Charakterystyka połączeń nerwowo-mięśniowych u myszy za pomocą połączonej mikroskopii konfokalnej i superrozdzielczej

Protokół ten pomaga ilościowo analizować strukturę 3D połączeń nerwowo-mięśniowych w rozdzielczości zbliżonej do mikroskopii elektronowej przy użyciu prostej procedury. Główną zaletą tego protokołu jest to, że próbki mięśni są przetwarzane w podobny sposób i znakowane immunologicznie do mikroskopii konfokalnej i STED, co skraca czas dokładnej oceny struktury połączeń nerwowo-mięśniowych w modelach zwierzęcych. Opracowana przez nas kwantyfikacja morfologiczna może być łatwo dostosowana do analizy innych struktur subkomórkowych.

Mam przyjemność przedstawić dr Martinę Marinello, naukowca z mojego zespołu, który pokaże, w jaki sposób przeprowadza się drażnienie mięśni i barwienie immunologiczne oraz udzieli kilku zaleceń dotyczących skutecznego zastosowania tego protokołu. Mam przyjemność przedstawić dr Jeremie Cosette z platformy obrazowania Genethon, która pokaże akwizycję i analizę obrazu za pomocą mikroskopów konfokalnych i STED. Po eutanazji zacznij drażnić mięśnie piszczelowe przednie w małych wiązkach włókien o szerokości około jednego milimetra za pomocą dwóch drobno ząbkowanych kleszczy.

Następnie przenieś te wiązki mięśni na 24-dołkową płytkę zawierającą 1% Triton X-100 przygotowany w PBS i pozwól mu delikatnie mieszać przez godzinę w temperaturze pokojowej lub pięć godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po trzykrotnym myciu próbek przez pięć minut PBS w temperaturze pokojowej, należy inkubować próbki z roztworem blokującym składającym się z 4% BSA przygotowanym w PBS z 1% Tritonem X-100 przez cztery godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza pod delikatnym mieszaniem. Następnie inkubować próbki przez noc z tym samym roztworem blokującym zawierającym pierwszorzędowe przeciwciała monoklonalne przeciwko neurofilamentowi M lub glikoproteinie pęcherzyków synaptycznych 2 w celu znakowania presynaptycznych zakończeń aksonów lub stref aktywnych.

Następnego dnia umyj oznaczone wiązki mięśni trzy razy przez pięć minut za pomocą PBS pod delikatnym mieszaniem. Następnie inkubuj je z odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi, umieszczając je na wytrząsarce na dwie godziny w temperaturze pokojowej. Po ponownym umyciu wiązek mięśniowych umieść je na szkiełku z podłożem montażowym.

Następnie umieść na górze szklane szkiełko nakrywkowe o grubości 1,5 stopnia, a następnie cylindryczne magnesy po obu stronach szkiełka, aby wywrzeć nacisk i spłaszczyć mięśnie. Aby uzyskać obrazy za pomocą mikroskopu konfokalnego, uruchom oprogramowanie mikroskopu i wybierz maszynę jako tryb konfiguracji i zbierz stosy obrazów połączeń nerwowo-mięśniowych w każdej grupie eksperymentalnej zgodnie z ustawieniami wymienionymi w manuskrypcie tekstowym. Pod koniec sesji kliknij Otwórz w przeglądarce 3D i wybierz połączenie nerwowo-mięśniowe reprezentatywne dla grupy eksperymentalnej, aby zwizualizować etykietowanie 3D.

Aby obliczyć postsynaptyczne połączenie nerwowo-mięśniowe i objętość płytki, obszar projekcji maksymalnej intensywności i względną krętość, przeciągnij i upuść makro do kwantyfikacji objętości połączenia nerwowo-mięśniowego do okna Obraz J, a gdy makro otworzy się w drugim oknie, kliknij Makra i Uruchom makro. Wybierz folder natywny zawierający podfoldery skrzyżowania, które mają zostać przeanalizowane, a następnie kliknij przycisk Wybierz. Następnie w menu podręcznym zapisywania folderu wybierz folder przechowywania i kliknij Wybierz.

W nowym menu podręcznym o nazwie Typ obrazu wybierz format akwizycji stosu Z. Wybierz kanał RGB odpowiadający interesującemu Cię barwieniu i wskaż rozmiar piksela X, Y i krok Z. W przypadku wybrania zastrzeżonych formatów plików makro bezpośrednio odczytuje rozmiar w pikselach i krok Z.

Aby określić ilościowo akumulację neurofilamentu presynaptycznego, przeciągnij i upuść makro do kwantyfikacji akumulacji połączeń nerwowo-mięśniowych do okna Obraz J, a następnie kliknij Makra i Uruchom makro. Wybierz podfoldery skrzyżowań, folder przechowywania i format nabycia stosu Z, jak pokazano wcześniej. Następnie w wyskakującym okienku Staining Infos wskaż etykietę i kolor presynaptyczny i postsynaptyczny, a następnie kliknij OK.In wyskakującym okienku Rozmiar piksela, wskaż rozmiar piksela X, Y jako 0,072 mikrometra, krok Z jako 0,5 mikrometra i kliknij OK. W przypadku wybrania zastrzeżonych formatów plików makro bezpośrednio odczytuje rozmiar w pikselach i krok Z.

Aby obliczyć odległość między paskami receptora acetylocholiny, wybierz menu Quantify w górnej części środkowego okna. Kliknij zakładkę Narzędzia, wybierz intensywność i kliknij ikonę profilu linii. Ustaw nadpróbkowanie na jeden i zaznacz opcję Sortuj kanały.

Kliknij zakładkę Otwórz projekty i wybierz przefiltrowany obraz, który chcesz przeanalizować. Następnie kliknij ikonę rysowania linii i narysuj linię przecinającą prostopadle kilka pasków lub zagięć łączących. Kliknij na wierzchołek pierwszego szczytu i przesuwaj wskaźnik myszy, naciskając lewy przycisk myszy, aż zostanie osiągnięty następny szczyt maksymalny.

Zwróć uwagę na wartość DX, która odpowiada odległości między dwoma szczytami. Kliknij prawym przyciskiem myszy na obrazie po prawej stronie i wybierz Zapisz ROI. Po kliknięciu na ikonę strzałki kliknij ROI i usuń go, klikając ikonę kosza.

Aby obliczyć szerokość paska receptora acetylocholiny, wybierz intensywność w lewym górnym panelu w zakładce narzędzi, kliknij ikonę określ FWHM i zaznacz kanały sortowania. Następnie kliknij zakładkę Otwórz projekty i wybierz przefiltrowany obraz, który chcesz przeanalizować. Następnie kliknij ikonę rysowania prostokąta w górnym menu prawego okna.

Zaznacz pasek, który jest poziomy lub pionowy, a następnie narysuj prostokąt prostopadle do paska. W środkowym oknie pojawi się profil. Kliknij pionowo lub poziomo w menu Projekcja średnia znajdującym się w lewym panelu, w zależności od tego, czy orientacja paska jest pionowa czy pozioma.

Kliknij Statystyki w środkowym oknie, aby odczytać wartość FWHM, a następnie zapisz i usuń ROI, jak pokazano wcześniej. Postsynaptyczna płytka końcowa silnika, oznaczona fluorescencyjną alfa-bungarotoksyną, wydawała się mniejsza i pofragmentowana u mutantów dwóch linii myszy. Kwantyfikacja stosów Z połączenia nerwowo-mięśniowego przy użyciu niestandardowych makr Image J ujawniła wyraźny spadek objętości płytki końcowej, projekcji maksymalnej intensywności i względnej krętości w obu modelach myszy choroby w porównaniu z kontrolą, co wskazuje na defekty dojrzewania połączenia nerwowo-mięśniowego.

Kwantyfikacja rozkładu presynaptycznych końcowych gałęzi aksonów przy użyciu niestandardowego makra Image J ujawniła zmieniony wzór w dystrybucji neurofilamentu M w dwóch modelach zwierzęcych ze zwiększonym znakowaniem immunologicznym. Poprzez barwienie glikoproteiną 2 pęcherzyków synaptycznych zaobserwowano 43% zmniejszenie współczynnika zajętości regionów zawierających receptor acetylocholiny z sąsiednimi strefami aktywnymi zakończeń nerwowych u myszy Smn 2B/myszy. Aspekt postsynaptycznych płytek końcowych połączenia nerwowo-mięśniowego został wyraźnie uwidoczniony za pomocą fluorescencyjnego znakowania alfa-bungarotoksyny i analizy profilu intensywności.

Ocena parametrów połączenia nerwowo-mięśniowego wykazała wzrost odległości i szerokości fałdu połączeniowego pasków receptora acetylocholiny w mięśniu brzuchatym łydki mutantów. Aby uzyskać wiarygodne wyniki, ważne jest, aby odpowiednio drażnić mięśnie, zwracając szczególną uwagę na siłę zastosowaną do rozdzielenia wiązek mięśniowych. Protokół ten może pomóc w uzyskaniu bardziej dogłębnej charakterystyki morfologicznej połączenia nerwowo-mięśniowego, które wcześniej było uwzględniane tylko za pomocą skomplikowanych i czasochłonnych procedur, takich jak transmisyjna mikroskopia elektronowa.

Procedura obrazowania STED utorowała drogę do zbadania nowych informacji na temat markerów pre- i postsynaptycznych, które przyczyniają się do patofizjologii chorób wpływających na połączenie nerwowo-mięśniowe.