Prosta i skuteczna metoda konsekwentnego izolowania kardiomiocytów myszy
November 11th, 2022
Złotym standardem w kardiologii dla komórkowych i molekularnych eksperymentów funkcjonalnych są kardiomiocyty. W artykule opisano adaptacje techniki innej niż Langendorff do izolowania kardiomiocytów myszy.
Technika ta jest bardziej niezawodna i wydajna i nie wymaga rozległej praktyki ani szkolenia w porównaniu z najczęściej stosowanymi technikami aparatu Langendorffa. Główną zaletą tej techniki jest to, że ogranicza ona czas niedokrwienia, ponieważ początkowa perfuzja zachodzi in vivo. Podczas wykonywania tej techniki ważne jest, aby unikać pęcherzyków w kolektorze i unikać nadmiernego ruchu serca podczas trawienia, ponieważ mogą one zmniejszyć wydajność.
Technikę tę zademonstruje Sarah Sturgill, doktorantka w laboratorium dr Marka Ziolo. Rozpocząć od oczyszczenia kolektora o kontrolowanej temperaturze za pomocą świeżo przygotowanego buforu perfuzyjnego. W tym celu wkręć igłę o rozmiarze 27 i usuń pęcherzyki za pomocą złącza typu luer lock.
Upewnij się, że nie pozostały żadne bąbelki. Aby wyizolować kardiomiocyt, odsłoń mostek w pełni znieczulonej myszy i bocznie do linii środkowej, przetnij proksymalnie przez żebra i do pachy. Następnie przetnij przeponę, zapewniając płytkie cięcia, aby uniknąć serca.
Zaciśnij mostek hemostatem i złóż żebra do tyłu, aby odsłonić klatkę piersiową. Delikatnie usuń osierdzie z serca przed przecięciem żyły głównej dolnej bezpośrednio dystalnie do serca. Wstrzyknąć trzy mililitry lodowatego buforu oczyszczającego do prawej komory serca w ciągu jednej minuty za pomocą igły o rozmiarze 27.
Następnie przytrzymaj serce za pomocą pęsety. Odciągnij go od ciała i odsłoń jak najwięcej aorty. Następnie zacisnąć aortę wstępującą za pomocą hemostatu i wyciąć serce.
Szybko przenieś zaciśnięte serce na pokrywę polipropylenowej szalki Petriego zawierającej 10 mililitrów ciepłego buforu perfuzyjnego. Umieść zaciśnięte serce na platformie nośnej i wstrzyknij 10 mililitrów buforu perfuzyjnego o kontrolowanej temperaturze 37 stopni Celsjusza do lewej komory w ciągu pięciu minut za pomocą stabilizowanej igły o rozmiarze 27 przymocowanej do kolektora. Następnie przenieś zaciśnięte serce i platformę nośną na szalkę Petriego z około pięcioma mililitrami buforu wytrawiającego.
Zamień strzykawki wejściowe na 50-mililitrową strzykawkę zawierającą 25 mililitrów buforu wytrawiającego. Przed wstrzyknięciem oczyścić kolektor z pęcherzyków i pozostałego buforu perfuzyjnego. Ostrożnie umieścić igłę w tym samym położeniu igły w wierzchołku lewej komory.
Za pomocą pompy perfuzyjnej wstrzyknij bufor wytrawiający o temperaturze 37 stopni Celsjusza do lewej komory na 15 minut za pomocą 50-mililitrowej strzykawki. Kontroluj temperaturę roztworu za pomocą płaszcza wodnego skalibrowanego do wyrzucania roztworu o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Usuń komory z przedsionków przed przeniesieniem ich do 10-mililitrowej zlewki.
Dodaj trzy mililitry buforu wytrawiającego do zlewki i pokrój komory na duże kawałki ostrymi nożyczkami. Przykryj zlewkę folią aluminiową i umieść ją w roztrząsającej łaźni wodnej podgrzanej do 37 stopni Celsjusza na pięć minut. Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić kawałki tkanki w trzech mililitrach buforu wytrawiającego i rozcierać go przez około cztery minuty lub do uzyskania jednorodnej mieszaniny.
Po zakończeniu przefiltruj komórki do 50-mililitrowej rurki polipropylenowej za pomocą nylonowego sitka do komórek o średnicy 70 mikrometrów. Umyj nylonowe sitko komórkowe trzema mililitrami buforu wytrawiającego. Umieść filtrat z powrotem w 14-mililitrowej probówce polipropylenowej z okrągłym dnem i odwiruj go.
Wyrzucić supernatant przed ponownym zawieszeniem osadu w trzech mililitrach buforu zatrzymującego. Do zawiesiny komórkowej dodać 54 mikrolitry 100-milimolowego chlorku wapnia, aby końcowe stężenie chlorku wapnia wynosiło 1,8 milimola. Pozwól żywym komórkom osiąść przez 10 minut i usuń supernatant zawierający martwe komórki.
Po ponownym zawieszeniu osadu w roztworze do przechowywania, komórki można wykorzystać do eksperymentów funkcjonalnych i hodowli. Obrazy mikroskopowe w jasnym polu izolowanych komórek wykazały, że izolacja kardiomiocytów myszy wytworzyła spokojne komórki w kształcie pręcików bez pęcherzyków błonowych lub zaokrąglonych krawędzi. Komórki wykazały około 80% wydajności i wysokie wskaźniki przeżycia, które decydują o powodzeniu techniki izolacji.
Aby pomyślnie wyizolować się, najważniejsze jest usunięcie pęcherzyków z kolektora i włożenie igły do tego samego otworu w sercu. Po wyizolowaniu kardiomiocyty można wykorzystać do komórkowych i molekularnych eksperymentów funkcjonalnych.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł opisuje niezawodną i wydajną technikę izolowania kardiomiocytów mysich bez konieczności rozległego szkolenia. Metoda minimalizuje czas niedokrwienia poprzez wykonywanie początkowej perfuzji in vivo.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Kardiologia
- Biologia komórki
- Biologia molekularna
Tło
- Kardiomiocyty są niezbędne do eksperymentów funkcjonalnych na poziomie komórkowym i molekularnym w kardiologii.
- Technika Langendorffa jest powszechnie stosowana, ale ma ograniczenia.
- Ten artykuł przedstawia adaptacje mające na celu poprawę procesu izolacji.
- Minimalizowanie czasu niedokrwienia jest kluczowe dla lepszej wydajności.
Cel badania
- Prezentacja techniki nie-Langendorffa do izolowania kardiomiocytów mysich.
- Wykazanie zalet tej metody w porównaniu z tradycyjnymi technikami.
- Dostarczenie niezawodnego protokołu dla badaczy.
Stosowane metody
- Początkowa perfuzja wykonywana in vivo w celu ograniczenia czasu niedokrwienia.
- Zastosowanie sterowanego temperaturowo manifoldu z świeżo przygotowanym buforem perfuzji.
- Usunięcie pęcherzyków w manifoldzie za pomocą złącza luer lock.
- Ostrożne obchodzenie się z sercem podczas trawienia w celu utrzymania wydajności.
Główne wyniki
- Technika jest bardziej niezawodna i wydajna niż metody Langendorffa.
- Zmniejsza potrzebę rozległego szkolenia.
- Poprawia wydajność izolowanych kardiomiocytów.
- Przedstawione przez studenta ostatniego roku w warunkach laboratoryjnych.
Wnioski
- Technika nie-Langendorffa jest wykonalną alternatywą do izolowania kardiomiocytów.
- Oferuje znaczne zalety pod względem wydajności i niezawodności.
- Ta metoda może ulepszyć badania w kardiologii i pokrewnych dziedzinach.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Consistent isolation of high-quality mouse cardiomyocytes is critical for cardiac target validation and mechanistic de-risking in early discovery. This streamlined, Langendorff-free protocol reduces technical barriers and ischemic artifact, enabling reliable functional assays that inform portfolio triage and predictive confidence. The method supports scalable, reproducible workflows essential for cross-program comparability in cardiovascular R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables robust interrogation of cardiac disease mechanisms using primary mouse cardiomyocytes.
- Reduces technical variability, supporting functional target validation and mechanistic clarity.
- Facilitates predictive confidence in early-stage cardiac biology studies.
Screening & Assay Development
- Provides a reproducible source of viable cardiomyocytes for downstream functional assays.
- Supports standardization of contraction, electrophysiology, and calcium cycling measurements.
- Improves assay readiness and scalability for compound screening platforms.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant functional endpoints for translational biomarker studies.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation using consistent cell preparations.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by reducing biological ambiguity.
Pipeline & Workflow Integration
This isolation protocol fits at the interface of early discovery and assay development, providing high-quality cardiomyocytes for functional testing, screening, and translational research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and mechanistic de-risking by enabling direct functional analysis of cardiac cells.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for compound evaluation in validated biological systems.
- Analytics: Facilitates measurement of contraction, viability, and electrophysiological parameters for comparative studies.
- Translational Research: Maintains continuity of functional endpoints from in vitro to preclinical models.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, scalable protocol for repeated use across cardiovascular research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cardiac target validation.
- Operational Value: Simplifies training requirements and enhances reproducibility across teams.
- Strategic Value: Enables more informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of cardiac programs.
Implementation Considerations
- Requires basic surgical and perfusion skills, but less technical expertise than Langendorff methods.
- Needs temperature-controlled perfusion and digestion infrastructure.
- Demands rigorous bubble removal and consistent needle placement for reproducibility.
- Adaptable to various mouse models and cardiac disease contexts.
- Yield and viability depend on precise handling and timing as described in the protocol.
