Immunopeptydomika: izolacja mysich i ludzkich peptydów związanych z MHC klasy I i II do analizy spektrometrii mas

Protokół ten jest ważny, ponieważ jest prosty do wykonania i znajduje się w zasięgu każdego laboratorium. Protokół ten umożliwia izolację peptydów HLA lub MHC typu I lub typu II z próbek ludzkich lub mysich. Metoda ta może odpowiedzieć na pytania naukowe związane ze wszystkimi obszarami badawczymi związanymi z układem odpornościowym, czy to w raku, wirusologii czy chorobach autoimmunologicznych.

Protokół ten został zbudowany tak, aby był dostępny dla każdego, kto pracuje w laboratorium badawczym. Po prostu postępuj zgodnie z instrukcjami. Rozpocznij aktywację kulek bromku cyjanogenu Sepharose, ważąc 80 miligramów na próbkę i przenosząc je do 15-mililitrowej stożkowej probówki.

Dodaj pięć mililitrów jednomilimolowego kwasu solnego. Pipetować w górę i w dół pięć razy, aby ułatwić ponowne zawieszenie wysuszonych kulek, a następnie napełnić stożkową probówkę dodatkowymi 8,5 mililitrami jednomilimolowego kwasu solnego. Obracaj koraliki z prędkością 20 obr./min przez 30 minut w temperaturze pokojowej za pomocą urządzenia rotatora.

Odwirować kulki w temperaturze 200x G przez dwie minuty w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant przez aspirację. Dodać 500 mikrolitrów buforu sprzęgającego do palety kulek, a następnie przenieść zawiesinę kulek do nowej, dwumililitrowej probówki wirówkowej i odstawić na bok. W celu sprzężenia przeciwciał z tymi kulkami, dodaj dwa miligramy wybranego przeciwciała do nowej, dwumililitrowej probówki mikrowirówkowej i uzupełnij objętość do jednego mililitra roztworem buforowym sprzęgającym, aby uzyskać końcowe stężenie dwóch miligramów na mililitr.

Przenieś wcześniej przygotowany roztwór kulek i dodaj go do roztworu przeciwciał. Następnie obracaj probówkę mikrowirówki z prędkością 20 obr./min przez 120 minut za pomocą rotatora, odwiruj kulki, a następnie usuń supernatant zgodnie z wcześniejszym opisem. Teraz rozpocznij blokowanie i mycie kulek, najpierw dodając jeden mililitr glicyny 0,2-molowej do probówki mikrowirówki zawierającej kulki sprzężone z przeciwciałami i obracając z prędkością 20 obr./min przez 60 minut w temperaturze pokojowej za pomocą urządzenia rotatora.

Po odwirowaniu i usunięciu supernatantu umyj kulki jednym mililitrem PBS, usuń supernatant przez odwirowanie i przechowuj kulki w jednym mililitrze PBS w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu użycia. Aby wyizolować peptydy MHC klasy I lub II, rozmrozić zamrożoną paletę 100 milionów komórek, ogrzewając dno probówki dłonią. Dodaj 500 mikrolitrów PBS do palety i pipetuj w górę iw dół, aż zawiesina będzie jednorodna.

Przenieść zawiesinę do nowej, dwumililitrowej probówki do mikrowirówki i dodać równą objętość buforu do lizy komórek. Obracaj z prędkością 10 obr./min przez 60 minut w czterech stopniach Celsjusza za pomocą rotatora. Odwirować lizat komórkowy w temperaturze 18 000x G przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza z pełnym hamowaniem i przenieść supernatant do nowej, dwumililitrowej probówki do mikrowirówki.

Odzyskać kulki sprzężone z przeciwciałami przez odwirowanie i usunięcie supernatantu. Następnie przenieś supernatant lizatu komórkowego do kulek sprzężonych z przeciwciałami i inkubuj z prędkością 10 obr./min przez 14 do 18 godzin przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza za pomocą urządzenia rotatorowego. Drugiego dnia zdejmij dolną pokrywę kolumny polipropylenowej, umieść kolumnę na stojaku kolumny polipropylenowej i zainstaluj pod nią pusty pojemnik, aby zebrać przepływ.

Teraz przepłucz kolumnę polipropylenową 10 mililitrami buforu A i pozwól jej spłynąć grawitacyjnie. Jeśli prędkość przepływu płynnej elucji jest zbyt niska, należy dodatkowo przyciąć dolną końcówkę kolumny polipropylenowej. Odmierz i zbierz mieszaninę kulek/lizatu i przenieś ją do kolumny polipropylenowej.

Pozwól, aby płynna mieszanina wymyła się grawitacyjnie. Opcjonalnie zbierz i zamroź 20 mikrolitrów podwielokrotności do Western blot. Teraz umyj kulki zatrzymane w kolumnie polipropylenowej, dodając 10 mililitrów buforu A i pozwalając mu wymywać się grawitacyjnie.

Wyjmij kolumnę polipropylenową ze stojaka i umieść ją na nowej, dwumililitrowej probówce do mikrowirówki, trzymając kolumnę i probówkę razem ręką. Dodaj 300 mikrolitrów 1% TFA do kolumny polipropylenowej i wymieszaj kulki, przesuwając je w górę iw dół pięć razy. Następnie przenieś eluat do nowej, dwumililitrowej probówki do mikrowirówki.

W celu odsalania i elucji peptydów MHC, dodaj 200 mikrolitrów metanolu na wierzch kolumny C-18 i odwiruj przy 1,546x G przez trzy minuty, aby odrzucić przepływ. Dodać 200 mikrolitrów 80% acetonitrylu w 0,1% TFA na wierzch kolumny C-18 i ponownie odwirować, aby odrzucić przepływ. Następnie dodaj 200 mikrolitrów 0,1% TFA, odrzucając przepływ przez odwirowanie.

Na koniec załaduj 200 mikrolitrów kompleksów peptydowych MHC na kolumnę C-18, odrzuć przepływ przez wirowanie i powtarzaj, aż zostanie załadowana pełna objętość. Następnie dodaj 200 mikrolitrów 0,1% TFA, odwiruj, aby odrzucić przepływ, przenieś kolumnę C-18 do nowej, dwumililitrowej probówki do mikrowirówki i wymyj peptydy MHC, dodając 150 mikrolitrów 28% acetonitrylu w 0,1% TFA. Po odwirowaniu zbierz przepływ do nowej, 1,5-mililitrowej probówki do mikrowirówki.

Powtórz proces elucji dwukrotnie dla całkowitej objętości 450 mikrolitrów i zamrażaj w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do czasu analizy przez LC-MS-MS. Użyj tych oczyszczonych peptydów do identyfikacji peptydów MHC klasy I i II w spektrometrze mas. Skuteczność wiązania kulek zilustrowano znacznym spadkiem intensywności barwienia sygnału lekkich i ciężkich łańcuchów, gdy koraliki są kowalencyjnie związane z kulkami CNBr, w porównaniu z przeciwciałem przed sprzężeniem.

Wyizolowanie kompleksów peptydowych MHC po kwaśnej elucji zostało potwierdzone silnym sygnałem detekcji kompleksów peptydowych MHC przy użyciu przeciwciała łańcucha ciężkiego anty-HAL-ABC. Oszacowano również odtwarzalność wyników wewnątrz i między osobnikami przy użyciu obecnego protokołu. Średni współczynnik zmienności liczby peptydów wykrytych w trzech różnych kontrpróbach biologicznych był niewielki i wahał się od 1,9 do 11%Jednak tożsamość peptydów różniła się znacznie, a odsetek peptydów wykrytych w sposób powtarzalny w trzech kontrpróbach biologicznych wahał się od 39% do 63%Wygenerowane mapy cieplne wykazały przewidywaną siłę wiązania MHC zidentyfikowanych peptydów.

W przypadku mysich peptydów MHC klasy I i klasy II przewidywane silne lub słabe spoiwa wynosiły odpowiednio 89 i 87%. W przypadku ludzkich peptydów HLA klasy I i klasy II przewidywane silne lub słabe spoiwa wynosiły odpowiednio 97 i 70%. Wygenerowano również motywy wiązania peptydów myszy i człowieka dla peptydów LHC klasy I i II.

Przed optymalizacją tego protokołu izolacja mysich peptydów MHC klasy I i II była znacznie trudniejsza. Ten zoptymalizowany protokół ułatwi izolację mysich peptydów MHC klasy I i II z mysich modeli in vivo, na przykład rutynowo stosowanych do walidacji wielu różnych badań związanych z chorobami.