Prosta i skuteczna metoda konsekwentnego izolowania kardiomiocytów myszy
November 11th, 2022
Złotym standardem w kardiologii dla komórkowych i molekularnych eksperymentów funkcjonalnych są kardiomiocyty. W artykule opisano adaptacje techniki innej niż Langendorff do izolowania kardiomiocytów myszy.
Technika ta jest bardziej niezawodna i wydajna i nie wymaga rozległej praktyki ani szkolenia w porównaniu z najczęściej stosowanymi technikami aparatu Langendorffa. Główną zaletą tej techniki jest to, że ogranicza ona czas niedokrwienia, ponieważ początkowa perfuzja zachodzi in vivo. Podczas wykonywania tej techniki ważne jest, aby unikać pęcherzyków w kolektorze i unikać nadmiernego ruchu serca podczas trawienia, ponieważ mogą one zmniejszyć wydajność.
Technikę tę zademonstruje Sarah Sturgill, doktorantka w laboratorium dr Marka Ziolo. Rozpocząć od oczyszczenia kolektora o kontrolowanej temperaturze za pomocą świeżo przygotowanego buforu perfuzyjnego. W tym celu wkręć igłę o rozmiarze 27 i usuń pęcherzyki za pomocą złącza typu luer lock.
Upewnij się, że nie pozostały żadne bąbelki. Aby wyizolować kardiomiocyt, odsłoń mostek w pełni znieczulonej myszy i bocznie do linii środkowej, przetnij proksymalnie przez żebra i do pachy. Następnie przetnij przeponę, zapewniając płytkie cięcia, aby uniknąć serca.
Zaciśnij mostek hemostatem i złóż żebra do tyłu, aby odsłonić klatkę piersiową. Delikatnie usuń osierdzie z serca przed przecięciem żyły głównej dolnej bezpośrednio dystalnie do serca. Wstrzyknąć trzy mililitry lodowatego buforu oczyszczającego do prawej komory serca w ciągu jednej minuty za pomocą igły o rozmiarze 27.
Następnie przytrzymaj serce za pomocą pęsety. Odciągnij go od ciała i odsłoń jak najwięcej aorty. Następnie zacisnąć aortę wstępującą za pomocą hemostatu i wyciąć serce.
Szybko przenieś zaciśnięte serce na pokrywę polipropylenowej szalki Petriego zawierającej 10 mililitrów ciepłego buforu perfuzyjnego. Umieść zaciśnięte serce na platformie nośnej i wstrzyknij 10 mililitrów buforu perfuzyjnego o kontrolowanej temperaturze 37 stopni Celsjusza do lewej komory w ciągu pięciu minut za pomocą stabilizowanej igły o rozmiarze 27 przymocowanej do kolektora. Następnie przenieś zaciśnięte serce i platformę nośną na szalkę Petriego z około pięcioma mililitrami buforu wytrawiającego.
Zamień strzykawki wejściowe na 50-mililitrową strzykawkę zawierającą 25 mililitrów buforu wytrawiającego. Przed wstrzyknięciem oczyścić kolektor z pęcherzyków i pozostałego buforu perfuzyjnego. Ostrożnie umieścić igłę w tym samym położeniu igły w wierzchołku lewej komory.
Za pomocą pompy perfuzyjnej wstrzyknij bufor wytrawiający o temperaturze 37 stopni Celsjusza do lewej komory na 15 minut za pomocą 50-mililitrowej strzykawki. Kontroluj temperaturę roztworu za pomocą płaszcza wodnego skalibrowanego do wyrzucania roztworu o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Usuń komory z przedsionków przed przeniesieniem ich do 10-mililitrowej zlewki.
Dodaj trzy mililitry buforu wytrawiającego do zlewki i pokrój komory na duże kawałki ostrymi nożyczkami. Przykryj zlewkę folią aluminiową i umieść ją w roztrząsającej łaźni wodnej podgrzanej do 37 stopni Celsjusza na pięć minut. Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić kawałki tkanki w trzech mililitrach buforu wytrawiającego i rozcierać go przez około cztery minuty lub do uzyskania jednorodnej mieszaniny.
Po zakończeniu przefiltruj komórki do 50-mililitrowej rurki polipropylenowej za pomocą nylonowego sitka do komórek o średnicy 70 mikrometrów. Umyj nylonowe sitko komórkowe trzema mililitrami buforu wytrawiającego. Umieść filtrat z powrotem w 14-mililitrowej probówce polipropylenowej z okrągłym dnem i odwiruj go.
Wyrzucić supernatant przed ponownym zawieszeniem osadu w trzech mililitrach buforu zatrzymującego. Do zawiesiny komórkowej dodać 54 mikrolitry 100-milimolowego chlorku wapnia, aby końcowe stężenie chlorku wapnia wynosiło 1,8 milimola. Pozwól żywym komórkom osiąść przez 10 minut i usuń supernatant zawierający martwe komórki.
Po ponownym zawieszeniu osadu w roztworze do przechowywania, komórki można wykorzystać do eksperymentów funkcjonalnych i hodowli. Obrazy mikroskopowe w jasnym polu izolowanych komórek wykazały, że izolacja kardiomiocytów myszy wytworzyła spokojne komórki w kształcie pręcików bez pęcherzyków błonowych lub zaokrąglonych krawędzi. Komórki wykazały około 80% wydajności i wysokie wskaźniki przeżycia, które decydują o powodzeniu techniki izolacji.
Aby pomyślnie wyizolować się, najważniejsze jest usunięcie pęcherzyków z kolektora i włożenie igły do tego samego otworu w sercu. Po wyizolowaniu kardiomiocyty można wykorzystać do komórkowych i molekularnych eksperymentów funkcjonalnych.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overview
This article describes a reliable and efficient technique for isolating mouse cardiomyocytes without the need for extensive training. The method minimizes ischemic time by performing initial perfusion in vivo.
Key Study Components
Area of Science
- Cardiology
- Cellular Biology
- Molecular Biology
Background
- Cardiomyocytes are essential for cellular and molecular functional experiments in cardiology.
- The Langendorff technique is commonly used but has limitations.
- This article presents adaptations to improve the isolation process.
- Minimizing ischemic time is crucial for better yield.
Purpose of Study
- To present a non-Langendorff technique for isolating mouse cardiomyocytes.
- To demonstrate the advantages of this method over traditional techniques.
- To provide a reliable protocol for researchers.
Methods Used
- Initial perfusion performed in vivo to limit ischemic time.
- Use of a temperature-controlled manifold with freshly prepared perfusion buffer.
- Clearance of bubbles in the manifold using a luer lock connector.
- Careful handling of the heart during digestion to maintain yield.
Main Results
- The technique is more reliable and efficient than Langendorff methods.
- Reduces the need for extensive training.
- Improves the yield of isolated cardiomyocytes.
- Demonstrated by a graduate student in a laboratory setting.
Conclusions
- The non-Langendorff technique is a viable alternative for isolating cardiomyocytes.
- It offers significant advantages in terms of efficiency and reliability.
- This method can enhance research in cardiology and related fields.
