Name: Charakterystyka połączeń nerwowo-mięśniowych u myszy za pomocą połączonej mikroskopii konfokalnej i superrozdzielczej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: Poznaj metodę analizy morfometrycznej połączeń nerwowo-mięśniowych u myszy przy użyciu połączonej mikroskopii konfokalnej i STED. Protokół umożliwia ilościową ocenę zmian patologicznych w modelach SMA i CMS.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy "Centralnemu Ośrodku Obrazowania i Cytometrii" firmy Genethon, a także służbie histologicznej, które są częściowo wspierane przez fundusze sprzętowe z Regionu Ile-de-France, Conseil General de l'Essonne, Genopole Recherche z Evry, Uniwersytetu Evry Val d'Essonne i INSERM we Francji. Jesteśmy również wdzięczni dr Rashmi Kothary za dostarczenie linii myszy Smn2B/2B (University of Ottawa, Kanada) oraz dr Ericowi Krejci za linię myszy ColQDex2/+ (niepublikowanej, Uniwersytet Paryski, Francja). Dziękujemy Guillaume'owi Corre za jego wsparcie w analizie statystycznej. Przeciwciała monoklonalne 2H3 (opracowane przez Jessel, TM i Dodd, J.) i SV2 (opracowane przez Buckley, KM) uzyskano z Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB), utworzonego przez NICHD NIH i utrzymywanego na Uniwersytecie Iowa, Wydział Biologii, Iowa City, IA 52242. Prace te były wspierane przez Association Française contre les Myopathies (AFM-Telethon), INSERM i Uniwersytet w Evry Val d'Essonne.

<ol><li>Slater, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+maturation+of+nerve-muscle+junctions+in+hindlimb+muscles+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Postnatal maturation of nerve-muscle junctions in hindlimb muscles of the mouse.</a> Developmental Biology. 94 (1), 11-22 (1982).</li>
<li>Jones, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMJ-morph+reveals+principal+components+of+synaptic+morphology+influencing+structure-function+relationships+at+the+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biology%22%5BJournal%5D)">NMJ-morph reveals principal components of synaptic morphology influencing structure-function relationships at the neuromuscular junction.</a> Open Biology. 6 (12), (2016).</li>
<li>Willadt, S., Nash, M., Slater, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+changes+in+the+structure+and+function+of+mammalian+neuromuscular+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Age-related changes in the structure and function of mammalian neuromuscular junctions.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1412, 41-53 (2018).</li>
<li>Boehm, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+anatomy+of+the+mammalian+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Comparative anatomy of the mammalian neuromuscular junction.</a> Journal of Anatomy. 237 (5), 827-836 (2020).</li>
<li>Nishimune, H., Shigemoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+anatomy+of+the+neuromuscular+junction+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurologic+Clinics%22%5BJournal%5D)">Practical anatomy of the neuromuscular junction in health and disease.</a> Neurologic Clinics. 36 (2), 231-240 (2018).</li>
<li>Moloney, E. B., de Winter, F., Verhaagen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALS+as+a+distal+axonopathy%3A+molecular+mechanisms+affecting+neuromuscular+junction+stability+in+the+presymptomatic+stages+of+the+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">ALS as a distal axonopathy: molecular mechanisms affecting neuromuscular junction stability in the presymptomatic stages of the disease.</a> Frontiers in Neuroscience. 8, (2014).</li>
<li>Lovering, R. M., Iyer, S. R., Edwards, B., Davies, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+of+neuromuscular+junctions+in+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Alterations of neuromuscular junctions in Duchenne muscular dystrophy.</a> Neuroscience Letters. 737, 135304(2020).</li>
<li>Koneczny, I., Herbst, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myasthenia+Gravis%3A+Pathogenic+effects+of+autoantibodies+on+neuromuscular+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Myasthenia Gravis: Pathogenic effects of autoantibodies on neuromuscular architecture.</a> Cells. 8 (7), 671(2019).</li>
<li>Dowling, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myotubular+myopathy+and+the+neuromuscular+junction%3A+a+novel+therapeutic+approach+from+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Models+%26+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">Myotubular myopathy and the neuromuscular junction: a novel therapeutic approach from mouse models.</a> Disease Models & Mechanisms. 5 (6), 852-859 (2012).</li>
<li>Gibbs, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuromuscular+junction+abnormalities+in+DNM2-related+centronuclear+myopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Neuromuscular junction abnormalities in DNM2-related centronuclear myopathy.</a> Journal of Molecular Medicine. 91 (6), 727-737 (2013).</li>
<li>Swoboda, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+history+of+denervation+in+SMA%3A+Relation+to+age%2C+SMN2+copy+number%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Natural history of denervation in SMA: Relation to age, SMN2 copy number, and function.</a> Annals of Neurology. 57 (5), 704-712 (2005).</li>
<li>Rodríguez Cruz, P. M., Palace, J., Beeson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neuromuscular+junction+and+wide+heterogeneity+of+congenital+myasthenic+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">The neuromuscular junction and wide heterogeneity of congenital myasthenic syndromes.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), 1677(2018).</li>
<li>Tse, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neuromuscular+junction%3A+Measuring+synapse+size%2C+fragmentation+and+changes+in+synaptic+protein+density+using+confocal+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">The neuromuscular junction: Measuring synapse size, fragmentation and changes in synaptic protein density using confocal fluorescence microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (94), e52220(2014).</li>
<li>Mejia Maza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMJ-Analyser+identifies+subtle+early+changes+in+mouse+models+of+neuromuscular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">NMJ-Analyser identifies subtle early changes in mouse models of neuromuscular disease.</a> Scientific Reports. 11 (1), 12251(2021).</li>
<li>Minty, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((aNMJ-morph%3A+a+simple+macro+for+rapid+analysis+of+neuromuscular+junction+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Royal+Society+Open+Science%22%5BJournal%5D)">aNMJ-morph: a simple macro for rapid analysis of neuromuscular junction morphology.</a> Royal Society Open Science. 7 (4), 200128(2020).</li>
<li>Modla, S., Mendonca, J., Czymmek, K. J., Akins, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+neuromuscular+junctions+by+correlative+confocal+and+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Identification of neuromuscular junctions by correlative confocal and transmission electron microscopy.</a> Journal of Neuroscience Methods. 191 (2), 158-165 (2010).</li>
<li>Kittel, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bruchpilot+promotes+active+zone+assembly%2C+Ca2%2B+channel+clustering%2C+and+vesicle+release%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bruchpilot promotes active zone assembly, Ca2+ channel clustering, and vesicle release.</a> Science. 312 (5776), 1051-1054 (2006).</li>
<li>York, A. L., Zheng, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+microscopy+reveals+a+nanoscale+organization+of+acetylcholine+receptors+for+trans-synaptic+alignment+at+neuromuscular+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Super-resolution microscopy reveals a nanoscale organization of acetylcholine receptors for trans-synaptic alignment at neuromuscular synapses.</a> eNeuro. 4 (4), (2017).</li>
<li>Bowerman, M., Murray, L. M., Beauvais, A., Pinheiro, B., Kothary, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+smn+threshold+in+mice+dictates+onset+of+an+intermediate+spinal+muscular+atrophy+phenotype+associated+with+a+distinct+neuromuscular+junction+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscular+Disorders%22%5BJournal%5D)">A critical smn threshold in mice dictates onset of an intermediate spinal muscular atrophy phenotype associated with a distinct neuromuscular junction pathology.</a> Neuromuscular Disorders. 22 (3), 263-276 (2012).</li>
<li>Feng, G., Krejci, E., Molgo, J., Cunningham, J. M., Massoulié, J., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+collagen+Q%3A+Roles+in+acetylcholinesterase+and+butyrylcholinesterase+assembly+and+in+synaptic+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of collagen Q: Roles in acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase assembly and in synaptic structure and function.</a> Journal of Cell Biology. 144 (6), 1349-1360 (1999).</li>
<li>Sigoillot, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuromuscular+junction+immaturity+and+muscle+atrophy+are+hallmarks+of+the+ColQ-deficient+mouse%2C+a+model+of+congenital+myasthenic+syndrome+with+acetylcholinesterase+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Neuromuscular junction immaturity and muscle atrophy are hallmarks of the ColQ-deficient mouse, a model of congenital myasthenic syndrome with acetylcholinesterase deficiency.</a> The FASEB Journal. 30 (6), 2382-2399 (2016).</li>
<li>Vanhaesebrouck, A. E., Beeson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+congenital+myasthenic+syndromes%3A+expanding+genetic+and+phenotypic+spectrums+and+refining+treatment+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurology%22%5BJournal%5D)">The congenital myasthenic syndromes: expanding genetic and phenotypic spectrums and refining treatment strategies.</a> Current Opinion in Neurology. 32 (5), 696-703 (2019).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>ImageJ. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://imagej.nih.gov/ij">http://imagej.nih.gov/ij</a> (2021).</li>
<li>Linkert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metadata+matters%3A+access+to+image+data+in+the+real+world%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Metadata matters: access to image data in the real world.</a> Journal of Cell Biology. 189 (5), 777-782 (2010).</li>
<li>Bio-Formats. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.openmicroscopy.org/bio-formats/downloads/">http://www.openmicroscopy.org/bio-formats/downloads/</a> (2021).</li>
<li>Legland, D., Beaugrand, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+clustering+of+lignocellulosic+fibres+based+on+morphometric+features+and+using+clustering+of+variables%5BTitle%5D)+AND+%22Industrial+Crops+and+Products%22%5BJournal%5D)">Automated clustering of lignocellulosic fibres based on morphometric features and using clustering of variables.</a> Industrial Crops and Products. 45, Supplement C 253-261 (2013).</li>
<li>ImageJ documentation. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://imagejdocu.tudor.lu/plugin/analysis/geodesic_distances/start">http://imagejdocu.tudor.lu/plugin/analysis/geodesic_distances/start</a> (2021).</li>
<li>GitHUb. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://github.com/Genethon/ImCy">https://github.com/Genethon/ImCy</a> (2021).</li>
<li>Otsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Threshold+selection+method+from+gray-level+histograms%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Systems%2C+Man%2C+and+Cybernetics%22%5BJournal%5D)">A Threshold selection method from gray-level histograms.</a> IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 9 (1), 62-66 (1979).</li>
<li>Sanes, J. R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction%2C+assembly%2C+maturation+and+maintenance+of+a+postsynaptic+apparatus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Induction, assembly, maturation and maintenance of a postsynaptic apparatus.</a> Nature Reviews Neuroscience. 2 (11), 791-805 (2001).</li>
<li>Kong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+synaptic+vesicle+release+and+immaturity+of+neuromuscular+junctions+in+spinal+muscular+atrophy+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Impaired synaptic vesicle release and immaturity of neuromuscular junctions in spinal muscular atrophy mice.</a> The Journal of Neuroscience. 29 (3), 842-851 (2009).</li>
<li>Cifuentes-Diaz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurofilament+accumulation+at+the+motor+endplate+and+lack+of+axonal+sprouting+in+a+spinal+muscular+atrophy+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Neurofilament accumulation at the motor endplate and lack of axonal sprouting in a spinal muscular atrophy mouse model.</a> Human Molecular Genetics. 11 (12), 1439-1447 (2002).</li>
<li>Murray, L. M., Comley, L. H., Thomson, D., Parkinson, N., Talbot, K., Gillingwater, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+vulnerability+of+motor+neurons+and+dissociation+of+pre-+and+post-synaptic+pathology+at+the+neuromuscular+junction+in+mouse+models+of+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Selective vulnerability of motor neurons and dissociation of pre- and post-synaptic pathology at the neuromuscular junction in mouse models of spinal muscular atrophy.</a> Human Molecular Genetics. 17 (7), 949-962 (2008).</li>
<li>Boyer, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myogenic+program+dysregulation+is+contributory+to+disease+pathogenesis+in+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Myogenic program dysregulation is contributory to disease pathogenesis in spinal muscular atrophy.</a> Human Molecular Genetics. 23 (16), 4249-4259 (2014).</li>
<li>Ling, K. K. Y., Gibbs, R. M., Feng, Z., Ko, C. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severe+neuromuscular+denervation+of+clinically+relevant+muscles+in+a+mouse+model+of+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Severe neuromuscular denervation of clinically relevant muscles in a mouse model of spinal muscular atrophy.</a> Human Molecular Genetics. 21 (1), 185-195 (2012).</li>
<li>Murray, L., Gillingwater, T. H., Kothary, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+the+transversus+abdominis+muscle+for+whole-mount+neuromuscular+junction+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Dissection of the transversus abdominis muscle for whole-mount neuromuscular junction analysis.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (83), e51162(2014).</li>
<li>Baker, J. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBaker%2C+JR+%22Principles+of+biological+microtechnique%3B+a+study+of+fixation+and+dyeing%22">Principles of biological microtechnique; a study of fixation and dyeing</a>. , Wiley. London Methuen; New York. at http://archive.org/details/principlesofbiol01bake (1958).</li>
<li>Vicidomini, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STED+Nanoscopy+with+time-gated+detection%3A+Theoretical+and+experimental+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">STED Nanoscopy with time-gated detection: Theoretical and experimental aspects.</a> PLoS ONE. 8 (1), 054421(2013).</li>
<li>Badawi, Y., Nishimune, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+microscopy+for+analyzing+neuromuscular+junctions+and+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Super-resolution microscopy for analyzing neuromuscular junctions and synapses.</a> Neuroscience Letters. 715, 134644(2020).</li>
<li>Thomson, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+characteristics+of+motor+neurons+do+not+determine+their+relative+susceptibility+to+degeneration+in+a+mouse+model+of+severe+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Morphological characteristics of motor neurons do not determine their relative susceptibility to degeneration in a mouse model of severe spinal muscular atrophy.</a> PLoS ONE. 7 (12), 052605(2012).</li>
<li>McMacken, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salbutamol+modifies+the+neuromuscular+junction+in+a+mouse+model+of+ColQ+myasthenic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Salbutamol modifies the neuromuscular junction in a mouse model of ColQ myasthenic syndrome.</a> Human Molecular Genetics. 28 (14), 2339-2351 (2019).</li>
</ol>

Autorzy deklarują, że nie ma konfliktu interesów związanego z tą pracą.

Opisany protokół wideo zapewnia szczegółową metodę ilościowego określania struktury 3D połączeń nerwowo-mięśniowych poprzez połączenie mikroskopii konfokalnej i STED, które można wykorzystać do scharakteryzowania zmian patologicznych na poziomie pre- i postsynaptycznym. Wysoka rozdzielczość mikroskopii STED umożliwia wizualizację i analizę morfometryczną nanostruktur, których nie można zidentyfikować za pomocą konwencjonalnego obrazowania konfokalnego. Procedura ta umożliwiła nam zmierzenie zmian strukturalnych NMJ w dwóch mięśniach wyrostka robaczkowego, piszczelowym przednim i brzuchatym łydki, myszy CMS związanych z SMA i ColQ.
Aby uzyskać wiarygodne wyniki za pomocą tej techniki, bardzo ważne jest, aby prawidłowo rozciąć i drażnić mięśnie, zwracając szczególną uwagę na powięź otaczającą mięsień i siłę przyłożoną do oddzielenia wiązek mięśniowych; w przeciwnym razie wzorzec unerwienia może zostać zakłócony, utrudniając prawidłową ocenę presynaptycznego NMJ. Chociaż szczegółowe informacje są dostarczane do analizy NMJ z TA i GA, w zasadzie protokół ten można dostosować do innych mięśni, w tym mięśni płaskich, takich jak przepona lub poprzeczny brzuch37, które nie wymagają kroku drażnienia. Utrwalenie tkanek ma również kluczowe znaczenie dla zapewnienia dobrej jakości barwienia; dlatego zaleca się stosowanie wysokiej jakości PFA w odpowiedniej objętości (15-20 razy większej niż w mięśniu). Ponadto czas ekspozycji na utrwalacz jest ważnym krokiem, ponieważ artefakty, takie jak kurczenie się i zbrylanie, mogą pojawić się z powodu nadmiernej fiksacji i wpływać na cechy NMJ. Biorąc pod uwagę wielkość próbek i szybkość penetracji roztworu paraformaldehydu w tkankach38, dla tego typu mięśni zaleca się czas utrwalenia 18-24 godzin. W przypadku, gdy etap barwienia jest planowany później niż tydzień po pobraniu tkanek, sugeruje się utrzymywanie mięśni utrwalonych PFA w PBS uzupełnionych azydkiem sodu w temperaturze 4 °C, aby zapobiec namnażaniu się bakterii.
Protokół ten przedstawia podejście wykorzystujące α-BTX-F488 do obrazowania konfokalnego i α-BTX-F633 do obrazowania STED. Fluorofory te zostały dobrane tak, aby pasowały do opisanego projektu eksperymentalnego, ale mogą być modyfikowane w zależności od dostępnego sprzętu i materiałów. Na przykład etykietowanie α-BTX F488 można wybrać w przypadku korzystania z lasera STED CW 592 nm do akwizycji obrazu i kwantyfikacji. Wydaje się jednak, że konfiguracja, która została zastosowana w niniejszym badaniu (wzbudzenie impulsowe bramkowane STED, zubożenie 775 nm) wykazuje wyższą wydajność i lepszą rozdzielczość niż inne podejścia, takie jak STED39 z falą ciągłą, co czyni ją bardziej odpowiednią do obecnego zastosowania. Ważne jest również, aby starannie dobrać ustawienia mocy lasera, zwłaszcza dla STED (zarówno wzbudzenia, jak i zubożenia), ponieważ charakterystyka profilu intensywności nie może być zmierzona w przypadku nasycenia, a zatem każdy nasycony sygnał na obrazie NMJ może zagrozić całej analizie.
Ten szczegółowy przepływ pracy, w tym akwizycja i analiza obrazu przy użyciu oprogramowania mikroskopowego i makr ImageJ, został opracowany w celu ułatwienia autonomicznej analizy morfometrycznej NMJ za pomocą mikroskopii konfokalnej i STED z pojedynczego mięśnia. Wcześniej opisane przepływy pracy dla analizy konfokalnej NMJ, takie jak NMJ-morph2 lub NMJ-Analyser14, utorowały drogę do zaprojektowania półautomatycznych metod, które ułatwiają analizę morfologiczną NMJ i badania porównawcze. NMJ-morph (i jego zaktualizowana wersja aNMJ-morph15) to darmowa platforma oparta na ImageJ, która wykorzystuje projekcję maksymalnej intensywności do pomiaru 21 cech morfologicznych, a NMJ-Analyser wykorzystuje skrypt opracowany w Pythonie, który generuje 29 istotnych parametrów z całej struktury 3D NMJ. Ręczne progowanie jest jedynym krokiem podczas przetwarzania obrazu w tych dwóch metodach, który wymaga analizy użytkownika. Ten zintegrowany protokół szczegółowo opisuje etapy przygotowania tkanki, akwizycji obrazów konfokalnych 3D i przetwarzania NMJ z całych mięśni szkieletowych w oparciu o ImageJ i zapewnia uproszczony przegląd pięciu ważnych parametrów postsynaptycznych (objętość, maksymalny obszar projekcji i krętość) i presynaptycznych (zajętość końców aksonów i akumulacja neurofilamentów). Dodatkowy parametr o znaczeniu biologicznym, wzorzec organizacji AChR postsynaptycznych fałdów połączeniowych, został włączony do analizy morfometrycznej na poziomie nanoskali za pomocą superrozdzielczej mikroskopii STED (rozdzielczość 20-30 nm)40. Co ciekawe, przygotowanie tkanek do obrazowania STED jest prostsze niż inne metody stosowane w badaniach ultrastrukturalnych NMJ, takie jak konwencjonalna transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM)9, która jest dość złożoną i czasochłonną procedurą, która wymaga wykwalifikowanego manipulatora w celu uzyskania ultracienkich odcinków odpowiedniego obszaru mięśniowego. Ponadto dane ilościowe z wielu zagięć złączy można uzyskać automatycznie za pomocą oprogramowania powiązanego z STED.
Protokół ten został zastosowany w celu zilustrowania wcześniej znanych defektów NMJ w mięśniach z niedoborem SMN i ColQ 20,36,41,42. Wspólne zmiany stwierdzono w dwóch modelach mysich za pomocą mikroskopii konfokalnej, takie jak zmniejszona objętość postsynaptycznej płytki końcowej, obszar MIP i względna krętość oraz zwiększona akumulacja neurofilamentów, podczas gdy niektóre bardziej szczegółowe wyniki (zmniejszone zajętość NMJ) zaobserwowano tylko u myszy SMA, jako wskaźnik upośledzonego transportu pęcherzyków36. Wreszcie, wzrost odległości i szerokości pasków AChR wykryto w ColQ-KO za pomocą analizy STED, które są oznakami defektów ultrastrukturalnych w postsynaptycznych fałdach połączeniowych, jak wcześniej zaobserwowano w TEM20. Co ważne, protokół ten może pomóc w bardziej dogłębnej charakterystyce morfologicznej połączeń nerwowo-mięśniowych podczas rozwoju, utrzymania i w różnych stanach patologicznych.

Połączenie nerwowo-mięśniowe (NMJ) to złożona struktura składająca się z zakończenia aksonu ruchowego, perisynaptycznej komórki Schwanna i części szkieletu włókna mięśniowego zaangażowanej w przekazywanie informacji chemicznej i sprzężenie aktywności dolnego neuronu ruchowego ze skurczem mięśni. U ssaków morfologia połączenia nerwowo-mięśniowego zmienia się podczas rozwoju, przyjmując typowy kształt podobny do precla po osiągnięciu dojrzałości, z różnicami w kształcie i złożoności między gatunkami, i wykazuje pewien stopień plastyczności w odpowiedzi na procesy fizjologiczne, takie jak ćwiczenia lub starzenie się1,2,3,4. Postsynaptyczna płytka końcowa silnika tworzy wgłębienia błonowe zwane fałdami połączeniowymi, gdzie górna część zawierająca receptory acetylocholiny (AChR) jest w bliskim kontakcie z presynaptyczną końcową gałęzią aksonu5.
Zmiany morfologiczne i funkcjonalne w połączeniach nerwowo-mięśniowych przyczyniają się do patofizjologii wielu zaburzeń neurodegeneracyjnych, takich jak rdzeniowy zanik mięśni (SMA) i stwardnienie zanikowe boczne (ALS), miopatie takie jak dystrofia mięśniowa Duchenne'a (DMD), wrodzone zespoły miasteniczne (CMS), miastenia (MG) i miopatie centronuklearne (CNM) oraz sarkopenia związana ze starzeniem się3,6,7,8,9,10,11,12. W tych chorobach obserwuje się zmiany strukturalne NMJ, takie jak fragmentacja płytki końcowej, zmniejszony rozmiar postsynaptycznego fałdu połączeniowego i/lub odnerwienie. Patologia NMJ może być pierwotnym lub wczesnym zdarzeniem podczas progresji choroby lub pojawić się ostatnio jako zdarzenie wtórne przyczyniające się do objawów klinicznych. W każdym razie monitorowanie morfologii NMJ w modelach zwierzęcych tych chorób stanowi cenny parametr do badania zmian patologicznych i oceny skuteczności potencjalnych metod leczenia.
Morfologia połączeń nerwowo-mięśniowych jest zazwyczaj analizowana za pomocą technik wykorzystujących mikroskopię konfokalną2,13,14,15 lub mikroskopia elektronowa5,16, z ich nieodłącznymi ograniczeniami, takimi jak rozdzielczość lub trudności techniczne. Ostatnio mikroskopia superrozdzielcza została również wykorzystana do wizualizacji poszczególnych regionów NMJ, takich jak presynaptyczne strefy aktywne lub rozkład AChR na błonie postsynaptycznej16,17,18, jako alternatywne lub uzupełniające podejście do analizy ultrastrukturalnej za pomocą mikroskopii elektronowej.
Ten protokół ma na celu dostarczenie szczegółowej i powtarzalnej metody oceny parametrów morfologicznych NMJ poprzez połączenie fluorescencji konfokalnej i mikroskopii STED (Stimulated emission depletion). Ważne cechy presynaptycznych i postsynaptycznych płytek końcowych, takie jak objętość, obszar, względna krętość, szerokość paska AChR i dystrybucja końców aksonów w unerwionych drażnionych włóknach mięśniowych mięśnia brzuchatego łydki myszy i piszczela przedniego, określono ilościowo w kontekście normalnych i chorobowych stanów. W szczególności defekty NMJ zostały zilustrowane w mysim modelu rdzeniowego zaniku mięśni Smn2B/-, choroby nerwowo-mięśniowej ze zwyrodnieniem neuronu ruchowego spowodowanym mutacjami w genie SMN1<klasa sup="xref">11,19, oraz w podjednostce ogonowej podobnej do kolagenu myszy z asymetrycznym nokautem acetylocholinoesterazy (ColQDex2/Dex2 lub ColQ-KO), jako model wrodzonego zespołu miastenicznego20,21,22.

<table><tbody><tr><td>Buffers and Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 kozia anty-mysia IgG (F488)</td><td>Life Technologies, Thermofisher</td><td>A-11001</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 &alpha;-bungarotoxin (F488-a-BTX)</td><td>Life Technologies, Thermofisher</td><td>B13422</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 kozia anty-mysia IgG (F594)</td><td>Life Technologies, Thermofisher</td><td>A-11032</td><td></td></tr><tr><td>ATTO-633 &alpha;-bungarotoksyna (F633-a-BTX)</td><td>Alomone Labs</td><td>B-100-FR</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>DAPI Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>00-4959-52</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco, Invitrogen</td><td>14190-169</td><td></td></tr><tr><td>Absolutny etanol VWR</td><td></td><td>20821.296</td><td></td></tr><tr><td>Olejek immersyjny, n = 1.518</td><td>THORLABS</td><td>MOIL-10LF&nbsp;</td><td>Niska autofluorescencja</td></tr><tr><td>Przeciwciało neurofilamentowe (NF-M)&nbsp;</td><td>DSHB</td><td>AB_531793</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td><td>MERCK</td><td>1.04005</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwko glikoproteinie pęcherzyków synaptycznych 2 (SV2)</td><td>DSHB</td><td>AB_2315387</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Materiały</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alnico Magnesy cylindryczne</td><td>Farnell France</td><td>E822</td><td>średnica 19,1 mm przy maksymalnym uciągu 1,9 Kg</td></tr><tr><td>63x 1,4 NA magnitudo olejek immersyjny&nbsp; HCX Plan Apo CS obiektyw</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100x 1.4 NA HC PL APPO CS2 Obiektyw</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zakrzywione cienkie kleszcze-Kleszczyki do tęczówki Moria</td><td>Fine Science Tools</td><td>11370-31</td><td></td></tr><tr><td>Ekstra cienkie nożyczki - Vannas-T&uuml; Bingen Nożyczki sprężynowe</td><td>Fine Science Tools</td><td>15-003-08</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze drobno ząbkowane</td><td>Euronexia</td><td>P-95-AA</td><td></td></tr><tr><td>Końcówka ładująca żel okrągła 1-200 i mikro; L</td><td>COSTAR</td><td>4853</td><td></td></tr><tr><td>Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny Leica TCS SP8</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny TCS SP8 bramkowany STED 775 nm</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chusteczka do czyszczenia soczewek&nbsp;</td><td>Whatman (GE Healthcare)</td><td>2105-841</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze średnio ząbkowane</td><td>Euronexia</td><td>P-95-AB</td><td></td></tr><tr><td>Okulary nakrywkowe do mikroskopu 24x50 nm Nr 1,5H 170&plusmn; 5 & mikro; m</td><td>Marienfield</td><td>107222</td><td>Precyzyjna</td></tr><tr><td>powierzchnia delta Nunclon (płytki 12-dołkowe)</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>150628</tr><tr><td>Powierzchnia delta nunclon (płytki 24-dołkowe)</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>142475</tr><tr><td>Skalpel Safeshield</td><td>Feather</td><td>02.001.40.023</td><td></td></tr><tr><td>Ostro-nożyczki - drobne Nożyczki - martenzytyczne Stal nierdzewna</td><td>Fine Science Tools</td><td>14094-11</td><td></td></tr><tr><td>Prowadnice Superfrost plus</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad&nbsp;</td><td>Prism, San Diego (US)</td><td>Wydanie N&deg; 6.07</td><td>Oprogramowanie statystyczne</td></tr><tr><td>Oprogramowanie ImageJ</td><td>National Institutes of Health</td><td>Release N&deg; 1.53f</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Leica Application Suite X</td> Wydanie <td>Leica Microsystems</td><td>N&deg; 3.7.2.2283</td><td>Darmowe oprogramowanie mikroskopowe dostępne na https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/downloads/&nbsp;</td></tr></tbody></table>

charakterystyka połączeń nerwowo-mięśniowych u myszy za pomocą połączonej mikroskopii konfokalnej i superrozdzielczej

Characterization of Neuromuscular Junctions in Mice by Combined Confocal and Super-Resolution Microscopy

Połączenia nerwowo-mięśniowe (NMJ) to wysoce wyspecjalizowane synapsy między dolnymi neuronami ruchowymi a włóknami mięśni szkieletowych, które odgrywają istotną rolę w przekazywaniu cząsteczek z układu nerwowego do mięśni dobrowolnych, prowadząc do skurczu. Są one dotknięte wieloma chorobami ludzkimi, w tym dziedzicznymi zaburzeniami nerwowo-mięśniowymi, takimi jak dystrofia mięśniowa Duchenne'a (DMD), wrodzone zespoły miasteniczne (CMS), rdzeniowy zanik mięśni (SMA) i stwardnienie zanikowe boczne (ALS). Dlatego monitorowanie morfologii połączeń nerwowo-mięśniowych i ich zmian w mysich modelach choroby stanowi cenne narzędzie do badań patologicznych i przedklinicznej oceny podejść terapeutycznych. W tym miejscu opisano metody znakowania i analizy trójwymiarowej (3D) morfologii pre- i postsynaptycznych części motorycznych płytek końcowych z mysich drażnionych włókien mięśniowych. Szczegółowo opisano procedury przygotowywania próbek i pomiaru objętości NMJ, powierzchni, krętości i morfologii/zajętości końcówek aksonów za pomocą obrazowania konfokalnego oraz odległości między postsynaptykalnymi fałdami połączeniowymi a szerokością pasma receptora acetylocholiny (AChR) za pomocą mikroskopii STED (Authorized emission depletion) o wysokiej rozdzielczości. Zmiany w tych parametrach NMJ są zilustrowane u zmutowanych myszy dotkniętych SMA i CMS.

W celu umożliwienia reprodukowalnej analizy morfologicznej złączy nerwowo-mięśniowych na poziomie presynaptycznym i postsynaptycznym opracowano schemat postępowania obejmujący etapy od pobrania mięśni po obrazowanie i kwantyfikację z wykorzystaniem oprogramowania mikroskopowego oraz niestandardowych makr programu ImageJ (Rysunek 1). Aby zilustrować użyteczność niniejszego protokołu, oceniono morfologię złączy nerwowo-mięśniowych u dwóch mysich modeli zaburzeń genetycznych: myszy Smn2B/- oraz ColQDex2/Dex2, dotkniętych odpowiednio rdzeniowym zanikiem mięśni (SMA) oraz postacią wrodzonego zespołu miastenicznego (CMS), a następnie porównano uzyskane dane z grup kontrolnych miotów w tym samym wieku.
Strukturę NMJ oceniano odpowiednio w mięśniach tibialis anterior oraz gastrocnemius 3- i 6-tygodniowych myszy Smn2B/- (tło C57Bl/6) i ColQDex2/Dex2 (tło B6D2F1/J), w czasie gdy u tych zwierząt występowały już objawy choroby. W 3. tygodniu życia myszy Smn2B/- wykazują oznaki opóźnionego rozwoju mięśni szkieletowych i denerwacji, takie jak zanik i utrata NMJ35,36. Myszy CMS mają pierwotną patologię w obrębie NMJ i wykazują spadek masy ciała od pierwszego tygodnia życia oraz wyraźne osłabienie mięśni20 (dane niepokazane). Jak pokazano na Rysunku 2A, w badaniu mikroskopii konfokalnej postsynaptyczna płytka końcowa motoryczna znakowana fluorescencyjną α-bungarotoksyną wydawała się mniejsza i/lub pofragmentowana u mutantów obu linii myszy. Kwantyfikacja stosów Z (Z-stacks) NMJ przy użyciu spersonalizowanych makr ImageJ ujawniła znaczne zmniejszenie objętości płytki końcowej, maksymalnej projekcji intensywności (MIP) oraz względnej krętości u myszy z SMA i CMS w porównaniu z grupą kontrolną, co stanowi oznaki wad dojrzewania NMJ32 (Rysunek 2B-D). Objętość postsynaptycznej płytki końcowej oraz MIP były zmniejszone u chorych zwierząt (zmiana krotności wyniosła 2,7 i 2,0 dla objętości oraz 2,5 i 2,0 dla MIP odpowiednio u myszy Smn2B/- i ColQDex2/Dex2). Względna krętość była również mniejsza w mięśniach z niedoborem SMN i ColQ niż u myszy WT (16,97% ± 1,33% w SMA versus 48,84% ± 5,90% u myszy WT oraz 13,29% ± 2,79% w CMS versus 30,20% ± 4,44% u myszy kontrolnych). Ponadto kwantyfikacja rozkładu presynaptycznych odgałęzień zakończeń aksonalnych z użyciem spersonalizowanego makra ImageJ ujawniła zmieniony wzorzec rozkładu neurofilamentu M w obu modelach zwierzęcych, z zwiększonym immunoznakowaniem (84,65% ± 0,32% versus 16,57% ± 2,03% oraz 23,64% ± 2,78% versus 18,77% ± 1,73% odpowiednio u myszy Smn2B/- i ColQDex2/Dex2 w porównaniu z grupami kontrolnymi) (Rysunek 3A-D). W barwieniu SV2 u myszy Smn2B/- zaobserwowano również 43% redukcję współczynnika zajętości, tj. procenta obszarów zawierających AChR z sąsiadującymi aktywnymi strefami zakończeń nerwowych (49,36% ± 3,76% w SMA versus 85,69% ± 2,34% u myszy WT) (Rysunek 3E,F). Ten parametr NMJ obliczono również w GA mutantów ColQDex2/Dex2, jednak nie stwierdzono statystycznie istotnej różnicy w porównaniu z kontrolnymi rodzeństwem z jednego miotu (dane niepokazane).
Dalsze analizy charakterystyki błony postsynaptycznej przeprowadzono poprzez ilościowe określenie odległości między fałdami synaptycznymi oraz szerokości pasm AChR, znajdujących się na szczytach tych fałdów, w mięśniach z niedoborem ColQ, wykorzystując mikroskopię superrozdzielczą z wygaszaniem emisji stymulowanej (STED). Jak pokazano na Ryc. 4, wygląd tych struktur można wyraźnie zwizualizować za pomocą fluorescencyjnego znakowania α-bungarotoksyną oraz analizy profilu intensywności. Oceńiono te parametry NMJ i stwierdzono zwiększenie odległości między fałdami synaptycznymi (d) oraz szerokości (w) pasm AChR w mięśniu brzuchatym (gastrocnemius) mutantów (odpowiednio 358,3 nm ± 11,97 nm i 320,8 nm ± 10,90 nm dla odległości oraz 216,9 nm ± 10,51 nm i 186,3 nm ± 7,015 nm dla szerokości u myszy ColQDex2/Dex2 w porównaniu z myszami typu dzikiego, p &lt; 0,05) (Ryc. 4C,D).
<img alt="Analiza włókien mięśniowych STED; schemat; immunoznakowanie, stos konfokalny, intensywność NMJ, równanie krętości." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63032/63032fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schemat protokołu wideo dla 3D wielkoskalowej charakterystyki NMJ za pomocą mikroskopii konfokalnej i STED. Tibialis anterior (TA) i mięśnie gastrocnemius (GA) pobrano od myszy, a włókna mięśniowe rozdzielono przed znakowaniem α-bungarotoksyną-F488 lub α-bungarotoksyną-F633, DAPI, przeciwciałami pierwszorzędowymi skierowanymi przeciwko neurofilamentowi M (NF-M) i glikoproteinie pęcherzyków synaptycznych 2 (SV2) oraz przeciwciałami wtórnymi sprzężonymi z fluoroforami (F488 lub F594). Stosy obrazów pozyskano za pomocą mikroskopii konfokalnej i przetworzono w celu pomiaru objętości postsynaptycznej NMJ, presynaptycznego nagromadzenia NF-M, stopnia zajęcia zakończeń aksonalnych NMJ, powierzchni blaszki końcowej w maksymalnej projekcji intensywności (MIP) postsynaptycznej oraz krętości (dObj(AB) to odległość między punktami A i B wzdłuż obwodu obiektu (czerwona linia), natomiast dEuc(AB) to odległość euklidesowa między punktami A i B (zielona linia)). W analizie mikroskopowej STED określono szerokość prążków receptora acetylocholiny (AChR) oraz odległość między fałdami synaptycznymi na podstawie profili intensywności barwienia α-BTX-F633. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/63032fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza złącza nerwowo-mięśniowego; barwienie α-BTX; mięsień piszczelowy przedni i brzuchaty łydki; wykresy słupkowe przedstawiają objętość, pole powierzchni i intensywność postsynaptycznego NMJ u myszy WT, Smn2B/−, ColQDex2/Dex2; porównanie mięśni." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63032/63032fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Wieloparametryczna charakterystyka postsynaptycznego NMJ w modelach mysich rdzeniowego zaniku mięśni (SMA) oraz wrodzonego zespołu miastenicznego (CMS) związanego z ColQ. (A) Reprezentatywne obrazy postsynaptycznych blaszek końcowych z mięśni TA i GA znakowanych α-bungarotoksyną-F488 (α-BTX). (B) Ilościowe oznaczenie objętości postsynaptycznej blaszki końcowej NMJ, (C) pola powierzchni maksymalnej projekcji intensywności (MIP) oraz (D) względnej krętości w mięśniu TA 3-tygodniowych myszy typu dzikiego (WT) i Smn2B/- (wykresy po lewej, N = 3 zwierzęta na genotyp, odpowiednio n = 37 i n = 56 NMJ) oraz 6-tygodniowych myszy WT i ColQDex2/Dex2 (wykresy po prawej, N = 5 myszy na genotyp, odpowiednio n = 89 i n = 97 NMJ). Dane przedstawiono jako średnią na mysz (kropka) ± SEM. Różnice między grupami analizowano testem Manna-Whitneya (* p &lt; 0.05). Pasek skali to 10 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/63032fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Akumulacja neurofilamentów w osobnikach WT vs mutantach; obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej, wykresy słupkowe, mutacja ColQ." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63032/63032fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Analiza morfometryczna rozkładu presynaptycznych zakończeń aksonalnych w mięśniach myszy WT i mutantów. Wzór unerwienia złączy nerwowo-mięśniowych (NMJ) w mięśniach piszczelowych przednich (tibialis anterior, TA) i brzuchatych łydki (gastrocnemius, GA) u myszy typu dzikiego (WT), myszy z SMA oraz myszy z CMS związany z ColQ. (A, B) Reprezentatywne złącza nerwowo-mięśniowe z mięśnia TA myszy WT i Smn2B/- w 21. dniu życia, znakowane przeciwciałami przeciwko neurofilamentowi M (NF-M, czerwony) i α-bungarotoksyną-F488 (α-BTX, zielony) (A), oraz wyniki ilościowej analizy akumulacji neurofilamentów (B); (C, D) Reprezentatywne złącza nerwowo-mięśniowe z mięśnia GA 6-tygodniowych myszy WT i ColQDex2/Dex2, znakowane przeciwciałami przeciwko neurofilamentowi M (NF-M, czerwony) i α-bungarotoksyną-F488 (α-BTX, zielony), wykazujące pofragmentowane i niedojrzałe płytki postsynaptyczne (C), oraz wyniki akumulacji neurofilamentów w dwóch grupach zwierząt (D). W eksperymentach (B, D) analizowano N= 4 (n = 34 NMJs) (B) i N = 3 (n = 54 NMJs) (D) zwierząt WT, a także N=3 (n = 36 NMJs) myszy Smn2B/- i N = 3 (n = 55 NMJs) myszy ColQDex2/Dex2. (E, F) Reprezentatywne obrazy stopnia zajęcia złączy NMJ przez zakończenia aksonalne w mięśniu TA 3-tygodniowych myszy WT i Smn2B/-, znakowane przeciwciałami przeciwko glikoproteinie 2 pęcherzyków synaptycznych (SV2, czerwony) i α-bungarotoksyną-F488 (α-BTX, zielony) (E), oraz wyniki stopnia zajęcia NMJ (stosunek objętości SV2/AChR) (F). Analizie poddano mięśnie od N = 3 (n = 50 NMJs) myszy typu dzikiego i N = 4 (n = 62 NMJs) myszy Smn2B/-. Dane przedstawiono jako średnią wartość na mysz (kropka) ± SEM. Różnice między grupami analizowano testem Manna-Whitneya (* p &lt; 0.05). Paski skali oznaczają 20 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/63032fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat lokalizacji α-BTX z wykresami rozkładu AChR, paskami skali i wynikami analizy statystycznej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63032/63032fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Obrazowanie STED postsynaptycznych blaszek końcowych NMJ. (A) Reprezentatywny obraz STED NMJ znakowanego α-bungarotoksyną-F633 (α-BTX) z mięśnia gastrocnemius 6-tygodniowej myszy typu dzikiego, pokazujący postsynaptyczne prążki AChR (pasek skali 5 µm). (B) Powiększenie obszaru z prążkami AChR (dolny panel), który został wykorzystany do wygenerowania profilu intensywności. Szerokość (w) prążków AChR oraz odległość między dwoma sąsiednimi prążkami (d) w tym obszarze zostały ilościowo określone i przedstawione na wykresie słupkowym. Schematyczne przedstawienie postsynaptycznej blaszki końcowej obrazujące szerokość (w) i odległość (d) prążków AChR. Parametry te, (C) odległość prążków AChR oraz (D) szerokość, zmierzono u myszy ColQDex2/Dex2 oraz kontrolnych myszy z tego samego miotu w wieku 6 tygodni. NMJ od 5 zwierząt WT (łącznie n = 29 NMJ) i 6 zwierząt ColQDex2/Dex2 (łącznie n = 43 NMJ) zostały poddane ślepej analizie. Dane przedstawiono jako średnią na mysz (kropka) ± SEM. Różnice statystyczne między grupami analizowano za pomocą testu Manna-Whitneya (* p &lt; 0.05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/63032fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Rysunek dodatkowy 1: Uruchomienie oprogramowania LAS X i parametry akwizycji konfokalnej.Różne etapy pozyskiwania obrazów konfokalnych opisano w sekcjach 3.1.2 do 3.1.7 protokołu. Dla każdej akwizycji stosu NMJ otwiera się projekt (krok 3.1.4) i wybiera parametry rozmiaru obrazu, prędkości akwizycji oraz osi X, Y i Z (krok 3.1.7), z zaznaczeniem każdego skanowania sekwencyjnego (Seq.1, laser 405 dla DAPI; Seq.2, laser 488 dla α-BTX-F488; oraz Seq.3, laser 552 dla przeciwciał wtórnych sprzężonych z F594). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Supplemental%20Figure%201.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rysunek dodatkowy 2: Uruchamianie oprogramowania LAS X i parametry akwizycji STED.Kroki niezbędne do uzyskania obrazów STED opisano w sekcjach 3.2.2 do 3.2.8 protokołu. Mikroskop jest uruchamiany w trybie konfiguracji STED ON (krok 3.2.2), a następnie otwiera się projekt (krok 3.2.3). Wskazano parametry akwizycji obrazu (krok 3.2.7) (rozmiar obrazu, prędkość akwizycji, współczynnik powiększenia Zoom, oś X) dla każdego skanu sekwencyjnego (Seq.1 dla α-BTX-F633; Seq.2 dla przeciwciał wtórnych sprzężonych z F488). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Supplemental%20Figure%202.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rysunek dodatkowy 3: Obrazy fałdów połączeniowych barwionych α-BTX uzyskane za pomocą mikroskopii STED.Przykładowe obrazy postsynaptycznej blaszki końcowej znakowanej α-BTX-F633 od 6-tygodniowej myszy typu dzikiego, wykonane przy prawidłowym (lewo) lub nieprawidłowym (prawo) ustawieniu ostrości. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Supplemental%20Figure%203.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rysunek dodatkowy 4: Okna pop-up opisujące dane wejściowe i wyjściowe uzyskane za pomocą niestandardowych makr ImageJ.Przykłady danych wejściowych (.tif oraz pliki .lif) obrazów NMJ przedstawiono w lewej kolumnie. Dane wyjściowe z makr (prawa kolumna) są zapisywane w folderach (Save_Volume, Save_Accu), które zawierają obrazy złącza (.tif) oraz arkusze danych z wynikami (pliki .csv). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Supplemental%20Figure%204.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rysunek dodatkowy 5: Analiza odległości i szerokości prążków AChR z obrazu STED z wykorzystaniem oprogramowania LAS X. Kroki analizy obrazów STED z połączeń NMJ opisano w sekcji 5 protokołu. A) Obraz oznakowanego obszaru postsynaptycznej blaszki końcowej zawierający prążki AChR. Obszar zainteresowania do analizy prążków jest wybierany poprzez narysowanie linii prostopadłej (zielona linia, dla odległości prążków) lub prostokąta prostopadłego (fioletowy prostokąt, dla szerokości prążków). (B, C) Przedstawiono profile intensywności wybranych obszarów oraz pomiary służące do obliczenia odległości między prążkami AChR (B) i szerokości prążka AChR (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Supplemental%20Figure%205.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Uzupełniający plik kodu 1: Macro_NMJ_VOL_Marinelloetal. Niestandardowe makro ImageJ do wyodrębniania pomiarów parametrów NMJ (objętość NMJ, powierzchnia płytki końcowej MIP oraz krętość NMJ). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Macro_NMJ_VOL_Marinelloetal_63032.ijm" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający z kodem 2: Macro_NMJ_ACCU_Marinelloetal. Własne makro ImageJ do ekstrakcji akumulacji NF-M oraz barwienia SV2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63032/Macro_NMJ_ACCU_Marinelloetal_63032.ijm" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Ten protokół opisuje metodę analizy morfometrycznej połączeń nerwowo-mięśniowych za pomocą połączonej mikroskopii konfokalnej i STED, która jest używana do ilościowego określania zmian patologicznych w mysich modelach SMA i CMS związanych z ColQ.

Charakterystyka połączeń nerwowo-mięśniowych u myszy za pomocą połączonej mikroskopii konfokalnej i superrozdzielczej

Neuromuscular junctions (NMJs) are highly specialized synapses between lower motor neurons and skeletal muscle fibers that play an essential role in the ...

Protokół ten pomaga ilościowo analizować strukturę 3D połączeń nerwowo-mięśniowych w rozdzielczości zbliżonej do mikroskopii elektronowej przy użyciu prostej procedury. Główną zaletą tego protokołu jest to, że próbki mięśni są przetwarzane w podobny sposób i znakowane immunologicznie do mikroskopii konfokalnej i STED, co skraca czas dokładnej oceny struktury połączeń nerwowo-mięśniowych w modelach zwierzęcych. Opracowana przez nas kwantyfikacja morfologiczna może być łatwo dostosowana do analizy innych struktur subkomórkowych.Mam przyjemność przedstawić dr Martinę Marinello, naukowca z mojego zespołu, który pokaże, w jaki sposób przeprowadza się drażnienie mięśni i barwienie immunologiczne oraz udzieli kilku zaleceń dotyczących skutecznego zastosowania tego protokołu. Mam przyjemność przedstawić dr Jeremie Cosette z platformy obrazowania Genethon, która pokaże akwizycję i analizę obrazu za pomocą mikroskopów konfokalnych i STED. Po eutanazji zacznij drażnić mięśnie piszczelowe przednie w małych wiązkach włókien o szerokości około jednego milimetra za pomocą dwóch drobno ząbkowanych kleszczy.Następnie przenieś te wiązki mięśni na 24-dołkową płytkę zawierającą 1% Triton X-100 przygotowany w PBS i pozwól mu delikatnie mieszać przez godzinę w temperaturze pokojowej lub pięć godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po trzykrotnym myciu próbek przez pięć minut PBS w temperaturze pokojowej, należy inkubować próbki z roztworem blokującym składającym się z 4% BSA przygotowanym w PBS z 1% Tritonem X-100 przez cztery godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza pod delikatnym mieszaniem. Następnie inkubować próbki przez noc z tym samym roztworem blokującym zawierającym pierwszorzędowe przeciwciała monoklonalne przeciwko neurofilamentowi M lub glikoproteinie pęcherzyków synaptycznych 2 w celu znakowania presynaptycznych zakończeń aksonów lub stref aktywnych.Następnego dnia umyj oznaczone wiązki mięśni trzy razy przez pięć minut za pomocą PBS pod delikatnym mieszaniem. Następnie inkubuj je z odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi, umieszczając je na wytrząsarce na dwie godziny w temperaturze pokojowej. Po ponownym umyciu wiązek mięśniowych umieść je na szkiełku z podłożem montażowym.Następnie umieść na górze szklane szkiełko nakrywkowe o grubości 1,5 stopnia, a następnie cylindryczne magnesy po obu stronach szkiełka, aby wywrzeć nacisk i spłaszczyć mięśnie. Aby uzyskać obrazy za pomocą mikroskopu konfokalnego, uruchom oprogramowanie mikroskopu i wybierz maszynę jako tryb konfiguracji i zbierz stosy obrazów połączeń nerwowo-mięśniowych w każdej grupie eksperymentalnej zgodnie z ustawieniami wymienionymi w manuskrypcie tekstowym. Pod koniec sesji kliknij Otwórz w przeglądarce 3D i wybierz połączenie nerwowo-mięśniowe reprezentatywne dla grupy eksperymentalnej, aby zwizualizować etykietowanie 3D.Aby obliczyć postsynaptyczne połączenie nerwowo-mięśniowe i objętość płytki, obszar projekcji maksymalnej intensywności i względną krętość, przeciągnij i upuść makro do kwantyfikacji objętości połączenia nerwowo-mięśniowego do okna Obraz J, a gdy makro otworzy się w drugim oknie, kliknij Makra i Uruchom makro. Wybierz folder natywny zawierający podfoldery skrzyżowania, które mają zostać przeanalizowane, a następnie kliknij przycisk Wybierz. Następnie w menu podręcznym zapisywania folderu wybierz folder przechowywania i kliknij Wybierz.W nowym menu podręcznym o nazwie Typ obrazu wybierz format akwizycji stosu Z. Wybierz kanał RGB odpowiadający interesującemu Cię barwieniu i wskaż rozmiar piksela X, Y i krok Z. W przypadku wybrania zastrzeżonych formatów plików makro bezpośrednio odczytuje rozmiar w pikselach i krok Z.Aby określić ilościowo akumulację neurofilamentu presynaptycznego, przeciągnij i upuść makro do kwantyfikacji akumulacji połączeń nerwowo-mięśniowych do okna Obraz J, a następnie kliknij Makra i Uruchom makro. Wybierz podfoldery skrzyżowań, folder przechowywania i format nabycia stosu Z, jak pokazano wcześniej. Następnie w wyskakującym okienku Staining Infos wskaż etykietę i kolor presynaptyczny i postsynaptyczny, a następnie kliknij OK.In wyskakującym okienku Rozmiar piksela, wskaż rozmiar piksela X, Y jako 0,072 mikrometra, krok Z jako 0,5 mikrometra i kliknij OK. W przypadku wybrania zastrzeżonych formatów plików makro bezpośrednio odczytuje rozmiar w pikselach i krok Z.Aby obliczyć odległość między paskami receptora acetylocholiny, wybierz menu Quantify w górnej części środkowego okna. Kliknij zakładkę Narzędzia, wybierz intensywność i kliknij ikonę profilu linii. Ustaw nadpróbkowanie na jeden i zaznacz opcję Sortuj kanały.Kliknij zakładkę Otwórz projekty i wybierz przefiltrowany obraz, który chcesz przeanalizować. Następnie kliknij ikonę rysowania linii i narysuj linię przecinającą prostopadle kilka pasków lub zagięć łączących. Kliknij na wierzchołek pierwszego szczytu i przesuwaj wskaźnik myszy, naciskając lewy przycisk myszy, aż zostanie osiągnięty następny szczyt maksymalny.Zwróć uwagę na wartość DX, która odpowiada odległości między dwoma szczytami. Kliknij prawym przyciskiem myszy na obrazie po prawej stronie i wybierz Zapisz ROI. Po kliknięciu na ikonę strzałki kliknij ROI i usuń go, klikając ikonę kosza.Aby obliczyć szerokość paska receptora acetylocholiny, wybierz intensywność w lewym górnym panelu w zakładce narzędzi, kliknij ikonę określ FWHM i zaznacz kanały sortowania. Następnie kliknij zakładkę Otwórz projekty i wybierz przefiltrowany obraz, który chcesz przeanalizować. Następnie kliknij ikonę rysowania prostokąta w górnym menu prawego okna.Zaznacz pasek, który jest poziomy lub pionowy, a następnie narysuj prostokąt prostopadle do paska. W środkowym oknie pojawi się profil. Kliknij pionowo lub poziomo w menu Projekcja średnia znajdującym się w lewym panelu, w zależności od tego, czy orientacja paska jest pionowa czy pozioma.Kliknij Statystyki w środkowym oknie, aby odczytać wartość FWHM, a następnie zapisz i usuń ROI, jak pokazano wcześniej. Postsynaptyczna płytka końcowa silnika, oznaczona fluorescencyjną alfa-bungarotoksyną, wydawała się mniejsza i pofragmentowana u mutantów dwóch linii myszy. Kwantyfikacja stosów Z połączenia nerwowo-mięśniowego przy użyciu niestandardowych makr Image J ujawniła wyraźny spadek objętości płytki końcowej, projekcji maksymalnej intensywności i względnej krętości w obu modelach myszy choroby w porównaniu z kontrolą, co wskazuje na defekty dojrzewania połączenia nerwowo-mięśniowego.Kwantyfikacja rozkładu presynaptycznych końcowych gałęzi aksonów przy użyciu niestandardowego makra Image J ujawniła zmieniony wzór w dystrybucji neurofilamentu M w dwóch modelach zwierzęcych ze zwiększonym znakowaniem immunologicznym. Poprzez barwienie glikoproteiną 2 pęcherzyków synaptycznych zaobserwowano 43% zmniejszenie współczynnika zajętości regionów zawierających receptor acetylocholiny z sąsiednimi strefami aktywnymi zakończeń nerwowych u myszy Smn 2B/myszy. Aspekt postsynaptycznych płytek końcowych połączenia nerwowo-mięśniowego został wyraźnie uwidoczniony za pomocą fluorescencyjnego znakowania alfa-bungarotoksyny i analizy profilu intensywności.Ocena parametrów połączenia nerwowo-mięśniowego wykazała wzrost odległości i szerokości fałdu połączeniowego pasków receptora acetylocholiny w mięśniu brzuchatym łydki mutantów. Aby uzyskać wiarygodne wyniki, ważne jest, aby odpowiednio drażnić mięśnie, zwracając szczególną uwagę na siłę zastosowaną do rozdzielenia wiązek mięśniowych. Protokół ten może pomóc w uzyskaniu bardziej dogłębnej charakterystyki morfologicznej połączenia nerwowo-mięśniowego, które wcześniej było uwzględniane tylko za pomocą skomplikowanych i czasochłonnych procedur, takich jak transmisyjna mikroskopia elektronowa.Procedura obrazowania STED utorowała drogę do zbadania nowych informacji na temat markerów pre- i postsynaptycznych, które przyczyniają się do patofizjologii chorób wpływających na połączenie nerwowo-mięśniowe.

characterization-neuromuscular-junctions-mice-combined-confocal-super

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Złącze neuromięśniowe (NMJ) Drosophila melanogaster stanowi istotny system modelowy do badania prawidłowej funkcji synaptycznej, jak i zaburzeń tej funkcji występujących w niektórych chorobach neurologicznych. Przedstawiamy protokół sekcji układu ruchowego larw Drosophila oraz immunobarwienia białek strefy aktywnej w obrębie NMJ.

Disekcja i obrazowanie stref aktywnych w połączeniu nerwowo-mięśniowym Drosophila

Opisujemy procedury powtarzalnego podawania inhibitorów sygnalizacji muskarynowej do mięśnia dźwigacza małżowiny usznej (LAL) u młodych dorosłych myszy oraz późniejszego barwienia immunocytochemicznego jego złącz neuromięśniowych (NMJs) w preparatach całych organów. Mięsień LAL posiada wyjątkowe zalety w kontekście ujawniania farmakologicznych efektów in vivo w złączach NMJs.

Podskórne podawanie antagonistów muskarynowych oraz potrójne barwienie immunocytochemiczne mięśnia dźwigacza małżowiny usznej u myszy

Wizualizacja pojedynczych komórek w gęsto upakowanych tkankach, takich jak terminalne komórki Schwanna (SCs) w złączach nerwowo-mięśniowych (NMJs), jest trudna. „Sekwencyjne fotoblaknięcie” pozwala na wyodrębnienie pojedynczych terminalnych SCs, na przykład w eksplantacie mięśnia triangularis sterni — wygodnej preparacji nerwowo-mięśniowej, w której sekwencyjne blaknięcie można połączyć z obrazowaniem poklatkowym i post-hoc immunobarwieniem.

Sekwencyjne fotoblaknięcie w celu wyznaczenia pojedynczych komórek Schwanna w złączu neuromięśniowym

Źródło: Marinello, M., et al. Charakterystyka połączeń nerwowo-mięśniowych u myszy za pomocą połączonej mikroskopii konfokalnej i superrozdzielczej. J. Vis. Exp. (2021)Ten film przedstawia przygotowanie, barwienie immunologiczne i obrazowanie połączeń nerwowo-mięśniowych w tkance mięśniowej szczura przy użyciu mikroskopii konfokalnej i superrozdzielczej do wizualizacji i analizy struktur presynaptycznych i postsynaptycznych.

W tym filmie demonstrujemy protokół do preparacji mięśnia poprzecznego brzucha myszy i używamy immunofluorescencji i mikroskopii do wizualizacji połączeń nerwowo-mięśniowych.

Rozwarstwienie mięśnia poprzecznego brzucha w celu analizy całego połączenia nerwowo-mięśniowego

Połączenie nerwowo-mięśniowe (NMJ) jest zmienione w różnych stanach, które czasami mogą prowadzić do niewydolności synaptycznej. W niniejszym raporcie opisano metody oparte na mikroskopie fluorescencyjnym do ilościowego określania takich zmian strukturalnych.

Połączenie nerwowo-mięśniowe: pomiar wielkości synaps, fragmentacji i zmian gęstości białek synaptycznych za pomocą konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej

Ten protokół pokazuje, jak wykorzystać mikroskopię superrozdzielczą do badania kolokalizacji białek w pierwotnych kulturach neuronalnych.

Obrazowanie superrozdzielcze w celu zbadania kolokalizacji białek i markerów synaptycznych w neuronach pierwotnych

Zdolność do dokładnego wykrywania komponentów połączenia nerwowo-mięśniowego jest kluczowa w ocenie zmian w jego architekturze spowodowanych procesami patologicznymi lub rozwojowymi. Poniżej przedstawiamy pełny opis prostej metody uzyskiwania wysokiej jakości obrazów całych połączeń nerwowo-mięśniowych, które można wykorzystać do wykonywania pomiarów ilościowych.

Rozwarstwienie pojedynczych włókien mięśni szkieletowych do analiz immunofluorescencyjnych i morfometrycznych połączeń nerwowo-mięśniowych w całości

Protokół opisuje metodę ładowania fluorescencyjnego barwnika wapniowego przez przecięty nerw do zakończeń nerwu ruchowego myszy. Ponadto przedstawiono unikalną metodę rejestracji szybkich stanów przejściowych wapnia w zakończeniach nerwów obwodowych za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Rejestracja stanów przejściowych wapnia w mysim połączeniu nerwowo-mięśniowym z wysoką rozdzielczością czasową przy użyciu mikroskopii konfokalnej

Protokół pokazuje metodę badania korelacji przestrzennej między zakończeniami presynaptycznymi, receptorami postsynaptycznymi i okołosynaptycznymi komórkami Schwanna w mięśniu brzuchatym łydki szczura przy użyciu immunohistochemii fluorescencyjnej z różnymi biomarkerami, a mianowicie: neurofilamentem 200, pęcherzykowym transporterem acetylocholiny, alfa-bungarotoksyną i S100.

Wizualizacja cech morfologicznych połączenia nerwowo-mięśniowego w mięśniu brzuchatym łydki przyśrodkowym szczura

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół wizualizacji sieci mikrotubul w połączeniach nerwowo-mięśniowych i komórkach mięśniowych. W połączeniu z potężnymi narzędziami genetycznymi Drosophila melanogaster, protokół ten znacznie ułatwia genetyczne badania przesiewowe i analizę dynamiki mikrotubul pod kątem roli białek regulatorowych sieci mikrotubul w układzie nerwowym.

Wykorzystanie połączenia nerwowo-mięśniowego larw Drosophila i komórek mięśniowych do wizualizacji sieci mikrotubul

Poznaj metodę analizy morfometrycznej połączeń nerwowo-mięśniowych u myszy przy użyciu połączonej mikroskopii konfokalnej i STED. Protokół umożliwia ilościową ocenę zmian patologicznych w modelach SMA i CMS.

Charakterystyka połączeń nerwowo-mięśniowych u myszy za pomocą połączonej mikroskopii konfokalnej i superrozdzielczej

Przeglądaj więcej filmów