Generowanie transgeników i nokautów u gatunków Strongyloides za pomocą mikroiniekcji

Wykorzystanie mikroiniekcji do dostarczania konstruktów DNA do Strongyloides pozwala nam generować nokauty i transgeniki, które można wykorzystać do badania, jak te robaki się rozwijają, poruszają się w swoim środowisku i pasożytują na żywicielach. Jak dotąd jest to jedyna skuteczna technika generowania nokautów i transgeników u tych pasożytów. Dzień przed mikrowstrzyknięciem dodaj 180 mikrolitrów roztworu agarozy na szkiełko nakrywkowe za pomocą szklanej pipety Pasteura, a następnie natychmiast upuść drugie szkiełko nakrywkowe na wierzch, aby spłaszczyć agarozę w cienką podkładkę.

Po 5 do 10 sekundach usuń górną szkiełko nakrywkowe, rozsuwając je i określ, na którym slajdzie znajduje się podkładka agarowa, a następnie połóż ją stroną zadrukowaną do góry. Następnie wybierz mały kawałek szkła z pękniętego szkiełka nakrywkowego i za pomocą kleszczy delikatnie wciśnij go w agar w pobliżu górnej krawędzi podkładki. W dniu mikroiniekcji należy wyłożyć uchwyt Baermann, który jest sitkiem wykonanym z dwóch plastikowych pierścieni z dwiema warstwami nylonowej siatki tuile zabezpieczonej między nimi trzema zachodzącymi na siebie kawałkami tkanki laboratoryjnej.

Następnie dodaj mieszaninę kału i węgla drzewnego do uchwytu Baermann. Następnie umieść uchwyt Baermann z mieszaniną kału i węgla drzewnego w lejku, złóż kawałki tkanek wokół mieszanki kału i węgla drzewnego i dodaj tyle wody, aby zanurzyć większość węgla kałowego. Następnie przykryj lejek 15-centymetrową plastikową pokrywką na szalkę Petriego, aby zatrzymać zapach i oznacz lejek w razie potrzeby.

Po jednej do dwóch godzin przytrzymaj 50-mililitrową probówkę wirówkową pod gumową rurką na dnie lejka i ostrożnie otwórz zaciski na dole, aby dozować od 30 do 40 mililitrów wody zawierającej robaki do 50-mililitrowej probówki. Wtedy. przenieść 15 mililitrów wody Baermann zawierającej robaki do 15-mililitrowej probówki wirówkowej. Zakręć probówką, usuń do 13 mililitrów supernatantu i wyrzuć go do pojemnika na odpady płynne z jodem, aby zabić wszelkie robaki.

Po zebraniu wszystkich robaków sprawdź granulki robaków na dnie tuby. Jeśli nie widać żadnych robaków, odczekaj od jednej do dwóch godzin, a następnie zbierz więcej robaków z aparatu Baermanna. Przenieś robaki w jak najmniejszej ilości wody na sześciocentymetrową pożywkę dla 2% nicieni z trawnikiem E.coli HB101 i użyj tej płytki jako płytki źródłowej do mikroiniekcji.

Pod mikroskopem preparacyjnym przykryj odłamek szkła na szkiełku nakrywkowym z podkładką do mikroiniekcji olejem halowęglowym za pomocą standardowego platynowego kilofa. Następnie umieść szkiełko nakrywające podkładkę do mikroiniekcji na lunecie do mikroiniekcji i zlokalizuj odłamek szkła pokryty olejem. Wyrównaj odłamek szkła w taki sposób, aby krawędź była prostopadła do kierunku igły, aby służyła jako powierzchnia używana do łamania igły.

Następnie za pomocą mikroskopu preparacyjnego upewnij się, że igła nie ma pęcherzyków ani zanieczyszczeń w stożkowym trzonie, a następnie przymocuj igłę od 1 do 1,5 centymetra w uchwycie ciśnieniowym. Umieść końcówkę igły w środku mikroskopu pole widzenia na oko i w małym powiększeniu, umieść końcówkę igły w polu widzenia prostopadle do boku odłamka szkła. Następnie przełącz się na większe powiększenie i wyrównaj końcówkę igły z krawędzią szkła, blisko, ale jej nie dotykając.

Następnie, aby złamać końcówkę igły i umożliwić przepływ płynu, delikatnie postukaj igłą w bok kawałka szkła, jednocześnie wywierając ciągły nacisk gazu. Gdy ciecz zacznie płynąć, sprawdź kształt końcówki i upewnij się, że jest ostra z łatwo płynącą cieczą. Gdy płyn dobrze spływa z igły, przesuń szkiełko do mikroiniekcji do lunety sekcyjnej i dodaj jeden do dwóch mikrolitrów oleju halowęglowego na podkładkę agarową w celu umieszczenia robaków.

Przenieś od 20 do 30 młodych dorosłych Strongyloides na 2% pożywkę dla nicieni bez bakterii na co najmniej pięć minut, aby usunąć nadmiar bakterii powierzchniowych i wybrać pojedyncze robaki do mikrowstrzyknięcia. W razie potrzeby dodaj więcej robaków do płytki podczas wstrzykiwania. Używając niewielkiej ilości oleju halowęglowego na kilofie do robaków, wybierz młodą dorosłą samicę Strongyloides z jednym do czterech jaj w gonadzie z płytki bez bakterii i przenieś robaka do maleńkiej kropli oleju na podkładce agarowej.

Za pomocą wykałacza delikatnie ustaw robaka tak, aby nie był zwijany i gonada była widoczna i łatwo dostępna. Następnie umieść robaka w polu widzenia mikroskopu mikroiniekcyjnego, upewniając się, że gonada znajduje się po tej samej stronie co igła i jest ustawiona tak, aby igła stykała się z gonadą pod niewielkim kątem. Następnie przesuń końcówkę igły na bok robaka w tej samej płaszczyźnie ogniskowej.

Następnie, kierując się w stronę ramienia gonady w pobliżu środka robaka, delikatnie wbij igłę do gonady za pomocą mikrowstrzykiwacza. Natychmiast przyłóż nacisk na igłę, aby delikatnie wypełnić całe ramię gonady roztworem DNA. Po wstrzyknięciu wystarczającej ilości płynu należy wyjąć igłę i obserwować, czy rana się zamyka.

Powtórz procedurę z drugim ramieniem gonady, jeśli jest widoczne. Po zakończeniu wstrzykiwania należy szybko sprawdzić, czy igła nie jest zatkana, wywierając nacisk końcówką igły na podkładkę agarową, a następnie przenieść szkiełko z wstrzykniętym robakiem do mikroskopu preparacyjnego. Aby odzyskać wstrzykniętego robaka, najpierw umieść kilka kropli soli fizjologicznej buforowanej przez robaki na robaku, aby spłynąć z podkładki agarowej.

Następnie zbierz niewielką ilość bakterii na szpikulcu do robaków i dotknij robaka z przylegającymi bakteriami, aby usunąć go z płynu. Delikatnie przenieś robaka na płytkę regeneracyjną. W przypadku eksperymentów behawioralnych przenieś od 20 do 30 larw na 2% pożywkę wzrostową nicieni z grubym trawnikiem bakteryjnym HB101 i pod mikroskopem fluorescencyjnym zidentyfikuj larwy wyrażające interesujący nas transgen.

Następnie, za pomocą wykałaczki do robaków, wybierz transgeniczne larwy i umieść je w małym szkiełku zegarkowym z solą fizjologiczną buforowaną przez robaki. W przypadku mikroskopii, za pomocą żyletki, naciąć siatkę na plastikowym spodzie 10-centymetrowej płytki chemotaksji, aby łatwo śledzić położenie robaków na płytce. Następnie dodaj trzy mikrolitry larw w soli fizjologicznej buforowanej przez robaki do kwadratu na siatce, wypełniając tyle kwadratów, ile potrzeba.

Następnie dodaj 15 do 20 mikrolitrów kropli 1% nikotyny w wodzie do kropli robaków. Po czterech minutach, gdy robaki są sparaliżowane, przebadaj je za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu preparacyjnego. Pokazano tutaj transgeniczne larwy Strongyloides stercolaris z niekompletnym i kompletnym wzorcem ekspresji act-2 mRFPmars.

Niejednolita ekspresja w mięśniu ściany ciała jest bardziej powszechna, gdy transgen nie jest zintegrowany z genomem. W przeciwieństwie do tego, spójna ekspresja w całym mięśniu ściany ciała często wskazuje, że transgen zintegrował się z genomem. Kluczowym krokiem jest ustawienie igły w tej samej płaszczyźnie ostrości co gonada, aby upewnić się, że DNA zostanie wstrzyknięte do gonady i zostanie włączone do rozwijających się komórek jajowych.

Opracowanie tej techniki umożliwiło zbadanie funkcji genów u pasożytniczych nicieni, co dostarcza nowych informacji na temat mechanizmów pasożytnictwa i interakcji gospodarz-pasożyt.