Fotodegradowalne interfejsy hydrożelowe do badań przesiewowych, selekcji i izolacji bakterii
November 4th, 2021
Zgłoszono użycie fotodegradowalnych hydrożeli do izolowania komórek bakteryjnych za pomocą narzędzia do próbkowania światła o wysokiej rozdzielczości. Dokonano przeglądu podstawowych procedur eksperymentalnych, wyników i zalet procesu. Metoda ta umożliwia szybką i niedrogą izolację docelowych bakterii wykazujących rzadkie lub unikalne funkcje z heterogenicznych społeczności lub populacji.
Protokół ten ma na celu szybkie izolowanie komórek od interfejsów przesiewowych w celu charakterystyki genomu, a ta zdolność jest znacząca, ponieważ może łączyć makroskopowo obserwowalne cechy komórki z informacjami genomowymi. Za pomocą tej techniki można wyizolować docelowe komórki bakteryjne z interfejsów przesiewowych z dużą pozycją przestrzenną w prosty operacyjnie sposób. Hydrożele mogą być stosowane w innych interfejsach przesiewowych.
Materiał hydrożelowy może być łatwo włączony do kanałów mikroprzepływowych w celu pobrania komórek z urządzeń mikroprzepływowych na żądanie. Zacznij od zaszczepienia buforu sieciującego o pożądanej gęstości komórek. Przygotować hydrożelowy roztwór prekursorowy w 0,5 mililitrowej probówce mikrowirówkowej, dodając 12,5 mikrolitra buforu sieciującego i 5,6 mikrolitra roztworu diakrylanu PEG ONB.
I na koniec dodaj do mieszaniny 6,9 mikrolitra roztworu tiolu PEG na przedramieniu. W celu enkapsulacji komórek w roztworze prekursora hydrożelu, należy umieścić tiolowane szkiełka nakrywkowe na czystej szalce Petriego i umieścić dwa przekładki po dwóch przeciwnych stronach szkiełka nakrywkowego. Zamocuj przekładki na podstawowym szkiełku nakrywkowym, przyklejając je do szalki Petriego.
Po dodaniu żądanej objętości roztworu prekursora na niereaktywne szkiełko perfluoroalkilowe, należy umieścić szkiełko na podstawowym szkiełku nakrywkowym i pozostawić do zakończenia tworzenia hydrożelu w temperaturze pokojowej przez 25 minut. Po zakończeniu żelowania delikatnie wyjmij szkiełko perfluoroalkilowe. Umieścić substrat na szalce Petriego o wymiarach 60 na 15 milimetrów zawierającej pożywkę ATGN uzupełnioną antybiotykiem.
Wysiewaj 700 mikrolitrów zawiesin komórek bakteryjnych z OD 600 0,1 na podłożu z matrycy mikrostudzienek i przygotuj roztwór prekursora hydrożelu, jak wykazano wcześniej, używając 12,5 mikrolitrów buforowanego fosforanem soli fizjologicznej ATGN o pH osiem. Pobrać pipetę 12,5 mikrolitra roztworu prekursora na niereaktywnym szkiełku ze szkła perfluoroalkilowego i umieścić dwie stalowe przekładki o grubości 38 mikrometrów po dwóch przeciwnych stronach podłoża układu mikrostudzienek zaszczepionego komórkami. Następnie odwróć szkiełko perfluoroalkilowane kropelką roztworu prekursora i umieść kroplę na środku podłoża mikrostudzienki.
Gdy hydrożel utworzy się po 25-minutowej inkubacji w temperaturze pokojowej, delikatnie wyjmij szkiełko z podłoża mikrostudzienki i umieść substrat na szalce Petriego zawierającej pożywkę ATGN uzupełnioną antybiotykiem. Umieść próbkę w uchwycie PDMS i dodaj zdefiniowane podłoże na próbce, aby zapobiec odwodnieniu próbki i zapewnić roztwór nośnikowy dla uwolnionych komórek. Po ustawieniu lustra kalibracyjnego na miejscu, wyreguluj ostrość mikroskopu, aby uzyskać ostry obraz kolonii w układzie hydrożelu lub mikrostudzienki i sprawdź, aby zidentyfikować kolonie lub studzienki będące przedmiotem zainteresowania.
Tutaj zaprojektuj wzory świetlne, podczas gdy widok kamery pokazuje kolonie wewnątrz próbki, aby przetestować różne wzorce ekstrakcji komórek i zapisać zdefiniowany wzór. Następnie wybierz sekcję kontroli sesji, dodaj zapisaną sekwencję w zakładce zatytułowanej nazwą produktu narzędzia do wzorzystego oświetlenia. Wybierz opcję stymulowania wzoru do wyświetlenia i dostosuj żądane położenie ekspozycji.
Następnie dostosuj natężenie światła do 60%, a czas ekspozycji do 40 sekund pod zakładką sterowania LED i rozpocznij proces ekspozycji. Monitoruj degradację hydrożelu w czasie rzeczywistym i w trybie Brightfield, aby zapewnić uwolnienie ogniw. Aby zebrać uwolnioną komórkę, zmień filtr mikroskopu z Brightfield na TRITC, aby uwidocznić odsłonięty obszar próbki gołym okiem.
Po zlokalizowaniu odsłoniętego obszaru umieść koniec rurki na napromieniowanym miejscu, a następnie zmień filtr mikroskopu z powrotem na Brightfield, aby monitorować pobieranie komórek w czasie rzeczywistym. Użyj strzykawki przymocowanej do drugiego końca rurki, aby ostrożnie pobrać 200 mikrolitrów roztworu zawierającego uwolnione komórki i przenieść roztwór do 1,5-milimetrowej probówki wirówkowej w celu analizy DNA lub posiewu. Do ekstrakcji komórek z hydrożeli luzem użyto różnych mikrowzorów światła UV, które wpłynęły na morfologię uwolnionych komórek.
Ekspozycja na promieniowanie UV we wzorze pierścieniowym spowodowała uwolnienie całej kolonii zamkniętej w ochronnym hydrożelu PEG. W przeciwieństwie do tego, wystawiając część lub całą kolonię na działanie światła UV, komórki można wyodrębnić albo jako zagregowane klastry komórek, albo jako wolne pojedyncze komórki. Gęstość wysiewu komórek i grubość hydrożelu są ważne dla enkapsulacji komórek.
Cieńsze hydrożele powodowały tworzenie mikrokolonii z minimalnym nakładaniem się kolonii, podczas gdy hydrożele o zwiększonej grubości powodowały nakładanie się kolonii, co może skutkować ekstrakcją wielu kolonii. Nakładające się na siebie kolonie mogą powodować zanieczyszczenie krzyżowe podczas ekstrakcji ze względu na dwuwymiarowy charakter wzoru świetlnego. Kiedy celem była górna kolonia, kolonia znajdująca się pod nią również była wydobywana wraz z nią.
Oceniono również wpływ różnych mikrowzorów światła UV na żywotność komórek. Gdy mikrokolonie były wystawione na kontrolowane dawki światła UV w kształcie koła lub krzyża, regeneracja komórek i czystość DNA nie uległy zmianie. Komórki udało się pobrać z matryc mikrostudzienek przy użyciu tego podejścia, co było widoczne na reprezentatywnych obrazach mikroskopii konfokalnej, gdzie po napromieniowaniu we wzorze kołowym i pierścieniowym, komórki zostały usunięte w odpowiednim wzorze.
Po ekstrakcji z macierzy mikrostudzienkowych oceniono żywotność komórek i ilość DNA. Wzorce ekspozycji nie wpłynęły ani na liczbę żywotnych komórek, ani na jakość DNA, co wskazuje, że żywe komórki bakteryjne mogą być selektywnie pobierane z mikrostudzienek przy minimalnych uszkodzeniach, a ich DNA można wyizolować w wysokiej czystości do dalszej analizy genomowej. Zawsze sprawdzaj, czy utworzył się hydrożel przed usunięciem perfluoroalkilowanego szkiełka nakrywkowego.
Precyzja i ostrożność są wymagane przy umieszczaniu przekładek do osadzania hydrożelu i używaniu wężyków do ekstrakcji komórek.
Przegląd
Ten artykuł omawia protokół izolowania komórek bakteryjnych za pomocą fotodegradowalnych żeli hydrofilowych i wysokorozdzielczego kształtowania wzorców świetlnych. Metoda ta umożliwia szybkie i opłacalne wyodrębnienie określonych bakterii ze złożonych społeczności, ułatwiając analizę genomową.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- Mikrobiologia
- Biologia komórki
- Genomika
Tło
- Izolowanie określonych komórek bakteryjnych jest kluczowe dla charakterystyki genomowej.
- Fotodegradowalne żele hydrofilowe zapewniają nowatorskie podejście do enkapsulacji i odzyskiwania komórek.
- Technika łączy obserwowalne cechy komórki z danymi genomowymi.
- Żele hydrofilowe mogą być zintegrowane z różnymi interfejsami przesiewowymi.
Cel badania
- Opracowanie metody szybkiego izolowania określonych komórek bakteryjnych.
- Ocena skuteczności wzorców świetlnych w ekstrakcji komórek.
- Ocena wpływu grubości żelu hydrofilowego na żywotność komórek i efektywność ekstrakcji.
Zastosowanie metod
- Przygotowanie roztworów prekursorów żelu hydrofilowego do enkapsulacji komórek.
- Zastosowanie narzędzi kształtowania światła do degradacji żeli hydrofilowych i uwolnienia komórek.
- Monitorowanie ekstrakcji komórek za pomocą mikroskopii.
- Ocena żywotności komórek i jakości DNA po ekstrakcji.
Główne wyniki
- Komórki zostały pomyślnie izolowane z mikrodołków z minimalnym uszkodzeniem.
- Różne wzorce światła UV wpływały na morfologię uwolnionych komórek.
- Grubość żelu hydrofilowego wpływała na nakładanie się kolonii i wyniki ekstrakcji.
- Żywotność komórek i czystość DNA były zachowane podczas procesu ekstrakcji.
Wnioski
- Metoda pozwala na selektywne odzyskiwanie żywych komórek bakteryjnych.
- Żele hydrofilowe mogą być skutecznie wykorzystywane w badaniach genomowych bakterii.
- To podejście zwiększa efektywność izolowania komórek dla dalszych zastosowań.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
High-resolution photodegradable hydrogel interfaces enable precise screening and isolation of bacterial phenotypes, directly linking observable traits to downstream genomic analysis. This capability addresses a critical bottleneck in early discovery by allowing rapid, high-purity retrieval of rare or emergent bacterial strains from heterogeneous populations. The approach supports portfolio-wide efforts to de-risk target selection and accelerate functional validation in microbiology-driven R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct correlation of phenotypic screening with genotypic analysis for functional target validation.
- Supports biological de-risking by isolating rare or emergent bacterial phenotypes from complex libraries.
- Facilitates predictive confidence in target selection by ensuring high-purity retrieval of candidate strains.
Screening & Assay Development
- Prepares validated bacterial systems for downstream workflows through precise, contamination-minimized isolation.
- Standardizes assay outputs by enabling reproducible, spatially controlled cell retrieval.
- Enhances screening readiness and scalability for mutant libraries and consortia studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker discovery by enabling genomic characterization of phenotypically distinct isolates.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation by preserving cell viability and DNA integrity.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by providing high-quality isolates for further functional studies.
Pipeline & Workflow Integration
This photodegradable hydrogel method integrates at the interface of phenotypic screening and genomic analysis, bridging early discovery and preclinical research stages.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling isolation of functionally relevant bacterial strains.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs through controlled cell encapsulation and release.
- Analytics: Provides high-purity samples for comparative genomic and phenotypic analyses.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment by linking phenotype to genotype in isolated strains.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, adaptable platform for diverse microbiology screening and isolation needs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable cell isolation workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by enabling high-fidelity downstream analysis.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of microbial targets and consortia.
Implementation Considerations
- Requires expertise in hydrogel chemistry, microscopy, and light patterning instrumentation.
- Needs access to high-resolution light patterning tools and compatible microfluidic or microwell platforms.
- Demands cross-team standardization for hydrogel preparation and cell retrieval protocols.
- Adaptable to various bacterial models but sensitive to hydrogel thickness and colony overlap.
- Careful handling is essential to prevent cross-contamination and ensure high-purity isolation.
