Name: Cyfrowa metoda kropelkowej PCR do ilościowego oznaczania skuteczności transdukcji AAV w siatkówce myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Poznaj cyfrową metodę kropelkową PCR do ilościowego oznaczania skuteczności transdukcji AAV w siatkówce myszy. Ta technika umożliwia precyzyjną ocenę terapii genowej w badaniach nad siatkówką.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Oezkan Keles, Josephine Jüttner i Prof. Botond Roska, Institute of Molecular and Clinical Ophthalmology, Basel, Complex Viruses Platform za ich pomoc i wsparcie w produkcji AAV. Chcielibyśmy również podziękować prof. Jean Bennett z Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania za szczep AAV8/BP2. Prace ze zwierzętami wykonywane są w zwierzęcym zakładzie Uniwersytetu Technicznego w Gebze. W tym celu dziękujemy Leyli Dikmetas i prof. Uygarowi Halisowi Tazebayowi za pomoc techniczną i wsparcie dla hodowli zwierząt. Chcielibyśmy również podziękować dr Fatmie Ozdemir za jej uwagi na temat manuskryptu. Prace te są wspierane przez TUBITAK, granty o numerach 118C226 i 121N275 oraz grant integracyjny Uniwersytetu Sabanci.

Wszystkie protokoły eksperymentalne zostały zaakceptowane przez komisję etyki Uniwersytetu Sabanci, a eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z oświadczeniem "Stowarzyszenia Badań nad Widzeniem i Okulistyką" w sprawie wykorzystania zwierząt w badaniach
1. Produkcja AAV na małą skalę12
<ol>
	<li>Hodowla HEK293T komórek za pomocą 15 cm płytek w pełnych 10 ml DMEM/10% FBS aż do 70-80% konfluencji.</li>
	<li>Przygotować mieszaninę transfekcji z 20 μg plazmidu pomocniczego (pHGT1-Adeno1), 7 μg plazmidu kapsydu i 7 μg wektora AAV2-CBA-tdPomidor-WPRE oraz 136 μl roztworu PEI (1 mg/ml) w 5 ml DMEM.</li>
	<li>Dodać 5 ml przygotowanej mieszaniny do transfekcji do naczynia do hodowli komórkowej zawierającej 10 ml pożywki hodowlanej i inkubować transfekowane komórki przez 48-60 godzin w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Zebrać pożywkę w 48-60 godzin po transfekcji i wytrawić ją za pomocą DNazy I w końcowym stężeniu 250 U/ml przez 30 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Odwirować przefermentowane media w temperaturze 4000 x g, 4 °C przez 30 minut, a następnie przefiltrować je za pomocą filtra strzykawkowego 0,22 μm do wstępnie zwilżonej membrany z regenerowanej celulozy na 100 kDa.</li>
	<li>Odwirować membranę z regenerowanej celulozy w temperaturze 4000 x g, 4 °C przez 30 minut i wyrzucić pożywkę.</li>
	<li>Przemyć i odwirować zregenerowaną membranę celulozową PBS zawierającym 0,001% Pluronic F-68 trzykrotnie w temperaturze 4000 x g, 4 °C przez 30 min. Na każdym etapie należy wyrzucić PBS.</li>
	<li>Zebrać skoncentrowane AAV z górnej części membrany regenerowanej celulozy i podwielokrotności do dalszych zastosowań.</li>
	<li>Trawić 5 μl świeżo przygotowanego AAV z DNazą I (0,2 U/μl) przez 15 minut w temperaturze 37 °C w celu miareczkowania. Następnie następuje 10-minutowa inkubacja w temperaturze 95 °C w celu zarówno inaktywacji DNazy I, jak i degradacji kapsydów wirusa.</li>
	<li>Przygotować 10-krotne seryjne rozcieńczenie z strawionych AAV przy użyciu 0,05% Pluronic F-68. Do miareczkowania należy stosować startery AAV2-ITR i WPRE (Tabela 1). Miana obliczono, mnożąc wyniki dd-PCR przez współczynniki rozcieńczenia. Wyniki przeliczono na kopię genomu/ml (GC/ml). 
	UWAGA: Oczekuje się, że stężenia AAV przy produkcji AAV na małą skalę wynoszą około 1 x 1012 GC/ml. Ten protokół nie ma zastosowania do szczepów AAV, które nie uwalniają skutecznie AAV do pożywek takich jak AAV213.</li>
</ol>
2. Iniekcja doszklistkowa AAV
<ol>
	<li>Przygotowanie sprzętu
	<ol>
		<li>Przed rozpoczęciem należy przygotować mikrostrzykawkę o pojemności 10 μl z igłą o sile 36 g. Spłukać pięć razy 70% EtOH, pięć razy w ddH2O, a na koniec pięć razy PBS.</li>
		<li>Do mikrostrzykawki należy wprowadzić odpowiednią ilość AAV przy każdym wstrzyknięciu.</li>
		<li>Przygotuj igłę chirurgiczną (szew, jedwab, 6/0), taśmę, kleszcze i nożyczki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Iniekcja doszklistkowa
	<ol>
		<li>Zastosuj 1 kroplę 0,5% tropikamidu i 2,5% chlorowodorku fenylefryny (np. Mydfrin) zawierającego krople do oczu przed znieczuleniem, aby rozszerzyć źrenice.</li>
		<li>Znieczulij myszy izofluranem 5% (1 l/min) i kontynuuj podawanie 1,5% izofluranu (1 l/min) podczas zabiegu. Do pierwszej indukcji używana jest mała komora izofluranu.</li>
		<li>Sprawdź głębokość znieczulenia na podstawie utraty odruchu prostowania, odruchu wycofania i reakcji uszczypnięcia ogona.</li>
		<li>Przed zabiegiem wstrzyknięcia należy nałożyć 0,3% tobramycyny i 0,1% sterylnego roztworu okulistycznego deksametazonu do każdego oka. Stosowanie kropli do oczu zapobiega przesuszeniu oraz działa przeciwzapalnie i przeciwbakteryjnie.</li>
		<li>Użyj haczyka chirurgicznego, aby ustabilizować górną powiekę. Lekko odciągnij do tyłu, aby odsłonić grzbietową część oka. Przyklej haczyk do ławki, aby utrzymać go na miejscu.</li>
		<li>Usuń spojówkę (mniej niż 1 mm2) za pomocą zakrzywionych nożyczek do tęczówki, aby odsłonić twardówkę oka pod mikroskopem preparacyjnym. Użyj świeżej i sterylnej strzykawki insulinowej (30 G), aby nakłuć twardówkę.</li>
		<li>Wprowadzić igłę mikrostrzykawki przez to samo nakłucie za pomocą mikromanipulatora. Umieść końcówkę igły za soczewką na środku muszli ocznej.</li>
		<li>Wstrzyknij 1 μl AAV2/BP2 i AAV2/PHP. Wektory S o stężeniach 1,63 x 1012 GC/ml i 1,7 x 1012 GC/ml powoli docierają do ciała szklistego oka. Regulacja objętości wtrysku odbywa się ręcznie. Pozostawić igłę na miejscu na 1 minutę i powoli ją wyjmować.</li>
		<li>Zwolnij powiekę i nałóż przeciwzapalny i przeciwbakteryjny żel do stosowania miejscowego zawierający 0,3% tobramycyny i 0,1% deksametazonu na muszlę oczną. Monitoruj i oceniaj myszy w kolejnych dniach zgodnie z arkuszem wyników pod względem wyglądu (jasne oczy, zadbana sierść, garbienie się), zachowania (aktywność, unieruchomienie, samookaleczenie) i masy ciała w skali od 0 do 3. Każdy warunek ma wynik od 0 do 3, a łączny wynik 3 lub wyższy jest kryterium zakończenia.</li>
		<li>Po wyzdrowieniu umieścić zwierzęta w klatce.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Fluorescencja i obrazowanie dna oka
<ol>
	<li>Odcedź mysz i rozszerz źrenicę, umieszczając krople 0,5% tropikamidu i 2,5% chlorowodorku fenylefryny w każdym oku.</li>
	<li>Znieczulić zwierzę powyższą procedurą izofluranem. Dokładnie oceń głębokość znieczulenia, ściskając łapy.</li>
	<li>Umieść mysz na stoliku do obrazowania i sprawdź prawidłowe rozszerzenie, sprawdzając przez kamerę do badania dna oka. Nałóż żel do stosowania miejscowego (0,2% karbomeru 980) na powierzchnię oczu, aby chronić oczy przed odwodnieniem w znieczuleniu i użyć go jako żelu sprzęgającego do obrazowania.</li>
	<li>Manipuluj stolikiem obrazowania, aby zrównał się z końcówką obiektywu. Dostosuj stół montażowy zgodnie z potrzebami, aby wyśrodkować oko myszy. Gdy oko zostanie wyśrodkowane, powoli przesuwaj obiektyw, aż zetknie się z okiem.</li>
	<li>Wykonaj obrazowanie dna oka i obrazowanie fluorescencyjne na obu oczach, aby śledzić ekspresję tdTomato po 1 tygodniu i 2 tygodniach po wstrzyknięciu do ciała szklistego (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3B) < klasa sup = "xref">14. Wykonaj zdjęcia dna oka i fluorescencji w identycznych ustawieniach w celu porównania ekspresji reporterowej.</li>
</ol>
4. Izolacja siatkówki
<ol>
	<li>Eutanazja zwierząt po obrazowaniu dna oka i obrazowaniu fluorescencyjnym za pomocą wdychania CO2 w celu pobrania siatkówki w ciągu 2 tygodni.</li>
	<li>Przesuń gałkę oczną do przodu za pomocą kleszczy rozdwajających o długości 13,5 cm.</li>
	<li>Wyjmij soczewkę wraz z resztkami ciała szklistego, delikatnie uciskając kleszcze.</li>
	<li>Przetnij połączenie gałki ocznej z nerwem wzrokowym za pomocą precyzyjnych zakrzywionych kleszczy i delikatnie ściśnij siatkówkę tymi samymi zakrzywionymi kleszkami.</li>
	<li>Przenieś wypreparowane siatkówki do probówki do mikrowirówki.</li>
	<li>Zatrzaskowo zamroź siatkówkę, umieszczając rurki w ciekłym azocie.</li>
</ol>
5. Izolacja genomowego DNA tkankowego
<ol>
	<li>Wyizoluj genomowe DNA za pomocą skomercjalizowanego zestawu genomowego DNA tkankowego opartego na trawieniu proteinazy K.</li>
	<li>Trawić siatkówkę w temperaturze 55 °C, 200 x g przez 30 minut z proteinazą K, która jest już dostarczona w zestawie.</li>
	<li>Wykonać etap inkubacji RNazy, etapy przemywania buforem płuczącym I i II, a na koniec etap elucji zgodnie z protokołem producenta.</li>
	<li>Dodaj dodatkowy etap wirowania po ostatnim praniu, aby usunąć resztki etanolu.</li>
	<li>Zmierzyć stężenie genomowego DNA i przechowywać próbki w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>
6. Kropelkowa cyfrowa analiza PCR próbek siatkówki myszy w celu ilościowego określenia genomów wirusowych
<ol>
	<li>Rozcieńczyć genomowe DNA z wstrzykniętych siatkówk w 0,05% roztworze Pluronic F-68, aby osiągnąć końcowe stężenie 1 ng / μl dla każdej próbki.</li>
	<li>Przeprowadzić oddzielne reakcje dla WPRE i 18S przy użyciu starterów specyficznych dla celu o końcowym stężeniu 125 nM dla każdego startera.</li>
	<li>Przeprowadź generowanie kropelek w 20 μl mieszaniny reakcyjnej PCR, w tym 1 ng genomowego DNA, starterów 125 nM i 2x supermiksu evagreen.</li>
	<li>Załaduj mieszaninę próbek do środkowej części wkładu w celu wytworzenia kropel.</li>
	<li>Po załadowaniu próbki do wkładu dodaj 70 μl oleju do wytwarzania kropelek do dolnego rzędu wkładu.</li>
	<li>Umieść uszczelkę na górze wkładu i umieść go w generatorze kropel. Upewnij się, że nie ma szczeliny między uszczelką a wkładem.</li>
	<li>Delikatnie weź około 40 μl kropelek, które powstają w górnej studzience. Dodać roztwór kropelki do 96-dołkowej płytki reakcyjnej PCR z półspódniczką.</li>
	<li>Uszczelnij płytkę PCR za pomocą uszczelniacza do płytek PCR za pomocą aluminiowej folii uszczelniającej.</li>
	<li>Umieść płytkę PCR w 96-dołkowym, zgrzewanym termocyklerze. Użyj protokołu PCR; 95 °C przez 5 min, 40 cykli po 95 °C przez 30 s, 60 °C przez 1 min, 4 °C przez 5 min, 90 °C przez 5 min i 4 °C bezstopniowe utrzymywanie. Stosuj prędkość narastania 2 °C/s w każdym cyklu, aby upewnić się, że kropelki osiągną odpowiednią temperaturę dla każdego kroku podczas cyklu</li>
	<li>Umieścić płytkę PCR w czytniku kropel, aby określić ilościowo kropelki za pomocą oprogramowania dd-PCR. Szablon jest konfigurowany przy użyciu określonych ustawień dla evagreen.</li>
	<li>Analizuj dane za pomocą wykresu 1-D z każdą próbką pod kątem intensywności fluorescencji w funkcji liczby kropel. Wartość progowa jest ułożona w taki sposób, że kropelki powyżej progu są przypisywane jako dodatnie, a poniżej jako ujemne. Następnie stosuje się algorytm Poissona w celu określenia początkowego stężenia docelowego DNA w jednostkach kopii/μl. Stosunek WPRE do 18S jest obliczany w celu pomiaru wydajności transdukcji AAV.</li>
</ol>

<ol><li>Herrmann, A. K., Grimm, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+dissection+of+AAV-host+interactions%3A+The+fast+and+the+curious%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">High-throughput dissection of AAV-host interactions: The fast and the curious.</a> Journal of Molecular Biology. 430 (17), 2626-2640 (2018).</li>
<li>Pillay, S., Carette, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+determinants+of+adeno-associated+viral+vector+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Virology%22%5BJournal%5D)">Host determinants of adeno-associated viral vector entry.</a> Current Opinion in Virology. 24, 124-131 (2017).</li>
<li>Castle, M. J., Turunen, H. T., Vandenberghe, L. H., Wolfe, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+AAV+tropism+in+the+nervous+system+with+natural+and+engineered+capsids%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Controlling AAV tropism in the nervous system with natural and engineered capsids.</a> Methods in Molecular Biology. 1382, 133-149 (2016).</li>
<li>Agbandje-McKenna, M., Kleinschmidt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV+capsid+structure+and+cell+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">AAV capsid structure and cell interactions.</a> Methods in Molecular Biology. 807, 47-92 (2011).</li>
<li>Han, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+tropism+and+transduction+of+adeno-associated+virus+varies+by+serotype+and+route+of+delivery+%28intravitreal%2C+subretinal%2C+or+suprachoroidal%29+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Retinal tropism and transduction of adeno-associated virus varies by serotype and route of delivery (intravitreal, subretinal, or suprachoroidal) in rats.</a> Human Gene Therapy. 31 (23-24), 1288-1299 (2020).</li>
<li>Muraine, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transduction+efficiency+of+adeno-associated+virus+serotypes+after+local+injection+in+mouse+and+human+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Transduction efficiency of adeno-associated virus serotypes after local injection in mouse and human skeletal muscle.</a> Human Gene Therapy. 31 (3-4), 233-240 (2020).</li>
<li>Cronin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transduction+and+optogenetic+stimulation+of+retinal+bipolar+cells+by+a+synthetic+adeno-associated+virus+capsid+and+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Efficient transduction and optogenetic stimulation of retinal bipolar cells by a synthetic adeno-associated virus capsid and promoter.</a> EMBO Molecular Medicine. 6 (9), 1175-1190 (2014).</li>
<li>Higashimoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+woodchuck+hepatitis+virus+post-transcriptional+regulatory+element+reduces+readthrough+transcription+from+retroviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">The woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element reduces readthrough transcription from retroviral vectors.</a> Gene Therapy. 14 (17), 1298-1304 (2007).</li>
<li>Pinheiro, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+droplet+digital+polymerase+chain+reaction+format+for+DNA+copy+number+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+in+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification.</a> Annals in Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).</li>
<li>Albayrak, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+quantification+of+proteins+and+mrna+in+single+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Digital quantification of proteins and mrna in single mammalian cells.</a> Molecular Cell. 61 (6), 914-924 (2016).</li>
<li>Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. J., Wilson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+determination+of+single-stranded+and+self-complementary+adeno-associated+viral+vector+genome+titers+by+droplet+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Therapy+Methods%22%5BJournal%5D)">Absolute determination of single-stranded and self-complementary adeno-associated viral vector genome titers by droplet digital PCR.</a> Hum Gene Therapy Methods. 25 (2), 115-125 (2014).</li>
<li>Juttner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+neuronal+and+glial+cell+types+with+synthetic+promoter+AAVs+in+mice%2C+non-human+primates+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Targeting neuronal and glial cell types with synthetic promoter AAVs in mice, non-human primates and humans.</a> Nature Neuroscience. 22 (8), 1345-1356 (2019).</li>
<li>Vandenberghe, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+serotype-dependent+release+of+functional+vector+into+the+culture+medium+during+adeno-associated+virus+manufacturing%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Efficient serotype-dependent release of functional vector into the culture medium during adeno-associated virus manufacturing.</a> Human Gene Therapy. 21 (10), 1251-1257 (2010).</li>
<li>Barben, M., Schori, C., Samardzija, M., Grimm, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Hif1a+rescues+cone+degeneration+and+prevents+subretinal+neovascularization+in+a+model+of+chronic+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurodegeneration%22%5BJournal%5D)">Targeting Hif1a rescues cone degeneration and prevents subretinal neovascularization in a model of chronic hypoxia.</a> Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 12(2018).</li>
<li>Chan, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+AAVs+for+efficient+noninvasive+gene+delivery+to+the+central+and+peripheral+nervous+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Engineered AAVs for efficient noninvasive gene delivery to the central and peripheral nervous systems.</a> Nature Neuroscience. 20 (8), 1172-1179 (2017).</li>
<li>Guiet, R., Burri, O., Seitz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+source+tools+for+biological+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Open source tools for biological image analysis.</a> Methods Molecular Biology. 2040, 23-37 (2019).</li>
<li>Parks, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variant+ribosomal+RNA+alleles+are+conserved+and+exhibit+tissue-specific+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Variant ribosomal RNA alleles are conserved and exhibit tissue-specific expression.</a> Science Advances. 4 (2), (2018).</li>
<li>Aurnhammer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+real-time+PCR+for+the+detection+and+quantification+of+adeno-associated+virus+serotype+2-derived+inverted+terminal+repeat+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy+Methods%22%5BJournal%5D)">Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences.</a> Human Gene Therapy Methods. 23 (1), 18-28 (2012).</li>
<li>Maclachlan, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+safety+evaluation+of+AAV2-sFLT01-+a+gene+therapy+for+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Preclinical safety evaluation of AAV2-sFLT01- a gene therapy for age-related macular degeneration.</a> Molecular Therapy. 19 (2), 326-334 (2011).</li>
<li>Stieger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+intact+rAAV+particles+up+to+6+years+after+successful+gene+transfer+in+the+retina+of+dogs+and+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Detection of intact rAAV particles up to 6 years after successful gene transfer in the retina of dogs and primates.</a> Molecular Therapy. 17 (3), 516-523 (2009).</li>
<li>Gyorgy, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allele-specific+gene+editing+prevents+deafness+in+a+model+of+dominant+progressive+hearing+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Allele-specific gene editing prevents deafness in a model of dominant progressive hearing loss.</a> Nature Medicine. 25 (7), 1123-1130 (2019).</li>
<li>Cox, D. B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+editing+with+CRISPR-Cas13%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA editing with CRISPR-Cas13.</a> Science. 358 (6366), 1019-1027 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym protokole wygenerowaliśmy dwa wektory AAV, które mają różne białka kapsydu, a następnie odpowiednio je zbalansowaliśmy. Jednym z najważniejszych etapów tego protokołu jest wytworzenie wystarczającej ilości AAV, które dadzą wykrywalną ekspresję reporterową po transdukcji12,13.
Mianowanie AAV jest również ważnym czynnikiem przy dostosowywaniu dawek AAV do wstrzyknięć doszklistkowych. Po spełnieniu tych ważnych kryteriów możliwe jes...

Wirusy związane z adeno (AAV) są teraz powszechnie używane do różnych badań nad terapią genową siatkówki. AAV zapewniają bezpieczny i skuteczny sposób dostarczania genów przy mniejszej immunogenności i mniejszej liczbie integracji genomu. Wnikanie AAV do komórki docelowej następuje poprzez endocytozę, która wymaga wiązania receptorów i koreceptorów na powierzchni komórki1,2. Dlatego skuteczność transdukcji AAV dla różnych typów komórek zależy głównie od kapsydu i jego interakcji z receptorami komórek gospodarza. AAV mają serotypy, a każdy serotyp może mieć odrębne tropizmy komórkowe/tkankowe i skuteczność transdukcji. Istnieją również sztuczne serotypy i warianty AAV generowane przez chemiczną modyfikację kapsydu wirusa, produkcję kapsydów hybrydowych, insercję peptydów, tasowanie kapsydu, ukierunkowaną ewolucję i racjonalną mutagenezę3. Nawet niewielkie zmiany w sekwencji aminokwasów lub strukturze kapsydu mogą mieć wpływ na interakcje z czynnikami komórkowymi gospodarza i skutkować różnymi tropizmami4. Oprócz wariantów kapsydu, inne czynniki, takie jak droga wstrzyknięcia i zmienność produkcji AAV z partii na partię, mogą wpływać na skuteczność transdukcji AAV w siatkówce neuronalnej. Dlatego konieczne są wiarygodne metody porównywania szybkości transdukcji dla różnych wariantów.
Większość metod określania skuteczności transdukcji AAV opiera się na ekspresji genu reporterowego. Należą do nich obrazowanie fluorescencyjne, immunohistochemia, western blot lub analiza histochemiczna produktu genu reporterowego5,6,7. Jednak ze względu na ograniczenie wielkości AAV, nie zawsze jest możliwe włączenie genów reporterowych w celu monitorowania wydajności transdukcji. Stosowanie silnych promotorów, takich jak hybrydowy wzmacniacz CMV / beta-aktyna kurczaka lub potranskrypcyjny element regulatorowy zapalenia wątroby Woodchuck (WPRE) jako sekwencja stabilizująca mRNA, dodatkowo komplikuje problem rozmiaru8. W związku z tym korzystne będzie również określenie szybkości transdukcji wstrzykiwanych AAV za pomocą bardziej bezpośredniej metodologii.
Cyfrowy kropelkowy PCR (dd-PCR) to potężna technika ilościowego oznaczania docelowego DNA z niewielkich ilości próbek. Technologia dd-PCR polega na enkapsulacji docelowego DNA i mieszaniny reakcji PCR za pomocą kropelek oleju. Każda reakcja dd-PCR zawiera tysiące kropel. Każda kropla jest przetwarzana i analizowana jako niezależna reakcja PCR9. Analiza kropelek umożliwia obliczenie bezwzględnej liczby kopii docelowych cząsteczek DNA w dowolnej próbce za pomocą algorytmu Poissona. Ponieważ skuteczność transdukcji AAV jest skorelowana z liczbą kopii genomów AAV w siatkówce neuronalnej, zastosowaliśmy metodę dd-PCR do ilościowego określenia genomów AAV.
Tutaj opisujemy metodologię dd-PCR do obliczania skuteczności transdukcji wektorów AAV z genomowego DNA siatkówki6,10. Po pierwsze, AAV, które wyrażają tdTomato reporter, zostały wygenerowane przy użyciu protokołu małej skali i zbalansowane metodą dd-PCR11. Po drugie, AAV zostały wstrzyknięte do ciała szklistego do siatkówki neuronalnej. Aby zademonstrować wydajność transdukcji, najpierw określiliśmy ilościowo ekspresję tdTomato za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej i oprogramowania ImageJ. Następnie wyizolowano genomowe DNA w celu ilościowego określenia genomów AAV w wstrzykniętych siatkówkach za pomocą dd-PCR. Porównanie poziomów ekspresji tdTomato z transdukowanymi genomami AAV oznaczonymi ilościowo za pomocą dd-PCR wykazało, że metoda dd-PCR dokładnie określiła ilościowo skuteczność transdukcji wektorów AAV. Nasze protokoły wykazały szczegółowy opis metodologii opartej na dd-PCR w celu ilościowego określenia skuteczności transdukcji AAV. W tym protokole pokazujemy również bezwzględną liczbę genomów AAV, które są transdukowane po wstrzyknięciach do ciała szklistego, po prostu używając czynnika rozcieńczającego po izolacji genomowego DNA i wyników dd-PCR. Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten zapewnia potężną metodę, która byłaby alternatywą dla ekspresji reporterowej w celu ilościowego określenia skuteczności transdukcji wektorów AAV w siatkówce.

<table><tbody><tr><td>96-dołkowe płytki ddPCR z półspódniczką</td><td>Uszczelki BioRad</td><td>12001925</td><td>ddPCR</td></tr><tr><td>Amicon Filter</td><td>Millipore</td><td>UFC910096</td><td>AAV</td></tr><tr><td>C1000 TOUCH 96 STUDNI GŁĘBOKICH</td><td>BioRad</td><td>1851197</td><td>ddPCR</td></tr><tr><td>C57BL/6JRj szczep myszy</td><td>Janvier</td><td>C57BL/6JRj</td><td></td></tr><tr><td>Uszczelki DG8</td> Wkłady <td>BioRad</td><td>1863009</td><td>ddPCR</td></tr><tr><td>DG8</td><td>BioRad</td><td>1864008</td><td>ddPCR</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Lonza</td><td>BE12-604Q</td><td>AAV</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>PAN BIOTECH</td><td>L 1825</td><td>AAV</td></tr><tr><td>Olej do wytwarzania kropelek eva zielony</td><td>BioRad</td><td>1864006</td><td>ddPCR</td></tr><tr><td>Olej do czytnika kropelek</td><td>BioRad</td><td>1863004</td><td>ddPCR</td></tr><tr><td>FBS</td><td>PAN BIOTECH</td><td>p30-3306</td><td>AAV</td></tr><tr><td>Uszczelki foliowe do PX1 Uszczelniacz płytek do</td><td>PCR BioRad</td><td>1814040</td><td>ddPCR</td></tr><tr><td>Strzykawki insulinowe</td><td>BD Medical</td><td>320933</td><td>Iniekcja doszklistkowa</td></tr><tr><td>Izofluran</td><td>ADEKA ILAC SANAYI VE TICARET</td> N01AB06 <td></td><td>znieczulający</td></tr><tr><td>mikrowstrzykiwacz MM33</td><td>World Precision Instruments</td><td>82-42-101-0000</td><td>Iniekcja doszklistkowa</td></tr><tr><td>Micron IV</td><td>Phoenix Research Labs</td><td>Micron IV</td><td>System mikroskopowy oparty na kolorowej kamerze 3 CCD, frame grabberze i gotowym oprogramowaniu umożliwia naukowcom obrazowanie siatkówki myszy.</td></tr><tr><td>Mydfrin (%2,5 chlorowodorek fenylefryny)</td><td>Alcon</td><td>S01FB01</td><td>rozszerzenie źrenicy</td></tr><tr><td>Nanofil Strzykawka 10 &mu; l</td><td>World Precision Instruments</td><td>NANOFIL</td><td>Igła do iniekcji doszklistkowej</td></tr><tr><td>RN G36, 25 mm, PST 2</td><td>World Precision Instruments</td><td>NF36BL-2</td><td>Iniekcja doszklistkowa</td></tr><tr><td>PEI-MAX</td><td>Polyscience</td><td>24765-1</td><td>AAV</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>PAN BIOTECH</td><td>P06-07100</td><td>Plazmid AAV</td></tr><tr><td>pHGT1-Adeno1</td><td>PlasmidFactory</td><td>PF1236</td><td>AAV</td></tr><tr><td>Pluronic F-68</td><td>Gibco</td><td>24040032</td><td>AAV</td></tr><tr><td>PX1 System uszczelniania płytek PCR</td><td>BioRad</td><td>1814000</td><td>ddPCR</td></tr><tr><td>QX200 ddPCR EvaGreen Supermix</td><td>Czytnik</td> kropel <td>1864034</td><td>ddPCR</td></tr><tr><td>QX200/generator kropel QX200</td><td>BioRad</td><td>1864001</td><td>ddPCR</td></tr><tr><td>SPLITTER KLESZCZYK WATCHER MAKER - DŁUGOŚĆ = 13,5 CM</td><td>endostall medyczny</td><td>EJN-160-0155</td><td>Izolacja siatkówki</td></tr><tr><td>Sterylny filtr strzykawkowy</td><td>AISIMO</td><td>ASF33PS22S</td><td></td></tr><tr><td>AAV Zestaw do genomowego DNA tkankowego</td><td>EcoSpin</td><td>E1070</td><td>Izolacja gDNA</td></tr><tr><td>Tobradex (0,3% tobramycyny / 0,1% deksametazonu)</td><td>Alcon</td><td>S01CA01</td><td>przeciwzapalny / antybiotyk</td></tr><tr><td>Tropamid (% 0,5 tropikamidu)</td><td>Bilim Ilac Sanayi ve Ticaret AS.</td><td>S01FA06</td><td>rozszerzenie źrenicy</td></tr><tr><td>Turbonukleaza</td><td>Accelagen</td><td>N0103L</td><td>AAV</td></tr><tr><td>Viscotears (karbomer 2 mg/g)</td><td>Bausch+Lomb</td><td>S01XA20</td><td>lubrykant do oczu krople do oczu</td></tr></tbody></table>

cyfrowa metoda kropelkowej pcr do ilościowego oznaczania skuteczności transdukcji aav w siatkówce myszy

Digital Droplet PCR Method for the Quantification of AAV Transduction Efficiency in Murine Retina

Wiele laboratoriów biologii komórek siatkówki teraz rutynowo używa wirusów związanych z adenowirusami (AAV) do edycji genów i zastosowań regulacyjnych. Skuteczność transdukcji AAV jest zwykle krytyczna, co wpływa na ogólne wyniki eksperymentu. Jednym z głównych czynników decydujących o skuteczności transdukcji jest serotyp lub wariant wektora AAV. Obecnie dostępne są różne sztuczne serotypy i warianty AAV o różnym powinowactwie do receptorów na powierzchni komórki gospodarza. W przypadku terapii genowej siatkówki skutkuje to różnym stopniem skuteczności transdukcji dla różnych typów komórek siatkówki. Ponadto droga iniekcji i jakość produkcji AAV mogą również wpływać na skuteczność transdukcji AAV w siatkówce. Dlatego ważne jest, aby porównać wydajność różnych wariantów, partii i metodologii. Metoda cyfrowego kropelkowego PCR (dd-PCR) określa ilościowo kwasy nukleinowe z dużą precyzją i pozwala na bezwzględne oznaczanie ilościowe danego celu bez żadnego wzorca lub odniesienia. Za pomocą dd-PCR możliwa jest również ocena skuteczności transdukcji AAV poprzez bezwzględną kwantyfikację liczby kopii genomu AAV w wstrzykniętej siatkówce. W tym miejscu przedstawiamy prostą metodę ilościowego określania szybkości transdukcji AAV w komórkach siatkówki za pomocą dd-PCR. Przy niewielkich modyfikacjach metodologia ta może również stanowić podstawę do ilościowego oznaczania liczby kopii mitochondrialnego DNA, a także oceny wydajności edycji zasad, krytycznej dla kilku chorób siatkówki i zastosowań terapii genowej.

Produkcja AAV w małej skali to szybka i wydajna metoda dostarczająca wektorów do iniekcji do ciała szklistego (Rycina 1). Produkcja AAV w małej skali zazwyczaj pozwala uzyskać miana w zakresie 1 x 1012 GC/ml, co jest wystarczające do wykrycia ekspresji reportera w siatkówce (Rycina 2). Oznaczanie miana AAV za pomocą dd-PCR daje spójne wyniki. Rutynowo stosuje się startery specyficzne dla ITR2 i WPRE, a początkową koncentrację każdej cząsteczki docelow...

Ten protokół pokazuje, jak określić ilościowo skuteczność transdukcji AAV w siatkówce myszy za pomocą cyfrowego kropelkowego PCR (dd-PCR) wraz z produkcją AAV na małą skalę, iniekcją doszklistkową, obrazowaniem siatkówki i izolacją genomowego DNA siatkówki.

Cyfrowa metoda kropelkowej PCR do ilościowego oznaczania skuteczności transdukcji AAV w siatkówce myszy

Many retinal cell biology laboratories now routinely use Adeno-associated viruses (AAVs) for gene editing and regulatory applications. The efficiency of ...

W tym filmie pokażemy, jak określić ilościowo transdukcję AAV w siatkówce myszy za pomocą cyfrowej metody PCR kropelkowej, która jest niezwykle czuła i wykonuje bezwzględną kwantyfikację docelowego DNA. Opracowaliśmy tę metodę głównie dla dużych konstruktów AVV, która nie pozwala nam na użycie genu reporterowego, takiego jak konstrukty oparte na CRISPR. Korzystając z tej metody, możemy po prostu określić ilościowo szybkość transdukcji AAV w siatkówce.Metoda ta opiera się na czułości i bezwzględnej kwantyfikacji cyfrowego PCR kropelkowego i daje proste wyniki. W tym filmie pokażemy, jak określić ilościowo transdukcję AAV w siatkówce myszy za pomocą cyfrowej metody PCR kropelkowej, która jest niezwykle czuła i wykonuje bezwzględną kwantyfikację docelowego DNA. Opracowaliśmy tę metodę głównie dla konstruktów o dużej powierzchni, która nie pozwala nam na użycie genu reporterowego, takiego jak konstrukty oparte na CRISPR.Korzystając z tej metody, możemy po prostu określić ilościowo szybkość transdukcji AAV w siatkówce. Metoda ta opiera się na czułości i bezwzględnej kwantyfikacji PCR z dwiema kroplami i daje proste wyniki. Ze względu na skuteczność metodologii cyfrowego PCR kropelkowego, kilka laboratoriów już przechodzi z ilościowego PCR w czasie rzeczywistym na cyfrowy PCR kropelkowy lub miareczkowanie AAV.Metoda ta może również stanowić podstawę do kwantyfikacji mitochondrialnego DNA w siatkówce, a także sprawdzić skuteczność korekcji mutacji opartej na CRISPR w terapii genowej w siatkówce myszy. Przygotuj mieszaninę transfekcji z plazmidem pomocniczym AAV, plazmidem kapsydu AAV, wektorem AAV i roztworem PI w zapotrzebowaniu na pięć mililitrów. Dodaj pięć mililitrów przygotowanej mieszaniny transfekcji do pożywki hodowlanej.Inkubować transfekowane komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Zbierz pożywkę po 48 do 60 godzinach od transfekcji. Trawić pożywkę z DNA w końcowym stężeniu 250 jednostek na mililitr przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i odwirowywać w temperaturze 4 000 g w czterech stopniach Celsjusza przez 30 minut.Wstępnie zwilż membranę z regenerowanej celulozy PBS. Przefiltruj media za pomocą filtra strzykawkowego o wielkości 0,22 mikrometra do wstępnie zwilżonej membrany z regenerowanej celulozy dla 100 kilogramów daltonów. Odwirować membranę z regenerowanej celulozy w temperaturze 4 000 G w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 30 minut i wyrzucić pożywkę.Przemyć i odwirować membranę z regenerowanej celulozy PBS zawierającym 0,001% pluronu F68 trzykrotnie w temperaturze 4000 G i czterech stopni Celsjusza przez 30 minut. Skoncentrowaną wartość AAV należy zebrać z górnej części zregenerowanej błony celulozowej i przeznaczyć do dalszego wykorzystania. Tutaj pokazaliśmy, jak zrobić produkcję AAV na mniejszą skalę.Po sprawdzeniu tego protokołu powinieneś być w stanie wytworzyć AVV, które są wystarczające, aby zobaczyć ekspresję reporterową w siatkówce. Możesz również postępować zgodnie z protokołem cyfrowego PCR, aby móc określić miano wyprodukowanych AAV. Zastosuj jedną kroplę 0,5% tropikamidu i 2,5% chlorowodorku fenylefryny zawierającego krople do oczu przed znieczuleniem, aby rozszerzyć źrenice.Znieczulij myszy izofluranem i zweryfikuj odruchy. Przed zabiegiem wstrzyknięcia należy zastosować 0,3% tobramycyny i 0,1% sterylnego roztworu okulistycznego deksametazonu do każdego oka. Użyj haczyka chirurgicznego, aby ustabilizować górną powiekę.Lekko odciągnij do tyłu, aby odsłonić grzbietową część oka. Przyklej haczyk do opaski, aby utrzymać go na miejscu. Usuń spojówkę nożyczkami z zakrzywioną tęczówką, aby odsłonić twardówkę oka.Użyj świeżej i sterylnej strzykawki insulinowej 30G, aby nakłuć twardówkę. Wprowadzić igłę mikrostrzykawki przez to samo nakłucie za pomocą mikromanipulatora. Umieść końcówkę igły za soczewką na środku muszli ocznej.Wstrzyknąć powoli jeden mikrolitr roztworu AAV do ciała szklistego oka. Pozostawić igłę na miejscu na jedną minutę i powoli ją wyjąć. Nałóż przeciwzapalny i przeciwbakteryjny żel do stosowania miejscowego zawierający 0,3% tobramycyny i 0,1% deksametazonu na muszkę oczną.Nałóż jedną kroplę 0,5% tropikamidu. I 2,5% chlorowodorek fenylefryny zawierający krople do oczu przed znieczuleniem w celu rozszerzenia źrenic. Nałóż karbamid dwa miligramy na gram żelu do stosowania miejscowego na powierzchnię oczu.W razie potrzeby dostosuj podstawkę myszy, aby wyśrodkować oko myszy. Wykonaj obrazowanie dna oka i obrazowanie fluorescencyjne na obu oczach, aby śledzić ekspresję TdTomato tydzień i dwa tygodnie po wstrzyknięciu do ciała szklistego. Przed zabiegiem należy poddać zwierzęta eutanazji za pomocą inhalacji dwutlenkiem węgla.Przesuń gałkę oczną do przodu za pomocą kleszczy rozłupujących 13,5 centymetra. Wyjmij soczewkę razem z resztkami ciała szklistego. Przetnij połączenie gałki ocznej z nerwem wzrokowym za pomocą precyzyjnych zakrzywionych kleszczyków i delikatnie ściśnij siatkówkę tymi samymi zakrzywionymi kleszczami.Wyizoluj genomowe DNA za pomocą skomercjalizowanego zestawu białkoazy K do błony genomowego DNA tkankowego. Trawić siatkówkę w temperaturze 55 stopni Celsjusza 200 G przez 30 minut za pomocą proteinazy K.Lyse retina całkowicie i postępować zgodnie z protokołem producenta. W tych protokołach pokazaliśmy obrazowanie kwiatu dna ciała szklistego we iniekcji do ciała szklistego, a także izolację siatkówki i genomowego DNA.Są to bardzo krytyczne procedury dla siatkówki i postępując zgodnie z tym protokołem, powinieneś być w stanie wstrzyknąć wyprodukowane AAV i śledzić ich profil ekspresji. I zwiększyć wydajność transdukcji, określając ilościowo genomy AAV w genomowym DNA siatkówki. Tutaj możesz zobaczyć podstawowe zastosowanie cyfrowego kropelkowego PCR, w którym możesz dokonać bezwzględnej kwantyfikacji genomu AAV, który transdukuje się w komórkach siatkówki.Rozcieńczyć genomowe DNA z wstrzykniętych siatkówk w 0,05% roztworze pluronicznym F 68, aby osiągnąć końcowe stężenie jednego nanograma na mikrolitr dla każdej próbki. Wykonaj generowanie kropelek w mieszaninie reakcyjnej PCR o objętości 20 mikrolitrów, w tym jeden nanogramowy starter genomowego DNA 125 nanomoli i 2X wiecznie zielona super mieszanka. Załaduj mieszaninę próbek do środkowej części wkładu w celu wytworzenia kropel.Następnie dodaj 70 mikrolitrów oleju do wytwarzania kropelek do dolnego rzędu wkładu. Umieść uszczelkę na górze wkładu. Upewnij się, że nie ma szczeliny między uszczelką a wkładem.Następnie umieść go w generatorze kropel. Delikatnie weź około 40 mikrolitrów kropel, które są generowane w górnym dzwonie. Dodać roztwór kropelkowy do częściowo osłonkowej 96-dołkowej płytki reakcyjnej PCR.Uszczelnij płytkę PCR za pomocą uszczelniacza do płytek PCR za pomocą aluminiowej folii uszczelniającej. Umieść płytkę PCR w 96-dołkowym termocyklerze zgrzewanym. Użyj protokołu ddPCR wskazanego w artykule.Umieść płytkę PCR w czytniku kropelkowym, aby przeanalizować dane. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś być w stanie wykonać podstawową technikę cyfrowego PCR. Można również użyć wymuszonych komórek z niewielkimi ilościami materiału, co jest idealne do techniki cyfrowego PCR.Należy jednak ostrożnie dostosować docelową ilość DNA, aby nie przekroczyć limitu cyfrowej kropelkowej reakcji PCR. Oto schemat blokowy procedury eksperymentalnej. Przeprowadziliśmy produkcję AAV na małą skalę, po której następuje mianowanie AAV.Następnie wykonaliśmy iniekcję doszklistkową. Następnie określiliśmy ilościowo intensywność fluorescencji za pomocą obrazowania fluorescencji dna oka. Następnie wyizolowano siatkówki myszy i wyekstrahowano genomowe DNA z siatkówki w celu ddPCR.Miareczkowanie AAV ma również kluczowe znaczenie dla prawidłowego ilościowego określenia transdukcji AAV. ddPCR zależy od generacji kropel, które mają rozcieńczony docelowy genom AAV. Reprezentatywne wyniki ddPCR wskazują na dodatnie i ujemne kropelki dla genomu AVV.Dodatni powyżej progu, a ujemny jest poniżej. Po namnażeniu przez czynniki rozcieńczające stwierdzono, że miano AAV wynosi od 10 do 12 w kopiach genomu na mililitr. W celu prawidłowego określenia ilościowego skuteczności trandukcji AAV, wstrzyknięto kilka siatkówk.Zobrazowano zwierzęta, którym wstrzyknięto zastrzyk i obliczono średnią intensywność fluorescencji. Po dwóch tygodniach siatkówki zostały odizolowane. A ddPCR wykonano przy użyciu starterów WPRE i 18 S.Intensywność fluorescencji siatkówki wstrzykniętej AAV skorelowano z obliczeniami genomu AAV, pokazując moc metodologii. Tutaj pokazaliśmy kilka technik, w tym wstrzyknięcie doszklistkowe na małą skalę.

digital-droplet-pcr-method-for-quantification-aav-transduction

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Aby zbadać przepuszczalność bariery krew-siatkówka i wewnętrzną integralność błony ograniczającej w zwierzęcych modelach chorób siatkówki, użyliśmy kilku wariantów wirusa związanego z adenowirusem (AAV) jako narzędzi do oznaczania neuronów siatkówki i gleju. Ekspresja genu reporterowego za pośrednictwem wirusa jest następnie wykorzystywana jako wskaźnik przepuszczalności bariery siatkówkowej.

Wykorzystanie wirusa związanego z adenowirusem jako narzędzia do badania barier siatkówkowych w chorobie

Ten manuskrypt szczegółowo opisuje prosty test punktowy do ilościowego oznaczania mian wirusów związanych z adenowirusem (AAV) i jego zastosowanie do badania roli białek aktywujących składanie (AAP), nowej klasy niestrukturalnych białek wirusowych występujących we wszystkich serotypach AAV, w promowaniu składania kapsydów pochodzących z pokrewnych i heterologicznych serotypów AAV.

Ilościowy test igłowy do miareczkowania AAV i jego zastosowanie do oceny funkcjonalnej białek aktywujących składanie wirusa związanego z adenowirusem

Obrazowanie in vivo jest potężnym narzędziem do badania biologii w zdrowiu i chorobie. Protokół ten opisuje obrazowanie przezźrenicowe siatkówki myszy za pomocą standardowego mikroskopu dwufotonowego. Zademonstrowano również różne metody obrazowania in vivo, które umożliwiają fluorescencyjne znakowanie wielu kohort komórkowych siatkówki.

Przezźrenicowe dwufotonowe obrazowanie in vivo siatkówki myszy

Tutaj prezentujemy metodę badania morfogenezy neurytów w pourodzeniowych eksplantatach siatkówki myszy za pomocą poklatkowej mikroskopii konfokalnej. Opisujemy podejście do rzadkiego znakowania i pozyskiwania typów komórek siatkówki i ich drobnych procesów przy użyciu rekombinowanych wektorów wirusowych związanych z adeno, które wyrażają białka fluorescencyjne ukierunkowane na błonę w sposób zależny od Cre.

Obrazowanie poklatkowe arboryzacji neuronów przy użyciu rzadkiego znakowania wirusem związanym z adenowirusem genetycznie ukierunkowanych populacji komórek siatkówki

Kompleksowy protokół laboratoryjny i przepływ pracy analizy są opisane dla szybkiego, opłacalnego i prostego testu kolorymetrycznego opartego na komórkach do wykrywania elementów neutralizujących przeciwko AAV6.

Metoda krok po kroku do wykrywania przeciwciał neutralizujących przeciwko AAV za pomocą kolorymetrycznego testu komórkowego

Tutaj prezentujemy protokół rozwoju i walidacji dobrych praktyk laboratoryjnych w zakresie zgodnego wykrywania wektorów wirusowych związanych z adenowirusem w ludzkich łzach za pomocą kropelkowej cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy w celu wsparcia klinicznego rozwoju wektorów terapii genowej.

Walidowalny cyfrowy test reakcji łańcuchowej polimerazy kropelkowej do wykrywania wektorów wirusowych związanych z adenowirusem w badaniach bioliowania łez

Tutaj szczegółowo opisujemy zoptymalizowany protokół wstrzykiwania bocznych żył ogonowych myszy w celu systemowego podawania wirusa związanego z adenowirusem (AAV) dorosłym myszom. Dodatkowo opisujemy protokoły powszechnie stosowanych testów do oceny transdukcji AAV.

Konsekwentne dostarczanie wirusa związanego z adenowirusem poprzez boczne wstrzyknięcie żyły ogonowej u dorosłych myszy

Precyzyjna kwantyfikacja kopii genomu wektora wirusa związanego z adenowirusem (AAV) jest kluczowa, ale standardowy protokół nie został jeszcze ustalony. Protokół ten opisuje zwalidowaną metodę przygotowania oczyszczonych próbek AAV i przeprowadzenia cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy kropelkowej (dd_PCR) w celu wiarygodnego ilościowego określenia miana genomu wirusa.

Kwantyfikacja genomów wirusów związanych z adenowirusami w oczyszczonych próbkach wektorów za pomocą cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy kropelkowej

Iniekcje podsiatkówkowe są nieodzowną techniką w przedklinicznym rozwoju terapii chorób fotoreceptorowych i RPE. Opisujemy zoptymalizowaną technikę przeztwardówkowego wstrzykiwania podsiatkówkowego u myszy, która poprawia wskaźniki powodzenia śródoperacyjnego i minimalizuje uszkodzenie siatkówki.

Zoptymalizowana minimalnie inwazyjna technika przeztwardówkowego wstrzykiwania podsiatkówkowego u myszy

Przedstawiono metodę wprowadzania plazmidowego DNA do komórek siatkówki myszy w celu przeprowadzenia badań nad przyrostem lub utratą funkcji in vivo. Metoda ta wykorzystuje przejściowy wzrost przepuszczalności błon plazmatycznych komórek wywołany przyłożeniem zewnętrznego pola elektrycznego.

In vivo elektroporacja rozwijającej się siatkówki myszy

Poznaj cyfrową metodę kropelkową PCR do ilościowego oznaczania skuteczności transdukcji AAV w siatkówce myszy. Ta technika umożliwia precyzyjną ocenę terapii genowej w badaniach nad siatkówką.

Cyfrowa metoda kropelkowej PCR do ilościowego oznaczania skuteczności transdukcji AAV w siatkówce myszy

Przeglądaj więcej filmów