniki dostarczania egzogennych kwasów nukleinowych mikroiniekcji dogonadalnej i jako takie pojawiły się jako systemy modelowe dla innych pasożytniczych robaków, które nie są jeszcze podatne na tę technikę.
Pasożytnicze dorosłe osobniki Strongyloides zamieszkują jelito cienkie swojego gospodarza i uwalniają potomstwo do środowiska poprzez kał. Po dostaniu się do środowiska larwy rozwijają się w wolno żyjące dorosłe osobniki, które żyją w kale i produkują potomstwo, które musi znaleźć i zaatakować nowego żywiciela. To pokolenie środowiskowe jest unikalne dla gatunku Strongyloides i na tyle podobne pod względem morfologii do modelowego wolno żyjącego nicienia Caenorhabditis elegans, że techniki opracowane dla C. elegans mogą być dostosowane do stosowania z tymi pasożytniczymi nicieniami, w tym mikroiniekcja downętrzna. Za pomocą mikroiniekcji intragonadalnej można wprowadzić do Strongyloides szeroką gamę transgenów. Składniki CRISPR/Cas9 mogą być również mikrowstrzykiwane w celu stworzenia zmutowanych larw Strongyloides. W tym miejscu opisano technikę mikroiniekcji dogonad do Strongyloides, w tym przygotowanie wolno żyjących osobników dorosłych, procedurę iniekcji oraz selekcję transgenicznego potomstwa. Dołączono obrazy transgenicznych larw Strongyloides stworzonych przy użyciu mutagenezy CRISPR/Cas9. Celem tej pracy jest umożliwienie innym badaczom wykorzystania mikroiniekcji do stworzenia transgenicznych i zmutowanych Strongyloides.

Jeśli eksperyment zakończył się sukcesem, larwy F1 będą wykazywać transgen i/lub interesujący fenotyp mutanta (Rysunek 4). Jednakże wskaźniki transformacji są bardzo zmienne i zależą od konstruktów, stanu zdrowia nicieni, warunków hodowli po iniekcji oraz umiejętności eksperymentatora. Generalnie udany eksperyment daje &gt;15 larw F1 na jedną iniektowaną samicę i wskaźnik transformacji &gt;3% dla markerów fluorescencyjnych. Jeśli całkowita liczba żyjącego potomstwa wyno...

Funkcjonalny zestaw narzędzi genomicznych dla pasożytniczych nicieni Strongyloides stercoralis i Strongyloides ratti obejmuje transgenezę, mutagenezę za pośrednictwem CRISPR/Cas9 oraz RNAi. Protokół ten pokaże, jak wykorzystać mikroiniekcje dogonadalne do wprowadzenia transgenów i składników CRISPR do S. stercoralis i S. ratti.

Generowanie transgeników i nokautów u gatunków Strongyloides za pomocą mikroiniekcji

The genus Strongyloides consists of multiple species of skin-penetrating nematodes with different host ranges, including Strongyloides stercoralis and ...

Wykorzystanie mikroiniekcji do dostarczania konstruktów DNA do Strongyloides pozwala nam generować nokauty i transgeniki, które można wykorzystać do badania, jak te robaki się rozwijają, poruszają się w swoim środowisku i pasożytują na żywicielach. Jak dotąd jest to jedyna skuteczna technika generowania nokautów i transgeników u tych pasożytów. Dzień przed mikrowstrzyknięciem dodaj 180 mikrolitrów roztworu agarozy na szkiełko nakrywkowe za pomocą szklanej pipety Pasteura, a następnie natychmiast upuść drugie szkiełko nakrywkowe na wierzch, aby spłaszczyć agarozę w cienką podkładkę.Po 5 do 10 sekundach usuń górną szkiełko nakrywkowe, rozsuwając je i określ, na którym slajdzie znajduje się podkładka agarowa, a następnie połóż ją stroną zadrukowaną do góry. Następnie wybierz mały kawałek szkła z pękniętego szkiełka nakrywkowego i za pomocą kleszczy delikatnie wciśnij go w agar w pobliżu górnej krawędzi podkładki. W dniu mikroiniekcji należy wyłożyć uchwyt Baermann, który jest sitkiem wykonanym z dwóch plastikowych pierścieni z dwiema warstwami nylonowej siatki tuile zabezpieczonej między nimi trzema zachodzącymi na siebie kawałkami tkanki laboratoryjnej.Następnie dodaj mieszaninę kału

generating-transgenics-knockouts-strongyloides-species

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

W tym filmie zaprezentowano technikę mikroiniekcji do gonady C. elegans w celu stworzenia zwierząt transgenicznych.

Generowanie stabilnych transgenicznych *C. elegans* metodą mikrowstrzykiwania

Robaki transgeniczne są powszechnie stosowane w badaniach nad C. elegans. Opisano prosty, a zarazem skuteczny protokół wprowadzania transgenów do organizmów za pomocą bombardowania biolistycznego cząstkami złota powleczonymi DNA. Nakład pracy oraz wyniki bombardowania wypadają korzystnie w porównaniu z mikroiniekcją w kontekście generowania zwierząt transgenicznych.

Generowanie transgenicznych C. elegans za pomocą transformacji biolistycznej

Wykazujemy tutaj, że przeprogramowanie epigenetyczne za pomocą transferu jąder komórek somatycznych (SCNT) może być wykorzystane jako narzędzie do tworzenia modeli mysich o zdefiniowanych specyficznościach receptorów limfocytów T (TCR). Myszy transjądrowe te wykazują ekspresję odpowiadającego TCR z ich locus endogennego pod kontrolą promotora endogennego.

Myszy transnuklearne o zdefiniowanej specyficzności receptorów limfocytów T przeciwko Toxoplasma gondii uzyskane poprzez SCNT

W organizmach modelowych transgeneza pozwala na manipulowanie funkcjami genów, podczas gdy RNAi umożliwia wyciszenie specyficznych transkryptów mRNA 1-2. Celem niniejszego protokołu jest przedstawienie technik niezbędnych do wprowadzenia stabilnie dziedziczonego DNA oraz przejściowego dwuniciowego RNA do nekromenicznego nicienia Pristionchus pacificus na potrzeby badań w dziedzinie biologii ewolucyjnej, rozwojowej i behawioralnej.

Wyciszanie genów za pomocą RNAi oraz transgeneza poprzez mikroiniekcję u nekromenicznego nicienienia Pristionchus pacificus

Śródziemnomorska muszka owocowa (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) jest światowym szkodnikiem rolnictwa. Głębsze zrozumienie jego biologii jest kluczem do kontrolowania populacji medfly, a tym samym zmniejszenia wpływu na gospodarkę. Mikroiniekcja zarodka jest podstawowym narzędziem umożliwiającym zarówno transformację linii zarodkowej, jak i odwrotne badania genetyczne u tego gatunku.

Dostarczanie kwasów nukleinowych poprzez mikroiniekcję zarodka u światowej populacji szkodników rolniczych, Ceratitis capitata

Mikroiniekcja mysich oocytów jest powszechnie stosowana zarówno do klasycznej transgenezy (tj. losowej integracji transgenów), jak i do celowania genów za pośrednictwem CRISPR. W protokole tym dokonano przeglądu najnowszych osiągnięć w dziedzinie mikroiniekcji, ze szczególnym naciskiem na kontrolę jakości i strategie genotypowania.

Generowanie genetycznie zmodyfikowanych myszy poprzez mikroiniekcję oocytów

Mikroiniekcja zarodków Nasonia vitripennis jest podstawową metodą generowania dziedzicznych modyfikacji genomu. Opisano tutaj szczegółową procedurę mikroiniekcji i przeszczepu zarodków Nasonia vitripennis, która znacznie ułatwi przyszłą manipulację genomem w tym organizmie.

Technika mikroiniekcji i przeszczepu zarodka w celu manipulacji genomem nosa vitripennis

Ten protokół opisuje procedury mikroiniekcji dla zarodków Culex quinquefasciatus, które są zoptymalizowane do pracy z narzędziami do edycji genów CRISPR/Cas9. Technika ta może skutecznie generować specyficzne dla danego miejsca, dziedziczne mutacje linii zarodkowej, które można wykorzystać do budowy technologii genetycznych w tym niedostatecznie zbadanym wektorze choroby.

Techniki mikroiniekcji zarodków w celu skutecznej mutagenezy specyficznej dla miejsca w Culex quinquefasciatus

Efektywność metody Improved Genome Editing za pomocą dostarczania kwasów nukleinowych w jajowódku (I-GONAD) jest porównywalna z tradycyjną mikroiniekcją, która wymaga pobrania zygot od samic dawców i przekazania ich do kobiet pseudo-ciężarnych. Protokół ten wykazuje swoją skuteczność, wprowadzając mutacje indukowane przez CRISPR/Cas9 do locus ROSA26 na chromosomie 6.

Ulepszona edycja genomu za pomocą techniki dostarczania kwasów nukleinowych jajowódkowych oparta na elektroporacji in vivo dla generowania myszy knockout

Ten artykuł demonstruje inżynierię genomu pośredniczoną przez CRISPR-Cas9 w Steinernema hermafroditum, nicieniu entomopatogenicznym (EPN: pasożytniczym owadziem) oraz rozwijającym się modelem genetycznym. Opisana technologia jest przydatna do tworzenia mutantów, umożliwiając wyjaśnienie funkcji genów w biologii nicieni, które są istotne dla symbiozy mutualistycznej i pasożytniczej.

Mutageneza oparta na CRISPR-Cas9 w nicieniu entomopatogenicznym Steinernema hermafroditum oraz utrzymanie linii mutantów

Poznaj metodę mikroiniekcji do generowania transgeników i nokautów u nicieni Strongyloides stercoralis i S. ratti. Ta technika umożliwia badanie rozwoju i mechanizmów pasożytnictwa tych organizmów.

Generowanie transgeników i nokautów u gatunków Strongyloides za pomocą mikroiniekcji

Przeglądaj więcej filmów