Cyfrowa metoda kropelkowej PCR do ilościowego oznaczania skuteczności transdukcji AAV w siatkówce myszy
25 grudnia 2021
Ten protokół pokazuje, jak określić ilościowo skuteczność transdukcji AAV w siatkówce myszy za pomocą cyfrowego kropelkowego PCR (dd-PCR) wraz z produkcją AAV na małą skalę, iniekcją doszklistkową, obrazowaniem siatkówki i izolacją genomowego DNA siatkówki.
W tym filmie pokażemy, jak określić ilościowo transdukcję AAV w siatkówce myszy za pomocą cyfrowej metody PCR kropelkowej, która jest niezwykle czuła i wykonuje bezwzględną kwantyfikację docelowego DNA. Opracowaliśmy tę metodę głównie dla dużych konstruktów AVV, która nie pozwala nam na użycie genu reporterowego, takiego jak konstrukty oparte na CRISPR. Korzystając z tej metody, możemy po prostu określić ilościowo szybkość transdukcji AAV w siatkówce.
Metoda ta opiera się na czułości i bezwzględnej kwantyfikacji cyfrowego PCR kropelkowego i daje proste wyniki. W tym filmie pokażemy, jak określić ilościowo transdukcję AAV w siatkówce myszy za pomocą cyfrowej metody PCR kropelkowej, która jest niezwykle czuła i wykonuje bezwzględną kwantyfikację docelowego DNA. Opracowaliśmy tę metodę głównie dla konstruktów o dużej powierzchni, która nie pozwala nam na użycie genu reporterowego, takiego jak konstrukty oparte na CRISPR.
Korzystając z tej metody, możemy po prostu określić ilościowo szybkość transdukcji AAV w siatkówce. Metoda ta opiera się na czułości i bezwzględnej kwantyfikacji PCR z dwiema kroplami i daje proste wyniki. Ze względu na skuteczność metodologii cyfrowego PCR kropelkowego, kilka laboratoriów już przechodzi z ilościowego PCR w czasie rzeczywistym na cyfrowy PCR kropelkowy lub miareczkowanie AAV.
Metoda ta może również stanowić podstawę do kwantyfikacji mitochondrialnego DNA w siatkówce, a także sprawdzić skuteczność korekcji mutacji opartej na CRISPR w terapii genowej w siatkówce myszy. Przygotuj mieszaninę transfekcji z plazmidem pomocniczym AAV, plazmidem kapsydu AAV, wektorem AAV i roztworem PI w zapotrzebowaniu na pięć mililitrów. Dodaj pięć mililitrów przygotowanej mieszaniny transfekcji do pożywki hodowlanej.
Inkubować transfekowane komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Zbierz pożywkę po 48 do 60 godzinach od transfekcji. Trawić pożywkę z DNA w końcowym stężeniu 250 jednostek na mililitr przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i odwirowywać w temperaturze 4 000 g w czterech stopniach Celsjusza przez 30 minut.
Wstępnie zwilż membranę z regenerowanej celulozy PBS. Przefiltruj media za pomocą filtra strzykawkowego o wielkości 0,22 mikrometra do wstępnie zwilżonej membrany z regenerowanej celulozy dla 100 kilogramów daltonów. Odwirować membranę z regenerowanej celulozy w temperaturze 4 000 G w temperaturze 4 stopni Celsjusza przez 30 minut i wyrzucić pożywkę.
Przemyć i odwirować membranę z regenerowanej celulozy PBS zawierającym 0,001% pluronu F68 trzykrotnie w temperaturze 4000 G i czterech stopni Celsjusza przez 30 minut. Skoncentrowaną wartość AAV należy zebrać z górnej części zregenerowanej błony celulozowej i przeznaczyć do dalszego wykorzystania. Tutaj pokazaliśmy, jak zrobić produkcję AAV na mniejszą skalę.
Po sprawdzeniu tego protokołu powinieneś być w stanie wytworzyć AVV, które są wystarczające, aby zobaczyć ekspresję reporterową w siatkówce. Możesz również postępować zgodnie z protokołem cyfrowego PCR, aby móc określić miano wyprodukowanych AAV. Zastosuj jedną kroplę 0,5% tropikamidu i 2,5% chlorowodorku fenylefryny zawierającego krople do oczu przed znieczuleniem, aby rozszerzyć źrenice.
Znieczulij myszy izofluranem i zweryfikuj odruchy. Przed zabiegiem wstrzyknięcia należy zastosować 0,3% tobramycyny i 0,1% sterylnego roztworu okulistycznego deksametazonu do każdego oka. Użyj haczyka chirurgicznego, aby ustabilizować górną powiekę.
Lekko odciągnij do tyłu, aby odsłonić grzbietową część oka. Przyklej haczyk do opaski, aby utrzymać go na miejscu. Usuń spojówkę nożyczkami z zakrzywioną tęczówką, aby odsłonić twardówkę oka.
Użyj świeżej i sterylnej strzykawki insulinowej 30G, aby nakłuć twardówkę. Wprowadzić igłę mikrostrzykawki przez to samo nakłucie za pomocą mikromanipulatora. Umieść końcówkę igły za soczewką na środku muszli ocznej.
Wstrzyknąć powoli jeden mikrolitr roztworu AAV do ciała szklistego oka. Pozostawić igłę na miejscu na jedną minutę i powoli ją wyjąć. Nałóż przeciwzapalny i przeciwbakteryjny żel do stosowania miejscowego zawierający 0,3% tobramycyny i 0,1% deksametazonu na muszkę oczną.
Nałóż jedną kroplę 0,5% tropikamidu. I 2,5% chlorowodorek fenylefryny zawierający krople do oczu przed znieczuleniem w celu rozszerzenia źrenic. Nałóż karbamid dwa miligramy na gram żelu do stosowania miejscowego na powierzchnię oczu.
W razie potrzeby dostosuj podstawkę myszy, aby wyśrodkować oko myszy. Wykonaj obrazowanie dna oka i obrazowanie fluorescencyjne na obu oczach, aby śledzić ekspresję TdTomato tydzień i dwa tygodnie po wstrzyknięciu do ciała szklistego. Przed zabiegiem należy poddać zwierzęta eutanazji za pomocą inhalacji dwutlenkiem węgla.
Przesuń gałkę oczną do przodu za pomocą kleszczy rozłupujących 13,5 centymetra. Wyjmij soczewkę razem z resztkami ciała szklistego. Przetnij połączenie gałki ocznej z nerwem wzrokowym za pomocą precyzyjnych zakrzywionych kleszczyków i delikatnie ściśnij siatkówkę tymi samymi zakrzywionymi kleszczami.
Wyizoluj genomowe DNA za pomocą skomercjalizowanego zestawu białkoazy K do błony genomowego DNA tkankowego. Trawić siatkówkę w temperaturze 55 stopni Celsjusza 200 G przez 30 minut za pomocą proteinazy K.Lyse retina całkowicie i postępować zgodnie z protokołem producenta. W tych protokołach pokazaliśmy obrazowanie kwiatu dna ciała szklistego we iniekcji do ciała szklistego, a także izolację siatkówki i genomowego DNA.
Są to bardzo krytyczne procedury dla siatkówki i postępując zgodnie z tym protokołem, powinieneś być w stanie wstrzyknąć wyprodukowane AAV i śledzić ich profil ekspresji. I zwiększyć wydajność transdukcji, określając ilościowo genomy AAV w genomowym DNA siatkówki. Tutaj możesz zobaczyć podstawowe zastosowanie cyfrowego kropelkowego PCR, w którym możesz dokonać bezwzględnej kwantyfikacji genomu AAV, który transdukuje się w komórkach siatkówki.
Rozcieńczyć genomowe DNA z wstrzykniętych siatkówk w 0,05% roztworze pluronicznym F 68, aby osiągnąć końcowe stężenie jednego nanograma na mikrolitr dla każdej próbki. Wykonaj generowanie kropelek w mieszaninie reakcyjnej PCR o objętości 20 mikrolitrów, w tym jeden nanogramowy starter genomowego DNA 125 nanomoli i 2X wiecznie zielona super mieszanka. Załaduj mieszaninę próbek do środkowej części wkładu w celu wytworzenia kropel.
Następnie dodaj 70 mikrolitrów oleju do wytwarzania kropelek do dolnego rzędu wkładu. Umieść uszczelkę na górze wkładu. Upewnij się, że nie ma szczeliny między uszczelką a wkładem.
Następnie umieść go w generatorze kropel. Delikatnie weź około 40 mikrolitrów kropel, które są generowane w górnym dzwonie. Dodać roztwór kropelkowy do częściowo osłonkowej 96-dołkowej płytki reakcyjnej PCR.
Uszczelnij płytkę PCR za pomocą uszczelniacza do płytek PCR za pomocą aluminiowej folii uszczelniającej. Umieść płytkę PCR w 96-dołkowym termocyklerze zgrzewanym. Użyj protokołu ddPCR wskazanego w artykule.
Umieść płytkę PCR w czytniku kropelkowym, aby przeanalizować dane. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś być w stanie wykonać podstawową technikę cyfrowego PCR. Można również użyć wymuszonych komórek z niewielkimi ilościami materiału, co jest idealne do techniki cyfrowego PCR.
Należy jednak ostrożnie dostosować docelową ilość DNA, aby nie przekroczyć limitu cyfrowej kropelkowej reakcji PCR. Oto schemat blokowy procedury eksperymentalnej. Przeprowadziliśmy produkcję AAV na małą skalę, po której następuje mianowanie AAV.
Następnie wykonaliśmy iniekcję doszklistkową. Następnie określiliśmy ilościowo intensywność fluorescencji za pomocą obrazowania fluorescencji dna oka. Następnie wyizolowano siatkówki myszy i wyekstrahowano genomowe DNA z siatkówki w celu ddPCR.
Miareczkowanie AAV ma również kluczowe znaczenie dla prawidłowego ilościowego określenia transdukcji AAV. ddPCR zależy od generacji kropel, które mają rozcieńczony docelowy genom AAV. Reprezentatywne wyniki ddPCR wskazują na dodatnie i ujemne kropelki dla genomu AVV.
Dodatni powyżej progu, a ujemny jest poniżej. Po namnażeniu przez czynniki rozcieńczające stwierdzono, że miano AAV wynosi od 10 do 12 w kopiach genomu na mililitr. W celu prawidłowego określenia ilościowego skuteczności trandukcji AAV, wstrzyknięto kilka siatkówk.
Zobrazowano zwierzęta, którym wstrzyknięto zastrzyk i obliczono średnią intensywność fluorescencji. Po dwóch tygodniach siatkówki zostały odizolowane. A ddPCR wykonano przy użyciu starterów WPRE i 18 S.
Intensywność fluorescencji siatkówki wstrzykniętej AAV skorelowano z obliczeniami genomu AAV, pokazując moc metodologii. Tutaj pokazaliśmy kilka technik, w tym wstrzyknięcie doszklistkowe na małą skalę.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten protokół wyjaśnia, jak ilościowo określić efektywność transdukcji AAV w siatkówce mysi, wykorzystując cyfrową PCR kroplowej (dd-PCR). Obejmuje on małoskalowe produkcję AAV, wstrzyknięcie do jamy szklistego ciała, obrazowanie siatkówki i techniki izolację DNA genomowego.
Kluczowe komponenty badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Terapia genowa
- Biologia molekularna
Tło
- AAVs są kluczowe dla zastosowań terapii genowej.
- Ilościowa ocena efektywności transdukcji jest istotna dla oceny wyników terapii genowej.
- Cyfrowa PCR kroplowa oferuje wysoką czułość i bezwzględne ilościowe określenie docelowego DNA.
Cel badania
- Przedstawić metodę ilościowego określania transdukcji AAV w komórkach siatkówki mysi.
- Opracować protokół dla małoskalowej produkcji AAV.
- Ułatwić śledzenie profili ekspresji genów po wstrzyknięciu.
Stosowane metody
- Cyfrowa PCR kroplowa została użyta do ilościowego określania kopii genomu AAV w DNA genomowym siatkówki.
- Model biologiczny obejmował komórki siatkówki mysi z określonymi technikami chirurgicznymi i obrazowania.
- Kroki obejmowały produkcję AAV, wstrzyknięcie do jamy szklistego ciała i izolację DNA genomowego siatkówki.
- Krytyczne terminy rozciągają się od produkcji AAV do obrazowania po wstrzyknięciu.
- Protokół obejmuje znieczulenie, procedury wstrzyknięcia i następujące po nich obrazy dla śledzenia ekspresji.
Główne wyniki
- Metoda pozwala na precyzyjne ilościowe określenie transdukcji AAV w tkankach siatkówki.
- Wykorzystanie dd-PCR daje lepszą czułość w porównaniu z tradycyjnymi metodami PCR.
- Po wstrzyknięciu AAV można skutecznie monitorować zmiany w profilach ekspresji.
Wnioski
- To badanie ustanawia wiarygodny protokół do oceny efektywności transdukcji AAV w zastosowaniach siatkówkowych.
- Dostarcza ram dla przyszłych badań w terapii genowej i badaniach siatkówki.
- Zrozumienie efektywności AAV ma znaczące implikacje dla strategii terapeutycznych w chorobach siatkówki.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Accurate quantification of AAV transduction efficiency is critical for retinal gene therapy development, where vector dose directly impacts therapeutic efficacy and safety. Digital droplet PCR provides absolute quantification without standards, enabling precise comparison of AAV variants, batches, and delivery methods. This supports mechanistic de-risking in preclinical studies by delivering reproducible, quantitative readouts that inform go/no-go decisions in AAV-based therapeutic pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of AAV serotype and variant transduction efficiency in disease-relevant retinal tissue.
- Operational Value: Provides absolute quantification of AAV genome copies, reducing reliance on surrogate markers like reporter genes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, reproducible quantitative outputs for AAV titering and transduction efficiency assessment.
- Operational Value: Supports assay scalability and cross-laboratory comparability through droplet-based digital PCR precision.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates correlation between AAV genome quantification and functional readouts such as fluorescence intensity, supporting biomarker alignment.
- Operational Value: Enables longitudinal tracking of transgene expression post-injection, informing dose-response relationships in preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery workflow from AAV production through in vivo delivery to quantitative genomic analysis, supporting lead identification and preclinical validation stages.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of AAV variant tropism and transduction efficiency in murine retina.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative AAV genome measurements for comparing vector batches and serotypes.
- Analytics: Provides absolute quantification and threshold-based droplet analysis for precise titer determination and transduction efficiency calculation.
- Translational Research: Connects molecular quantification to functional imaging outcomes, enabling translational continuity from discovery to preclinical validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable quantification platform applicable across AAV serotypes, constructs, and retinal disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in AAV transduction efficiency, reduction of mechanistic ambiguity in vector performance.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and sensitivity superior to qPCR for low-abundance targets in complex tissues.
- Strategic Value: Informed go/no-go decisions based on quantitative transduction data, reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of AAV candidates through standardized efficiency metrics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular biology, AAV handling, and digital droplet PCR instrumentation.
- Dependent on ddPCR platform, primers/probes, droplet generation oil, and thermal cycling equipment.
- Necessitates standardization of DNA extraction, dilution, and input quantity across samples for comparable results.
- Adaptation to other tissue types requires validation of DNA yield, purity, and inhibitor compatibility.
- Practical limitation: accurate quantification depends on proper dilution to avoid droplet saturation, as noted in the protocol.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:01
Introduction
0:57
Small Scale AAV Production
2:52
Intravitreal Injection of AAV
4:17
Fluorescence and Fundus Imaging
4:48
Retina Isolation
5:16
Tissue Genomic DNA Isolation
5:57
Digital Droplet PCR Analysis of Mouse Retina Samples for Quantification of Viral Genomes
7:52
Results
9:07
Conclusion
