Prosta i skuteczna metoda konsekwentnego izolowania kardiomiocytów myszy
11 listopada 2022
Złotym standardem w kardiologii dla komórkowych i molekularnych eksperymentów funkcjonalnych są kardiomiocyty. W artykule opisano adaptacje techniki innej niż Langendorff do izolowania kardiomiocytów myszy.
Technika ta jest bardziej niezawodna i wydajna i nie wymaga rozległej praktyki ani szkolenia w porównaniu z najczęściej stosowanymi technikami aparatu Langendorffa. Główną zaletą tej techniki jest to, że ogranicza ona czas niedokrwienia, ponieważ początkowa perfuzja zachodzi in vivo. Podczas wykonywania tej techniki ważne jest, aby unikać pęcherzyków w kolektorze i unikać nadmiernego ruchu serca podczas trawienia, ponieważ mogą one zmniejszyć wydajność.
Technikę tę zademonstruje Sarah Sturgill, doktorantka w laboratorium dr Marka Ziolo. Rozpocząć od oczyszczenia kolektora o kontrolowanej temperaturze za pomocą świeżo przygotowanego buforu perfuzyjnego. W tym celu wkręć igłę o rozmiarze 27 i usuń pęcherzyki za pomocą złącza typu luer lock.
Upewnij się, że nie pozostały żadne bąbelki. Aby wyizolować kardiomiocyt, odsłoń mostek w pełni znieczulonej myszy i bocznie do linii środkowej, przetnij proksymalnie przez żebra i do pachy. Następnie przetnij przeponę, zapewniając płytkie cięcia, aby uniknąć serca.
Zaciśnij mostek hemostatem i złóż żebra do tyłu, aby odsłonić klatkę piersiową. Delikatnie usuń osierdzie z serca przed przecięciem żyły głównej dolnej bezpośrednio dystalnie do serca. Wstrzyknąć trzy mililitry lodowatego buforu oczyszczającego do prawej komory serca w ciągu jednej minuty za pomocą igły o rozmiarze 27.
Następnie przytrzymaj serce za pomocą pęsety. Odciągnij go od ciała i odsłoń jak najwięcej aorty. Następnie zacisnąć aortę wstępującą za pomocą hemostatu i wyciąć serce.
Szybko przenieś zaciśnięte serce na pokrywę polipropylenowej szalki Petriego zawierającej 10 mililitrów ciepłego buforu perfuzyjnego. Umieść zaciśnięte serce na platformie nośnej i wstrzyknij 10 mililitrów buforu perfuzyjnego o kontrolowanej temperaturze 37 stopni Celsjusza do lewej komory w ciągu pięciu minut za pomocą stabilizowanej igły o rozmiarze 27 przymocowanej do kolektora. Następnie przenieś zaciśnięte serce i platformę nośną na szalkę Petriego z około pięcioma mililitrami buforu wytrawiającego.
Zamień strzykawki wejściowe na 50-mililitrową strzykawkę zawierającą 25 mililitrów buforu wytrawiającego. Przed wstrzyknięciem oczyścić kolektor z pęcherzyków i pozostałego buforu perfuzyjnego. Ostrożnie umieścić igłę w tym samym położeniu igły w wierzchołku lewej komory.
Za pomocą pompy perfuzyjnej wstrzyknij bufor wytrawiający o temperaturze 37 stopni Celsjusza do lewej komory na 15 minut za pomocą 50-mililitrowej strzykawki. Kontroluj temperaturę roztworu za pomocą płaszcza wodnego skalibrowanego do wyrzucania roztworu o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Usuń komory z przedsionków przed przeniesieniem ich do 10-mililitrowej zlewki.
Dodaj trzy mililitry buforu wytrawiającego do zlewki i pokrój komory na duże kawałki ostrymi nożyczkami. Przykryj zlewkę folią aluminiową i umieść ją w roztrząsającej łaźni wodnej podgrzanej do 37 stopni Celsjusza na pięć minut. Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić kawałki tkanki w trzech mililitrach buforu wytrawiającego i rozcierać go przez około cztery minuty lub do uzyskania jednorodnej mieszaniny.
Po zakończeniu przefiltruj komórki do 50-mililitrowej rurki polipropylenowej za pomocą nylonowego sitka do komórek o średnicy 70 mikrometrów. Umyj nylonowe sitko komórkowe trzema mililitrami buforu wytrawiającego. Umieść filtrat z powrotem w 14-mililitrowej probówce polipropylenowej z okrągłym dnem i odwiruj go.
Wyrzucić supernatant przed ponownym zawieszeniem osadu w trzech mililitrach buforu zatrzymującego. Do zawiesiny komórkowej dodać 54 mikrolitry 100-milimolowego chlorku wapnia, aby końcowe stężenie chlorku wapnia wynosiło 1,8 milimola. Pozwól żywym komórkom osiąść przez 10 minut i usuń supernatant zawierający martwe komórki.
Po ponownym zawieszeniu osadu w roztworze do przechowywania, komórki można wykorzystać do eksperymentów funkcjonalnych i hodowli. Obrazy mikroskopowe w jasnym polu izolowanych komórek wykazały, że izolacja kardiomiocytów myszy wytworzyła spokojne komórki w kształcie pręcików bez pęcherzyków błonowych lub zaokrąglonych krawędzi. Komórki wykazały około 80% wydajności i wysokie wskaźniki przeżycia, które decydują o powodzeniu techniki izolacji.
Aby pomyślnie wyizolować się, najważniejsze jest usunięcie pęcherzyków z kolektora i włożenie igły do tego samego otworu w sercu. Po wyizolowaniu kardiomiocyty można wykorzystać do komórkowych i molekularnych eksperymentów funkcjonalnych.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
W niniejszym artykule opisano niezawodną i wydajną technikę izolacji kardiomiocytów myszy, która nie wymaga rozbudowanego szkolenia. Metoda ta minimalizuje czas niedokrwienia dzięki przeprowadzeniu wstępnej perfuzji in vivo.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Kardiologia
- Biologia komórki
- Biologia molekularna
Wprowadzenie
- Kardiomiocyty są niezbędne do prowadzenia eksperymentów funkcjonalnych na poziomie komórkowym i molekularnym w kardiologii.
- Technika Langendorffa jest powszechnie stosowana, lecz posiada pewne ograniczenia.
- Niniejszy artykuł przedstawia modyfikacje mające na celu usprawnienie procesu izolacji.
- Minimalizacja czasu niedokrwienia jest kluczowa dla uzyskania lepszej wydajności.
Cel badania
- Przedstawienie techniki izolacji kardiomiocytów mysich, która nie opiera się na metodzie Langendorffa.
- Wykazanie zalet tej metody w porównaniu do technik tradycyjnych.
- Dostarczenie wiarygodnego protokołu dla badaczy.
Zastosowane metody
- Wstępna perfuzja przeprowadzona in vivo w celu ograniczenia czasu niedokrwienia.
- Zastosowanie rozdzielacza z kontrolą temperatury z nowo przygotowanym buforem perfuzyjnym.
- Usuwanie pęcherzyków powietrza z rozdzielacza za pomocą złącza Luer Lock.
- Ostrożne obchodzenie się z sercem podczas trawienia w celu utrzymania wydajności.
Główne wyniki
- Technika ta jest bardziej niezawodna i wydajna niż metody Langendorffa.
- Zmniejsza zapotrzebowanie na rozległe szkolenie.
- Zwiększa wydajność izolacji kardiomiocytów.
- Procedura została przeprowadzona przez studenta studiów magisterskich w warunkach laboratoryjnych.
Wnioski
- Technika nielangendorffowska stanowi odpowiednią alternatywę dla izolacji kardiomiocytów.
- Oferuje ona istotne zalety w zakresie wydajności i niezawodności.
- Metoda ta może usprawnić badania w kardiologii i dziedzinach pokrewnych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Spójna izolacja wysokiej jakości kardiomiocytów myszych jest kluczowa dla walidacji celów sercowych oraz mitygacji ryzyka mechanistycznego we wczesnej fazie odkrywania leków. Ten usprawniony protokół, niewymagający zastosowania aparatu Langendorffa, zmniejsza bariery techniczne oraz artefakty niedokrwienne, umożliwiając wiarygodne testy funkcjonalne, które pomagają w selekcji portfolio i zwiększają pewność predykcyjną. Metoda ta wspiera skalowalne i powtarzalne przepływy pracy, niezbędne do zapewnienia porównywalności między programami w badaniach i rozwoju (R&D) w obszarze układu sercowo-naczyniowego.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia rzetelną analizę mechanizmów chorób serca z wykorzystaniem pierwotnych kardiomiocytów mysich.
- Ogranicza zmienność techniczną, wspierając walidację celów funkcjonalnych oraz klarowność mechanistyczną.
- Zwiększa wiarygodność prognostyczną w badaniach nad biologią serca na wczesnym etapie.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia powtarzalne źródło żywotnych kardiomiocytów do późniejszych analiz funkcjonalnych.
- Wspiera standaryzację pomiarów skurczu, elektrofizjologii oraz cyklu wapniowego.
- Poprawia gotowość i skalowalność testów dla platform przesiewowych związków chemicznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z funkcjonalnymi punktami końcowymi istotnymi dla choroby w badaniach nad biomarkerami translacyjnymi.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną dzięki zastosowaniu spójnych preparatów komórkowych.
- Wspiera decyzje o dalszym rozwoju projektu w oparciu o analizę ryzyka poprzez zmniejszenie niejednoznaczności biologicznej.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół izolacji znajduje zastosowanie na styku wczesnych etapów odkrywania i rozwoju testów, dostarczając wysokiej jakości kardiomiocytów do badań funkcjonalnych, przesiewowych i translacyjnych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez i ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez umożliwienie bezpośredniej analizy funkcjonalnej komórek serca.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalne, ilościowe wyniki niezbędne do oceny związków w zwalidowanych systemach biologicznych.
- Analityka: Umożliwia pomiar skurczu, żywotności oraz parametrów elektrofizjologicznych na potrzeby badań porównawczych.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość punktów końcowych funkcji od modeli in vitro po modele przedkliniczne.
- Wykorzystanie w organizacji: Ustanawia zstandardyzowany, skalowalny protokół do wielokrotnego stosowania w ramach programów badawczych nad układem sercowo-naczyniowym.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów kardiologicznych.
- Wartość operacyjna: Upraszcza wymagania szkoleniowe i poprawia powtarzalność między zespołami.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie bardziej świadomych decyzji typu go/no-go oraz efektywne pod kątem kapitałowym zarządzanie portfolio.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój programów kardiologicznych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga podstawowych umiejętności chirurgicznych i perfuzyjnych, lecz mniejszej wiedzy technicznej niż w przypadku metod Langendorffa.
- Wymaga infrastruktury do perfuzji i trawienia z kontrolą temperatury.
- Wymaga rygorystycznego usuwania pęcherzyków powietrza i spójnego rozmieszczenia igły w celu zapewnienia powtarzalności.
- Można go dostosować do różnych modeli mysich i kontekstów chorób serca.
- Wydajność i żywotność zależą od precyzyjnej obsługi i czasu trwania procedur, zgodnie z opisem w protokole.
