Ocena bioenergetyki komórkowej w krwiotwórczych komórkach macierzystych myszy i prymitywnych komórkach progenitorowych przy użyciu analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego

Podczas hematopoezy hematopoetyczne komórki macierzyste przechodzą metaboliczną przemianę z glikolizy na fosforylację oksydacyjną. Protokół ten może być stosowany do oceny funkcji glikolitycznych i mitochondrialnych krwiotwórczych komórek macierzystych i progenitorowych myszy. Metoda ta może być wykorzystana do oceny bioenergetyki komórkowej w czasie rzeczywistym.

96-dołkowa platforma oparta na mikropłytkach oferuje wysoką przepustowość kwantyfikacji z wysoką czułością, umożliwiając jednoczesną analizę wielu próbek przy użyciu jednej płytki. Technika ta może być wykorzystana do badania wpływu chemikaliów lub manipulacji genetycznych na metabolizm HSC w różnych warunkach. Może pomóc w wyjaśnieniu szlaków metabolicznych, które podtrzymują pluripotencję HSC.

Chociaż obecne badanie koncentruje się głównie na mysich krwiotwórczych łodygach i komórkach progenitorowych, protokół i to podejście można łatwo dostosować w celu optymalizacji warunków analizy dla dowolnego typu komórek zawiesinowych. Na dzień przed testem otwórz zestaw do oznaczania strumienia zewnątrzkomórkowego, aby wyjąć wkład czujnika i zespół płytki użytkowej. Zachowaj mieszkania w prowadnicy załadunku do wykorzystania następnego dnia.

Teraz ręcznie oddziel wkład czujnika od tabliczki użytkowej i umieść go do góry nogami obok tabliczki narzędziowej. Za pomocą pipety wielokanałowej napełnij każdą studzienkę płytki użytkowej kalibrem 200 mikrolitrów dołączonym do zestawu do oznaczania topnika, a następnie umieść wkład czujnika z powrotem na płytce użytkowej, upewniając się, że czujniki są całkowicie zanurzone w kalibrze. Następnie inkubuj płytkę użytkową z kalibrem i zmontowanym wkładem czujnika w inkubatorze bez dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc, postępując zgodnie z warunkami nawilżania wymienionymi w manuskrypcie.

W dniu testu należy przygotować 2,5 mililitra roztworu kleju komórkowego na 96-dołkową mikropłytkę do hodowli komórek, jak opisano w manuskrypcie tekstowym. Otwórz 96-dołkową mikropłytkę do hodowli komórkowej dołączoną do zestawu do oznaczania topnika i dozuj 25 mikrolitrów przygotowanego roztworu kleju komórkowego na dno każdej studzienki. Przykryj mikropłytkę pokrywką i inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej wewnątrz okapu.

Po inkubacji usunąć i wyrzucić nadmiar roztworu kleju komórkowego za pomocą wielokanałowej pipety lub aspiratora i umyć każdą studzienkę dwukrotnie 200 mikrolitrami sterylnej ultraczystej wody. Wysuszyć płytkę na powietrzu bez pokrywki wewnątrz okapu przez 30 do 45 minut. Odwirować przygotowane HSPC ujemnej linii myszy przy 200 razy G przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić osad komórkowy w odpowiednim podłożu do oznaczania i ponownie odwirować zawiesinę komórek. Powtórz tę procedurę jeszcze raz i ponownie zawieś komórki w odpowiednim podgrzanym podłożu testowym do stężenia 250 000 komórek na 50 mikrolitrów lub pięciu milionów komórek na mililitr. Za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 50 mikrolitrów zawiesiny komórek wzdłuż boku każdej studzienki 96-dołkowej mikropłytki do hodowli komórkowej pokrytej klejem komórkowym, a następnie dodaj 50 mikrolitrów pożywki do oznaczania do narożnych studzienek pomiarowych tła.

Utwórz szalkę równoważącą wirówkę, dodając 50 mikrolitrów wody na studzienkę niepowlekanej 96-dołkowej mikropłytki do hodowli komórkowej. Odwirować komórki w temperaturze 200 razy G przez jedną minutę w temperaturze pokojowej. Inkubować płytkę w inkubatorze bez dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 25 do 30 minut w celu przyłączenia komórek.

Po 30 minutach potwierdź wzrokowo pod mikroskopem, że komórki są stabilnie przylegające do powierzchni mikropłytki. Rozpocząć od przygotowania wszystkich wymaganych roztworów we wstępnie podgrzanym pożywce do testów wysiłkowych glikolizy, jak wspomniano w rękopisie tekstowym, a następnie wyjąć uwodniony wkład czujnika z inkubatora. Wyjmij wkład czujnika z kalibru i umieść go na tej samej tabliczce narzędziowej co kaliber, aby usunąć pęcherzyki powietrza.

Umieść prowadnicę ładowania 80 płasko na górze wkładu czujnika, ustawiając ją tak, aby litera A znajdowała się w lewym górnym rogu. Za pomocą pipety wielokanałowej dozuj 20 mikrolitrów 100-milimolowego roztworu glukozy w porcie A. Zamień płaską prowadnicę ładowania 80 na płaską prowadnicę ładowania BC, ustawiając literę B w lewym górnym rogu. Dozować 22 mikrolitry 20 mikromolowego roztworu oligomycyny w porcie B. Zmień orientację prowadnicy ładowania BC na płasko, aby zlokalizować literę C w lewym górnym rogu portu C i dozować 25 mikrolitrów 500-milimolowego roztworu 2-deoksy-d-glukozy w porcie C. Następnie wyjmij i wyrzuć płaskie prowadnice ładowania.

Teraz utwórz lub załaduj szablon do testu obciążenia glikolizą na sterowniku. Wprowadź szczegółowe informacje dotyczące strategii wstrzykiwania, warunków leczenia i typów komórek, a następnie naciśnij przycisk Generuj grupy. Przejdź do mapy płyt i przypisz odwierty do każdej grupy, która ma być analizowana.

W protokole upewnij się, że kalibracja i równoważenie są sprawdzane na etapie inicjalizacji. W przypadku pomiaru podstawowego i pomiarów po każdym wstrzyknięciu ustaw liczbę cykli pomiarowych na trzy i mieszaj, odczekaj, zmierz czasy na trzy minuty, zero minut, trzy minuty. Kliknij przycisk Start Run w oprogramowaniu.

Zdejmij pokrywkę z wkładu czujnika załadowanego związkami i uwodnionego i umieść go na tacy roboczej analizatora strumienia zewnątrzkomórkowego. Rozpocznij proces kalibracji. Wyjąć z inkubatora mikropłytkę zawierającą wysiane komórki.

Nie naruszając komórek, powoli dodawać 130 mikrolitrów wstępnie podgrzanego podłoża do testów wytrzymałościowych glikolizy na dołek, aby uzupełnić objętość pożywki w każdym dołku do 180 mikrolitrów i włóż płytkę z powrotem do inkubatora na dodatkowe 15 do 20 minut. Kliknij Otwórz tacę w oprogramowaniu, aby otworzyć tacę termiczną Seahorse. Po zakończeniu kalibracji zastąp płytkę użytkową tą mikropłytką testową zawierającą komórki i naciśnij płytkę ogniwa obciążnikowego, aby rozpocząć pomiary.

Po zakończeniu pomiarów należy usunąć pożywkę testową z płytki bez naruszania komórek i delikatnie umyć je 250 mikrolitrami soli fizjologicznej buforowanej fosforanem, nie usuwając komórek. Teraz dodaj 10 mikrolitrów buforu do lizy radioimmunoprecypitacyjnej uzupełnionego koktajlem inhibitorów proteazy 1X do każdej studzienki i mieszaj płytkę na shakerze przez 10 minut. Zamrozić całą płytkę w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Rozmrozić płytkę i wykonać test pomiaru białka w celu normalizacji danych zgodnie z instrukcjami producenta. Pobieraj i analizuj dane, otwierając plik danych za pomocą oprogramowania komputerowego Wave. Kliknij Normalizuj, wklej wartości normalizacji dla każdej studni, a następnie kliknij Zastosuj, aby znormalizować dane.

Kliknij Eksportuj i wybierz generator raportów z testu warunków skrajnych glikolizy, aby wyeksportować analizowane dane do generatora raportów. Szybkość zakwaszenia nieglikolitycznego wzrasta wraz ze wzrostem liczby komórek z 50 000 do 250 000, ale wzrasta tylko minimalnie między 200 000 a 250 000. Wstrzyknięcie 10 milimolowej glukozy stymuluje glikolizę przy wszystkich liczbach komórek, przy czym maksymalny wzrost ECAR obserwuje się przy 250 000 komórek na studzienkę.

Jednak wstrzyknięcie dwóch mikromolowców oligomycyny nie zwiększa dodatkowo ECAR. Dane OCR uzyskane w tym samym zestawie testów stresowych glikolizy wskazują na znaczny spadek po wstrzyknięciu oligomycyny z powodu hamowania kompleksu 5. Obliczono parametry testu wysiłkowego glikolizy i wybrano 250 000 komórek na studzienkę w dwóch mikromolach oligomycyny do dalszych badań.

Test wysiłkowy mitochondriów wykazał, że wstrzyknięcie dwóch mikromolowych oligomycyny powoduje znaczne zmniejszenie OCR poprzez hamowanie kompleksu 5. FCCP stymuluje OCR w HSPC w sposób zależny od dawki, z maksymalnym wzrostem obserwowanym przy dwóch mikromolach. Mieszanina 0,5 mikromolowego rotenonu i 0,5 mikromolowej antymycyny A iniekcja zmniejsza OCR do minimalnego poziomu odpowiadającego niemitochondrialnemu zużyciu tlenu

Obliczono parametry testu wysiłkowego mitochondriów i wybrano dwa mikromole FCCP do dalszych badań. Biorąc pod uwagę wysoką przepustowość tej techniki, opisany tutaj protokół można łatwo dostosować do badań przesiewowych dużej liczby modulatorów bioenergetycznych w hematopoetycznych komórkach macierzystych, krwiotwórczych komórkach progenitorowych i złośliwych komórkach krwiotwórczych. Analiza konika morskiego jest szeroko stosowana w literaturze do pomiaru metabolizmu w wielu różnych kontekstach w obecności różnych substratów i inhibitorów.