Name: Immunopeptydomika: izolacja mysich i ludzkich peptydów związanych z MHC klasy I i II do analizy spektrometrii mas (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-15T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Poznaj metodę izolacji peptydów MHC klasy I i II z komórek mysich i ludzkich do analizy spektrometrii mas. Protokół ten umożliwia badania w immunologii, onkologii i chorobach autoimmunologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Pierre'owi Thibaultowi, Ericowi Bonneilowi, Joëlowi Lanoix, Caroline Côté (Institute for Research in Immunology and Cancer, Université de Montréal) i Anthony'emu Purcellowi (Monash University) za ich wnikliwe komentarze. Prace te były wspierane przez fundusze z Fonds de recherche du Québec - Santé (FRQS), Fundacji Cole'a, CHU Sainte-Justine oraz Fundacji Charlesa-Bruneau, Kanadyjskiej Fundacji Innowacji, Narodowej Rady ds. Badań Naukowych i Inżynieryjnych (NSERC) (#RGPIN-2020-05232) oraz Kanadyjskich Instytutów Badań nad Zdrowiem (CIHR) (#174924).

Dostarczony tutaj protokół został zaadaptowany z ustalonych protokołów13,14,15,16,17,18,19,20. Ogólna procedura oczyszczania powinowactwa immunologicznego (IP) peptydów MHC klasy I i II jest zilustrowana na <silna klasa="xfig">Rysunek 1. Zobacz tabelę materiałów, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat zastosowanych linii komórkowych i przeciwciał.
1. Koraliki sprzęgające się z przeciwciałami (Dzień 1): Sprzężenie przeciwciał z sefarozą kulkami aktywowanymi CNBr
UWAGA: Przygotuj nowe roztwory do każdego nowego eksperymentu. Zapoznaj się z Tabelą materiałów i Tabelą uzupełniającą 1, aby zapoznać się z listą receptur odczynników i roztworów. Wszystkie kroki są wykonywane w temperaturze pokojowej (RT). W przypadku stosowania nowego przeciwciała należy sprawdzić skuteczność wiązania, pobierając kluczowe porcje (patrz wskazanie OPCJONALNIE) i wykonując barwienie na niebiesko Coomassie SDS-PAGE (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2).
<ol>
	<li>Aktywacja kulek sefarozy CNBr
	<ol>
		<li>Zważyć 80 mg kulek aktywowanych CNBr sefarozy na próbkę i przenieść je do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.</li>
		<li>Aby ułatwić ponowne zawieszenie wysuszonych kulek, najpierw dodaj 5 ml 1 ml HCl i pipetuj w górę i w dół 5 razy. Następnie napełnij stożkową probówkę dodatkowymi 8,5 ml 1 mM HCl.</li>
		<li>Obracaj z prędkością 20 obr./min (obrotów na minutę) przez 30 min przy prędkości obrotowej za pomocą urządzenia obrotowego. Odwirować kulki o masie 200 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant przez aspirację.</li>
		<li>Dodać 500 μl buforu sprzęgającego do osadu kulek i przenieść do nowej probówki wirówkowej o pojemności 2,0 ml i odłożyć na krok 1.2.2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sprzężenie przeciwciał z kulkami aktywowanymi CNBr
	<ol>
		<li>Przygotować przeciwciało wybrane do izolacji peptydów MHC klasy I lub II w nowej probówce mikrowirówkowej o pojemności 2,0 ml, dodając 2 mg przeciwciała (zgodnie ze stężeniem określonym przez producenta). Uzupełnić objętość do 1 ml roztworem buforu sprzęgającego, aby uzyskać końcowe stężenie 2 mg/ml.</li>
		<li>Odwirować kulki z etapu 1.1.4 przy 200 x g przez 2 minuty w temperaturze pokojowej, a następnie usunąć supernatant przez aspirację.</li>
		<li>Dodać roztwór przeciwciała do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2,0 ml zawierającej aktywowane kulki.</li>
		<li>(OPCJONALNIE) Weź porcję 18 μL (WEJŚCIE), dodaj 6 μL bufora 4x SDS-PAGE i natychmiast zamroź.</li>
		<li>Obracać probówkę mikrowirówki z kroku 1.2.3 z prędkością 20 obr./min przez 120 minut za pomocą urządzenia rotatora. Odwirować kulki o masie 200 x g przez 2 minuty, a następnie usunąć supernatant.</li>
		<li>(OPCJONALNIE) Pobrać podwielokrotność 18 μl supernatantu (przeciwciała niezwiązanego), dodać 6 μl buforu 4x SDS-PAGE i natychmiast zamrozić.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Blokowanie i mycie koralików sprzężonych z przeciwciałami
	<ol>
		<li>Dodać 1 ml 0,2 M glicyny do probówki mikrowirówki zawierającej kulki sprzężone z przeciwciałami z kroku 1.2.5. Obracaj z prędkością 20 obr./min przez 60 minut przy prędkości obrotowej za pomocą urządzenia rotatora.</li>
		<li>Odwirować kulki o masie 200 x g przez 2 minuty, a następnie usunąć supernatant. Dodać 1 ml PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami).</li>
		<li>Odwirować kulki o masie 200 x g przez 2 minuty, a następnie usunąć supernatant.</li>
		<li>(OPCJONALNIE) Pobrać podwielokrotność 18 μl supernatantu (przeciwciało niezwiązane, ostatnie płukanie), dodać 6 μl 4x buforu SDS-PAGE i natychmiast zamrozić.</li>
		<li>Dodaj 1 ml PBS do kulek w kroku 1.3.3.</li>
		<li>(OPCJONALNIE) Pobrać podwielokrotność 18 μl mieszaniny kulek (kulki sprzężone z przeciwciałem), dodać 6 μl 4x buforu SDS-PAGE i natychmiast zamrozić.</li>
		<li>Przechowywać w temperaturze 4 °C do użycia tego samego dnia w kroku 2.5. 
		UWAGA: Koraliki można przygotować dzień przed immunowychwytywaniem, ale dłuższe przechowywanie nie zostało przetestowane.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Liza komórek i wychwytywanie immunologiczne za pomocą sprzężonych kulek przeciwciał (Dzień 1)
UWAGA: Poziom cząsteczek MHC różni się w zależności od typu komórki, a kwantyfikacja cząsteczek MHC/HLA na komórkę jest sugerowana21 (Rysunek 4A). Zalecamy co najmniej 1 x 108 komórek dla każdego adresu IP. Ta liczba komórek odpowiada 6-10 mg białka z komórek JY, EL4 i A20 rozpuszczonych 0,5% buforem Chaps. Aby przygotować granulki komórkowe dla IP, komórki należy zebrać, odwirować i dwukrotnie przemyć 5 ml PBS. Następnie granulki komórkowe można przechowywać w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml lub probówce stożkowej o pojemności 15 ml w temperaturze -80 °C do czasu IP. Należy pamiętać, że IP można wykonać na świeżo zebranych lub zamrożonych granulkach komórek.
<ol>
	<li>Aby wyizolować peptydy MHC klasy I lub II, rozmrozić zamrożony granulat 1 x 108 komórek, ogrzewając dno probówki dłonią. Dodać 500 μl PBS do granulki i pipetować w górę i w dół, aż zawiesina będzie jednorodna. 
	UWAGA: W zależności od typu ogniwa, objętość osadu komórkowego może się znacznie różnić. Jeśli 500 μl PBS nie wystarczy do rozpuszczenia osadu komórkowego, użyj więcej PBS, aż komórki łatwo się rozlegną podczas pipetowania w górę iw dół.</li>
	<li>Zmierzyć całkowitą objętość osadu zawieszonego w PBS i przenieść do nowej probówki o pojemności 2 ml do mikrowirówki. W razie potrzeby podziel na więcej rurek.</li>
	<li>Dodać objętość buforu do lizy komórek (1% buforu chaps w PBS zawierającym inhibitory proteazy, 1 osadka/10 ml buforu) równoważną objętości osadu komórkowego ponownie zawieszonego w PBS zmierzonej w poprzednim kroku. Końcowe stężenie buforu do lizy wynosi 0,5% Chaps.</li>
	<li>Obracać z prędkością 10 obr./min przez 60 min w temperaturze 4 °C za pomocą rotatora. Odwirować lizat komórkowy przy 18 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C z pełnym hamowaniem i przenieść supernatant (zawierający kompleksy MHC-peptydy) do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 2,0 ml.</li>
	<li>Odzyskać kulki sprzężone z przeciwciałami z kroku 1.3.7 przez odwirowanie przy 200 x g przez 2 minuty i usunąć supernatant.</li>
	<li>Przenieść supernatant lizatu komórkowego opisany w kroku 2.4 do kulek sprzężonych z przeciwciałami i inkubować z rotacją (10 obr./min) przez 14-18 godzin (przez noc) w temperaturze 4 °C za pomocą urządzenia rotatorowego.</li>
</ol>
3. Elucja peptydów MHC (Dzień 2)
UWAGA: Kolumna polipropylenowa umożliwia elucję kompleksów MHC-peptyd, jednocześnie zatrzymując kulki w kolumnie. W celu oceny proporcji kompleksów MHC-peptydy związanych z kulkami przed i po kwaśnej elucji z 1% TFA (kwas trifluorooctowy), możliwe jest wykonanie western blot z podwielokrotnościami pobranymi na kluczowych etapach protokołu (patrz wskazanie OPCJONALNIE). Western blot pokazany w <silna klasa="xfig">Rysunek 3 pokazuje wzbogacenie kompleksów MHC-peptyd po kwaśnej elucji z 1% TFA. Brak sygnału w tej frakcji wskazywałby, że etap elucji nie powiódł się. Należy zauważyć, że proporcja niezwiązanych kompleksów peptydów MHC do kulek może być również oceniana równolegle przez western blot przy użyciu podwielokrotności opisanej w kroku 3.1.6.
<ol>
	<li>Elucja kompleksów MHC-peptyd z kulek sprzężonych z przeciwciałami
	<ol>
		<li>Zdejmij dolną pokrywę kolumny polipropylenowej, umieść kolumnę na stojaku kolumny polipropylenowej i zainstaluj pod spodem pusty pojemnik, aby zbierać przepływ. 
		UWAGA: Wymagana jest jedna kolumna na próbkę.</li>
		<li>Przepłukać kolumnę polipropylenową 10 ml buforu A i pozostawić do spłynięcia grawitacyjnie. Jeśli prędkość przepływu płynnej elucji jest zbyt niska, należy dodatkowo przyciąć dolną końcówkę kolumny polipropylenowej.</li>
		<li>Odmierz i zbierz mieszaninę kulek i lizatu (~2 ml) z kroku 2.5 i przenieś ją do kolumny polipropylenowej.</li>
		<li>(OPCJONALNIE) Pobrać porcję 20 μl (lub 1/100 z całkowitej objętości) do western blotting i natychmiast zamrozić. Frakcja ta odpowiada całkowitym kompleksom MHC-peptydów inkubowanym z kulkami.</li>
		<li>Pozwól, aby płynna mieszanina wymyła się grawitacyjnie.</li>
		<li>(OPCJONALNIE) Zebrać i zmierzyć przepływ, a następnie pobrać podwielokrotność 20 μl (lub 1/100 z całkowitej objętości) do western blot i natychmiast zamrozić. Frakcja ta reprezentuje resztkowe niezwiązane kompleksy peptydów MHC.</li>
		<li>Aby w jak największym stopniu odzyskać mieszaninę kulek i lizatu, należy przepłukać probówkę z kroku 3.1.3 1 ml buforu A i przenieść ją do kolumny polipropylenowej.</li>
		<li>Przemyć kulki zatrzymane w kolumnie polipropylenowej, dodając 10 ml buforu A. Pozwól, aby bufor myjący wymywa się grawitacyjnie.</li>
		<li>Powtórzyć etap przemywania z 10 ml buforu B, 10 ml buforu A, a następnie 10 ml buforu C.</li>
		<li>Wyjmij kolumnę polipropylenową ze stojaka i umieść ją na nowej probówce do mikrowirówek o pojemności 2.0 ml. Trzymaj kolumnę i rurkę razem ręką.</li>
		<li>Dodać 300 μl 1% TFA do kolumny polipropylenowej i wymieszać kulki, pipetując w górę i w dół 5 razy. 
		UWAGA: Kulki zostaną zatrzymane w kolumnie polipropylenowej, a peptydy związane z MHC zostaną wymyte w probówce mikrowirówkowej o pojemności 2,0 ml.</li>
		<li>Przenieść eluat do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 2,0 ml. Powtórzyć krok 3.1.11 i połączyć 2 eluaty (eluaty zawierające kompleksy MHC-peptyd powinny odpowiadać całkowitej ilości 600 μl i zostaną użyte w kroku 3.2.4).</li>
		<li>(OPCJONALNIE) Zebrać porcję 6 μl (lub 1/100 całkowitej objętości) do western blotting i natychmiast zamrozić. Frakcja ta odpowiada kompleksom MHC-peptydy eluowane z kulek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odsalanie i elucja peptydów MHC 
	UWAGA: Etapy odsalania i elucji peptydów MHC można wykonać, instalując kolumnę C18 na probówce mikrowirówki o pojemności 2.0 ml. Aby uzyskać lepsze dopasowanie, zainstaluj wyżarzacze dostarczone przez producenta między kolumną C18 a probówką mikrowirówki o pojemności 2,0 ml. W tym protokole używana jest kolumna C18 o pojemności objętościowej 5-200 μL (6-60 μg). Wszystkie kroki są wykonywane w RT.
	<ol>
		<li>Dodać 200 μl metanolu na wierzch kolumny C18, a następnie odwirować przy 1546 x g przez 3 minuty. Odrzucić przepływ.</li>
		<li>Dodać 200 μl 80% ACN (acetonitryl)/0,1% TFA na wierzch kolumny C18, a następnie odwirować przy 1546 x g przez 3 minuty. Wyrzucić przepływ.</li>
		<li>Dodać 200 μl 0,1% TFA na wierzch kolumny C18, a następnie odwirować przy 1546 x g przez 3 minuty. Wyrzucić przepływ.</li>
		<li>Załadować 200 μl kompleksów peptydowych MHC z kroku 3.1.12 na kolumnę C18. Wirować przy 1546 x g przez 3 minuty i odrzucić przepływ</li>.
		<li>Powtórz krok 3.2.4 dwukrotnie, aż zostanie załadowany cały wolumin. Należy pamiętać, że peptydy MHC są zatrzymywane w kolumnie C18.</li>
		<li>Dodać 200 μl 0,1% TFA do kolumny C18, a następnie odwirować przy 1546 x g przez 3 minuty. Wyrzucić przepływ.</li>
		<li>Przenieść kolumnę C18 do nowej probówki do mikrowirówki o pojemności 2,0 ml. Elute peptydy MHC z kolumny C18 przez dodanie 150 μL 28%ACN/0,1%TFA.</li>
		<li>Wirować przy 1546 x g przez 3 min.</li>
		<li>Przenieś przepływ do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Uważaj, aby nie wyrzucić przepływu; zawiera wyizolowane peptydy MHC klasy I lub II.</li>
		<li>Powtórzyć kroki 3.2.7-3.2.9 dwukrotnie, uzyskując całkowitą objętość 450 μl.</li>
		<li>Zamrozić 450 μl eluatu (oczyszczone peptydy MHC klasy I lub II) w temperaturze -20 °C do czasu analizy próbek za pomocą LC-MSMS.</li>
		<li>Przed analizą LC-MS/MS oczyszczone peptydy MHC klasy I lub II z kroku 3.2.11 są odparowywane do sucha za pomocą koncentratora próżniowego z ustawieniami wstępnymi 45 °C przez 2 godziny, poziomem próżni: 100 mTorr i rampą podciśnienia: 5, 
		UWAGA: Odparowywanie zamrożonych próbek jest bardzo wydajne. Wysuszone peptydy można ponownie zamrozić do czasu analizy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Identyfikacja peptydów MHC klasy I i II przez LC-MS/MS
UWAGA: Analizuj immunopeptydome MHC klasy I i II za pomocą wysokowydajnego Orbitrapu i kwadrupolowych spektrometrów masowych czasu przelotu o wysokiej rozdzielczości6. Poniższe informacje mają jedynie charakter orientacyjny, biorąc pod uwagę, że różne istniejące przyrządy do tandemowej spektrometrii mas działają zgodnie z różnymi normami operacyjnymi. Krótki zarys kroków omówiono poniżej:
<ol>
	<li>Wysuszone próbki należy rozpuścić (z etapu 3.2.12) w 50 μl 4% kwasu mrówkowego (FA).</li>
	<li>Załaduj trzy wstrzyknięcia po 16 μl na każdą próbkę i oddziel na domowej roboty kolumnie z odwróconymi fazami (średnica wewnętrzna 150 μm na długość 250 mm, Jowisz 3 μm C18 300 A) o nachyleniu od 5%-30% ACN-0,1% FA i natężeniu przepływu 600 nL/min na nanoprzepływowym UHPLC podłączonym do MS.</li>
	<li>Uzyskaj każde pełne widmo MS w rozdzielczości 120000, AGC 4 x 105 z trybem automatycznym dla czasu wtrysku i widm za pomocą tandem-MS (MS-MS) na najliczniej występujących wielokrotnie naładowanych jonach prekursorowych dla maksymalnie 3 s. 
	UWAGA: Eksperymenty Tandem-MS są przeprowadzane przy użyciu dysocjacji kolizyjnej o wyższej energii (HCD) przy energii zderzenia 30%, rozdzielczości 30 000, AGC 1,5 x 10,5 i czasie wtrysku 300 ms.</li>
	<li>Przetwarzaj pliki danych z trzech wstrzyknięć/próbki za pomocą oprogramowania do analizy proteomicznej LC-MS/MS (np. PEAKS X) przy użyciu baz danych myszy i ludzi (UniProtKB/Swiss-Prot (2019_09)).</li>
	<li>Wybierz "Nieokreślone trawienie enzymatyczne" dla parametru enzymu oraz 10 ppm i 0,01 Da dla tolerancji masy odpowiednio dla jonów prekursorowych i fragmentacyjnych. 
	UWAGA: Zmiennymi modyfikacjami są deamidacja (NQ) i utlenianie (M). Wszystkie inne parametry wyszukiwania są wartościami domyślnymi. Końcowe listy peptydów są filtrowane przy użyciu ALC wynoszącego 80% i ze wskaźnikiem fałszywych wykryć (FDR) wynoszącym 1% przy użyciu oprogramowania do analizy proteomicznej LC-MS/MS.</li>
</ol>
5. Wizualizacja danych immunopeptydomicznych
UWAGA: Jakość danych immunopeptydomicznych generowanych przez SM może być oceniana na wiele sposobów, jak ostatnio opisano22,23. Do wizualizacji danych i oceny ich ogólnej jakości, składu i specyficzności MHC można użyć narzędzia programowego MhcVizPipe (MVP).
<ol>
	<li>Postępuj zgodnie ze wszystkimi instrukcjami i powiązaną dokumentacją, aby zainstalować i uruchomić oprogramowanie MVP dostępne na stronie Caron Lab GitHub 24. 
	UWAGA: MVP zapewnia szybki i skonsolidowany wgląd w jakość, skład i swoistość próbki MHC. MVP równolegle wykorzystuje sprawdzone algorytmy immunopeptydomiczne (NetMHCpan25, NetMHCIIpan26 i GibbsCluster27) i generuje zorganizowane i łatwe do zrozumienia raporty w formacie HTML (HyperText Markup Language). Raporty są w pełni przenośne i można je przeglądać na dowolnym komputerze z nowoczesną przeglądarką internetową. Zobacz Dane uzupełniające 1-4, aby zapoznać się z przykładami raportów HTML.</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Dwie mysie linie komórkowe (EL4 i A20), jedna ludzka linia komórkowa (JY) i pięć komercyjnie dostępnych przeciwciał [M1 (anty-H2Db/Kb), Y3 (anty-H2Kb), M5 (anty-H2-IAd/IEd), W6/32 (anty-HLA-ABC) i L243 (anty-HLA-DR)] zostały przetestowane i zwalidowane w kontekście tego protokołu i dostarczają wysokiej jakości danych immunopeptydomowych. Dostępne są inne przeciwciała anty-HLA (np. anty-HLA-A2 BB7.2), ale nie zostały tutaj przetestowane. Należy zauważyć, że przeciwciało W6/32 jest szeroko stosowane i jest najbardziej znanym przeciwciałem w tej dziedzinie; umożliwia izolację peptydów prezentowanych przez wszystkie cząsteczki HLA-ABC u ludzi i był wcześniej zgłaszany przez laboratoria eksperckie do pracy z różnych źródeł biologicznych, takich jak świeże lub mrożone tkanki 8,39, komórki jednojądrzaste krwi obwodowej i komórki jednojądrzaste szpiku kostnego40, biopsje41, ksenografty41,42, autopsje43 i próbki osocza44,45.
Przygotowanie świeżych roztworów, które są stosowane w całym protokole, ma kluczowe znaczenie. W szczególności stosowanie świeżych roztworów kwasowych w szklanych butelkach ma kluczowe znaczenie dla uniknięcia późniejszego zanieczyszczenia próbek analizowanych przez MS. Ponadto, gdy protokół jest wykonywany po raz pierwszy i/lub z nowym przeciwciałem, ważne jest, aby ocenić, czy przeciwciało jest rzeczywiście sprzężone z kulkami CNBr Sepharose za pomocą niebieskiego żelu Coomassie. Etapy płukania kulek sprzężonych z przeciwciałami po immunowychwytywaniu kompleksów MHC-peptyd mają również kluczowe znaczenie dla uniknięcia zanieczyszczenia peptydów innych niż MHC. Wreszcie, należy zachować szczególną ostrożność, aby nie wyrzucić eluatów po elucji kompleksów MHC-peptyd z 1% TFA i elucji peptydów z kolumny C18 z ACN28%/0,1% FA.
Istniejące protokoły dostępne w literaturze opisują dodatkowe etapy dalszego oczyszczania peptydów na końcu procedury izolacji, np. frakcjonowanie peptydów różnymi metodami14,46 lub ultrafiltrację przy użyciu filtrów 10-30 kDa13,47. Obecny protokół nie zawiera szczegółowych informacji na temat tych dodatkowych kroków i jest wystarczający do zapewnienia wysokiej jakości danych immunopeptydomowych. Jednak takie kroki mogą być rozważane przez osoby niebędące ekspertami w celu modyfikacji i rozwiązywania problemów w celu dalszej optymalizacji procedury izolacji peptydów.
Rodzaj kulek i rodzaj kwaśnego buforu elucyjnego, które są używane do elucji kompleksów MHC z kulek, można również zmodyfikować w celu rozwiązywania problemów 13,14,15,16,17,18,19. W związku z tym kulki aktywowane sefarozą CNBr są na ogół dobrym punktem wyjścia, ponieważ są stosunkowo niedrogie, a ponadto wykazują elastyczność w zakresie wiązania z różnymi typami przeciwciał. W obecnym protokole wykazano, że kulki aktywowane sefarozą CNBr działają stosunkowo dobrze przy użyciu pięciu różnych dostępnych na rynku przeciwciał (tj. M1, Y3, W6/32, L243 i M5). Oprócz kulek aktywowanych sefarozą CNBr, kulki Protein A lub G lub A/G sepharose 4 Fast Flow są również łatwe w obsłudze i chociaż są stosunkowo droższe, mogą generować podobne wyniki. Innym czynnikiem, który należy wziąć pod uwagę, jest powinowactwo przeciwciała do białka A lub G. Co więcej, kulki magnetyczne sefarozy są również bardzo łatwe w użyciu, ale są stosunkowo drogie. Niezależnie od rodzaju kulek wybranych przez osoby niebędące ekspertami, zachęca się do zbierania podwielokrotności na krytycznych etapach protokołu i wykonywania niebieskich żeli SDS-PAGE barwionych Coomassie w celu śledzenia skuteczności wiązania przeciwciała z kulkami, jak pokazano na rysunku 2.
Innym ważnym czynnikiem wpływającym na skuteczność izolacji peptydów MHC jest rodzaj kwaśnego buforu elucyjnego używanego do izolacji kompleksów MHC-peptyd z kulek. Zgłaszano różne, w tym 0,1%, 1% lub 10% TFA, 0,2% FA i 10% kwas octowy. 1% TFA był buforem elucyjnym działającym dla wszystkich badanych przeciwciał. Etap ten można również prześledzić za pomocą western blot w stosunku do cząsteczek MHC używanych do wychwytywania peptydów MHC, jak pokazano na rysunku 3.
Wszystkie zawierające acetonitryl (ACN) i/lub kwas trifluorooctowy (TFA) są agresywne i mogą prowadzić do zanieczyszczenia próbki substancjami drobnocząsteczkowymi i polimerowymi, takimi jak plastyfikatory w kontakcie z tworzywem sztucznym. Aby uniknąć takich problemów, wszystkie roztwory zawierające rozpuszczalnik organiczny i/lub tłuszcz tłuszczowy są codziennie przygotowywane świeże i przechowywane w szklanej butelce do czasu użycia. Większość kroków jest wykonywana w plastikowej tubie Protein LoBind. Rurki te są specjalnie zaprojektowane do proteomiki i są wykonane z najwyższej jakości pierwotnego polipropylenu wolnego od biocydów, plastyfikatorów i lateksu. Produkowane są również ze zoptymalizowanych, wypolerowanych na wysoki połysk form bez użycia środków poślizgowych. Te środki ostrożności są ważne do rozważenia, aby umożliwić generowanie wysokiej jakości danych immunopeptydomowych.
Przeciwciało jest ważnym ograniczeniem izolacji peptydów związanych z MHC. Przeciwciało W6/32 umożliwia izolację peptydów prezentowanych przez wszystkie cząsteczki HLA-ABC klasy I u ludzi i jest najczęściej stosowanym i uznanym przeciwciałem w tej dziedzinie. Typowanie HLA w wysokiej rozdzielczości niescharakteryzowanych ludzkich linii komórkowych lub próbek biologicznych nie jest konieczne po zastosowaniu przeciwciała W6/32, niemniej jednak jest zalecane w przypadku niektórych zastosowań w celu ułatwienia interpretacji danych48. Informacje o typowaniu HLA/MHC można również znaleźć w zasobach publicznych dla wielu linii komórkowych i modeli myszy49. Oprócz przeciwciała W6/32, cztery inne przeciwciała (M1, M5, Y3 i L243), które zostały przetestowane i zwalidowane w kontekście tego protokołu, są dostępne na rynku. Z drugiej strony, wiele innych przeciwciał, które zostały zgłoszone w poprzednich badaniach immunopeptydomicznych, nie zostało w dużej mierze przyjętych przez społeczność i nie są dostępne komercyjnie lub są dostępne poprzez hodowlę linii komórkowych hybrydomy, co jest stosunkowo drogie.
Innym ważnym ograniczeniem izolacji peptydów związanych z MHC jest wymagana ilość materiału wyjściowego. Wymagana ilość jest odwrotnie proporcjonalna do poziomu ekspresji cząsteczek MHC na powierzchni komórki, który można określić ilościowo za pomocą cytometrii przepływowej (ryc. 4A). Komórki wykazujące wysoki poziom ekspresji cząsteczek MHC (np. komórki dendrytyczne i ogólnie komórki hematopoetyczne) na ogół dostarczają wysokiej jakości danych immunopeptydomowych. Laboratoria eksperckie używają już od 50 milionów komórek50, ale dla osób niebędących ekspertami zaleca się od 100 milionów do 1 miliarda komórek. Zgłoszono również zastosowanie biopsji tkanek (<13 mg)41, ksenoprzeszczepu42,43, autopsji44 i próbki osocza45,46, które nadal stanowią wyzwanie dla laboratoriów niebędących ekspertami. Również całkowita liczba oczekiwanych peptydów związanych z MHC jest dobrze udokumentowana dla ustalonych linii komórkowych (tutaj od ~ 2000 do ~ 10000 peptydów w zależności od użytej linii komórkowej i przeciwciała), ale bezwzględne ilości naturalnie prezentowanych peptydów, które są skutecznie ściągane w dół przez tę technikę, pozostają przedmiotem dyskusji. Rzeczywiście, w poprzednich badaniach szacowano, że skuteczność procedury izolacji jest zależna od peptydów i może wynosić nawet od 0,5% do 2%51. Inne ograniczenia w immunopeptydomikach to powtarzalność metod i niezdolność narzędzi zestawu NetMHCpan do prawidłowego opisywania peptydów do alleli MHC, które są mniej scharakteryzowane. W związku z tym dalszy rozwój i zastosowanie stosunkowo nowych, niezależnych od danych metod akwizycji MS 7,32,52, a także nowych algorytmów grupowania peptydów i przewidywania wiązania peptydów MHC3 1,34,53,54 Oczekuje się, że poprawią odtwarzalność i dokładność adnotacji peptydów w immunopeptydomikach. Immunopeptydomika napotyka inne ograniczenia dotyczące pozyskiwania stwardnienia rozsianego i analizy obliczeniowej peptydów związanych z MHC i są omówione w innym miejscu 1,6,55.
Podczasgdy izolacja peptydów związanych z HLA-ABC z próbek ludzkich przy użyciu przeciwciała W6/32 jest dobrze znana i szeroko stosowana przez wiele grup badawczych, izolacja mysich peptydów związanych z MHC klasy I i II jest stosunkowo mniej znana. W związku z tym potrzebne są solidne protokoły izolacji mysich ligandów MHC. Tutaj zapewniamy protokół zoptymalizowany pod kątem izolacji peptydów MHC klasy I i peptydów MHC klasy II z dwóch linii komórkowych myszy odpowiednio pochodzenia C57BL/6 i BALB/c. W szczególności protokół umożliwia izolację peptydów związanych z H2Kb i H2Db klasy I przy użyciu przeciwciała M1, a także peptydów związanych z H2-IAi H2-IEd klasy II przy użyciu przeciwciała M5. W związku z tym rozpowszechnienie i zastosowanie obecnego protokołu powinno ułatwić podstawowe i translacyjne badania immunopeptydomiczne w różnych modelach mysich.
Protokół może być wykorzystany do ustanowienia i standaryzacji przepływu pracy immunopeptydomiki, a także do analizy porównawczej nowych protokołów. Na przykład, można go dostosować i dalej optymalizować do wykonywania badań przesiewowych immunopeptydomicznych w różnych matrycach biologicznych, od krwi/osocza po świeże lub zamrożone tkanki do FFPE (Formalin-Fixed Paraffin-Embedded). Ponadto protokół będzie sprzyjał wewnątrz- i międzylaboratoryjnej odtwarzalności procedury przygotowania próbek w immunopeptydomikach i dlatego oczekuje się, że znajdzie szerokie zastosowanie w badaniach podstawowych i klinicznych.

W ciągu ostatniej dekady zainteresowanie badaniem repertuaru peptydów związanych z MHC przekroczyło sektor akademicki i dotarło do przemysłu biotechnologicznego i farmaceutycznego. Rzeczywiście, w przypadku nowotworów odkrycie neoantygenów specyficznych dla nowotworu stanowi główny cel badań w sektorze przemysłowym w celu opracowania immunoterapii klinicznych prowadzących do spersonalizowanej onkologii1,2,3. Zasadniczo peptydy związane z MHC są obecne w całym ciele, odzwierciedlają wewnątrzkomórkowy etap komórki i są istotne w różnych stanach chorobowych, takich jak autoimmunizacja, przeszczepy, choroby zakaźne, stany zapalne, rak i alergie1,4. Tak więc peptydy związane z MHC lub ligandy ludzkiego antygenu leukocytarnego (HLA) u ludzi mają duże znaczenie medyczne i są zbiorczo określane jako immunopeptydoma5.
MS to potężne analityczne podejście do charakteryzowania immunopeptydome6,7, w tym odkrycie neoantygenów specyficznych dla nowotworu8,9,10,11. Typowy przepływ pracy w celu przeprowadzenia eksperymentu immunopeptydomicznego obejmuje trzy główne kroki: 1) przygotowanie próbki do izolacji peptydów związanych z MHC, 2) akwizycję danych przez MS oraz 3) analizę danych przy użyciu różnych obliczeniowych narzędzi programowych12. Generowanie wysokiej jakości próbek opisanych w tym zobrazowanym protokole ma kluczowe znaczenie dla powodzenia każdego projektu dotyczącego immunopeptydomiki opartej na stwardnieniu rozsianym. Opisany poniżej protokół koncentruje się na izolowaniu peptydów związanych z MHC klasy I i II z dobrze ugruntowanych linii komórkowych, które są odpowiednie do generowania wysokiej jakości danych immunopeptydomowych. Reprezentatywne wyniki z tych linii komórkowych są pokazane w aktualnym protokole.

<table><tbody><tr><td>Linia komórkowa A20</td><td>ATCC</td><td>TIB-208</td><td>mysi limfoblast B</td></tr><tr><td>Acetonitryl, LC/MS Grade</td><td>FisherScientific</td><td>A955-4</td><td></td></tr><tr><td>anty-ludzki HLA A, B, C (W6/32) - MHC klasa I</td><td>BioXcell</td><td>BE0079</td><td></td></tr><tr><td>anty-Human/Monkey HLA-DR (L243) - MHC klasa II</td><td>BioXcell</td><td>BE0308</td><td></td></tr><tr><td>anty-mysz H2 (M1/42.3.9.8) - MHC klasa I</td><td>BioXcell</td><td>BE0077</td><td></td></tr><tr><td>anty-mysie H2-IAd/IEd (M5/114) - MHC klasa II</td><td>BioXcell</td><td>BE00108</td><td></td></tr><tr><td>anty-mysie H2Kb (Y3) - MHC klasa I</td><td>BioXcell</td><td>BE0172</td><td></td></tr><tr><td>BupH Pakiety soli fizjologicznej buforowane fosforanem (PBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>28372</td><td>Zawartość torebki rozpuszczona w końcowej objętości 500 ml wody dejonizowanej (FisherScientific, W64)</td></tr><tr><td>CHAPS (3-[(3-cholamidopropylo)dimetyloamonio]-1- propanosulfonian)</td><td>EMDMilipore</td><td>220201-10MG</td><td></td></tr><tr>Sepharose <td>Cytivia</td> <td>aktywowana CNBr</td><td># 17-0430-01</td><td></td></tr><tr><td>Linia komórkowa EL4</td><td>ATCC</td><td>TIB-39</td><td>mysi limfoblast T</td></tr><tr><td>epTIPS Końcówki LoRetencji, 1000 i mikro; L/Eppendorf</td><td>FisherScientific</td><td>02-717-352</td><td>Lepsze wyniki dzięki materiałowi o niskiej retencji</td></tr><tr><td>epTIPS Końcówki LoRetention Tips, 200 &micro; L/Eppendorf</td><td>FisherScientific</td><td>02-717-351</td><td>Lepsze wyniki dzięki materiałowi o niskiej retencji</td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy, klasa LC/MS</td><td>FisherScientific</td><td>A117-50</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>FisherScientific</td><td>RDCG0250500</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór kwasu solnego</td><td>FisherScientific</td><td>60-007-11</td><td></td></tr><tr><td>Linia komórkowa JY</td><td>Sigma Aldrich</td><td>94022533-1VL</td><td>Unieśmiertelniona przez EBV linia limfoblastoidów komórek B</td></tr><tr><td>Metanol, klasa LC/MS</td><td>FisherScientific</td><td>A456-4</td><td></td></tr><tr><td>Kolumny do chromatografii polipropylenowej (kolumna polipropylenowa)</td><td>Bio-Rad</td><td>731-1550</td><td>określany jako kolumna polipropylenowa w protokole</td></tr><tr><td>Inhibitor proteaz</td><td>ThermoFisher</td><td>A32963</td><td>1 granulka na 10 ml buforu do lizy komórek</td></tr><tr><td>Qifikit</td><td>Dako</td><td>K007811-8</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Amresco</td><td># 0865-1kg</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>FisherScientific</td><td>MSX04201</td><td></td></tr><tr><td>Dysk ekstrakcyjny do fazy stałej, kolumna ultramikrospinowa C18</td><td>Grupa gniazdowa</td><td>SEMSS18V</td><td>pojemność 6&ndash; 60 &mikro; g, maksymalna głośność 200 i mikro; Kwas</td></tr><tr><td>trifluorooctowy (TFA), klasa LC-MS</td><td>FisherScientific</td><td>PI85183</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>FisherScientific</td><td>T395-500</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>FisherScientific</td><td>#10812846001</td><td></td></tr><tr><td>Probówka LoBind 1,5 mL/Eppendorf</td><td>FisherScientific</td><td>E925000090</td><td>Lepsze wyniki dzięki materiałowi o niskiej retencji</td></tr><tr><td>Tubka LoBind 2 mL/Eppendorf</td><td>FisherScientific</td><td>13-698-795</td><td>Lepsze wyniki dzięki materiałowi o niskiej retencji</td></tr><tr><td>Woda, klasa LC/MS</td><td>FisherScientific</td><td>W64</td><td></td></tr></tbody></table>

immunopeptydomika: izolacja mysich i ludzkich peptydów związanych z mhc klasy i i ii do analizy spektrometrii mas

Immunopeptidomics: Isolation of Mouse and Human MHC Class I- and II-Associated Peptides for Mass Spectrometry Analysis

Immunopeptydomika to rozwijająca się dziedzina, która napędza i kieruje rozwojem szczepionek i immunoterapii. Dokładniej rzecz ujmując, odnosi się do nauki polegającej na badaniu składu peptydów prezentowanych przez cząsteczki głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC) klasy I i klasy II przy użyciu platform technologicznych spektrometrii mas (MS). Spośród wszystkich etapów procesu pracy immunopeptydomicznego opartego na stwardnieniu rozsianym, przygotowanie próbki jest niezwykle ważne dla uzyskania wysokiej jakości danych o znaczeniu terapeutycznym. W tym miejscu opisano instrukcje krok po kroku, jak wyizolować peptydy związane z MHC klasy I i II poprzez oczyszczanie immunopowinowactwa z próbek kontroli jakości, w szczególności z linii komórkowych myszy (EL4 i A20), a dokładniej ludzi (JY). Różne odczynniki i specyficzne przeciwciała są dokładnie opisane w celu wyizolowania peptydów związanych z MHC z tych linii komórkowych, w tym etapy weryfikacji skuteczności wiązania kulek przeciwciała i wydajności elucji kompleksów MHC-peptyd z kulek. Protokół może być wykorzystany do ustanowienia i standaryzacji przepływu pracy immunopeptydomiki, a także do analizy porównawczej nowych protokołów. Co więcej, protokół stanowi doskonały punkt wyjścia dla wszystkich laików, a także wspiera wewnątrz- i międzylaboratoryjną odtwarzalność procedury przygotowania próbki w immunopeptydomii.

Ogólny schemat izolacji kompleksów MHC-peptyd w celu analizy immunopeptydomów metodą MS przedstawiono na Ryc. 1. Przedstawiono reprezentatywne wyniki weryfikacji wydajności wiązania przeciwciała do kulek (Ryc. 2>) (z użyciem przeciwciała Y3 anty-H2Kb) oraz wydajności elucji kompleksów MHC-peptyd z kulek (Ryc. 3>) (z użyciem przeciwciała W6/32 anty-HLA-ABC). W celu pomiaru bezwzględnej liczby cząsteczek MHC klasy I na jedną komórkę EL4 (H2Kb i H2Db) oraz komórkę JY (HLA-ABC) zastosowano również analizy ilościowe oparte na cytometrii przepływowej21, jak pokazano na Ryc. 4A.
Powtarzalność wewnątrz- i międzyosobnicza wyników uzyskanych przy użyciu obecnego protokołu przedstawiono na Rysunku 4B-E. Reprezentatywne wyniki pokazano dla peptydów MHC klasy I zidentyfikowanych z 1 x 108 komórek EL4 oraz 1 x 108 komórek JY. Wyniki zostały wygenerowane przez dwóch różnych członków laboratorium (Użytkownik 1 i Użytkownik 2). Dla Użytkownika 1 średnia liczba wykrytych peptydów specyficznych dla MHCI z komórek EL4 i JY wynosiła odpowiednio 1341 i 6361; dla Użytkownika 2 odpowiednio 1933 i 7238 (Rysunek 4B,D). Średni współczynnik zmienności (CV) dla liczby wykrytych peptydów w trzech różnych powtórzeniach biologicznych/eksperymentach waha się od 1,9%-11% (Rysunek 4B,D). Chociaż współczynniki CV dla liczby wykrytych peptydów w trzech różnych eksperymentach były stosunkowo niskie, to tożsamość peptydów znacząco się różniła (Rysunek 4C,E). Rzeczywiście, reprezentatywne diagramy Venna pokazują, że odsetek peptydów wykrytych powtarzalnie w trzech powtórzeniach biologicznych wynosił od 39% (Użytkownik 2, komórki EL4) do 63% (Użytkownik 1, komórki JY) (Rysunek 4C,E oraz Tabela uzupełniająca 2).
Mapy ciepła generowane przez oprogramowanie MVP przedstawiają przewidywaną siłę wiązania MHC zidentyfikowanych peptydów przy użyciu narzędzi z pakietu NetMHCpan25,26,28. MVP wykonuje również dwie opcje procedury GibbsCluster, nazwane „Unsupervised GibbsCluster” oraz „Allele-Specific GibbsCluster”, w celu wyodrębnienia motywów wiązania peptydów MHC. Należy zauważyć, że MVP posiada pewne ograniczenia; jego głównym celem nie jest wyodrębnianie motywów specyficznych dla konkretnych alleli i precyzyjna adnotacja peptydów, lecz raczej zapewnienie ogólnego przeglądu jakości, składu i specyficzności MHC próbek.
Dla mysiego MHC klasy I (H2Db oraz H2Kb) peptydy w komórkach EL4 (Rycina 5A; górne panele i Dane uzupełniające 1), reprezentatywna mapa ciepła pokazuje, że 89% wszystkich wykrytych peptydów o długości 8–12 merów jest przewidywanych jako silne wiązania (SB: NetMHCpan %Rank &lt;0,5) lub słabe wiązania (WB: NetMHCpan %Rank &lt;2) dla H2Db lub H2Kb cząsteczki. Klastry sekwencji wygenerowane z peptydów 8-12-merowych są zgodne z raportowanymi logotypami dla H2Db (asparagina w pozycji P5 i leucyna w pozycji P9) oraz H2Kb (fenylalanina w pozycji P5 i leucyna w pozycji P8) (Rysunek 5)29Warto wspomnieć, że przy użyciu przeciwciała M1 można zaobserwować trzeci dominujący motyw (histydyna w pozycji P7 i leucyna w pozycji P9), a także dodatkowe motywy „artefaktowe” (Dane uzupełniające 1). W rzeczywistości wiadomo, że przeciwciało M1 wykazuje reaktywność krzyżową z nieklasyczną cząsteczką Qa2, w związku z czym za pomocą MS wykrywane są również peptydy związane z Qa2 (Dane uzupełniające 1). Tutaj, dla uproszczenia, Rysunek 5 koncentruje się na przedstawieniu dobrze udokumentowanych motywów wiązania peptydów dla dwóch klasycznych H2b allelele (np. H2Db lub H2Kb) wykazane w komórkach EL4.
W przypadku ludzkich peptydów HLA klasy I (HLA-ABC) w komórkach JY (Rysunek 5A; dolne panele i Dane uzupełniające 2), reprezentatywna mapa ciepła pokazuje, że 97% wszystkich wykrytych peptydów o długości 8-12 aminokwasów jest przewidywanych jako SB lub WB dla HLA-A*0201, -B*0702 lub -C*0702. Peptydy pogrupowano w celu wizualizacji motywów wiązania peptydów dla HLA-A*0201 oraz -B*0702. Motyw wiązania dla HLA-C*0702 nie jest pokazany na Rysunku 5A, ponieważ allel C*0702 wykazuje stosunkowo niski poziom ekspresji. W związku z tym wyizolowano i zidentyfikowano zbyt mało peptydów C*0702, aby wygenerować reprezentatywny motyw C*0702. Należy zauważyć, że motyw C*0702 można zwizualizować w innych badaniach30,31,32 lub na stronie internetowej NetMHCpan 4.1 Motif Viewer33.
W przypadku ludzkich peptydów HLA klasy II (HLA-DR) w komórkach JY (Rysunek 5B; górne panele i Dane uzupełniające S3), reprezentatywna mapa ciepła pokazuje, że 70% wszystkich wykrytych peptydów 9-22-merów jest przewidywanych jako SB lub WB dla HLA-DRB1*0404 oraz -DRB1*1301. Przedstawiono motywy wiązania peptydów dla tych dwóch alleli (Rysunek 5B). Należy zauważyć, że przedstawione tutaj motywy wiązania peptydów mogą nie być w pełnej zgodzie z ostatnio raportowanymi logotypami dla HLA-DRB1*0404 i -DRB1*130134. Ta rozbieżność podkreśla obecną niezdolność MVP/NetMHCpan do precyzyjnego przypisania peptydów do mniej scharakteryzowanych alleli HLA klasy II, takich jak HLA-DRB1*0404 i -DRB1*1301 ekspresjonowanych w komórkach JY. Dodatkowe informacje na temat motywów wiązania peptydów klasy II można znaleźć w innych badaniach34,35 oraz na stronie internetowej NetMHCIIpan 4.0 Motif Viewer36.
Wreszcie, dla peptydów MHC klasy II myszy (H2-IAd i H2-IEd) w komórkach A20 (Rysunek 5B; panele dolne i Dane uzupełniające 4), reprezentatywna mapa ciepła wykazuje, że 87% wszystkich wykrytych peptydów o długości 9-22 aminokwasów jest przewidywanych jako SB lub WB dla H2-IAd lub H2-IEd. Motywy wiązania peptydów dla tych dwóch alleli są zgodne z raportowanymi logotypami37.
Pełne raporty w formacie HTML wygenerowane przez oprogramowanie MVP w celu oceny ogólnej jakości i swoistości MHC próbek są dostępne w Dodatkowych Danych 1-4.
<img alt="Schemat analizy kompleksu MHC-peptyd przedstawiający proces wychwytu immunologicznego, LC-MS/MS oraz wizualizacji danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63052/63052fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schemat pełnej procedury izolacji peptydów MHC klasy I i II. (A-B) 100 milionów komórek zostaje odwirowanych i poddanych lizie w buforze 0,5% Chaps. (C) Lizat komórkowy jest centryfugowany, a nadfiltr dodawany do kulek CNBr-sepharose, które zostały wcześniej sprzężone z odpowiednim przeciwciałem i (D) inkubowany przez 14-18 h w 4 °C. (E) Po wychwycie immunologicznym kulki przenosi się do kolumny polipropylenowej i płucze, a kompleksy MHC-peptyd są eluowane roztworem 1% TFA. (F) Peptydy są odsalane i eluowane przy użyciu kolumny C18. (G) Następnie peptydy są suszone w koncentratorze próżniowym (speed vac) i analizowane metodą tandemowej spektrometrii mas. (H) Jakość izolowanych peptydów MHC klasy I i II można ocenić na podstawie podtypów HLA, korzystając z bezpłatnego oprogramowania MhcVizPipe. Rysunek stworzony przy użyciu BioRender.com (NT22ZL8QSL). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63052/63052fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Żel SDS-PAGE wykazujący prążki białkowe z przeciwciałem H2K^b, wyniki immunoprecypitacji, masa cząsteczkowa." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63052/63052fig02.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Barwienie żelu Coomassie w celu śledzenia wydajności wiązania przeciwciał do kulek sepharose aktywowanych CNBr. Na żel SDS-PAGE 12% naniesiono alikwoty równych objętości, a następnie wykonano barwienie błękitem Coomassie: kulki + przeciwciało przed sprzęganiem (1), niezwiązane przeciwciało po etapie sprzęgania (2), nadsącz po ostatnim przemywaniu po sprzęganiu (3) oraz kulki sprzężone z przeciwciałem (4). Wydajność wiązania jest zilustrowana znacznym spadkiem intensywności barwienia sygnału łańcuchów lekkich i ciężkich H2Kb w przypadku kulek kowalencyjnie związanych (ścieżka 4) z kulkami CNBr w porównaniu z przeciwciałem przed sprzęganiem (ścieżka 1). Rycina została przedrukowana i zaadaptowana z bioRxiv38. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63052/63052fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat analizy Western blot; przeciwciało anty-HLA-ABC do detekcji kompleksów MHC-peptyd." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63052/63052fig03.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Western blotting w celu śledzenia kompleksów MHC-peptyd po elucji kwasowej z kulek aktywowanych CNBr sprzężonych z przeciwciałem. Alikwoty pobrane na etapach wskazanych w protokole (1/100 całkowitej zmierzonej objętości) naniesiono na żel SDS-PAGE 12% i przeniesiono na membranę nitrocelulozową: kuleczki + lizat po immunowych przechwytywaniu i ostatnim przemyciu (A); nadsącz z ostatniego przemycia (B) oraz kompleksy MHC-peptyd eluowane z kuleczek (C). Silny sygnał detekcji kompleksów MHC-peptyd w (C) przy użyciu przeciwciała przeciwko ciężkiemu łańcuchowi HLA-ABC (Abcam, #ab 70328, 1:5000) potwierdził izolację kompleksów MHC-peptyd po elucji kwasowej. Należy zauważyć, że możliwe jest ocenić proporcję kompleksów MHC-peptyd, które nie zostały przechwycone przez kuleczki sprzężone z przeciwciałem, poprzez zebranie frakcji przepływowej z etapu 3.1.6. Alikwotę tę można dodać do analizy western blot (nie pokazano na tym żelu). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63052/63052fig03large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Analiza cząsteczek MHC: wykresy słupkowe, diagramy Venna. Dane dotyczące H2Db, H2Kb, HLA-ABC u myszy i ludzi." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63052/63052fig04.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rycina 4Identyfikacja peptydów MHC klasy I z komórek JY i EL4. (A) Histogram przedstawiający bezwzględną liczbę H2D na powierzchni komórekb oraz H2Kb liczba cząsteczek na komórkę EL4 oraz liczba cząsteczek HLA-ABC na komórkę JY. Ilościowe oznaczenie wykonano za pomocą cytometrii przepływowej. Średnią oraz błąd standardowy średniej obliczono z trzech powtórzeń biologicznych. (B, D) Histogram przedstawiający średnią liczbę oraz odchylenie standardowe średniej peptydów MHC klasy I zidentyfikowanych przez dwóch niezależnych użytkowników (USER_1 [U1] i USER_2 [U2]). Średnia liczba i odchylenie standardowe średniej peptydów MHC klasy I wykrytych w mysich komórkach EL4 (B) oraz ludzkie komórki JY (D) przedstawiono. Wskazano współczynniki zmienności (CV) dla trzech niezależnych powtórzeń biologicznych. (C, E) Diagramy Venna przedstawiające liczbę peptydów, które zostały powtarzalnie wykryte w EL4 (C) oraz komórki JY (E) przez dwóch niezależnych użytkowników (U1 i U2) w trzech niezależnych powtórzeniach biologicznych. Rycina 4A zostało przedrukowane i dostosowane z bioRxiv38. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63052/63052fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza powinowactwa wiązania MHC klasy I i II; wykresy słupkowe rankingów peptydów i diagramy logo sekwencyjnego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63052/63052fig05.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Wizualizacja danych immunopeptydomicznych za pomocą narzędzia programistycznego MVP. Analiza danych peptydów MHC klasy I u myszy i człowieka (A) oraz (B) MHC klasy II. Przedstawiono reprezentatywne mapy ciepła powinowactwa wiązania (panele lewe) oraz motywy wiązania peptydów (panele prawe). Kolory map ciepła reprezentują powinowactwo wiązania MHC przewidywane przez NetMHCpan 4.1 (%rank). Silne wiązacze (Strong Binders) są zaznaczone na czerwono (%rank &lt;0,5), słabe wiązacze (Weak Binders) na niebiesko (%rank &lt;2), a niewiążące (Non-Binders) na żółto (%Rank &gt;2). Procentowa proporcja (%) peptydów 8-12merowych (A) oraz 9-22merowych (B), które są SB lub WB, jest podana w nawiasach. Motywy wiązania peptydów zostały wygenerowane przez MVP przy użyciu opcji „Allele-specific Gibbscluster”. Te reprezentatywne wyniki uzyskano z 1 x 108 komórek, wykorzystując następujące przeciwciała i linie komórkowe: przeciwciało M1 i komórki EL4 dla peptydów MHC klasy I myszy; przeciwciało W6/32 i komórki JY dla peptydów MHC klasy I człowieka; przeciwciało M5 i komórki A20 dla peptydów MHC klasy II myszy; przeciwciało L243 i komórki JY dla peptydów MHC klasy II człowieka. Należy odwołać się do Supplementary Data 1-4, aby uzyskać dostęp do pełnych raportów HTML wygenerowanych przez oprogramowanie MVP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63052/63052fig05large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
Dane uzupełniające 1-4: <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63052/SUPPLEMENTARY%20DATA%20S1-S4.zip" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Dane uzupełniające 1: Raport HTML wygenerowany przez oprogramowanie MVP z peptydów wyizolowanych z 1 x 108 komórek EL4 przy użyciu przeciwciała M1. Przedstawiono trzy powtórzenia biologiczne. Raport ten odnosi się do Rysunku 4 oraz Rysunku 5, a reprezentatywne peptydy wymieniono w Tabeli uzupełniającej 2.
Dane uzupełniające 2: Raport HTML wygenerowany przez oprogramowanie MVP z peptydów wyizolowanych z 1 x 108 komórek JY przy użyciu przeciwciała W6/32. Przedstawiono trzy powtórzenia biologiczne. Raport ten odnosi się do Rysunku 4 oraz Rysunku 5, a reprezentatywne peptydy wymieniono w Tabeli uzupełniającej 2.
Dane uzupełniające 3: Raport HTML wygenerowany przez oprogramowanie MVP na podstawie peptydów wyizolowanych z 1 x 108 komórek JY przy użyciu przeciwciała L243. Niniejszy raport odnosi się do Rysunku 5, a reprezentatywne peptydy wymieniono w Tabeli uzupełniającej 2.
Dodatkowe dane 4: Raport HTML wygenerowany przez oprogramowanie MVP z peptydów wyizolowanych z 1 x 108 komórek A20 przy użyciu przeciwciała M5. Raport ten odnosi się do Rysunku 5, a reprezentatywne peptydy wymieniono w Dodatkowej tabeli 2.
Tabela uzupełniająca 1: Lista buforów. Opisano przepisy na wszystkie bufory użyte w protokole. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63052/List%20of%20Buffers-63052R1.xlsx" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
Tabela uzupełniająca 2: Reprezentatywne listy peptydów związanych z H2Db/Kb, HLA-ABC, HLA-DR oraz H2-IAd/IEd. Tabela ta zawiera listy reprezentatywnych peptydów MHC klasy I i II wyizolowanych odpowiednio z mysich linii komórkowych EL4 i A20 oraz peptydów HLA klasy I i II z ludzkiej linii komórkowej JY. Dane te zostały zdeponowane w bazie ProteomeXchange (PXD028633). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63052/SUPPLEMENTARY%20TABLE%20S2-R2.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
DOSTĘPNOŚĆ DANYCH:
Zbiory danych wykorzystane w niniejszej pracy zostały zdeponowane w bazie ProteomeXchange (http://proteomecentral.proteomexchange.org/cgi/GetDataset): PXD028633.

Tutaj prezentujemy protokół oczyszczania kompleksów peptydowych MHC klasy I i klasy II z linii komórkowych myszy i ludzi, dostarczając wysokiej jakości danych immunopeptydomowych. Protokół koncentruje się na przygotowaniu próbki przy użyciu dostępnych na rynku przeciwciał.

Immunopeptydomika: izolacja mysich i ludzkich peptydów związanych z MHC klasy I i II do analizy spektrometrii mas

Immunopeptidomics is an emerging field that fuels and guides the development of vaccines and immunotherapies. More specifically, it refers to the science ...

Protokół ten jest ważny, ponieważ jest prosty do wykonania i znajduje się w zasięgu każdego laboratorium. Protokół ten umożliwia izolację peptydów HLA lub MHC typu I lub typu II z próbek ludzkich lub mysich. Metoda ta może odpowiedzieć na pytania naukowe związane ze wszystkimi obszarami badawczymi związanymi z układem odpornościowym, czy to w raku, wirusologii czy chorobach autoimmunologicznych.Protokół ten został zbudowany tak, aby był dostępny dla każdego, kto pracuje w laboratorium badawczym. Po prostu postępuj zgodnie z instrukcjami. Rozpocznij aktywację kulek bromku cyjanogenu Sepharose, ważąc 80 miligramów na próbkę i przenosząc je do 15-mililitrowej stożkowej probówki.Dodaj pięć mililitrów jednomilimolowego kwasu solnego. Pipetować w górę i w dół pięć razy, aby ułatwić ponowne zawieszenie wysuszonych kulek, a następnie napełnić stożkową probówkę dodatkowymi 8,5 mililitrami jednomilimolowego kwasu solnego. Obracaj koraliki z prędkością 20 obr./min przez 30 minut w temperaturze pokojowej za pomocą urządzenia rotatora.Odwirować kulki w temperaturze 200x G przez dwie minuty w temperaturze pokojowej i usunąć supernatant przez aspirację. Dodać 500 mikrolitrów buforu sprzęgającego do palety kulek, a następnie przenieść zawiesinę kulek do nowej, dwumililitrowej probówki wirówkowej i odstawić na bok. W celu sprzężenia przeciwciał z tymi kulkami, dodaj dwa miligramy wybranego przeciwciała do nowej, dwumililitrowej probówki mikrowirówkowej i uzupełnij objętość do jednego mililitra roztworem buforowym sprzęgającym, aby uzyskać końcowe stężenie dwóch miligramów na mililitr.Przenieś wcześniej przygotowany roztwór kulek i dodaj go do roztworu przeciwciał. Następnie obracaj probówkę mikrowirówki z prędkością 20 obr./min przez 120 minut za pomocą rotatora, odwiruj kulki, a następnie usuń supernatant zgodnie z wcześniejszym opisem. Teraz rozpocznij blokowanie i mycie kulek, najpierw dodając jeden mililitr glicyny 0,2-molowej do probówki mikrowirówki zawierającej kulki sprzężone z przeciwciałami i obracając z prędkością 20 obr./min przez 60 minut w temperaturze pokojowej za pomocą urządzenia rotatora.Po odwirowaniu i usunięciu supernatantu umyj kulki jednym mililitrem PBS, usuń supernatant przez odwirowanie i przechowuj kulki w jednym mililitrze PBS w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu użycia. Aby wyizolować peptydy MHC klasy I lub II, rozmrozić zamrożoną paletę 100 milionów komórek, ogrzewając dno probówki dłonią. Dodaj 500 mikrolitrów PBS do palety i pipetuj w górę iw dół, aż zawiesina będzie jednorodna.Przenieść zawiesinę do nowej, dwumililitrowej probówki do mikrowirówki i dodać równą objętość buforu do lizy komórek. Obracaj z prędkością 10 obr./min przez 60 minut w czterech stopniach Celsjusza za pomocą rotatora. Odwirować lizat komórkowy w temperaturze 18 000x G przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza z pełnym hamowaniem i przenieść supernatant do nowej, dwumililitrowej probówki do mikrowirówki.Odzyskać kulki sprzężone z przeciwciałami przez odwirowanie i usunięcie supernatantu. Następnie przenieś supernatant lizatu komórkowego do kulek sprzężonych z przeciwciałami i inkubuj z prędkością 10 obr./min przez 14 do 18 godzin przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza za pomocą urządzenia rotatorowego. Drugiego dnia zdejmij dolną pokrywę kolumny polipropylenowej, umieść kolumnę na stojaku kolumny polipropylenowej i zainstaluj pod nią pusty pojemnik, aby zebrać przepływ.Teraz przepłucz kolumnę polipropylenową 10 mililitrami buforu A i pozwól jej spłynąć grawitacyjnie. Jeśli prędkość przepływu płynnej elucji jest zbyt niska, należy dodatkowo przyciąć dolną końcówkę kolumny polipropylenowej. Odmierz i zbierz mieszaninę kulek/lizatu i przenieś ją do kolumny polipropylenowej.Pozwól, aby płynna mieszanina wymyła się grawitacyjnie. Opcjonalnie zbierz i zamroź 20 mikrolitrów podwielokrotności do Western blot. Teraz umyj kulki zatrzymane w kolumnie polipropylenowej, dodając 10 mililitrów buforu A i pozwalając mu wymywać się grawitacyjnie.Wyjmij kolumnę polipropylenową ze stojaka i umieść ją na nowej, dwumililitrowej probówce do mikrowirówki, trzymając kolumnę i probówkę razem ręką. Dodaj 300 mikrolitrów 1% TFA do kolumny polipropylenowej i wymieszaj kulki, przesuwając je w górę iw dół pięć razy. Następnie przenieś eluat do nowej, dwumililitrowej probówki do mikrowirówki.W celu odsalania i elucji peptydów MHC, dodaj 200 mikrolitrów metanolu na wierzch kolumny C-18 i odwiruj przy 1,546x G przez trzy minuty, aby odrzucić przepływ. Dodać 200 mikrolitrów 80% acetonitrylu w 0,1% TFA na wierzch kolumny C-18 i ponownie odwirować, aby odrzucić przepływ. Następnie dodaj 200 mikrolitrów 0,1% TFA, odrzucając przepływ przez odwirowanie.Na koniec załaduj 200 mikrolitrów kompleksów peptydowych MHC na kolumnę C-18, odrzuć przepływ przez wirowanie i powtarzaj, aż zostanie załadowana pełna objętość. Następnie dodaj 200 mikrolitrów 0,1% TFA, odwiruj, aby odrzucić przepływ, przenieś kolumnę C-18 do nowej, dwumililitrowej probówki do mikrowirówki i wymyj peptydy MHC, dodając 150 mikrolitrów 28% acetonitrylu w 0,1% TFA. Po odwirowaniu zbierz przepływ do nowej, 1,5-mililitrowej probówki do mikrowirówki.Powtórz proces elucji dwukrotnie dla całkowitej objętości 450 mikrolitrów i zamrażaj w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do czasu analizy przez LC-MS-MS. Użyj tych oczyszczonych peptydów do identyfikacji peptydów MHC klasy I i II w spektrometrze mas. Skuteczność wiązania kulek zilustrowano znacznym spadkiem intensywności barwienia sygnału lekkich i ciężkich łańcuchów, gdy koraliki są kowalencyjnie związane z kulkami CNBr, w porównaniu z przeciwciałem przed sprzężeniem.Wyizolowanie kompleksów peptydowych MHC po kwaśnej elucji zostało potwierdzone silnym sygnałem detekcji kompleksów peptydowych MHC przy użyciu przeciwciała łańcucha ciężkiego anty-HAL-ABC. Oszacowano również odtwarzalność wyników wewnątrz i między osobnikami przy użyciu obecnego protokołu. Średni współczynnik zmienności liczby peptydów wykrytych w trzech różnych kontrpróbach biologicznych był niewielki i wahał się od 1,9 do 11%Jednak tożsamość peptydów różniła się znacznie, a odsetek peptydów wykrytych w sposób powtarzalny w trzech kontrpróbach biologicznych wahał się od 39% do 63%Wygenerowane mapy cieplne wykazały przewidywaną siłę wiązania MHC zidentyfikowanych peptydów.W przypadku mysich peptydów MHC klasy I i klasy II przewidywane silne lub słabe spoiwa wynosiły odpowiednio 89 i 87%. W przypadku ludzkich peptydów HLA klasy I i klasy II przewidywane silne lub słabe spoiwa wynosiły odpowiednio 97 i 70%. Wygenerowano również motywy wiązania peptydów myszy i człowieka dla peptydów LHC klasy I i II.Przed optymalizacją tego protokołu izolacja mysich peptydów MHC klasy I i II była znacznie trudniejsza. Ten zoptymalizowany protokół ułatwi izolację mysich peptydów MHC klasy I i II z mysich modeli in vivo, na przykład rutynowo stosowanych do walidacji wielu różnych badań związanych z chorobami.

immunopeptidomics-isolation-mouse-human-mhc-class-i-ii-associated

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Metoda SISCAPA (Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies) łączy wzbogacanie peptydów metodą powinowactwa z masową spektrometrią z rozcieńczeniem izotopem stabilnym (MRM-MS), aby zapewnić ilościowe pomiary peptydów jako substytutów odpowiadających im białek. W niniejszym opracowaniu opisujemy protokół z wykorzystaniem cząstek magnetycznych w formacie częściowo zautomatyzowanym.

Ilościowe oznaczanie białek z wykorzystaniem immunoafinityjnego wzbogacania peptydów sprzężonego ze spektrometrią mas

Niniejszy protokół opisuje zastosowanie tetramerów peptyd:MHC oraz magnetycznych mikrokulek do izolacji populacji limfocytów T specyficznych dla epitopu o niskiej częstotliwości oraz ich analizy za pomocą cytometrii przepływowej. Metoda ta umożliwia bezpośrednie badanie endogennych populacji limfocytów T w systemach eksperymentalnych in vivo.

Wzbogacanie limfocytów T swoistych dla epitopu z wykorzystaniem tetramerów peptyd-MHC

Testy biochemiczne z rekombinowanymi ludzkimi cząsteczkami MHC II mogą dostarczyć szybkich, ilościowych wglądów w identyfikację, delecję lub projektowanie epitopów immunogennych. Tutaj opisany jest test wiązania peptyd-MHC II skalowany do płytek 384-dołkowych. Ten opłacalny format powinien okazać się przydatny w dziedzinie deimmunizacji białek oraz projektowania i opracowywania szczepionek.

Wysokoprzepustowy test wiązania MHC II do analizy ilościowej epitopów peptydowych

Przedstawiono protokół kwantyfikacji białek w złożonych płynach biologicznych przy użyciu technologii automatycznego immuno-MALDI (iMALDI).

Kwantyfikacja peptydów i białek przy użyciu zautomatyzowanego immuno-MALDI (iMALDI)

Tutaj prezentujemy protokół do przeprowadzenia profilowania polisomów na izolowanym perfundowanym sercu myszy. Opisano metody perfuzji serca, profilowania polisomów i analizy frakcji polisomów w odniesieniu do mRNA, miRNA i proteomu polisomowego.

Dynamiczna analiza proteomiczna i miRNA polisomów z izolowanego serca myszy po perfuzji Langendorffa

Prezentujemy metodę oczyszczania, wykrywania i identyfikacji peptydów diGly, które pochodzą z ubikwitynowanych białek ze złożonych próbek biologicznych. Przedstawiona metoda jest powtarzalna, solidna i przewyższa opublikowane metody pod względem poziomu szczegółowości analizy wszechobecności.

Wykrywanie miejsc ubikwitynacji białek za pomocą wzbogacania peptydów i spektrometrii mas

Syntetazy lantipeptydu katalizują wieloetapowe reakcje podczas biosyntezy naturalnych produktów peptydowych. W tym miejscu opisujemy ciągły, oddolny przepływ pracy spektrometrii mas z wymianą wodorowo-deuterową (HDX-MS), który można wykorzystać do badania dynamiki konformacyjnej syntetaz lantipeptydów, a także innych podobnych enzymów zaangażowanych w biosyntezę naturalnych produktów peptydowych.

Platforma spektrometrii mas z wymianą wodorowo-deuterową (HDX-MS) do badania biosyntetycznych enzymów peptydowych

Ten protokół obejmuje szczegółową analizę składu peptydoglikanu za pomocą chromatografii cieczowej, spektrometrii mas w połączeniu z zaawansowanym oprogramowaniem do ekstrakcji cech i analizy bioinformatycznej.

Półilościowa analiza peptydoglikanu za pomocą chromatografii cieczowej, spektrometrii mas i bioinformatyki

Metylacja argininy (R) jest szeroko rozpowszechnioną modyfikacją potranslacyjną regulującą wiele szlaków biologicznych. Spektrometria mas jest najlepszą technologią do globalnego profilowania proteomu R-metylowego, w połączeniu z podejściami biochemicznymi do wzbogacania zmodyfikowanych peptydów. Przepływ pracy przeznaczony do identyfikacji globalnej metylacji R-metylacji w komórkach ludzkich o wysokim poziomie pewności jest opisany tutaj.

Podejście proteomiczne oparte na spektrometrii mas do globalnej i wysoce wiarygodnej analizy R-metylacji białek

Przedstawiono protokół wzbogacania białek komórek gospodarza (HCP) z produktów leczniczych (DP) i wykrywania peptydów za pomocą kulek wzbogacających proteom. Metodę demonstruje się przy użyciu wyprodukowanej we własnym zakresie substancji leczniczej (DS) opartej na przeciwciałach monoklonalnych (mAb), która jest dobrze scharakteryzowanym materiałem referencyjnym do oceny i porównywania różnych metod pod względem wydajności.

Analiza białek komórek gospodarza przy użyciu kulek wzbogacających w połączeniu z ograniczonym trawieniem

Dostarczamy szczegółowy protokół do izolowania i identyfikacji rzadkich populacji limfocytów T specyficznych dla antygenu w płucach myszy poprzez magnetyczne wzbogacanie limfocytów T na bazie kulek magnetycznych i tetramery peptydu:głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC).

Identyfikacja rzadkich limfocytów T specyficznych dla antygenu z płuc myszy za pomocą peptydów: głównych tetramerów kompleksu zgodności tkankowej

Poznaj metodę izolacji peptydów MHC klasy I i II z komórek mysich i ludzkich do analizy spektrometrii mas. Protokół ten umożliwia badania w immunologii, onkologii i chorobach autoimmunologicznych.

Immunopeptydomika: izolacja mysich i ludzkich peptydów związanych z MHC klasy I i II do analizy spektrometrii mas

Przeglądaj więcej filmów