Name: Technika otrzymywania mezenchymalnych komórek macierzystych z tkanki tłuszczowej i charakterystyka frakcji naczyniowej zrębu w długoterminowej kriokonserwacji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-30T16:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 57 s
Description: Poznaj ulepszoną metodę izolacji mezenchymalnych komórek macierzystych z tkanki tłuszczowej, zapewniającą wyższą wydajność i krótszy czas. Technika ta umożliwia długoterminową kriokonserwację przy zachowaniu żywotności komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy pacjentom, którzy zgłosili się do udziału oraz personelowi medycznemu i pielęgniarskiemu Szpitala São Paulo. Badanie to było wspierane przez Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) i Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) w Brazylii.

Niniejsze badanie zostało zatwierdzone przez Komitet Etyki UNIFESP (numer protokołu: 0029/2015 CAAE: 40846215.0.0000.5505), przeprowadzone po uzyskaniu pisemnej świadomej zgody pacjentów zgodnie z Deklaracją Helsińską (2004). Próba niniejszego badania składa się z dziewięciu pacjentek w wieku 33-50 lat (średnia wieku 41,5 lat) i średnim początkowym wskaźnikiem masy ciała (BMI) 24,54 (w zakresie 22,32-26,77) (Tabela 1), które przeszły estetyczną abdominoplastykę z powodu nadmiaru skóry po ciąży, na Wydziale Chirurgii Plastycznej Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), Brazylia. Aby zmniejszyć stronniczość, pacjenci zostali wybrani jako jednorodna grupa pod względem płci, wieku i BMI. Zestawy danych wykorzystane i/lub przeanalizowane podczas tego badania są dostępne u autora korespondencyjnego na uzasadnione żądanie.
1. Kolekcja lipoaspiratu
UWAGA: Ten krok musi być wykonany w centrum chirurgicznym.
<ol>
	<li>Użyj 4% glukonianu chlorheksydyny (patrz tabela materiałów) do przygotowania skóry i aseptyki.
	<ol>
		<li>Wykonać podskórne nacięcie skóry o średnicy 2 mm (między skórą właściwą a rozcięgnem). Wprowadzić kaniulę Kleina o kalibrze 3 mm 3 mm i 3 mm oraz strzykawkę, aby wstrzyknąć całkowitą objętość 500 ml roztworu adrenaliny (1 mg/ml) (patrz tabela materiałów) rozcieńczonego w roztworze soli fizjologicznej (1:1 000 000) w okolicy podpępkowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podłącz strzykawkę o pojemności 60 ml do kaniuli do liposukcji 26 mm 3 G z trzema otworami i kalibrem 3 mm i włóż ją przez nacięcie skóry, blokując tłok w celu wytworzenia podciśnienia.
	<ol>
		<li>Wykonuj ruchy pchania i ciągnięcia, tak aby po wytworzeniu podciśnienia lipoaspirat pozostał w strzykawce o pojemności 60 ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Za pomocą sterylnego łącznika z zaworem przenieś 100 ml zebranego lipoaspiratu do worka transferowego z polichlorku winylu o pojemności 150 ml (patrz tabela materiałów).
	<ol>
		<li>Zapakuj worek transferowy w styropianowe pudełko w temperaturze pokojowej (~25 °C) i natychmiast zanieś go do laboratorium. Nie należy poświęcać więcej niż 30 minut na rozpoczęcie przetwarzania tkanki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przetwarzanie lipoaspiratu
UWAGA: Ten krok ma być wykonany w laboratorium.
<ol>
	<li>Najpierw zważ worek, zmierz temperaturę za pomocą cyfrowego bezdotykowego termometru klinicznego na podczerwień i pozostaw worek na 5 minut w komorze przepływu laminarnego w celu wytrącenia bardziej tłustych warstw (pęcherzyków) i oddzielenia tkanek zawierających interesujące komórki.
	<ol>
		<li>Wykonaj serię płukania chusteczek. Pierwsze mycie: wstrzyknąć 100 ml DPBS z wapniem (1x) do worka transferowego i wymieszać z rękami.</li>
		<li>Odstaw na 5 minut i usuń większość wytrącającego się płynu podstawowego.</li>
		<li>Wyrzuć podstawowy płyn za pomocą strzykawki o pojemności 60 ml dołączonej do adaptera worka. Ten proces należy powtórzyć dwukrotnie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać 100 ml roztworu trawiącego do torebki (93 ml DPBS bez wapnia + 60 μl chlorku wapnia (1 g/l) + 7 ml 0,075% sterylnej kolagenazy, patrz tabela materiałów) i pozostawić w temperaturze 37 °C na 30 minut przy powolnym mieszaniu.</li>
	<li>Przenieść całą zawartość worka do czterech stożkowych probówek o pojemności 50 ml i odwirować je w temperaturze 400 x g w temperaturze 22 °C przez 10 minut.
	<ol>
		<li>Usuń i wyrzuć supernatant i dodaj 5 ml zmodyfikowanego podłoża Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco o niskiej zawartości glukozy uzupełnionego 20% FBS (płodowa surowica bydlęca) do osadu komórkowego (<klasa silna = "xfig">Ryc. 1).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Liczenie komórek SVF
<ol>
	<li>Świeży roztwór 10 μl błękitu trypanowego o stężeniu 0,05% mieszać w wodzie destylowanej z 10 μl zawiesiny komórkowej przez 5 minut.</li>
	<li>Policz żywe komórki w komorze do liczenia komórek Neubauera32 za pomocą mikroskopu światła odwróconego (patrz Tabela materiałów) przy 20-krotnym powiększeniu.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy w podłożu krioprotrotanckim (5 ml FBS + 10% dimetylosulfotlenku - DMSO) w stężeniu 1 x 106 komórek/ml.</li>
	<li>Umieść 1 ml tej mieszanki w kriowialach. Użyć pojemnika do zamrażania (patrz tabela materiałów) o szybkości chłodzenia (od 1 °C/min do -80 °C).
	<ol>
		<li>Przechowywać w temperaturze -80 °C przez 1 rok.</li>
		<li>Po tym czasie przechowywać w standardowych kasetach zanurzonych w fazie parowej ciekłego azotu (-165 °C).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Proces rozmrażania komórek
<ol>
	<li>Wyjąć fiolki z ciekłego azotu i natychmiast umieścić je w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 1 minutę.</li>
	<li>Umieścić komórki SVF w stożkowej probówce z 4 ml DMEM (niska glukoza uzupełniona 20% FBS) podgrzanej do 37 °C.</li>
	<li>Wirować przy 400 x g w temperaturze 22 °C przez 5 min.</li>
	<li>Usuń supernatant i dodaj 1 ml DMEM (niski poziom glukozy) + 10% FBS. Wykonaj immunofenotypowanie, wykonując poniższe czynności.</li>
</ol>
5. Technika cytometrii przepływowej (wielokrotne znakowanie immunofenotypu)
<ol>
	<li>Umieść 1 ml osadu komórkowego (stężenie 1 000 komórek/μl) w pięciu probówkach cytometrycznych (po 200 μl każda).</li>
	<li>Wirować przy 400 x g w temperaturze 22 °C przez 5 minut i odrzucić supernatant za pomocą pipety.</li>
	<li>Dodać 300 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) (10x), odwirować przy 400 x g w temperaturze 22 °C i odrzucić supernatant za pomocą pipety.</li>
	<li>Przygotować pięć probówek dla różnych kombinacji markerów w następujący sposób: 5 μl CD11B/5 μl CD19/20 μl CD45; 5 μl CD73/20 μL CD90/5 μL CD105/20 μL CD45; 20 μL CD34/5 μL HLA-DR/20 μL CD45; Test żywotności komórek-5 μl fluorescencyjnego barwnika reaktywnego. (patrz tabela materiałów) oraz probówkę z niebarwionymi komórkami i PBS jako kontrolą ujemną. Homogenizować w wirze i inkubować w temperaturze 4 °C przez 30 minut.
	<ol>
		<li>Wirować przy 400 x g w temperaturze 22 °C przez 5 minut, odrzucić supernatant za pomocą pipety, dodać 500 μl PBS (10x) i przystąpić do sortowania komórek. 
		UWAGA: Pięć tysięcy zdarzeń jest rejestrowanych na zestaw przeciwciał w cytometrze przepływowym o czterech kolorach i pięciu parametrach i analizowanych za pomocą oprogramowania CellQuest.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Zasiewanie przejścia 1 (P1)
<ol>
	<li>Wysiew 2 x 105 komórek w kolbie hodowlanej o średnicy 75cm2.</li>
	<li>Dodaj 12 ml DMEM o niskiej stężeniu glukozy + 20% FBS + 10% antybiotyku/antybiotyku (z 10 000 jednostek penicyliny, 10 mg streptomycyny i 25 μg amfoterycyny B na ml, 0,1 μm).</li>
	<li>Gdy komórki osiągną zbieżność między 80% -90%, wykonuj trypsynizację przylegających komórek za pomocą 2 ml 0,25% EDTA-trypsyny przez 3 minuty.</li>
	<li>Ponownie policz komórki (jak wspomniano w kroku 3).</li>
	<li>Ponownie wykonaj immunofenotypowanie (jak wspomniano w kroku 5).</li>
</ol>
7. Analiza statystyczna
<ol>
	<li>Użyj kalkulatora Rho Spearmana33, aby zmierzyć siłę powiązania między następującymi zmiennymi o P < 0,05, jak wspomniano poniżej.
	<ol>
		<li>Wybierz wydajność komórkową SVF i liczbę dni, przez które SVF pozostaje w kulturze w pierwszym pasażu (P1) do 80%-90% konfluencji (dni do P1).</li>
		<li>Wybierz wydajność komórkową SVF przed i po przejściu do P1.</li>
		<li>Weź pod uwagę dni do P1 i wydajność komórkową przed przejściem do P1.</li>
		<li>Wybierz wydajność komórkową SVF ze średnim procentem potwierdzonego ADSC.</li>
		<li>Oblicz procent potwierdzonego ADSC i wydajność komórkową przed przejściem do P1.</li>
		<li>Określ BMI i wydajność komórkową SVF.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. Test różnicowania
<ol>
	<li>Przeprowadzić test różnicowania zgodnie z protokołem zestawu do różnicowania (patrz tabela materiałów). Rysunek 4 przedstawia wyniki dla przypadku 1.</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Wydajność izolacji Powszechnie wiadomo, że proces kriokonserwacji, często wymagany w terapii komórkowej, powoduje znaczną utratę komórek, czasami większą niż 50%29,30,35. W związku z tym zasadnicze znaczenie ma ulepszenie techniczne w celu uzyskania wysokiej początkowej wydajności komórkowej w izolacji. Metoda pobierania lipoaspiratu i metoda izolacji komórek muszą koncentrować się na zachowaniu większej li...

Ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste są korzystne zarówno w badaniach podstawowych, jak i stosowanych. Wykorzystanie tego dorosłego typu komórek wykracza poza kwestie etyczne - w porównaniu z wykorzystaniem komórek embrionalnych lub innych - będąc jednym z najbardziej obiecujących obszarów badań w inżynierii autologicznej regeneracji tkanek i terapii komórkowej1, takich jak obszar nowotworowy, leczenie chorób zwyrodnieniowych i zastosowania terapeutyczne w obszarze chirurgii rekonstrukcyjnej2,3,4,5. Wcześniej informowano, że we frakcji komórek naczyniowych zrębu tkanki tłuszczowej znajduje się obfite źródło mezenchymalnych komórek macierzystych multipotencjalnych i pluripotencjalnych6,7. Te ADSC są uważane za doskonałych kandydatów do stosowania w terapii komórkowej i transplantacji/infuzji, ponieważ znaczna liczba komórek o dużej zdolności do ekspansji ex vivo może być łatwo uzyskana z wysoką wydajnością z minimalnie inwazyjnej procedury5,8.
Wykazano również, że tkanka tłuszczowa wykazuje większą zdolność do dostarczania mezenchymalnych komórek macierzystych niż dwa inne źródła (szpik kostny i tkanka pępowiny)9. Oprócz tego, że jest słabo immunogenny i ma wysoką zdolność do integracji z tkanką gospodarza i interakcji z otaczającymi tkankami4,10, ADSC ma wielosilną zdolność różnicowania się w linie komórkowe, z doniesieniami o różnicowaniu chondrogenicznym, osteogennym i miogennym w odpowiednich warunkach hodowli11,12,13oraz do komórek, takich jak trzustka, hepatocyty i komórki neurogenne14,15,16.
Społeczność naukowa zgadza się, że immunomodulacyjny efekt mezenchymalnych komórek macierzystych jest bardziej istotnym mechanizmem działania dla terapii komórkowej17,18,19 niż ich właściwość różnicowania. Jedną z najważniejszych zalet stosowania ADSC jest możliwość autologicznej infuzji lub szczepienia, stając się alternatywnym sposobem leczenia wielu chorób. W medycynie regeneracyjnej ADSC były już stosowane w przypadkach uszkodzenia wątroby, rekonstrukcji mięśnia sercowego, regeneracji tkanki nerwowej, poprawy funkcji mięśni szkieletowych, regeneracji kości, terapii nowotworów i leczenia cukrzycy20,21.
Do dnia dzisiejszego na stronie internetowej Narodowych Instytutów Zdrowia Stanów Zjednoczonych zarejestrowano 263 badania kliniczne mające na celu ocenę potencjału ADSC, wymienione na stronie internetowej Narodowych Instytutów Zdrowia Stanów Zjednoczonych22. Ustalono różne protokoły pobierania tkanki tłuszczowej, ale w literaturze nie ma zgody co do ustandaryzowanej metody izolacji ADSC do użytku klinicznego23,24. Metody przetwarzania lipoaspiratu w trakcie i po operacji mogą bezpośrednio wpływać na żywotność komórek, końcową wydajność komórkową25 oraz jakość populacji ADSC20. Jeśli chodzi o chirurgiczne leczenie wstępne, nie jest dobrze ustalone, która technika chirurgicznego leczenia wstępnego daje większą liczbę żywych komórek po izolacji, czy też roztwór znieczulający wstrzyknięty do tkanki tłuszczowej wpływa na wydajność komórek i ich funkcje26. Podobnie, różnica między technikami pozyskiwania komórek tłuszczowych może prowadzić nawet do 70% spadku liczby żywotnych ADSC20. Zgodnie z literaturą, należy unikać zabiegów mechanicznych mających na celu uzyskanie populacji komórek o wysokiej żywotności - w tym ultradźwięków - ponieważ mogą one rozbić tkankę tłuszczową20. Jednak metoda ręcznego aspiracji tłuszczu za pomocą strzykawek jest mniej szkodliwa, powodując mniejsze niszczenie komórek, a liposukcja tumescencyjna daje znaczną liczbę komórek o najlepszej jakości26.
Ta technika wykorzystuje roztwór soli fizjologicznej z lidokainą i epinefryną, który jest wstrzykiwany do obszaru liposukcji. Na każde 3 ml wstrzykniętej objętości roztworu odsysa się 1 ml. W tym badaniu przeprowadzono technikę liposukcji na mokro, w której na każdy wstrzyknięty 1 ml adrenaliny i roztworu soli fizjologicznej odsysane jest 0,2 ml tkanki tłuszczowej. Stosowanie enzymów trawiennych, zwłaszcza kolagenazy, jest powszechne w procesie izolacji ADSC.
Po pierwszym etapie izolacji w laboratorium, końcowy granulat nazywany jest frakcją naczyniową zrębu (SVF). Zawiera różne typy komórek27, w tym komórki prekursorowe śródbłonka, komórki śródbłonka, makrofagi, komórki mięśni gładkich, limfocyty, perycyty, preadipocyty i ADSC, które są zdolne do adhezji. Po zakończeniu ostatecznej izolacji z kultur in vitro, komórki, które nie przylegały do tworzywa sztucznego, są eliminowane w wyniku wymiany pożywki. Po ośmiu tygodniach ekspansji, zmian pożywki i pasażów, ADSC reprezentują większość populacji komórek w kolbach20. Jedną z najważniejszych zalet wykorzystania wyizolowanych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej do ewentualnej przyszłej terapii jest możliwość kriokonserwacji. Wykazano, że kriokonserwowany lipoaspirat jest potencjalnym źródłem komórek SVF nawet po 6 tygodniach zamrażania28, z aktywnością biologiczną nawet po 2 latach krioprezerwacji29, oraz pełną zdolnością do wzrostu i różnicowania w hodowli30. Jednak podczas procesu rozmrażania znaczny procent komórek jest zwykle tracony31. Dlatego proces usuwania lipoaspiratu i następujące po nim metody izolacji komórek muszą zapewnić najwyższą wydajność komórek.
To badanie opisuje szybszą metodologię zbierania i izolowania ADSC, wykazując wysoką wydajność komórkową i żywotność dla lepszej skuteczności terapii komórkowych. Ponadto oceniono wpływ tej ulepszonej techniki po długotrwałej kriokonserwacji SVF.

<table><tbody><tr><td>1,8 ml kriowiale</td><td>Nunc Thermo Fisher Scientific</td><td>340711</td><td></td></tr><tr><td>150 ml worek transferowy z polichlorku winylu</td><td>JP FARMA</td><td>80146150059</td><td></td></tr><tr><td>2% roztwór czerwieni alizarynowej S, pH 4,2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5533</td><td></td></tr><tr><td>Adrenalina (1 mg / ml)</td><td>Hipolabor</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Alcian Blue roztwór</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1,01,647</td><td></td></tr><tr><td>Antybiotyk-Antybiotyk Przeciwgrzybiczy 100x</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCalibur Cytometr przepływowy przy użyciu BD CellQues Pro Analysis</td><td>BD BioSciences</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia 10%</td><td>Merck</td><td>102379</td><td></td></tr><tr><td>Glukonian chlorheksydyny 4%</td><td>VIC PHARMA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza, Typ I, proszek</td><td>Gibco</td><td>17018029</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (zmodyfikowana pożywka Eagle's Modified Eagle's Sole)</td> <td>Gibco</td><td>11966025</td><td></td></tr><tr><td>DPBS bez wapnia, bez magnezu (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems)</td><td>Gibco</td><td>A1285801</td><td></td></tr><tr><td>DPBS z wapniem (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Gibco Cell Therapy Systems)</td><td>Gibco</td><td>A1285601</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Gibco</td><td>10500056</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd 4%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1,00,496</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop światła odwróconego</td><td>Nikon Eclipse TS100</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Test żywych i martwych komórek</td><td>Thermofisher</td><td>01-3333-41 | 01-3333-42</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne: CD105</td><td>BD BioSciences</td><td>745927</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne: CD11B</td><td>BD BioSciences</td><td>746004</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne: CD19</td><td>BD BioSciences</td><td>745907</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne: CD34</td><td>BD BioSciences</td><td>747822</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne: CD45</td><td>DAKO</td><td>M0701</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne: CD73</td><td>BD BioSciences</td><td>746000</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne: CD90</td><td>BD BioSciences</td><td>553011</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało monoklonalne: HLA-DR</td><td>BD BioSciences</td><td>340827</td><td></td></tr><tr><td>Mr. Frosty Pojemnik do zamrażania</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami) 1x pH 7,4</td><td>Gibco</td><td>&nbsp; </td><td></td>10010023</tr><tr><td>Zestaw do różnicowania adipogenezy StemPro Zestaw do różnicowania adipogenezy</td><td>Gibco</td><td>A1007001</td><td></td></tr><tr><td>StemPro Zestaw do różnicowania w zakresie</td> ewolucji <td>Kości Gibco</td><td>A1007101</td><td></td></tr><tr><td>StemPro Zestaw do różnicowania osteogenezy</td><td>Gibco</td><td>A1007201</td><td></td></tr><tr><td>Sterylny łącznik z jednym szpikulcem z miejscem wstrzyknięcia igły</td><td>Origen Biomedical Connector, USA</td><td>NA</td><td>Oznaczenie kodowe: IBS</td></tr><tr><td>Roztwór błękitu trypanowego 0,4%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>93595</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA 0,25% 1x, czerwień fenolowa</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr></tbody></table>

technika otrzymywania mezenchymalnych komórek macierzystych z tkanki tłuszczowej i charakterystyka frakcji naczyniowej zrębu w długoterminowej kriokonserwacji

Technique for Obtaining Mesenchymal Stem Cell from Adipose Tissue and Stromal Vascular Fraction Characterization in Long-Term Cryopreservation

Ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej stają się coraz bardziej atrakcyjne, ponieważ wykazują odpowiednie cechy i są dostępnym źródłem do regeneracyjnych zastosowań klinicznych. Do pozyskiwania komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej zastosowano różne protokoły. W tym artykule opisano różne etapy ulepszonego protokołu oszczędzającego czas w celu uzyskania bardziej znaczącej ilości ADSC, pokazując, jak kriokonserwować i rozmrażać ADSC w celu uzyskania żywych komórek do ekspansji hodowli. Sto mililitrów lipoaspiratu pobrano za pomocą liposukcji strzykawkowej kalibru 3 mm o średnicy 26 cm i 3 mm z okolic brzucha dziewięciu pacjentów, którzy następnie przeszli planową abdominoplastykę. Izolację komórek macierzystych przeprowadzono za pomocą serii płukań roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco uzupełnionym wapniem i przy użyciu kolagenazy. Komórki zrębu frakcji naczyniowej (SVF) poddano kriokonserwacji, a ich żywotność sprawdzono za pomocą immunofenotypowania. Wydajność komórkowa SVF wynosiła 15,7 x 105 komórek/ml, w zakresie 6,1-26,2 komórek/ml. Przylegające komórki SVF osiągnęły konfluencję średnio po 7,5 (±4,5) dni, przy średniej wydajności komórkowej 12,3 (± 5,7) x 105 komórek/ml. Żywotność rozmrożonego SVF po 8 miesiącach, 1 roku i 2 latach wahała się między 23,06%-72,34%, przy średniej 47,7% (±24,64), przy czym najniższa żywotność korelowała z przypadkami dwuletniego zamrożenia. Zastosowanie roztworu DPBS uzupełnionego wapniem i czasem spoczynku w worku w celu wytrącenia tłuszczu przy krótszym czasie trawienia kolagenazy spowodowało zwiększenie końcowej wydajności komórkowej komórek macierzystych. Szczegółowa procedura uzyskiwania wysokich plonów żywotnych komórek macierzystych była bardziej efektywna pod względem czasu i wydajności komórkowej niż techniki z poprzednich badań. Nawet po długim okresie krioprezerwacji, w SVF znaleziono żywotne komórki ADSC.

Charakterystyka dziewięciu badanych osób, obejmująca wiek, masę ciała, wzrost i BMI, przedstawiona jest w Tabeli 1.
Na podstawie wstępnie określonego uzysku komórkowego obliczono objętość komórek inokulowanych w hodowli tak, aby była ona jak najbliższa pojemności kolby hodowlanej 75 cm2. Objętość próbki zasianej w każdym przypadku opisano w Tabeli 2. Następnie, w zależności od początkowego uzysku komórkowego, określono zmienną objętość komórek dla k...

Obecny protokół opisuje ulepszoną metodologię izolacji ADSC, co skutkuje ogromną wydajnością komórkową z zyskiem czasu w porównaniu z literaturą. Badanie to dostarcza również prostej metody uzyskiwania stosunkowo dużej liczby żywotnych komórek po długotrwałej krioprezerwacji.

Technika otrzymywania mezenchymalnych komórek macierzystych z tkanki tłuszczowej i charakterystyka frakcji naczyniowej zrębu w długoterminowej kriokonserwacji

Human mesenchymal stem cells derived from adipose tissue have become increasingly attractive as they show appropriate features and are an accessible ...

Tutaj zademonstrowaliśmy protokół uzyskiwania i przechowywania dobrych i zdolnych do życia komórek do zastosowań etapów terapeutycznych, takich jak infuzja pluripotencjalnych komórek mezenchymalnych. Główną zaletą tego jest to, że za pomocą tej techniki możemy uzyskać żywotną objętość komórki w stosunku do czasu uzyskanego na etapie izolacji komórek od pobranej tkanki. Technika ta może być rozszerzona na wszystkie choroby lub stany, w których stosuje się medycynę heterogenną i terapię komórkową.Metoda ta może być również stosowana do badania stabilności cytogenomicznej w obszarach takich jak testowanie leków, gdzie można zachęcać do długoterminowych hodowli komórkowych. Za każdym razem, gdy manipulujesz żywymi komórkami, zachowaj spokój i pewność siebie. Zachowaj szczególną ostrożność w przypadku sepsy i bądź stale czujny oczami naukowca, aby obserwować wszelkie przeciwności losu i podejmować dobre decyzje.Zacznij od zważenia worka i zmierzenia temperatury za pomocą cyfrowego bezdotykowego termometru klinicznego na podczerwień. Pozostaw worek na pięć minut w komorze laminarnej, aby wytrącić bardziej tłuste warstwy i oddzielić tkankę zawierającą komórki. Wstrzyknąć 100 mililitrów DPBS z wapniem do worka transferowego i wymieszać go rękami.Odstaw na pięć minut. Następnie użyj 60-mililitrowej strzykawki dołączonej do adaptera worka, aby wyrzucić większość wytrącającego się płynu podstawowego. Powtórz ten proces dwa razy.Dodaj 100 mililitrów roztworu wytrawiającego do torebki i pozostaw w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 30 minut, powoli mieszając. Następnie przenieś całą zawartość worka do czterech 50-mililitrowych stożkowych probówek i odwiruj je w 400G przez 10 minut w temperaturze 22 stopni Celsjusza. Odrzuć supernatant i dodaj 5 mililitrów DMEM o niskiej zawartości glukozy uzupełnionej 20% płodową surowicą bydlęcą do osadu komórkowego.Mieszaj świeży roztwór 10 mikrolitrów błękitu trypanowego o stężeniu 0,05% w wodzie destylowanej z 10 mikrolitrami zawiesiny komórkowej przez pięć minut. Użyj mikroskopu ze światłem odwróconym przy 20-krotnym powiększeniu i policz żywe komórki w komorze do liczenia komórek Neubauera. Zawieś osad komórkowy w podłożu krioochronnym o stężeniu 1 miliona komórek na mililitr.Następnie umieść 1 mililitr tej mieszaniny w fiolkach kriogenicznych. Użyj pojemnika do zamrażania o szybkości chłodzenia 1 stopnia Celsjusza na minutę i przechowuj w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez rok. Po roku przechowuj go w standardowych kasetach zanurzonych w fazie parowej ciekłego azotu.W poniższej tabeli przedstawiono dane z różnych etapów procedury od dziewięciu pacjentów. Zgodnie z początkową wydajnością komórkową określono zmienną objętość komórek dla każdej próbki. 1 mililitr próbek o wyższej wydajności komórkowej, 1,1 mililitra dla próbek o pośredniej wydajności komórkowej i 2 mililitry na próbki o niższej wydajności komórkowej.Wydajność komórkowa przed pasażem pierwszym była bardzo zróżnicowana nawet wtedy, gdy obserwowano tę samą konfluencję przed trypsynizacją. Dlatego tutaj komórki mogły rosnąć warstwami. Reprezentatywny obraz przedstawia przylegające do tworzywa sztucznego mezenchymalne ADSC przy pierwszym pasażu po izolacji pod mikroskopem świetlnym.Komórki wykazują adhezję do morfologii podobnej do plastiku i fibroblastów. Żywe komórki zliczone w komorze Neubauera w teście błękitu trypanowego pokazano tutaj. W poniższej tabeli przedstawiono dane z cytometrii przepływowej od sześciu pacjentów.Na podstawie tych komórek CD45 ujemnych określono odsetek ADSC z różnymi kombinacjami markerów komórek macierzystych. Reprezentatywne obrazy pokazują subpopulację komórek dodatnich na obecność markerów związanych z komórkami macierzystymi w SVF przypadku dziewiątego po ośmiu miesiącach kriokonserwacji. W tym przypadku R1 jest całkowitym regionem komórkowym analizowanym na wykresie rozproszenia do przodu w porównaniu z wykresem punktowym z boku.A R2 to region ujemny CD45. Populacje CD73, CD90 i CD105 są dodatnie w tym regionie. Pokazano tutaj różnicowanie ADSC w chondrocytach, osteocytach i adipocytach.Podejmując tę procedurę, pamiętaj, aby mieszać powoli, najlepiej rękami, pozostawiając w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 30 minut, aby zaobserwować zrosty i pęcherze. Utrzymuj temperaturę w pomieszczeniu roboczym na poziomie około 25 stopni Celsjusza i unikaj szoku termicznego przy znacznie wyższych temperaturach. Technika, którą tutaj pokazaliśmy, może być wykorzystana do skutecznego wyizolowania pluripotencjalnych komórek mezenchymalnych z innych tkanek.

technique-for-obtaining-mesenchymal-stem-cell-from-adipose-tissue

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Niniejszy protokół opisuje izolację komórek zrębowych pochodzących z tkanki tłuszczowej z aspiratu tłuszczowego oraz stworzenie krytycznego ubytku w kalwaru o rozmiarze 4 mm w celu oceny regeneracji szkieletu.

Naprawa modelu krytycznego ubytku kalwarii z wykorzystaniem stromalnych komórek pochodzących z tkanki tłuszczowej pozyskanych z lipoaspiratu

Ten film demonstruje technikę izolowania i hodowli fluorescencyjnie znakowanych komórek macierzystych pochodzących z grzebienia nerwowego (ADSC) z mysiej tkanki tłuszczowej łuku okołoaortalnego. Po wyizolowaniu NCADSC są wykrywane, sortowane za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją, a następnie hodowane na płytce, co sprzyja proliferacji komórek.

Izolowanie komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej myszy okołoortowej

W 2001 roku naukowcy z UCLA opisali izolację populacji dorosłych komórek macierzystych, określanych jako komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej lub ASC. W tym artykule przedstawiono izolację ASC z lipoaspiratów przy użyciu ręcznego, enzymatycznego protokołu trawienia z użyciem kolagenazy.

Ręczna izolacja komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej z ludzkich lipoaspiratów

Ten protokół zapewnia bezenzymatyczną metodę izolowania mezenchymalnych komórek macierzystych z próbek abdominoplastyki i lipoaspiratu przy użyciu metody eksplantatu. Brak ostrych enzymów lub etapów wirowania zapewnia klinicznie istotne komórki macierzyste, które można wykorzystać do badań in vitro lub przenieść z powrotem do kliniki.

Bezenzymatyczna metoda izolacji i namnażania ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej

Tutaj prezentujemy mikrofragmentację ludzkiej tkanki tłuszczowej bez enzymów przy użyciu urządzenia systemu zamkniętego. Ta nowa metoda pozwala na uzyskanie submilimetrowych skupisk tkanki tłuszczowej nadających się do przeszczepu in vivo, hodowli in vitro oraz dalszej izolacji i charakterystyki komórek.

Mikrofragmentacja ludzkiej tkanki tłuszczowej do fenotypowania komórek i charakterystyki sekretomu

Ten protokół zapewnia efektywną metodę trawienia kolagenazy do izolacji żywotnych adipocytów i komórek frakcji naczyniowej zrębu - SVF z ludzkiego tłuszczu trzewnego w jednym procesie, w tym metodologię uzyskiwania wysokiej jakości RNA z adipocytów i fenotypyfikację makrofagów SVF poprzez barwienie wielu markerów związanych z błoną do analizy za pomocą cytometrii przepływowej.

Izolacja żywotnych adipocytów i frakcji naczyniowej zrębu z ludzkiej trzewnej tkanki tłuszczowej nadającej się do analizy RNA i fenotypowania makrofagów

Produkty ksenogeniczne (chemiczne lub pochodzenia zwierzęcego) wprowadzone do etapów przygotowania/manipulacji terapii komórkowej są związane ze zwiększonym ryzykiem reaktywności immunologicznej i transmisji patogennej u pacjentów gospodarza. W tym artykule opisano całkowicie wolną od ksenogenów metodę izolacji i ekspansji in vitro ludzkich komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej.

Izolacja i hodowla ludzkich komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej za pomocą innowacyjnej metody wolnej od ksenogenu w terapii u ludzi

Ten protokół opisuje metodologię izolowania i identyfikacji mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (MSC) od szczurów Sprague Dawley.

Izolacja i identyfikacja mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej szczurów Sprague Dawley

Tkanka tłuszczowa jest doskonałym źródłem mezenchymalnych komórek macierzystych. Tutaj przedstawiamy krok po kroku ekstrakcję, hodowlę i charakterystykę komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ADSC) z tkanki tłuszczowej najądrza szwajcarskich myszy.

Izolacja, ekspansja in vitro i charakterystyka mezenchymalnych komórek macierzystych z tkanki tłuszczowej najądrza myszy

Ten protokół opisuje wszystkie procedury, od hodowli ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ADSC) i pobierania supernatantu po ekstrakcję pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) za pomocą ultrawirowania.

Oczyszczanie i charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej

Przedstawiamy tutaj standardową metodę efektywnej izolacji komórek macierzystych pochodzących z tłuszczu i adipocytów, charakteryzującą się skróceniem czasu przetwarzania o &gt;90%, wysoką żywotnością komórek oraz szeroką kompatybilnością.

Efektywna izolacja komórek macierzystych i adipocytów pochodzących z tłuszczu z tkanki tłuszczowej wieprzi

Poznaj ulepszoną metodę izolacji mezenchymalnych komórek macierzystych z tkanki tłuszczowej, zapewniającą wyższą wydajność i krótszy czas. Technika ta umożliwia długoterminową kriokonserwację przy zachowaniu żywotności komórek.

Technika otrzymywania mezenchymalnych komórek macierzystych z tkanki tłuszczowej i charakterystyka frakcji naczyniowej zrębu w długoterminowej kriokonserwacji (Wideo) | JoVE Journal

Technika otrzymywania mezenchymalnych komórek macierzystych z tkanki tłuszczowej i charakterystyka frakcji naczyniowej zrębu w długoterminowej kriokonserwacji

Przeglądaj więcej filmów