Name: Fotodegradowalne interfejsy hydrożelowe do badań przesiewowych, selekcji i izolacji bakterii (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Poznaj metodę izolacji bakterii z wykorzystaniem fotodegradowalnych hydrożeli i wzorców świetlnych. Technika umożliwia selektywną ekstrakcję komórek przy zachowaniu ich żywotności i jakości DNA do analiz genomowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało wsparte przez NSF CAREER Award #1944791.

<ol><li>Welch, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+single+cell+isolation+for+genomics+using+microraft+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Selective single cell isolation for genomics using microraft arrays.</a> Nucleic Acids Research. 44 (17), 8292-8301 (2016).</li>
<li>Lim, J. W., Shin, K. S., Moon, J., Lee, S. K., Kim, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+platform+for+high-throughput+screening+of+small+mutant+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A microfluidic platform for high-throughput screening of small mutant libraries.</a> Analytical Chemistry. 88 (10), 5234-5242 (2016).</li>
<li>Ishii, S., Tago, K., Senoo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+and+isolation+for+microbiology+and+biotechnology%3A+Methods+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis and isolation for microbiology and biotechnology: Methods and applications.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 86 (5), 1281-1292 (2010).</li>
<li>Nichols, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+ichip+for+high-throughput+in+situ+cultivation+of+%E2%80%9Cuncultivable+microbial+species%E2%80%9D%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Use of ichip for high-throughput in situ cultivation of “uncultivable microbial species”.</a> Applied and Environmental Microbiology. 76 (8), 2445-2450 (2010).</li>
<li>Oliver, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+findings+on+the+viable+but+nonculturable+state+in+pathogenic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Recent findings on the viable but nonculturable state in pathogenic bacteria.</a> FEMS Microbiology Reviews. 34 (4), 415-425 (2010).</li>
<li>Zhao, X., Zhong, J., Wei, C., Lin, C. W., Ding, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+perspectives+on+viable+but+nonculturable+state+in+foodborne+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Current perspectives on viable but nonculturable state in foodborne pathogens.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 580(2017).</li>
<li>Wang, X., Gou, X., Chen, S., Yan, X., Sun, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+manipulation+tool+with+combined+microwell+array+and+optical+tweezers+for+cell+isolation+and+deposition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Micromechanics+and+Microengineering%22%5BJournal%5D)">Cell manipulation tool with combined microwell array and optical tweezers for cell isolation and deposition.</a> Journal of Micromechanics and Microengineering. 23 (7), 075006(2013).</li>
<li>Lewis, W. H., Tahon, G., Geesink, P., Sousa, D. Z., Ettema, T. J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innovations+to+culturing+the+uncultured+microbial+majority%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Innovations to culturing the uncultured microbial majority.</a> Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 225-240 (2020).</li>
<li>Poonlapdecha, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody-conjugated+ferromagnetic+nanoparticles+with+lateral+flow+test+strip+assay+for+rapid+detection+of+Campylobacter+jejuni+in+poultry+samples%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Food+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Antibody-conjugated ferromagnetic nanoparticles with lateral flow test strip assay for rapid detection of Campylobacter jejuni in poultry samples.</a> International Journal of Food Microbiology. 286, 6-14 (2018).</li>
<li>Wang, Z., Cai, R., Gao, Z., Yuan, Y., Yue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomagnetic+separation%3A+An+effective+pretreatment+technology+for+isolation+and+enrichment+in+food+microorganisms+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Comprehensive+Reviews+in+Food+Science+and+Food+Safety%22%5BJournal%5D)">Immunomagnetic separation: An effective pretreatment technology for isolation and enrichment in food microorganisms detection.</a> Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety. 19 (6), 3802-3824 (2020).</li>
<li>Blainey, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+is+now%3A+Single-cell+genomics+of+bacteria+and+archaea%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">The future is now: Single-cell genomics of bacteria and archaea.</a> FEMS Microbiology Reviews. 37 (3), 407-427 (2013).</li>
<li>Shrirao, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+flow+cytometry%3A+The+role+of+microfabrication+methodologies%2C+performance+and+functional+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Technology%22%5BJournal%5D)">Microfluidic flow cytometry: The role of microfabrication methodologies, performance and functional specification.</a> Technology. 06 (01), 1-23 (2018).</li>
<li>Kou, S., Cheng, D., Sun, F., Hsing, I. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+and+microbial+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidics and microbial engineering.</a> Lab on a Chip. 16 (3), 432-446 (2016).</li>
<li>Kehe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+screening+of+synthetic+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Massively parallel screening of synthetic microbial communities.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (26), 12804-12809 (2019).</li>
<li>Tibbitt, M. W., Kloxin, A. M., Sawicki, L. A., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+and+degradation+of+chain+and+step-polymerized+photodegradable+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties and degradation of chain and step-polymerized photodegradable hydrogels.</a> Macromolecules. 46 (7), 2785-2792 (2013).</li>
<li>Kloxin, A. M., Kasko, A. M., Salinas, C. N., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodegradable+hydrogels+for+dynamic+tuning+of+physical+and+chemical+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Photodegradable hydrogels for dynamic tuning of physical and chemical properties.</a> Science. 324 (5923), 59-63 (2009).</li>
<li>Van Der Vlies, A. J., Barua, N., Nieves-Otero, P. A., Platt, T. G., Hansen, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+demand+release+and+retrieval+of+bacteria+from+microwell+arrays+using+photodegradable+hydrogel+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Bio+Materials%22%5BJournal%5D)">On demand release and retrieval of bacteria from microwell arrays using photodegradable hydrogel membranes.</a> ACS Applied Bio Materials. 2 (1), 266-276 (2019).</li>
<li>Barua, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+discovery+of+positive+and+negative+interactions+among+root+microbiome+bacteria+using+microwell+recovery+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Simultaneous discovery of positive and negative interactions among root microbiome bacteria using microwell recovery arrays.</a> Frontiers in Microbiology. 11, 3361(2021).</li>
<li>Fattahi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodegradable+hydrogels+for+rapid+screening%2C+isolation%2C+and+genetic+characterization+of+bacteria+with+rare+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Photodegradable hydrogels for rapid screening, isolation, and genetic characterization of bacteria with rare phenotypes.</a> Biomacromolecules. 21 (8), 3140-3151 (2020).</li>
<li>Masigol, M., Barua, N., Retterer, S. T., Lokitz, B. S., Hansen, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+copatterning+strategies+using+azlactone-based+block+copolymers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vacuum+Science+%26+Technology+B%2C+Nanotechnology+and+Microelectronics%3A+Materials%2C+Processing%2C+Measurement%2C+and+Phenomena%22%5BJournal%5D)">Chemical copatterning strategies using azlactone-based block copolymers.</a> Journal of Vacuum Science & Technology B, Nanotechnology and Microelectronics: Materials, Processing, Measurement, and Phenomena. 35 (6), (2017).</li>
<li>Masigol, M., Barua, N., Lokitz, B. S., Hansen, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabricating+reactive+surfaces+with+brush-like+and+crosslinked+films+of+azlactone-functionalized+block+co-polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Fabricating reactive surfaces with brush-like and crosslinked films of azlactone-functionalized block co-polymers.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57562(2018).</li>
<li>Timm, A. C., Halsted, M. C., Wilmoth, J. L., Retterer, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+and+tracking+of+microbial+community+development+within+a+microwell+array+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Assembly and tracking of microbial community development within a microwell array platform.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (124), e55701(2017).</li>
<li>DNeasy Blood & Tissue Handbook - QIAGEN. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.qiagen.com/us/resources/resourcedetail?id=68f29296-5a9f-40fa-8b3d-1c148d0b3030&lang=en">https://www.qiagen.com/us/resources/resourcedetail?id=68f29296-5a9f-40fa-8b3d-1c148d0b3030&lang=en</a> (2021).</li>
<li>Baldwin, A. D., Kiick, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tunable+degradation+of+Maleimide-Thiol+adducts+in+reducing+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Tunable degradation of Maleimide-Thiol adducts in reducing environments.</a> Bioconjugate Chemistry. 22 (10), 1946-1953 (2011).</li>
<li>Shokrzadeh, M., Mohammadpour, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+modified+salt-out+method+for+DNA+extraction+from+whole+blood+lymphocytes%3A+A+simple+and+economical+method+for+gene+polymorphism%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+and+Biomedical+Research%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a modified salt-out method for DNA extraction from whole blood lymphocytes: A simple and economical method for gene polymorphism.</a> Pharmaceutical and Biomedical Research. 4 (2), 28(2018).</li>
<li>Hansen, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+assembly+of+bacteria+in+microwell+arrays+reveals+the+importance+of+confinement+in+community+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Stochastic assembly of bacteria in microwell arrays reveals the importance of confinement in community development.</a> PLoS One. 11 (5), 0155080(2016).</li>
<li>Halsted, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+transparent+microwell+arrays+for+optical+monitoring+and+dissection+of+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Vacuum+Science+%26+Technology+B%2C+Nanotechnology+and+Microelectronics%3A+Materials%2C+Processing%2C+Measurement%2C+and+Phenomena%22%5BJournal%5D)">Development of transparent microwell arrays for optical monitoring and dissection of microbial communities.</a> Journal of Vacuum Science & Technology B, Nanotechnology and Microelectronics: Materials, Processing, Measurement, and Phenomena. 34 (6), (2016).</li>
<li>Zustiak, S. P., Wei, Y., Leach, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-Hydrogel+Interactions+in+Tissue+Engineering%3A+Mechanisms+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering.+Part+B%2C+Reviews%22%5BJournal%5D)">Protein-Hydrogel Interactions in Tissue Engineering: Mechanisms and Applications.</a> Tissue Engineering. Part B, Reviews. 19 (2), 160(2013).</li>
<li>Kandemir, N., Vollmer, W., Jakubovics, N. S., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+interactions+between+bacteria+and+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Mechanical interactions between bacteria and hydrogels.</a> Scientific Reports. 8 (1), 10893(2018).</li>
</ol>

RRH i AJV złożyły patent na tę technologię. Pozostali autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Manuskrypt ten demonstruje zastosowanie fotodegradowalnych hydrożeli do badań przesiewowych i izolacji bakterii. Materiał i podejście umożliwiają hodowlę wysokoprzepustową, kontrolę nad pożywką wzrostową i warunkami wzrostu oraz czystą i precyzyjną ekstrakcję komórek w prosty i ekonomiczny sposób. Ekstrakcja wymaga jedynie mikroskopu fluorescencyjnego sprzężonego z narzędziem do oświetlenia wzorzystego i może być wykonana w sposób sekwencyjny w celu wyizolowania wielu celów komórkowych. Każda ekstrakcja trwa 5-10 minut, a z jednego hydrożelu usuwa się do 30 docelowych kolonii. Kluczową zaletą tego podejścia jest jego zdolność adaptacji do wielu różnych formatów testów, co wykazano w przypadku badań przesiewowych zarówno z hydrożeli luzem, jak i matryc mikrodołkowych. Proces separacji w obu formatach został z powodzeniem wykorzystany do wyizolowania bakterii, które wykazują unikalne zachowanie wzrostu, w celu dalszego genotypowania po hodowli i obserwacji mikroskopowej, co ma kluczowe znaczenie dla łączenia genotypu komórki z fenotypem. Do tej pory charakterystyka genomiczna bakterii wyekstrahowanych z tych interfejsów obejmowała sekwencjonowanie amplikonów 16S w celu identyfikacji wielogatunkowych kolekcji bakterii z mikrobiomów środowiskowych, które generują emergentne zachowania wzrostowe18, oraz sekwencjonowanie całego genomu w celu pomyślnej identyfikacji mutacji genetycznych, które powodują rzadkie profile wzrostu w komórkach obecnych w bibliotekach mutantów19.
Stosowanie hydrożeli luzem do badań przesiewowych i izolacji komórek jest najprostszym i najprostszym formatem. Hydrożele fotodegradowalne w dużej ilości tworzą się szybko (25 min) po zmieszaniu prekursorów z przezroczystymi szklanymi szkiełkami nakrywkowymi w celu zamknięcia komórek w matrycy 3-D hodowli komórkowej, która jest obrazowana za pomocą standardowego pionowego lub odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego. W związku z tym metoda ta ma potencjał, aby zostać przeniesiona do powszechnych laboratoriów mikrobiologicznych, które nie dysponują zasobami ani wiedzą specjalistyczną w zakresie mikrowytwarzania. Wadą tego formatu jest to, że komórki są losowo zorientowane w trójwymiarowym hydrożelu. W związku z tym komórki mogą pojawiać się poza płaszczyzną ogniskową podczas obrazowania z obiektywami o większym powiększeniu, a ekstrakcja może być trudna, jeśli kolonie komórek są zorientowane zbyt blisko siebie lub jeśli występuje pionowe nakładanie się kolonii. Osadzanie cienkiego hydrożelu (<13 μm) zgodnie z opisem ma kluczowe znaczenie dla złagodzenia tej wady. Ekspozycja w przerwanych krzyżowych wzorach światła (ryc. 4B) jest tutaj lepsza, ponieważ ten wzór powoduje, że komórki są wolne od hydrożelu, które mają minimalną ekspozycję na światło UV i można je łatwo odzyskać poprzez powlekanie.
W przeciwieństwie do tego, format matrycy mikrostudzienkowej zapewnia lepiej kontrolowany interfejs, ponieważ komórki bakteryjne są podzielone na dyskretne mikrodołki, które służą jako małe kultury lub miejsca kokultur 17,18,26. Wymiary, skok i gęstość mikrostudzienki są precyzyjnie wytwarzane przy użyciu standardowych technik fotolitograficznych. W porównaniu z hydrożelami luzem, bakterie można ekstrahować z układów mikrodołków o wyższym stopniu swoistości i mniejszym prawdopodobieństwie zanieczyszczenia krzyżowego, ponieważ komórki są obecne tylko w określonych miejscach, a nie losowo rozproszone w hydrożelu. Stężenie i proporcje komórek bakteryjnych w roztworze do wysiewu mogą być również zmieniane w celu kontrolowania ilości i składu inokulum mikrostudzienki poprzez proces wysiewu, który został scharakteryzowany w poprzednich raportach26, co daje użytkownikowi elastyczność w eksperymentalnym projektowaniu sita. Podstawową wadą przesiewania za pomocą formatu matrycy mikrodołkowej jest dodatkowy czas i wiedza specjalistyczna wymagana do mikrowytwarzania. Szacuje się, że produkcja mikrostudni kosztowała ~10 USD za matrycę, co obejmuje koszty materiałów i wydatki na pomieszczenia czyste. Ponadto matryce mikrostudzienek są tradycyjnie wykonane z krzemu, co może powodować trudności z obrazowaniem, ponieważ podłoża są nieprzezroczyste. Co więcej, duże rozproszenie światła z powierzchni krzemu może ograniczać obrazowanie w mikrostudzienkach i może zmniejszać rozdzielczość wzoru podczas ekspozycji na hydrożel światłem UV z narzędzia do oświetlania wzorzystego (patrz rysunek 8A,B). Podobne mikrostudzienki zostały wyprodukowane na przezroczystych podłożach kwarcowych, aby rozwiązać tego typu ograniczenia27; Jednak ta produkcja jest znacznie trudniejsza. Ekspozycja na wzory pierścieni, które oświetlają obwód studni, jest tutaj preferowana, aby uwolnić wolne komórki ze studzienek, jednocześnie minimalizując ekspozycję na promieniowanie UV.
Najczęstszym problemem, który występuje w obu formatach, jest oderwanie hydrożelu od podłoża znajdującego się pod spodem podczas hodowli z powodu pęcznienia hydrożelu. Jeżeli stanowi to problem w przypadku hydrożeli luzem, obecność, gęstość i jednorodność grup tiolowych w warstwie przyłączającej substancji chemicznej (MTPS) na powierzchni szkiełka nakrywkowego ze szkła bazowego należy zweryfikować przy użyciu odpowiedniej techniki charakteryzacji powierzchni (XPS, ATR-FTIR, AFM itp.). Niskie gęstości powierzchniowych grup tiolowych spowodowane nieefektywną funkcjonalizacją powierzchni mogą prowadzić do słabej interakcji między substratem a hydrożelem. W przypadku wystąpienia niskiego poziomu tiolizacji powierzchniowej należy sprawdzić stabilność roztworu MTPS. Należy zachować ostrożność podczas wstępnego czyszczenia szkiełka podstawowego, aby zapewnić czystą powierzchnię przed obróbką MTPS, a także należy zachować ostrożność, aby zapewnić użycie bezwodnego toluenu podczas reakcji powierzchniowej MTPS (sekcja 4 protokołu). W przypadku układów mikrostudzienkowych powierzchnie nie są tiolowane, a zamiast tego hydrożele przyłączają się poprzez częściowe wypełnienie studzienek hydrożelem, który zakotwicza hydrożel w podłożu krzemowym17. Jeśli w tym systemie problemem jest odklejanie hydrożelu, w matrycy można wytrawić więcej mikrostudzienek lub innych elementów w mikroskali, aby jeszcze bardziej zakotwiczyć hydrożel w podłożu i promować silniejsze przyczepienie.
Ograniczeniem techniki w obu formatach jest ograniczona stabilność hydrożeli w obecności bakterii. Zauważono, że niektóre bakterie, takie jak A. tumefaciens, mogą rozkładać hydrożel w ciągu 5-7 dni17,19, co ogranicza czas eksperymentu. Obecnie prowadzone są badania nad mechanizmami degradacji bakterii; Przypuszcza się, że grupy estrowe obecne w monomerach diakrylanowych podlegają hydrolizie i/lub degradacji enzymatycznej za pośrednictwem bakterii, jak zauważono w innych układach17. Opracowanie bardziej stabilnych chemii hydrożelowej wydłuży czas, w którym bakterie mogą pozostać w hydrożelu i rozszerzy ekran na mikroorganizmy o wolniejszym tempie wzrostu. Drugim ograniczeniem jest to, że w obu formatach odzyskiwanie i ekstrakcja komórek odbywa się w otwartym środowisku, co skutkuje stosunkowo dużymi objętościami ekstrakcji (30-100 μl), które mogą być podatne na zanieczyszczenie zewnętrzne. Dlatego należy zadbać o to, aby zapewnić wystarczającą ilość komórek z docelowych kolonii, jednocześnie minimalizując objętość roztworu ekstrakcyjnego. Aby uzyskać wystarczającą liczbę komórek do posiewu i odzysku lub do ekstrakcji materiału DNA, zaobserwowano, że w hydrożelach luzem komórki muszą być hodowane wystarczająco długo, aby osiągnąć średnicę kolonii co najmniej 10 μm. Aby obniżyć wymaganą objętość do ekstrakcji komórek, zaobserwowano, że użycie mikrolitrowej strzykawki i rurki (ryc. 2) było bardziej efektywne niż pipetowanie. Rurki pozwoliły na dokładniejsze pobieranie izolatów z punktu uwalniania, wymagając mniejszej objętości roztworu i zmniejszając ryzyko zanieczyszczenia.
Przyszłe prace obejmują zrozumienie wpływu właściwości mechanicznych hydrożelu na wzrost komórek, ponieważ cechy mechaniczne tych hydrożeli są dobrze kontrolowane przez dobór odpowiednich prekursorów monomerów na bazie PEG o różnych masach cząsteczkowych28, a interakcje mechaniczne prawdopodobnie odgrywają ważną rolę w zachowaniu bakterii29. Ponieważ materiały hydrożelowe mogą być łatwo włączane do wielu różnych systemów i urządzeń, dalszy rozwój koncentruje się również na integracji tego materiału z układami mikroprzepływowymi. Pozwoliłoby to zredukować roztwór ekstrakcyjny do objętości femtolitrów do pikolitrów, w porównaniu z tradycyjnymi objętościami 30-100 μl, które są obecnie wymagane w formacie otwartego zbioru. Mniejsze objętości roztworu znacznie zmniejszyłyby potencjalne zanieczyszczenie i przesunęłyby podejście w kierunku izolacji i charakterystyki pojedynczych komórek.

Izolacja komórek o unikalnych zachowaniach ze złożonego i niejednorodnego środowiska jest fundamentalna dla uzyskania informacji genetycznej w biologii1. W mikrobiologii selekcja i izolacja rzadkich lub unikalnych drobnoustrojów po obserwacji staje się ważna w wielu zastosowaniach, które wymagają połączenia między informacjami genomicznymi a obserwowalnymi informacjami fenotypowymi. Zastosowania te obejmują wybór fenotypowo rzadkich szczepów z bibliotek mutantów2, wybór mikroorganizmów kluczowych ze złożonych społeczności mikroorganizmów3,4 oraz wybór fenotypowo rzadkich, ale ważnych bakterii z populacji izogenicznych. Izolacja żywotnych, ale niehodowlanych komórek (VBNC) z populacji bakterii jest ważnym przykładem tej drugiej, gdzie komórki o fenotypie VBNC są często ukryte w populacjach bakterii w proporcjach 1:102 do 1:1055,6. Ze względu na powszechne trudności w izolacji bakterii, wiele pozostaje niewiadomych na temat wielu fenotypowo rzadkich mikroorganizmów. Ograniczenia te podkreślają potrzebę stosowania technik izolacji komórek, aby najpierw zidentyfikować komórkę lub komórki docelowe z mieszaniny, a następnie pobrać i wyizolować je do dalszej analizy molekularnej7.
Niektóre z najczęściej stosowanych metod izolacji komórek to cytometria przepływowa i fluorescencyjne sortowanie komórek aktywowanych (FACS)8, separacja immunomagnetyczna9,10, oraz mikrofluidyka11. Chociaż te metody izolacji mają wysoką wartość, mają również wady, które ograniczają ich stosowanie. Na przykład FACS może zapewnić rutynową izolację mikrobiologiczną na poziomie pojedynczej komórki w celu dalszej analizy genomicznej3, ale często jest ograniczony przez jego dostępność i koszty, a także problemy z dalszym zanieczyszczeniem11. Dużym zainteresowaniem cieszyły się podejścia oparte na mikroprzepływowości, takie jak mikroprzepływowa cytometria przepływowa, która w porównaniu z konwencjonalną cytometrią przepływową pozwala na znaczne zmniejszenie wymaganej objętości próbki12. Jednak separacja i pobranie pojedynczej lub małej grupy komórek z urządzeń mikroprzepływowych jest często trudnym problemem, który zazwyczaj wymaga bardziej złożonej konfiguracji i projektu urządzenia13. Wiele podejść opartych na mikroprzepływach genetycznie charakteryzuje komórki przed ich wprowadzeniem i obserwacją w urządzeniu14, ograniczając liczbę unikalnych gatunków obserwowanych podczas wykonywania funkcjonalnego badania przesiewowego. Biorąc pod uwagę te ograniczenia, do powszechnego stosowania w wielu laboratoriach potrzebne są dalsze innowacje zarówno w zakresie metod, jak i materiałów, które są praktyczne w badaniach przesiewowych i izolacji komórek.
Ten artykuł przedstawia nowe, oparte na materiałach podejście do badań przesiewowych i izolacji bakterii. Metoda wykorzystuje fotodegradowalne hydrożele do enkapsulacji komórek, hodowli, obserwacji mikroskopowej oraz uwalniania i odzyskiwania na żądanie docelowych bakterii o unikalnych fenotypach. Hydrożele są zaprojektowane tak, aby zawierały oczka o rozmiarze 10 nm, gdzie każdy link krzyżowy zawiera grupy o-nitrobenzylowe15. Materiał otacza lub wychwytuje komórki do obserwacji, umożliwiając jednocześnie dyfuzję składników odżywczych i produktów przemiany materii do i z komórek w celu hodowli. Wystawienie materiału na działanie wzorzystego źródła światła UV o długości fali 365 nm za pomocą mikroskopu pionowego umożliwia miejscową degradację hydrożelu poprzez fotorozszczepienie grup o-nitrobenzylowych16,17. Degradacja wyzwala selektywne uwalnianie komórek do odzyskania do dalszej analizy, w tym analizy genomicznej i, potencjalnie, proteomicznej i transkryptomicznej. Konfiguracja i protokół eksperymentu są stosunkowo proste, niedrogie i podatne na translację do laboratoriów mikrobiologicznych. Wymaga jedynie enkapsulacji komórek poprzez tworzenie hydrożelu, obserwacji przechwyconych komórek za pomocą pionowego jasnego pola i mikroskopu fluorescencyjnego oraz oświetlenia komórek będących przedmiotem zainteresowania wzorzystym źródłem światła UV w celu ich pobrania.
Kluczową zaletą tego opartego na materiałach podejścia do badań przesiewowych jest możliwość dostosowania do różnych formatów przesiewania. W najbardziej podstawowym formacie materiał może być używany do badań przesiewowych poprzez zamknięcie niejednorodnej kolekcji komórek w hydrożelach luzem. Komórki są następnie obserwowane pod kątem pożądanego fenotypu, a poszczególne komórki będące przedmiotem zainteresowania są usuwane w celu charakterystyki genomowej. W bardziej wyszukanych formatach materiał można również zintegrować z urządzeniami typu lab-on-a-chip, aby zapewnić precyzyjne uwalnianie i pobieranie komórek z pożądanych obszarów urządzenia. Oba formaty są opisane tutaj i oba umożliwiły najnowsze nowatorskie aplikacje do badań przesiewowych i selekcji drobnoustrojów17,18,19. Metoda została zademonstrowana na modelowych organizmach Gram-ujemnych (Escherichia coli, Agrobacterium tumefaciens) i modelowym organizmie Gram-dodatnim (Bacillus subtilis) i została łatwo rozszerzona na wiele innych bakterii.

<table><tbody><tr><td>(3-merkaptopropylo)trietoksysilan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>175617-25G</td><td>> 95%</td></tr> <tr><td>proszek do prania Alconox Alconox</td><td></td><td>1104</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan amonu</td><td>Fisher Chemical</td><td>A702-500</td><td>Certyfikowany</td></tr><tr><td>autoklaw granulowany ACS SK300C</td><td>Yamato Scientific</td><td>18016</td><td></td></tr><tr><td>Bacillus subtilis 1A1135</td><td>Centrum Zapasów Genetycznych Bacillus</td><td>1A1135</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop pionowy</td><td>Brightfield Olympus Corporation</td><td>BX51</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia, bezwodny</td><td>Fisher Chemical</td><td>C614-500</td><td>do dezykatorów Granulki, Wirówka siatkowa 4-20</td></tr><tr><td>5702</td><td>Eppendorf</td><td>5702</td><td></td></tr><tr><td>Monohydrat kwasu cytrynowego</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1909-500G</td><td>odczynnik ACS, > 99,0%</td></tr> <tr><td>D-glukozy ( Dekstroza)</td><td>VWR Amresco Life Science</td><td>0188-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Dneasy Blood & Zestaw tkanek</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td>Zestaw do oczyszczania DNA</td></tr><tr><td>DOWSIL 184 silikonowa baza elastomerowa</td><td>Dow Silicones Corporation</td><td></td><td>Temperatura przechowywania: -30-60 &deg; C</td></tr><tr><td>DOWSIL 184 utwardzacz z elastomeru silikonowego</td><td>Dow Silicones Corporation</td><td></td><td>Temperatura przechowywania: < 32 C</td></tr><tr><td>Spektrofotometr mikropłytkowy EPOCH2</td><td>BioTek Instruments</td><td>EPOCH2</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli ATCC 25922</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R19020</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, bezwodny</td><td>Fisher Chemical</td><td>459844</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Szkło osłonowe mikroskopu</td><td>Fisher Scientific</td><td>12540A</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe premium Fisherfinest gładkie</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-4</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór nadtlenku wodoru</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216763-500ML</td><td>Zawiera inhibitor, 30% wag. w H2O</td></tr><tr><td>Incu-Shaker Mini</td><td>Benchmark</td><td>E5-0014-01</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>190764</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu, 7-hydrat</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>6066-04</td><td>Avantor Performance Materials, Inc.</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179337-4L</td><td>Odczynnik ACS, > 99,8%</td></tr><tr><td>NanoDrop Jeden spektrofotometr</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-ONEC-W</td><td></td></tr><tr><td>Azot, sprężony</td><td>Matheson</td><td>UN1066</td><td></td></tr><tr><td>Tlenowy środek do czyszczenia plazmy</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-001-HP</td><td></td></tr><tr><td>Pentaerytrytol tetra(merkaptoetylo) polioksyetylen (4 ramiona-PEG)</td><td>NOF Ameryka Corporation</td><td>PTE-100SH</td><td>Sunbright-PTE-100SH</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), 10X</td><td>VWR Amresco Life Science</td><td>K813-500ML</td><td>Przechowywać między 15 stopniami; C&ndash; 30 &stopni; C</td></tr><tr><td>Polidimetylosiloksan (PDMS) Slygard 184</td><td>Dow Corning</td><td>4019862</td><td></td></tr><tr><td>Polygon400</td><td>Mightex</td><td>DSI-D-000</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe premium</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-4</td><td>25 x 75 x 1 mm</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma Life Science</td><td>S5886-500G</td><td>Bioodczynnik, odpowiedni do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045-500G</td><td>BioXtra, > 98%, granulki (bezwodne)</td></tr><tr><td>Fosforan sodu jednozasadowy dwuwodny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71505-250G</td><td>BioUltra, do biologii molekularnej, > 99.0% (T)</td></tr><tr><td>Grubościomierz ze stali nierdzewnej</td><td>Precision Brand Products</td><td>77739</td><td></td></tr><tr><td>Kwas siarkowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320501-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>Toluen, bezwodny, 99,8%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>244511-1L</td><td>Bezwodny, > 99,8%</td></tr><tr><td>Trichloro (1H,1H,2H,2H perfluorooktylo)silan (TPS), 97%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>448931-10G</td><td></td></tr><tr><td>Tryptyczny bulion sojowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22092-500G</td><td>Do mikrobiologii</td></tr><tr><td>Super Nuova Cyfrowe mieszadło z płytą grzejną</td><td>Thermo Scientific S131825</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultradźwiękowy sonograf</td><td>Fischer Scientific</td><td>FS-110H</td><td></td></tr></tbody></table>

fotodegradowalne interfejsy hydrożelowe do badań przesiewowych, selekcji i izolacji bakterii

Photodegradable Hydrogel Interfaces for Bacteria Screening, Selection, and Isolation

Biolodzy od dawna próbują zrozumieć związek między fenotypem a genotypem. Aby lepiej zrozumieć ten związek, kluczowe jest opracowanie praktycznych technologii, które łączą mikroskopijne badania przesiewowe komórek z izolacją komórek o wysokiej czystości na potrzeby dalszej analizy genetycznej. W tym artykule opisano zastosowanie fotodegradowalnych hydrożeli poli(glikolu etylenowego) do badań przesiewowych i izolacji bakterii o unikalnych fenotypach wzrostu z heterogenicznych populacji komórek. Metoda polega na otorbieniu lub uwięzieniu komórek hydrożelem, a następnie hodowli, badaniach przesiewowych pod mikroskopem, a następnie użyciu narzędzia do modelowania światła o wysokiej rozdzielczości do czasoprzestrzennej kontroli degradacji hydrożelu i uwalniania wybranych komórek do roztworu w celu pobrania. Zastosowanie różnych wzorów świetlnych pozwala na kontrolę nad morfologią wyekstrahowanej komórki, a wzory, takie jak pierścienie lub krzyżówki, mogą być używane do pobierania komórek przy minimalnej bezpośredniej ekspozycji na światło UV w celu złagodzenia uszkodzeń DNA izolatów. Co więcej, narzędzie do modelowania światła zapewnia regulowaną dawkę światła, aby osiągnąć różne szybkości degradacji i uwalniania komórek. Pozwala na degradację w wysokiej rozdzielczości, umożliwiając pobieranie komórek z precyzją przestrzenną w skali mikronów. W tym miejscu zademonstrowano zastosowanie tego materiału do przesiewania i pobierania bakterii zarówno z hydrożeli luzem, jak i z mikrofabrykowanych urządzeń typu lab-on-a-chip. Metoda jest niedroga, prosta i może być stosowana do powszechnych i pojawiających się zastosowań w mikrobiologii, w tym do izolacji szczepów bakteryjnych o rzadkich profilach wzrostu z bibliotek mutantów oraz izolacji konsorcjów bakteryjnych z pojawiającymi się fenotypami w celu charakterystyki genomowej.

Aby zbadać zdolność światła UV do wywoływania kontrolowanej degradacji hydrożelu w celu uwalniania komórek, hydrożele najpierw enkapsulowano na tiolowanych szkiełkach podstawowych w obecności samych materiałów, bez bakterii. Każdy hydrożel poddano działaniu trzech powtórzonych okrągłych wzorów światła o różnych intensywnościach i czasach naświetlania. Procent degradacji żelu obliczono po ekspozycji na światło UV przy każdej intensywności światła, a następnie określono czas ekspozycji poprzez sprzęgnięcie wiszących grup tiolowych z barwnikiem fluoresceina-5-maleimid w celu obrazowania fluorescencyjnego19,24. Reprezentatywny przykład wpływu tych dwóch parametrów na degradację hydrożelu przedstawiono na Rysunku 3. Jak widać, światło strukturyzowane generowane przez narzędzie do iluminacji wzorowanej zapewnia czasowo-przestrzenną kontrolę degradacji hydrożelu z rozdzielczością umożliwiającą uwolnienie jedynie niewielkiej liczby komórek.
<img alt="Wykres fotodegradacji, % degradacji w funkcji czasu ekspozycji, efekty natężenia, wstawki z obrazami mikrostruktury." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63048/63048fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Kontrola degradacji hydrożelu. Dawka światła UV i wynikająca z niej szybkość degradacji hydrożelu są regulowane za pomocą narzędzia do naświetlania wzorzystego. (Wstawka) Wybrano dwa różne natężenia światła do wzorzystej degradacji hydrożelu. Po ekspozycji na światło UV o długości fali 365 nm hydrożele oznakowano fluoresceiną-5-maleimidem w celu obrazowania fluorescencyjnego. Przedrukowano (zaadaptowano) za zgodą Fattahi et al.19 Copyright 2020 American Chemical Society.​ <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63048/63048fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
W celu ekstrakcji komórek zastosowano różne wzory światła, aby zbadać uwalnianie komórek (Rysunek 4). W tym przypadku komórki bakterii Agrobacterium zostały zamknięte w hydrożelach objętościowych na tiolowanych szkiełkach podstawkowych, a następnie hodowano w formie mikroskalowych kolonii. Hydrożele poddano następnie inspekcji za pomocą mikroskopii w jasnym polu, a wybrane mikrokolonie naświetlano zróżnicowanymi wzorami światła UV. Zaobserwowano, że różne wzory naświetlania wpływały na morfologię uwalnianych komórek. Może to być korzystne w różnych zastosowaniach. Na przykład naświetlanie w formie pierścienia wokół docelowej kolonii prowadzi do uwolnienia całej kolonii wciąż zamkniętej w ochronnym hydrożelu PEG i bez bezpośredniej ekspozycji na światło UV (Rysunek 4A), co może chronić komórki i ułatwiać późniejszą puryfikację. Z kolei poprzez naświetlanie części lub całości kolonii światłem UV, komórki mogą zostać wyekstrahowane albo w postaci zagregowanych klastrów komórkowych (Rysunek 4B), albo jako wolne, pojedyncze komórki (Rysunek 4C).
<img alt="Obraz mikroskopowy ekspozycji wzoru UV na odzyskiwanie komórek: pierścień, przerwany krzyż, wzór krzyża." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63048/63048fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Kontrola morfologii wyekstrahowanych komórek. (A) Zastosowanie wzoru pierścienia w celu uwolnienia całej kolonii komórek, chronionej w matrycy PEG. (B) Zastosowanie wzoru przerwanego krzyża w celu uwolnienia komórek w postaci agregatów. (C) Zastosowanie wzoru krzyża w celu uwolnienia pojedynczych komórek. Przedruk (adaptacja) za zgodą Fattahi i wsp.19 ​ <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63048/63048fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
Kluczowe w protokole enkapsulacji są zarówno gęstość wysiewu komórek, jak i grubość hydrożelu, ponieważ oba te parametry mogą wpływać na liczbę komórek włączonych do hydrożelu w celu obserwacji. Aby to zademonstrować, próbki komórek A. tumefaciens zostały zamknięte w hydrożelach o dwóch różnych grubościach przy użyciu cienkich dystansów (12,7 µm) lub grubych dystansów (40 µm), a następnie hodowane i obrazowane zgodnie z ustalonymi protokołami. Cieńsze hydrożele doprowadziły do uzyskania gęstości mikrokolon na poziomie 90 kolonii/mm2 w całym hydrożelu, przy czym zaobserwowano minimalne nakładanie się kolonii (Rysunek 5A). W przeciwieństwie do tego, grubość hydrożelu większa niż 12,7 µm skutkowała tworzeniem się kolonii nakładających się w kierunku pionowym (Rysunek 5B), co może prowadzić do ekstrakcji wielu kolonii jednocześnie. Nakładające się kolonie mogą powodować kontaminację krzyżową podczas ekstrakcji ze względu na dwuwymiarowy charakter wzoru świetlnego. Na przykład, można wycelować w kolonię znajdującą się na górze, podczas gdy kolonia znajdująca się pod nią zostanie wyekstrahowana razem z nią (Rysunek 5C). Dlatego do przygotowania hydrożelu zaleca się stosowanie dystansów 12,7 µm.
<img alt="Analiza żywotności komórek podczas ekspozycji pierścieniowej; wyniki mikroskopii fluorescencyjnej i w świetle przechodzącym." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63048/63048fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Grubość hydrożelu wpływa na czystość ekstrakcji. (A) Przy zastosowaniu dystansów o grubości 12,7 µm do formowania hydrożelu, kolonie powstają w obrębie jednej płaszczyzny ogniskowej przy powiększeniu 10x. (B) Przy powiększeniu 10x można zaobserwować nakładanie się kolonii, jeśli zastosowano dystansy o grubości większej niż 12,7 µm. (C) Nakładanie się kolonii może prowadzić do kontaminacji krzyżowej podczas uwalniania komórek: (i) zastosowano wzór pierścieniowy w celu uwolnienia docelowej kolonii komórek, (ii) docelowa kolonia komórek odrywa się od hydrożelu, a (iii) podczas ekspozycji na światło pod kolonią docelową obserwuje się drugą, znajdującą się poniżej kolonię. Kolonia ta również zostaje usunięta, co prowadzi do kontaminacji krzyżowej. Przedrukowano (zaadaptowano) za zgodą Fattahi et al.19 Copyright 2020 American Chemical Society.​ <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63048/63048fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
Biorąc pod uwagę potencjalne uszkodzenia bakterii pod wpływem światła UV, efekt zróżnicowanych mikrowzorów światła UV na żywotność komórek przebadano dalej z wykorzystaniem modelowych bakterii Gram-dodatnich (B. subtilis) oraz modelowych bakterii Gram-ujemnych (E. coli). Każdy z gatunków został zamknięty w hydrożelach objętościowych i hodowany w formie mikroskopijnych kolonii zgodnie ze standardowymi protokołami, co pozwoliło zweryfikować ich kompatybilność z hydrożelem. Wybrane mikrokolonie o jednakowych rozmiarach (średnica 26 ± 1 μm) poddano działaniu stałej dawki światła (168 mJ/mm2), albo w formie wzorów okrągłych, w których całe mikrokolonie były wystawione na działanie światła UV, albo we wzorach krzyżowych, które degradują jedynie krawędzie hydrożelu, aby zminimalizować ekspozycję komórek na światło. Następnie komórki odzyskano i wysiano na płytki w celu określenia liczby CFU/mL odzyskanych z każdej kolonii. Nie stwierdzono istotnych różnic w poziomie odzysku komórek (Ryc. 6A). Aby dokładniej zbadać czystość wyizolowanych komórek, z próbek E. coli wyizolowano DNA i poddano analizie za pomocą spektrofotometru UV-Vis. Dla obu wzorów poziomy jakości DNA mieściły się w zakresie A260/A280 od 1,8 do 2,0 (Ryc. 6B), co mieści się w optymalnym zakresie dla sekwencjonowania genomowego25. Wykazuje to, że wzory UV stosowane do uwalniania w opisanych warunkach mają minimalny wpływ na liczbę żywotnych komórek odzyskanych z hydrożeli objętościowych oraz na jakość genomowego DNA po ekstrakcji.
<img alt="Wykresy słupkowe i mikrofotografie porównujące wzrost E. coli i B. subtilis, jakość DNA oraz wyniki ekspozycji na wzory." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63048/63048fig06.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Wpływ różnych wzorów ekspozycji na światło na żywotność komórek i jakość DNA bakterii uwalnianych z hydrożeli masowych. (A) Poziomy odzysku komórek dla E. coli oraz B. subtilis po ekstrakcji z wykorzystaniem wzorów krzyżowych i kolistych. W tym eksperymencie ekstrakcję przeprowadzono z kolonii sferycznych o tej samej średnicy (26 µm ± 1 µm), aby zapewnić równą liczbę komórek uwalnianych z każdej kolonii. Następnie roztwory z ekstrakcji wysiano na płytki, aby obliczyć CFU/mL uzyskane dla każdego wzoru. Analiza statystyczna nie wykazała istotnych różnic w CFU/mL uzyskanych dla wzorów krzyżowych i kolistych zarówno dla E. coli, jak i B. subtilis (P-value &gt; 0.05, n= 6 dla obu szczepów). (B) Spektrofotometryczna ocena ilościowa jakości DNA dla wyizolowanych komórek E. coli z wykorzystaniem wzorów krzyżowych i kolistych. W tym przypadku analiza statystyczna nie wykazała istotnej różnicy w jakości DNA dla zastosowanych wzorów (P-value &gt; 0.05, n = 6) (C) Obrazy w polu jasnym kolonii o równych średnicach eksponowanych na wzory krzyżowe i koliste. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63048/63048fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
Matryce mikrowycieków stanowią alternatywny interfejs przesiewowy typu lab-on-a-chip, który oferuje bardziej kontrolowane funkcje screeningu w porównaniu do hydrożeli masowych. Na przykład matryce mikrowycieków umożliwiają wysiew bakterii do oddzielnych miejsc hodowlanych, w których można kontrolować liczbę komórek w inokulum. Cechy geometryczne mikrowycieków, takie jak głębokość i średnica otworu, są również kontrolowane za pomocą standardowych metod mikrofabrykacji. Dzięki tym zaletom mikrowycieki okazały się przydatne w badaniu wzrostu bakterii w ograniczeniu przestrzennym26, a ostatnio w odkrywaniu interakcji symbiotycznych i antagonistycznych między różnymi gatunkami bakterii w sytuacji ich wspólnego zamknięcia w skali mikro18. Ekstrakcja komórek z wycieków do analiz genomicznych, takich jak sekwencjonowanie amplikonów 16S, jest kluczowa dla tych zastosowań. Przy użyciu tego samego materiału hydrożelowego, światło UV może być naświetlane nad wyciekiem zawierającym interesujące komórki, albo w formie wzorów kołowych, albo pierścieniowych. Ta druga metoda zapewnia degradację hydrożelu tylko na obwodzie mikrowycieku, aby zapobiec bezpośredniemu napromieniowaniu komórek. Aby to zademonstrować, komórki A. tumefaciens wykazujące ekspresję mCherry zostały wysiane do wycieków, a następnie hydrożel przymocowano do matrycy mikrowycieków. Komórki hodowano, a następnie naświetlano wzorami kołowymi lub pierścieniowymi. Membranę zabarwiono następnie barwnikiem fluoresceiną-5-maleimidem. Dwukolorowe obrazy fluorescencyjne wykazały, że zarówno membrana, jak i komórki wewnątrz wycieków są usuwane przy obu wzorach napromieniowania17. W przeciwieństwie do formatu hydrożelu masowego, ekstrakcja komórek w tym przypadku była obserwowana wyłącznie w formie skupisk komórkowych18.
<img alt="Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej; komórki w fluorescencji czerwonej i niebieskiej. Przekroje poziome i pionowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63048/63048fig07.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 7"> 
Rycina 7: Reprezentatywne obrazy z mikroskopii konfokalnej pokazujące wpływ wzoru światła na izolację komórek z matryc mikrootworów. (A) Mikrootwory o średnicach 40 µm zawierające bakterie (czerwone) po zasianiu i inkubacji. (B) Naświetlanie z użyciem wzorów w kształcie koła i pierścienia (niebieskie). (C) Zmniejszona fluorescencja czerwona świadczy o ekstrakcji komórek z naświetlonych otworów. (D) Dwukolorowy obraz fluorescencyjny błon i bakterii po naświetlaniu, wskazujący na usunięcie zarówno hydrożelu (zielony), jak i bakterii (czerwone) z docelowych otworów. (E) Z-stack, dwukolorowy obraz fluorescencyjny docelowych otworów. Czerwona linia w (D) oznacza płaszczyznę xz obrazowaną w (E), a zielona linia w (E) oznacza płaszczyznę xy obrazowaną w (D). Próbki na obrazach (C-E) zostały przemyte w celu usunięcia uwolnionych komórek, a następnie utrwalone i obrazowane. Pasek skali = 40 µm. Przedrukowano (zaadaptowano) za zgodą van der Vlies et al.17. Copyright 2019 American Chemical Soceity. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63048/63048fig07large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
W celu ilościowego określenia żywotności komórek bakteryjnych i jakości DNA po ekstrakcji w tym formacie, komórki B. subtilis oraz E. coli zostały zasiane, wyhodowane, a następnie uwolnione z matryc mikrootworów przy użyciu wzorów w kształcie koła i pierścienia (Rysunek 8A, B). Uwolnione komórki wysiano następnie na płytki z agarem ATGN, a następnie określono ilościowo jakość DNA wyekstrahowanych komórek. Aby zapewnić obecność stałej liczby komórek podczas każdej ekstrakcji, do uwolnienia wybrano mikrootwory o podobnej intensywności fluorescencji (~6000 A.U.), a tym samym o podobnej liczbie komórek. Liczba żywych komórek wyekstrahowanych przy użyciu wzoru koła nie różniła się znacząco od liczby żywych komórek wyekstrahowanych przy użyciu wzoru pierścienia dla obu gatunków bakterii (Rysunek 8C). Ponadto poziomy jakości DNA nie różniły się znacząco między wzorami koła i pierścienia dla obu gatunków bakterii (Rysunek 8D). Zatem, podobnie jak w przypadku wyników dla hydrożeli masowych, zastosowanie światła UV o natężeniu i czasie trwania określonych w niniejszej pracy miało pomijalny wpływ na żywotność i jakość DNA komórek wyekstrahowanych z matryc mikrootworów. Wyniki te dowodzą, że żywe komórki bakteryjne mogą być selektywnie odzyskiwane z mikrootworów z minimalnymi uszkodzeniami w celu przeprowadzenia dalszych analiz.
<img alt="Analiza wzrostu bakterii i jakości DNA; formowanie wzorów; wykresy CFU/mL i czystości DNA; eksperyment." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63048/63048fig08.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Figure 8"> 
Rysunek 8: Wpływ różnych wzorów naświetlania na żywotność komórek i jakość DNA bakterii uwalnianych z macierzy mikrowykwropów. (A,B) W przypadku zarówno E. coli, jak i B. subtilis, do ekstrakcji komórek z mikrowykwropów o średnicy 10 µm zastosowano wzory okręgu oraz wzory pierścienia. W tym eksperymencie do ekstrakcji komórek wykorzystano wzór okręgu o średnicy 10 µm oraz wzór pierścienia o średnicy wewnętrznej 10 µm i średnicy zewnętrznej 20 µm. Wykorzystano mikrowykwropy o tych samych średnicach, aby zapewnić taką samą liczbę komórek uwalnianych z każdego mikrowykwropu. (C) Następnie wyekstrahowane roztwory wysiano na płytki w celu obliczenia CFU/mL uzyskanych dla każdego wzoru naświetlania. Analiza statystyczna nie wykazała istotnych różnic w CFU/mL otrzymanych dla wzoru okręgu i pierścienia zarówno dla E. coli, jak i B. subtilis (P-value &gt; 0.05, n = 6 dla obu szczepów). (D) Do pomiaru jakości DNA komórek E. coli i B. subtilis przy użyciu wzorów okręgu i pierścienia wykorzystano spektrofotometrię. W tym przypadku analiza statystyczna nie wykazała istotnych różnic w jakości DNA dla zastosowanych wzorów (P-value &gt; 0.05, n = 6 dla obu szczepów). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63048/63048fig08large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
Rycina uzupełniająca 1: Projektowanie i wytwarzanie matryc mikrootworów. (A) Do wytworzenia matryc mikrootworów na płytkach krzemowych zastosowano standardowe techniki mikrowytwarzania. (B) Każdy podłoże składało się z macierzy 7 x 7 otworów o średnicy 10µm, głębokości 20 µm i skoku 30 µm. (C) Każda matryca składała się z 225 mikrootworów. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Barua i wsp.18. Copyright 2021 Frontiers Media. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63048/Supplementary%20Figure%201.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Zgłoszono użycie fotodegradowalnych hydrożeli do izolowania komórek bakteryjnych za pomocą narzędzia do próbkowania światła o wysokiej rozdzielczości. Dokonano przeglądu podstawowych procedur eksperymentalnych, wyników i zalet procesu. Metoda ta umożliwia szybką i niedrogą izolację docelowych bakterii wykazujących rzadkie lub unikalne funkcje z heterogenicznych społeczności lub populacji.

Fotodegradowalne interfejsy hydrożelowe do badań przesiewowych, selekcji i izolacji bakterii

Biologists have long attempted to understand the relationship between phenotype and genotype. To better understand this connection, it is crucial to ...

Protokół ten ma na celu szybkie izolowanie komórek od interfejsów przesiewowych w celu charakterystyki genomu, a ta zdolność jest znacząca, ponieważ może łączyć makroskopowo obserwowalne cechy komórki z informacjami genomowymi. Za pomocą tej techniki można wyizolować docelowe komórki bakteryjne z interfejsów przesiewowych z dużą pozycją przestrzenną w prosty operacyjnie sposób. Hydrożele mogą być stosowane w innych interfejsach przesiewowych.Materiał hydrożelowy może być łatwo włączony do kanałów mikroprzepływowych w celu pobrania komórek z urządzeń mikroprzepływowych na żądanie. Zacznij od zaszczepienia buforu sieciującego o pożądanej gęstości komórek. Przygotować hydrożelowy roztwór prekursorowy w 0,5 mililitrowej probówce mikrowirówkowej, dodając 12,5 mikrolitra buforu sieciującego i 5,6 mikrolitra roztworu diakrylanu PEG ONB.I na koniec dodaj do mieszaniny 6,9 mikrolitra roztworu tiolu PEG na przedramieniu. W celu enkapsulacji komórek w roztworze prekursora hydrożelu, należy umieścić tiolowane szkiełka nakrywkowe na czystej szalce Petriego i umieścić dwa przekładki po dwóch przeciwnych stronach szkiełka nakrywkowego. Zamocuj przekładki na podstawowym szkiełku nakrywkowym, przyklejając je do szalki Petriego.Po dodaniu żądanej objętości roztworu prekursora na niereaktywne szkiełko perfluoroalkilowe, należy umieścić szkiełko na podstawowym szkiełku nakrywkowym i pozostawić do zakończenia tworzenia hydrożelu w temperaturze pokojowej przez 25 minut. Po zakończeniu żelowania delikatnie wyjmij szkiełko perfluoroalkilowe. Umieścić substrat na szalce Petriego o wymiarach 60 na 15 milimetrów zawierającej pożywkę ATGN uzupełnioną antybiotykiem.Wysiewaj 700 mikrolitrów zawiesin komórek bakteryjnych z OD 600 0,1 na podłożu z matrycy mikrostudzienek i przygotuj roztwór prekursora hydrożelu, jak wykazano wcześniej, używając 12,5 mikrolitrów buforowanego fosforanem soli fizjologicznej ATGN o pH osiem. Pobrać pipetę 12,5 mikrolitra roztworu prekursora na niereaktywnym szkiełku ze szkła perfluoroalkilowego i umieścić dwie stalowe przekładki o grubości 38 mikrometrów po dwóch przeciwnych stronach podłoża układu mikrostudzienek zaszczepionego komórkami. Następnie odwróć szkiełko perfluoroalkilowane kropelką roztworu prekursora i umieść kroplę na środku podłoża mikrostudzienki.Gdy hydrożel utworzy się po 25-minutowej inkubacji w temperaturze pokojowej, delikatnie wyjmij szkiełko z podłoża mikrostudzienki i umieść substrat na szalce Petriego zawierającej pożywkę ATGN uzupełnioną antybiotykiem. Umieść próbkę w uchwycie PDMS i dodaj zdefiniowane podłoże na próbce, aby zapobiec odwodnieniu próbki i zapewnić roztwór nośnikowy dla uwolnionych komórek. Po ustawieniu lustra kalibracyjnego na miejscu, wyreguluj ostrość mikroskopu, aby uzyskać ostry obraz kolonii w układzie hydrożelu lub mikrostudzienki i sprawdź, aby zidentyfikować kolonie lub studzienki będące przedmiotem zainteresowania.Tutaj zaprojektuj wzory świetlne, podczas gdy widok kamery pokazuje kolonie wewnątrz próbki, aby przetestować różne wzorce ekstrakcji komórek i zapisać zdefiniowany wzór. Następnie wybierz sekcję kontroli sesji, dodaj zapisaną sekwencję w zakładce zatytułowanej nazwą produktu narzędzia do wzorzystego oświetlenia. Wybierz opcję stymulowania wzoru do wyświetlenia i dostosuj żądane położenie ekspozycji.Następnie dostosuj natężenie światła do 60%, a czas ekspozycji do 40 sekund pod zakładką sterowania LED i rozpocznij proces ekspozycji. Monitoruj degradację hydrożelu w czasie rzeczywistym i w trybie Brightfield, aby zapewnić uwolnienie ogniw. Aby zebrać uwolnioną komórkę, zmień filtr mikroskopu z Brightfield na TRITC, aby uwidocznić odsłonięty obszar próbki gołym okiem.Po zlokalizowaniu odsłoniętego obszaru umieść koniec rurki na napromieniowanym miejscu, a następnie zmień filtr mikroskopu z powrotem na Brightfield, aby monitorować pobieranie komórek w czasie rzeczywistym. Użyj strzykawki przymocowanej do drugiego końca rurki, aby ostrożnie pobrać 200 mikrolitrów roztworu zawierającego uwolnione komórki i przenieść roztwór do 1,5-milimetrowej probówki wirówkowej w celu analizy DNA lub posiewu. Do ekstrakcji komórek z hydrożeli luzem użyto różnych mikrowzorów światła UV, które wpłynęły na morfologię uwolnionych komórek.Ekspozycja na promieniowanie UV we wzorze pierścieniowym spowodowała uwolnienie całej kolonii zamkniętej w ochronnym hydrożelu PEG. W przeciwieństwie do tego, wystawiając część lub całą kolonię na działanie światła UV, komórki można wyodrębnić albo jako zagregowane klastry komórek, albo jako wolne pojedyncze komórki. Gęstość wysiewu komórek i grubość hydrożelu są ważne dla enkapsulacji komórek.Cieńsze hydrożele powodowały tworzenie mikrokolonii z minimalnym nakładaniem się kolonii, podczas gdy hydrożele o zwiększonej grubości powodowały nakładanie się kolonii, co może skutkować ekstrakcją wielu kolonii. Nakładające się na siebie kolonie mogą powodować zanieczyszczenie krzyżowe podczas ekstrakcji ze względu na dwuwymiarowy charakter wzoru świetlnego. Kiedy celem była górna kolonia, kolonia znajdująca się pod nią również była wydobywana wraz z nią.Oceniono również wpływ różnych mikrowzorów światła UV na żywotność komórek. Gdy mikrokolonie były wystawione na kontrolowane dawki światła UV w kształcie koła lub krzyża, regeneracja komórek i czystość DNA nie uległy zmianie. Komórki udało się pobrać z matryc mikrostudzienek przy użyciu tego podejścia, co było widoczne na reprezentatywnych obrazach mikroskopii konfokalnej, gdzie po napromieniowaniu we wzorze kołowym i pierścieniowym, komórki zostały usunięte w odpowiednim wzorze.Po ekstrakcji z macierzy mikrostudzienkowych oceniono żywotność komórek i ilość DNA. Wzorce ekspozycji nie wpłynęły ani na liczbę żywotnych komórek, ani na jakość DNA, co wskazuje, że żywe komórki bakteryjne mogą być selektywnie pobierane z mikrostudzienek przy minimalnych uszkodzeniach, a ich DNA można wyizolować w wysokiej czystości do dalszej analizy genomowej. Zawsze sprawdzaj, czy utworzył się hydrożel przed usunięciem perfluoroalkilowanego szkiełka nakrywkowego.Precyzja i ostrożność są wymagane przy umieszczaniu przekładek do osadzania hydrożelu i używaniu wężyków do ekstrakcji komórek.

photodegradable-hydrogel-interfaces-for-bacteria-screening-selection

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Niniejszy protokół opisuje mikrofluidyczny model kokultury do jednoczesnej i zlokalizowanej hodowli komórek nabłonkowych oraz bakterii. Model ten może być wykorzystany do badania roli różnych rozpuszczalnych sygnałów molekularnych w patogenezie, a także do oceny skuteczności potencjalnych probiotycznych szczepów bakteryjnych.

Mikrofluidyczna kokultura komórek nabłonkowych i bakterii do badania oddziaływań zapśredniczonych przez sygnały rozpuszczalne

Opis tworzenia polimerowej mikrosieci przy użyciu techniki fotopolimeryzacji na chipie. Opisano również wysokoprzepustową charakterystykę powierzchni z wykorzystaniem mikroskopii sił atomowych, pomiarów kąta zwilżania wodą, rentgenowskiej spektroskopii fotoelektronowej, spektrometrii mas jonów wtórnych czasu przelotu oraz testu adhezji komórek.

Polimerowe mikromacierze do wysokoprzepustowego odkrywania biomateriałów

Opisano projekt syntetycznego operonu kodującego zarówno aparat sekrecyjny, jak i monomery strukturalne włókien curli. Nadprodukcja tych amyloidów i polimerów adhezyjnych pozwala na mierzalny wzrost adhezji chassis E. coli1. Wyjaśniono proste sposoby wizualizacji i kwantyfikacji adhezji.

Inżynieria bakterii adherentnych poprzez stworzenie pojedynczego syntetycznego operonu curli

Źródło: Fattahi, N., et al. Fotodegradowalne interfejsy hydrożelowe do badań przesiewowych, selekcji i izolacji bakterii. J. Vis. Exp. (2021)Ten film pokazuje zastosowanie fotodegradowalnych hydrożeli do izolowania kolonii bakteryjnych w układach mikrostudzienek krzemowych. Komórki bakteryjne są najpierw ładowane do mikrostudzienek, zamykane w usieciowanym hydrożelu i hodowane w odrębnych koloniach. Po wystawieniu na działanie światła ultrafioletowego ukierunkowana degradacja hydrożelu...

Fotodegradowalna izolacja kolonii bakteryjnych na bazie hydrożelu w układach mikrodołków

Źródło: Fattahi, N., et al. Fotodegradowalne interfejsy hydrożelowe do badań przesiewowych, selekcji i izolacji bakterii. J. Vis. Exp. (2021).Ten film pokazuje ekstrakcję kolonii bakteryjnych z fotodegradowalnego hydrożelu za pomocą światła UV. Wybierana jest określona kolonia, a wzorzysta ekspozycja na światło ma na celu zainicjowanie miejscowej degradacji hydrożelu. Po dostosowaniu natężenia i czasu trwania światła stosuje się światło UV, uwalniając kolonię. Kolonia jest następnie zasysana...

Ukierunkowana izolacja kolonii bakteryjnych za pomocą degradacji hydrożelu o jasnym wzorze

Źródło: Venkateswaran, S., et al. Wysokowydajna identyfikacja polimerów odstraszających bakterie do wyrobów medycznych. J. Vis. Exp. (2016)Ten film przedstawia wysokoprzepustową metodę identyfikacji polimerów odstraszających bakterie za pomocą szkiełka mikromacierzowego wystawionego na działanie mieszanych kultur bakteryjnych. Wiązanie bakteryjne ocenia się za pomocą fluorescencji DAPI, gdzie zmniejszony sygnał wskazuje na polimery o minimalnym przyczepieniu powierzchniowym.

Wysokoprzepustowa identyfikacja polimerów odpychających bakterie za pomocą badań przesiewowych mikromacierzy

Źródło: Yarringto, K. D., et al. Kinetyczna wizualizacja jednokomórkowych międzygatunkowych oddziaływań bakteryjnych. J. Vis. Exp. (2020)Ten film przedstawia przygotowanie systemu kokultury z wykorzystaniem ruchliwych i nieruchliwych bakterii pod podkładką agarozową do obrazowania żywych komórek. Pokazuje, w jaki sposób ruchliwe bakterie wykrywają chemiczne atraktanty i atakują nieruchliwe kolonie, ujawniając interakcje bakteryjne.

Wizualizacja oddziaływań bakterii jednokomórkowych

Opisano wysokoprzepustową metodę mikromatrycową do identyfikacji polimerów, które redukują wiązanie powierzchni bakteryjnej na urządzeniach medycznych.

Wysokowydajna identyfikacja polimerów odstraszających bakterie do wyrobów medycznych

Ten protokół obrazowania żywych komórek bakteryjnych pozwala na wizualizację interakcji między wieloma gatunkami bakterii na poziomie pojedynczej komórki w czasie. Obrazowanie poklatkowe pozwala na obserwację każdego gatunku bakterii w monokulturze lub kokulturze w celu zbadania interakcji międzygatunkowych w wielogatunkowych społecznościach bakteryjnych, w tym ruchliwości i żywotności poszczególnych komórek.

Kinetyczna wizualizacja jednokomórkowych międzygatunkowych interakcji bakteryjnych

Ten protokół opisuje procedurę trójwymiarowego (3D) drukowania kolonii bakteryjnych w celu zbadania ich ruchliwości i wzrostu w złożonych 3D porowatych matrycach hydrożelowych, które są bardziej zbliżone do ich naturalnych siedlisk niż konwencjonalne kultury płynów lub szalki Petriego.

Bakterie do drukowania 3D do badania ruchliwości i wzrostu w złożonych porowatych ośrodkach 3D

Ten protokół przedstawia standardowy przepływ wysokowydajnego przesiewania dla mikroorganizmów przemysłowych. Obejmuje ono konstruowanie biblioteki mutantów poprzez mutagenezę ARTP, przeprowadzanie pozytywnego przesiewania kropel za pomocą zautomatyzowanych mikrofluidów i następnie weryfikację wyników. Niezawodność przepływu została zweryfikowana poprzez przesiewanie wysokowydajnych szczepów B. coagulans.

Przesiewowe badanie wysokowydajne mutantów Bacillus coagulans hiperprodukujących kwas L-mlekowy za pomocą zautomatyzowanej platformy mikrofluidycznej kroplowej

Poznaj metodę izolacji bakterii z wykorzystaniem fotodegradowalnych hydrożeli i wzorców świetlnych. Technika umożliwia selektywną ekstrakcję komórek przy zachowaniu ich żywotności i jakości DNA do analiz genomowych.

Fotodegradowalne interfejsy hydrożelowe do badań przesiewowych, selekcji i izolacji bakterii

Przeglądaj więcej filmów