Technika otrzymywania mezenchymalnych komórek macierzystych z tkanki tłuszczowej i charakterystyka frakcji naczyniowej zrębu w długoterminowej kriokonserwacji
30 grudnia 2021
Obecny protokół opisuje ulepszoną metodologię izolacji ADSC, co skutkuje ogromną wydajnością komórkową z zyskiem czasu w porównaniu z literaturą. Badanie to dostarcza również prostej metody uzyskiwania stosunkowo dużej liczby żywotnych komórek po długotrwałej krioprezerwacji.
Tutaj zademonstrowaliśmy protokół uzyskiwania i przechowywania dobrych i zdolnych do życia komórek do zastosowań etapów terapeutycznych, takich jak infuzja pluripotencjalnych komórek mezenchymalnych. Główną zaletą tego jest to, że za pomocą tej techniki możemy uzyskać żywotną objętość komórki w stosunku do czasu uzyskanego na etapie izolacji komórek od pobranej tkanki. Technika ta może być rozszerzona na wszystkie choroby lub stany, w których stosuje się medycynę heterogenną i terapię komórkową.
Metoda ta może być również stosowana do badania stabilności cytogenomicznej w obszarach takich jak testowanie leków, gdzie można zachęcać do długoterminowych hodowli komórkowych. Za każdym razem, gdy manipulujesz żywymi komórkami, zachowaj spokój i pewność siebie. Zachowaj szczególną ostrożność w przypadku sepsy i bądź stale czujny oczami naukowca, aby obserwować wszelkie przeciwności losu i podejmować dobre decyzje.
Zacznij od zważenia worka i zmierzenia temperatury za pomocą cyfrowego bezdotykowego termometru klinicznego na podczerwień. Pozostaw worek na pięć minut w komorze laminarnej, aby wytrącić bardziej tłuste warstwy i oddzielić tkankę zawierającą komórki. Wstrzyknąć 100 mililitrów DPBS z wapniem do worka transferowego i wymieszać go rękami.
Odstaw na pięć minut. Następnie użyj 60-mililitrowej strzykawki dołączonej do adaptera worka, aby wyrzucić większość wytrącającego się płynu podstawowego. Powtórz ten proces dwa razy.
Dodaj 100 mililitrów roztworu wytrawiającego do torebki i pozostaw w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 30 minut, powoli mieszając. Następnie przenieś całą zawartość worka do czterech 50-mililitrowych stożkowych probówek i odwiruj je w 400G przez 10 minut w temperaturze 22 stopni Celsjusza. Odrzuć supernatant i dodaj 5 mililitrów DMEM o niskiej zawartości glukozy uzupełnionej 20% płodową surowicą bydlęcą do osadu komórkowego.
Mieszaj świeży roztwór 10 mikrolitrów błękitu trypanowego o stężeniu 0,05% w wodzie destylowanej z 10 mikrolitrami zawiesiny komórkowej przez pięć minut. Użyj mikroskopu ze światłem odwróconym przy 20-krotnym powiększeniu i policz żywe komórki w komorze do liczenia komórek Neubauera. Zawieś osad komórkowy w podłożu krioochronnym o stężeniu 1 miliona komórek na mililitr.
Następnie umieść 1 mililitr tej mieszaniny w fiolkach kriogenicznych. Użyj pojemnika do zamrażania o szybkości chłodzenia 1 stopnia Celsjusza na minutę i przechowuj w temperaturze 80 stopni Celsjusza przez rok. Po roku przechowuj go w standardowych kasetach zanurzonych w fazie parowej ciekłego azotu.
W poniższej tabeli przedstawiono dane z różnych etapów procedury od dziewięciu pacjentów. Zgodnie z początkową wydajnością komórkową określono zmienną objętość komórek dla każdej próbki. 1 mililitr próbek o wyższej wydajności komórkowej, 1,1 mililitra dla próbek o pośredniej wydajności komórkowej i 2 mililitry na próbki o niższej wydajności komórkowej.
Wydajność komórkowa przed pasażem pierwszym była bardzo zróżnicowana nawet wtedy, gdy obserwowano tę samą konfluencję przed trypsynizacją. Dlatego tutaj komórki mogły rosnąć warstwami. Reprezentatywny obraz przedstawia przylegające do tworzywa sztucznego mezenchymalne ADSC przy pierwszym pasażu po izolacji pod mikroskopem świetlnym.
Komórki wykazują adhezję do morfologii podobnej do plastiku i fibroblastów. Żywe komórki zliczone w komorze Neubauera w teście błękitu trypanowego pokazano tutaj. W poniższej tabeli przedstawiono dane z cytometrii przepływowej od sześciu pacjentów.
Na podstawie tych komórek CD45 ujemnych określono odsetek ADSC z różnymi kombinacjami markerów komórek macierzystych. Reprezentatywne obrazy pokazują subpopulację komórek dodatnich na obecność markerów związanych z komórkami macierzystymi w SVF przypadku dziewiątego po ośmiu miesiącach kriokonserwacji. W tym przypadku R1 jest całkowitym regionem komórkowym analizowanym na wykresie rozproszenia do przodu w porównaniu z wykresem punktowym z boku.
A R2 to region ujemny CD45. Populacje CD73, CD90 i CD105 są dodatnie w tym regionie. Pokazano tutaj różnicowanie ADSC w chondrocytach, osteocytach i adipocytach.
Podejmując tę procedurę, pamiętaj, aby mieszać powoli, najlepiej rękami, pozostawiając w temperaturze 37 stopni Celsjusza na 30 minut, aby zaobserwować zrosty i pęcherze. Utrzymuj temperaturę w pomieszczeniu roboczym na poziomie około 25 stopni Celsjusza i unikaj szoku termicznego przy znacznie wyższych temperaturach. Technika, którą tutaj pokazaliśmy, może być wykorzystana do skutecznego wyizolowania pluripotencjalnych komórek mezenchymalnych z innych tkanek.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół przedstawia ulepszoną metodologię izolacji mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzenia tłuszczowego (ADSCs), pozwalającą na uzyskanie wyższej wydajności komórkowej i skrócenie czasu procesu w porównaniu z istniejącą literaturą. Opisano w nim również metodę pozyskiwania znacznej liczby żywych komórek po długotrwałej kriosprzechowywaniu.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Badania nad komórkami macierzystymi
- Zastosowania terapeutyczne
Wprowadzenie
- ADSCs są cenne w medycynie regeneracyjnej.
- Techniki izolacji mogą wpływać na żywotność i wydajność komórek.
- Długoterminowa krio konserwacja jest kluczowa dla przechowywania komórek.
- Zastosowania w terapii komórkowej wymagają wysokiej jakości populacji komórek.
Cel badania
- W celu usprawnienia procesu izolacji ADSC.
- W celu poprawy żywotności komórek po kriokonserwacji.
- W celu zapewnienia niezawodnej metody do zastosowań terapeutycznych.
Zastosowane metody
- Izolacja ADSC z pobranej tkanki.
- Ocena żywotności komórek po kriokonserwacji.
- Zastosowanie metody w kontekstach terapeutycznych.
- Monitorowanie stabilności cytogenomowej podczas hodowli.
Główne wyniki
- Znaczący wzrost wydajności żywych komórek.
- Skrócenie czasu wymaganego do izolacji komórek.
- Skuteczne długoterminowe zachowanie żywotności komórek.
- Potencjalne zastosowania w różnych obszarach terapeutycznych.
Wnioski
- Ulepszony protokół jest skuteczny w izolacji ADSC.
- Długoterminowa krio konserwacja pozwala zachować żywotność komórek.
- Metoda ta wspiera postępy w terapii komórkowej.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Efektywna izolacja i długoterminowa kriokonserwacja mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ADSCs) mają bezpośredni wpływ na skalowalność i wiarygodność badań opartych na komórkach oraz rozwoju przedklinicznego. Niniejszy protokół pozwala na uzyskanie większej liczby żywych komórek oraz wysokiej przeżywalności po przedłużonym przechowywaniu, co wspiera przepływy translacyjne i ciągłość procesów w pipeline'ach biofarmaceutycznych. Niezawodny dostęp do dobrze scharakteryzowanych ADSCs stanowi podstawę pewności prognostycznej we wczesnych etapach odkrywania leków oraz w późniejszym modelowaniu terapeutycznym.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia stabilne pozyskiwanie żywotnych ADSC do badań nad szlakami sygnałowymi w oparciu o postawione hipotezy.
- Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez zapewnienie spójnych, wysokiej jakości populacji komórek.
- Ułatwia funkcjonalną walidację celu dzięki powtarzalnej ekspansji i różnicowaniu komórek.
Przesiewy i opracowanie testów
- Zapewnia standaryzowane, kriokonserwowane ADSC w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności analizy.
- Poprawia wiarygodność wyników ilościowych poprzez utrzymanie żywotności komórek po rozmrożeniu.
- Umożliwia przygotowanie zwalidowanych systemów biologicznych do przesiewania i oceny związków.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wspiera modelowanie istotne dla przebiegu chorób, zapewniając dostęp do multipotencjalnych ADSCs po długotrwałym przechowywaniu.
- Utrzymuje ciągłość translacyjną od etapu pozyskiwania komórek po fazy walidacji przedklinicznej.
- Zmniejsza ryzyko zmienności biologicznej w badaniach przedklinicznych poprzez standaryzację jakości materiału komórkowego.
Integracja potoków i przepływów pracy
Niniejszy protokół integruje etapy od wczesnego odkrywania do badań przedklinicznych, zapewniając stałą podaż ADSC do walidacji celów, opracowywania testów oraz badań translacyjnych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych dzięki zastosowaniu wiarygodnych populacji ADSC.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne i ilościowe materiały do testów komórkowych po kriokonserwacji.
- Analityka: Dostarcza dane dotyczące żywotności i immunofenotypowania w celu oceny jakości komórek w różnych partiach.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość charakterystyk komórkowych w modelowaniu chorób i badaniach nad biomarkerami.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy reużywalny zasób kriokonserwowanych ADSC dla wielu programów B+R.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach opartych na komórkach.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje izolację i przechowywanie komórek, poprawiając powtarzalność i skalowalność.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie lepszych decyzji typu go/no-go poprzez zapewnienie spójnej jakości i żywotności komórek.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój programów terapeutycznych opartych na komórkach.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymagana jest biegłość w technice aseptycznej oraz w obchodzeniu się z komórkami w celu uzyskania optymalnych wyników.
- Wymagany jest dostęp do infrastruktury do zamrażania z kontrolowaną szybkością oraz do przechowywania w ciekłym azocie.
- Niezbędna jest standaryzacja protokołów liczenia komórek i oceny ich żywotności pomiędzy zespołami.
- Możliżna może być konieczność adaptacji metody dla różnych źródeł tkanek lub systemów modelowych.
- Żywotność komórek spada podczas przedłużonej kriotoksyczności, co wymaga monitorowania w przypadku długoterminowego przechowywania.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:21
Processing of Lipoaspirate
2:29
Counting of the SVF Cells
3:19
Results: Morphology and Viability of ADSCs, bthe Subpopulation of Cells Positive for Stem Cell-Associated Markers in SVF, and the Differentiation Assay
5:05
Conclusion
