Name: Prosta i skuteczna metoda konsekwentnego izolowania kardiomiocytów myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 25 s
Description: Poznaj niezawodną metodę izolacji kardiomiocytów myszy bez aparatu Langendorffa. Technika ogranicza czas niedokrwienia dzięki perfuzji in vivo i zapewnia wysoką wydajność komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health Grants R01 HL114940 (Biesiadecki), R01 AG060542 (Ziolo) i T32 HL134616 (Sturgill i Salyer).

Wszystkie procedury przeprowadzone w tym badaniu zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Stanowym Ohio zgodnie z wytycznymi NIH.
1. Przygotowanie roztworu
UWAGA: Proszę zobaczyć Tabelę 2 dla stężeń.
<ol>
	<li>Izolacja wstępna (do 2 tygodni przed izolacją miocytów)
	<ol>
		<li>Baza buforowa perfuzyjna: Przygotuj 1 l perfuzyjnej bazy buforowej (NaCl, KCl, NaH2PO4, HEPES, glukoza i BDM) w 1 l ultraczystej 18,2 MΩ·cm H2O. Dostosuj do pH 7,4 przed sterylną filtracją 0,22 μm. Przechowywać w temperaturze 4 °C do dnia izolacji.</li>
		<li>Bufor czyszczący: Przygotować 1 l buforu czyszczącego (NaCl, KCl, NaH2PO4, HEPES, glukoza, EDTA i BDM) w 1 l ultraczystego 18,2 MΩ·cm H2O. Dostosować do pH 7,4 przed sterylną filtracją 0,22 μm. Przechowywać w temperaturze 4 °C do dnia izolacji.</li>
		<li>100 mM roztwór podstawowy CaCl2: Odważyć 1,11 g CaCl2 i rozpuścić w 100 ml ultraczystego 18,2 MΩ·cm H2O. Przechowywać w temperaturze pokojowej do dnia izolacji.</li>
		<li>Podwielokrotności liberazy: Rozpuść 5 mg enzymów trawiennych w 5 ml sterylnej, wolnej od RNaz wody. Przygotować porcje o objętości 0,8 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C do dnia izolacji.</li>
		<li>Laminowanie naczyń: Nałóż 100 μl 40 μg/ml mysiej lamininy na sterylne płytki Petriego o pojemności 30 ml ze szklanym dnem. Pozostaw na 30 minut i usuń nadmiar lamininy. Umieść lamininę na szalce Petriego z inkubacją UV w temperaturze pokojowej na 30 minut. Przechowywać w temperaturze 4 °C do dnia izolacji (laminowane szalki Petriego mogą być używane do 2 tygodni).</li>
		<li>Pożywki DMEM: W komorze bezpieczeństwa biologicznego dodaj 2,5 ml FBS, 0,5 ml penicyliny-streptomycyny (50 U/mL-50 μg) i 1 ml 500 mM BDM do 46 ml DMEM. Przechowywać w temperaturze 4 °C do dnia izolacji (podłoże można stosować do 2 tygodni).</li>
		<li>Pożywka M199: Przygotuj 1 l pożywki M199 (NaHCO3, HEPES, L-glutation, M199, BDM i BSA) w 1 l ultraczystej pożywki 18,2 MΩ·cm H2O. Dostosuj do pH 7,4 przed sterylną filtracją (filtr 0,22 μm). Przechowywać w temperaturze 4 °C do dnia izolacji.</li>
		<li>500 mM bulionu BDM: Dodać 0,5 g BDM do 10 ml ultraczystego 18,2 MΩ·cm H2O. Przechowywać w temperaturze 4 °C do dnia izolacji.</li>
		<li>Tworzenie platformy stabilizującej: Uformuj ciastolinę wokół podstawy igły wkręconej w kran Luer. Uformuj do szalki Petriego, która będzie zawierała serce i upewnij się, że igła znajduje się na odpowiedniej wysokości do wstrzyknięcia komory (~ 5 mm nad dnem naczynia).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dzień izolacji
	<ol>
		<li>Bufor perfuzyjny: W dniu izolacji dodać 9,5 mg MgCl2 do 100 ml perfuzyjnej bazy buforowej. Pozostawić do całkowitego wymieszania przed wyjęciem 30 ml gotowego buforu perfuzyjnego i umieścić w czystej, szklanej butelce o pojemności 100 ml z szerokim otworem i zakrętką (bufor do wytrawiania). 
		UWAGA: Dodatki te można wykonać w dniu izolacji bez dodatkowych korekt pH, ponieważ ich dodatek nieznacznie zmienia pH.
		<ol>
			<li>Usunąć 12 ml buforu perfuzyjnego i odłożyć na bok (bufor zatrzymujący). Wlej pozostałe 58 ml buforu perfuzyjnego do innej czystej, szklanej butelki o pojemności 100 ml z szerokim otworem i zakrętką. Przechowywać pozostały bufor perfuzyjny w temperaturze 37 °C przez cały czas izolacji.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Bufor do wytrawiania: Dodać 7,5 μl 100 mM CaCl2 do 30 ml buforu perfuzyjnego, aby uzyskać końcowe stężenie 25 μM. Bezpośrednio przed izolacją dodać 770 μl liberazy do buforu wytrawiającego dla końcowego stężenia 26 μg/ml.</li>
		<li>Bufor zatrzymujący: Rozpuścić 240 mg BSA w 12 ml buforu perfuzyjnego. Przechowywać w temperaturze 37 °C przez cały czas izolacji.</li>
		<li>Bufor czyszczący: Przygotować strzykawkę o pojemności 3 ml z buforem czyszczącym i usunąć igłę z pęcherzyków. Przechowywać na lodzie do momentu izolacji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie rozmaitości
<ol>
	<li>Wyczyść kolektor o kontrolowanej temperaturze świeżo przygotowanym buforem perfuzyjnym, uważając, aby nie pozostały żadne pęcherzyki. Za pomocą złącza Luer lock wkręć igłę 27 G i usuń pęcherzyki powietrza. Oczyszczony kolektor jest niezbędny do udanej izolacji.</li>
</ol>
3. Przygotowanie zwierząt
<ol>
	<li>Wstrzyknąć myszowi dootrzewnowo 100 mg/kg ketaminy i 20 mg/kg ksylazyny w przeliczeniu na masę ciała bezpośrednio przed izolacją. W procedurze wykorzystano samca, 4-miesięczną mysz C57Bl/6.</li>
	<li>W razie potrzeby umieść mysz na podgrzewanej podkładce chirurgicznej, aby zachęcić do sedacji. Zwiń ramiona myszy i przyklej kończyny i podstawę ogona do niebieskiej pieluchy laboratoryjnej. Upewnij się, że zwierzę jest w pełni znieczulone przez wycofanie odruchu szczypania palców u stóp. Nałóż sterylną serwetkę wokół obszaru operacyjnego.</li>
</ol>
4. Procedura izolacji kardiomiocytów
<ol>
	<li>Odsłoń mostek myszy i, bocznie do linii środkowej, przetnij proksymalnie przez żebra i do pachy. Delikatnie przeciąć całkowicie przeponę, zapewniając płytkie cięcia, aby uniknąć serca. Zaciśnij mostek hemostatem i złóż żebra do tyłu, aby odsłonić klatkę piersiową.</li>
	<li>Delikatnie usuń osierdzie z serca i całkowicie przetnij żyłę główną dolną, bezpośrednio dystalnie do serca. Użyj strzykawki o pojemności 3 ml z igłą 27 G, aby szybko wstrzyknąć 3 ml lodowatego buforu oczyszczającego do prawej komory serca w ciągu 1 minuty.</li>
	<li>Delikatnie przytrzymaj serce za pomocą pęsety i odsuń się od ciała, odsłaniając jak najwięcej aorty. Za pomocą hemostatu zaciśnij aortę wstępującą, uważając, aby nie zacisnąć przedsionków, i wytnij serce z klatki piersiowej.</li>
	<li>Szybko przenieś zaciśnięte serce na pokrywkę polipropylenowej szalki Petriego z około 10 ml ciepłego buforu perfuzyjnego. Umieścić zaciśnięte serce na platformie nośnej i za pomocą stabilizowanej igły 27 G przymocowanej do kolektora wstrzyknąć 10 ml buforu perfuzyjnego o kontrolowanej temperaturze 37 °C do lewej komory w ciągu 5 minut.</li>
	<li>Przenieść zaciśnięte serce i platformę nośną na szalkę Petriego z około 5 ml buforu wytrawiającego. Zamień strzykawki wejściowe na strzykawkę o pojemności 50 ml z 25 ml buforu wytrawiającego.</li>
	<li>Przed wstrzyknięciem oczyścić kolektor z pęcherzyków i pozostałego buforu perfuzyjnego. Ostrożnie umieścić igłę w tym samym położeniu igły w wierzchołku lewej komory.</li>
	<li>Za pomocą pompy perfuzyjnej wstrzyknąć bufor wytrawiający o kontrolowanej temperaturze 37 °C do lewej komory na 15 minut za pomocą strzykawki o pojemności 50 ml. Kontrolować temperaturę roztworu za pomocą płaszcza wodnego uprzednio skalibrowanego w taki sposób, aby wyrzucał roztwór o temperaturze 37 °C na koniec igły.</li>
	<li>Usunąć komory z przedsionków i przenieść do zlewki o pojemności 10 ml. Dodać 3 ml buforu wytrawiającego do zlewki i ostrymi nożyczkami pokroić komory na duże kawałki. Przykryj zlewkę folią aluminiową i umieść w roztrząsającej łaźni wodnej podgrzanej do 37 °C na 5 minut.</li>
	<li>Wyrzucić supernatant, uważając, aby nie usunąć żadnych kawałków tkanki. Ponownie zawiesić fragmenty tkanki w 3 ml buforu wytrawiającego i rozcierać przez około 4 minuty lub do uzyskania jednorodnej mieszaniny.</li>
	<li>Przefiltruj komórki przez nylonowe sitko o średnicy 70 μm do probówki polipropylenowej o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Umieścić filtrat z powrotem w okrągłodennej probówce polipropylenowej o pojemności 14 ml i odwirowywać przez 1 minutę przy 100 obr./min. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 3 ml buforu zatrzymującego.</li>
	<li>Dodać 54 μl 100 mM CaCl2 do zawieszonych komórek, aby uzyskać końcowe stężenie CaCl2 1,8 mM. Ten krok można również wykonać stopniowo, aby zwiększyć wydajność komórek.</li>
	<li>Pozostawić żywe komórki do osadzenia się grawitacyjnie przez 10 minut przed usunięciem supernatantu zawierającego martwe komórki. Zawiesić osad w roztworze do przechowywania (roztwór perfuzyjny z 200 μM CaCl2). Komórki te mogą być teraz wykorzystywane do eksperymentów funkcjonalnych (tj. obrazowanie/kurczenie wapnia, zacisk łaty itp.), hodowli itp. 
	UWAGA: Komórki mogą być również ponownie zawieszone w roztworach zależnych od laboratorium lub eksperymentu.</li>
</ol>
5. Hodowla komórkowa
<ol>
	<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru lub za pomocą widoku pola za pomocą szkiełka nakrywkowego w siatkę. Ponieważ miocyty są bardzo duże, liczenie za pomocą hemocytometru nie zawsze jest dokładne. Służy to do zorientowania się, ile w przybliżeniu komórek uzyskano z izolacji.</li>
	<li>Rozcieńczyć komórki do ~ 25 000 komórek/ml za pomocą pożywki DMEM. Dodaj 1 ml roztworu komórkowego do każdej studzienki.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 37 °C, 95%O2, 5% CO2 przez 2 godziny.</li>
	<li>Delikatnie odessać pożywkę DMEM z każdej studzienki i dodać 2 ml pożywki M199.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 37 °C, 95%O2, 5% CO2 przez okres do 24 godzin.</li>
</ol>

<ol><li>Ziolo, M. T., Dollinger, S. J., Wahler, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocytes+isolated+from+rejecting+transplanted+rat+hearts+exhibit+reduced+basal+shortening+which+is+reversible+by+aminoguanidine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Myocytes isolated from rejecting transplanted rat hearts exhibit reduced basal shortening which is reversible by aminoguanidine.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 30 (5), 1009-1017 (1998).</li>
<li>Ziolo, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocytes+isolated+from+rejecting+transplanted+rat+hearts+exhibit+a+nitric+oxide-mediated+reduction+in+the+calcium+current%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Myocytes isolated from rejecting transplanted rat hearts exhibit a nitric oxide-mediated reduction in the calcium current.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 33 (9), 1691-1699 (2001).</li>
<li>Traynham, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diesterified+nitrone+rescues+nitroso-redox+levels+and+increases+myocyte+contraction+via+increased+SR+Ca%282%2B%29+handling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Diesterified nitrone rescues nitroso-redox levels and increases myocyte contraction via increased SR Ca(2+) handling.</a> PLoS One. 7 (12), 52005(2012).</li>
<li>Nixon, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+troponin+I+Ser-150+and+Ser-23%2F24+phosphorylation+sustains+thin+filament+Ca%282%2B%29+sensitivity+and+accelerates+deactivation+in+an+acidic+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Combined troponin I Ser-150 and Ser-23/24 phosphorylation sustains thin filament Ca(2+) sensitivity and accelerates deactivation in an acidic environment.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 72, 177-185 (2014).</li>
<li>Swager, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Claudin-5+levels+are+reduced+from+multiple+cell+types+in+human+failing+hearts+and+are+associated+with+mislocalization+of+ephrin-B1%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Pathology%22%5BJournal%5D)">Claudin-5 levels are reduced from multiple cell types in human failing hearts and are associated with mislocalization of ephrin-B1.</a> Cardiovascular Pathology. 24 (3), 160-167 (2015).</li>
<li>Pinckard, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+endocrine+role+for+the+BAT-released+lipokine+12%2C13-diHOME+to+mediate+cardiac+function%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">A novel endocrine role for the BAT-released lipokine 12,13-diHOME to mediate cardiac function.</a> Circulation. 143 (2), 145-159 (2021).</li>
<li>Roof, S. R., Shannon, T. R., Janssen, P. M., Ziolo, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+increased+systolic+Ca2%2B+and+phospholamban+phosphorylation+during+beta-adrenergic+stimulation+on+Ca2%2B+transient+kinetics+in+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Effects of increased systolic Ca2+ and phospholamban phosphorylation during beta-adrenergic stimulation on Ca2+ transient kinetics in cardiac myocytes.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (4), 1570-1578 (2011).</li>
<li>Harris, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise-induced+3%27-sialyllactose+in+breast+milk+is+a+critical+mediator+to+improve+metabolic+health+and+cardiac+function+in+mouse+offspring%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Exercise-induced 3'-sialyllactose in breast milk is a critical mediator to improve metabolic health and cardiac function in mouse offspring.</a> Nature Metabolism. 2 (8), 678-687 (2020).</li>
<li>Roof, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CXL-1020%2C+a+novel+nitroxyl+%28HNO%29+prodrug%2C+is+more+effective+than+milrinone+in+models+of+diastolic+dysfunction-a+cardiovascular+therapeutic%3A+an+efficacy+and+safety+study+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">CXL-1020, a novel nitroxyl (HNO) prodrug, is more effective than milrinone in models of diastolic dysfunction-a cardiovascular therapeutic: an efficacy and safety study in the rat.</a> Frontiers in Physiology. 8, 894(2017).</li>
<li>Milani-Nejad, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+and+large+animal+models+in+cardiac+contraction+research%3A+advantages+and+disadvantages%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+and+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Small and large animal models in cardiac contraction research: advantages and disadvantages.</a> Pharmacology and Therapeutics. 141 (3), 235-249 (2014).</li>
<li>Harary, I., Farley, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+studies+of+single+isolated+beating+heart+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vitro studies of single isolated beating heart cells.</a> Science. 131 (3414), 1674-1675 (1960).</li>
<li>Kono, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+collagenases+and+other+proteolytic+enzymes+in+the+dispersal+of+animal+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Roles of collagenases and other proteolytic enzymes in the dispersal of animal tissues.</a> Biochimica Biophysica Acta. 178 (2), 397-400 (1969).</li>
<li>Baker, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+apparatus+for+mammalian+heart+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">An improved apparatus for mammalian heart perfusion.</a> The Journal of Physiology. 115 (1), 30-32 (1951).</li>
<li>Powell, T., Twist, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+technique+for+the+isolation+and+purification+of+adult+cardiac+muscle+cells+having+respiratory+control+and+a+tolerance+to+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">A rapid technique for the isolation and purification of adult cardiac muscle cells having respiratory control and a tolerance to calcium.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 72 (1), 327-333 (1976).</li>
<li>Motayagheni, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+Langendorff+technique+for+mouse+heart+cannulation%3A+Improved+heart+quality+and+decreased+risk+of+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Modified Langendorff technique for mouse heart cannulation: Improved heart quality and decreased risk of ischemia.</a> MethodsX. 4, 508-512 (2017).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+procedure+for+isolating+adult+mouse+cardiomyocytes+for+epicardial+activation+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">An improved procedure for isolating adult mouse cardiomyocytes for epicardial activation mapping.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (24), 11257-11263 (2021).</li>
<li>Jian, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+cannulation+methods+for+cardiomyocytes+isolation+from+heart+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vivo cannulation methods for cardiomyocytes isolation from heart disease models.</a> PLoS One. 11 (8), 0160605(2016).</li>
<li>Ackers-Johnson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified%2C+Langendorff-free+method+for+concomitant+isolation+of+viable+cardiac+myocytes+and+nonmyocytes+from+the+adult+mouse+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">A simplified, Langendorff-free method for concomitant isolation of viable cardiac myocytes and nonmyocytes from the adult mouse heart.</a> Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).</li>
<li>Weldrick, J. J., Abdul-Ghani, M., Megeney, L. A., Burgon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+efficient+method+for+the+isolation+of+postnatal+murine+cardiac+myocyte+and+fibroblast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Physiology+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">A rapid and efficient method for the isolation of postnatal murine cardiac myocyte and fibroblast cells.</a> Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 96 (5), 535-539 (2018).</li>
<li>Myachina, T. A., Butova, X. A., Khohlova, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+Langendorff-free+method+for+isolation+of+cadiomyocytes+from+adult+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22AIP+Conference+Proceedings%22%5BJournal%5D)">A modified Langendorff-free method for isolation of cadiomyocytes from adult rat heart.</a> AIP Conference Proceedings. 2174 (1), 020140(2019).</li>
<li>Omatsu-Kanbe, M., Yoshioka, K., Fukunaga, R., Sagawa, H., Matsuura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+antegrade+perfusion+method+for+isolating+viable+single+cardiomyocytes+from+neonatal+to+aged+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reports%22%5BJournal%5D)">A simple antegrade perfusion method for isolating viable single cardiomyocytes from neonatal to aged mice.</a> Physiological Reports. 6 (9), 13688(2018).</li>
<li>Omatsu-Kanbe, M., Fukunaga, R., Mi, X., Matsuura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+antegrade+perfusion+method+for+cardiomyocyte+isolation+from+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An antegrade perfusion method for cardiomyocyte isolation from mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (171), e61866(2021).</li>
<li>Bers, D. M., Patton, C. W., Nuccitelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+the+preparation+of+Ca2%2B+buffers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A practical guide to the preparation of Ca2+ buffers.</a> Methods in Cell Biology. 99, 126(1994).</li>
<li>Grosso, D. S., Frangakis, C. J., Carlson, E. C., Bressler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+myocytes+from+the+adult+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Preparative+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of myocytes from the adult rat heart.</a> Preparative Biochemistry. 7 (5), 383-401 (1977).</li>
<li>Thum, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Butadione+Monoxime+increases+the+viability+and+yield+of+adult+cardiomyocytes+in+primary+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Butadione Monoxime increases the viability and yield of adult cardiomyocytes in primary cultures.</a> Cardiovascular Toxicology. 1 (1), 61-72 (2001).</li>
<li>Wolska, B. M., Solaro, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+isolation+of+adult+mouse+cardiac+myocytes+for+studies+of+contraction+and+microfluorimetry%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry.</a> American Journal of Physiology. 271 (3), 1250-1255 (1996).</li>
</ol>

Brak konfliktów interesów do ujawnienia.

Główną zaletą naszej techniki izolacji kardiomiocytów bez użycia metody Langendorffa jest to, że ogranicza ona niedotlenienie i czas niedokrwienia, ponieważ nie wymaga kaniulacji do aparatu Langendorffa. W przeciwieństwie do klasycznych technik Langendorffa, które zajmują kilka minut na usunięcie, oczyszczenie i zawieszenie serca, często powodując niedokrwienne uszkodzenie miocytów, nasza metoda obejmuje oczyszczanie krwi in vivo za pomocą lodowatego roztworu oczyszczającego. Lodowaty bufor oczyszczając...

Przez dziesięciolecia, podstawową ideą w literaturze biologii serca był molekularny mechanizm działania. Należy ustalić mechanizm działania w celu opublikowania wiarygodnych badań. Ugruntowaną strategią określania mechanizmu molekularnego są izolowane badania kardiomiocytów, które wymagają wysokiej jakości kardiomiocytów w celu uzyskania wiarygodnych danych. Eksperymenty komórkowe i molekularne przeprowadzane na kardiomiocytach w celu określenia mechanizmu działania są złotym standardem w badaniu skurczu1, elektrofizjologia2, cykl wapnia (Ca2+)3, czułość miofilamentu Ca2+4, cytoskeleton5, metabolizm6, wpływ hormonów7, sygnalizacja molekuły8, badania leków9, itd. Mysz stała się gatunkiem wybieranym przez większość eksperymentów biologii serca ze względu na łatwość manipulacji genetycznej, jej niewielkie rozmiary, stosunkowo krótką żywotność, niski koszt itp10. Jednak niezawodna izolacja wysokiej jakości kardiomiocytów myszy nie jest trywialna przy obecnych technikach.
Labs izoluje kardiomiocyty od prawie 70 lat11. Praktycznie wszystkie techniki izolacji kardiomiocytów opierają się na trawieniu serca za pomocą różnych enzymów (kolagenazy, proteazy, trypsyny itp.). We wczesnych okresach (1950-1960) stosowano metodę chunkową, która polegała na usunięciu serca, pokrojeniu na znacznie mniejsze kawałki i inkubacji w roztworze z kolagenazą/proteazą/trypsyną12. W latach siedemdziesiątych laboratoria wdrożyły ulepszoną metodę "Langendorffa"13, która izolowała kardiomiocyty za pomocą techniki izolacji opartej na perfuzji tętnic wieńcowych (wsteczna perfuzja enzymu za pomocą aparatu Langendorffa); Ta technika pozostaje dominującą metodą izolacji miocytów w tej dziedzinie dzisiaj, ~ 50 lat później14,15,16. Ostatnie prace przeniosły się na kaniulację serca in vivo w celu ograniczenia czasu niedotlenienia i uszkodzeń niedokrwiennych, co skutkuje lepszymi izolacjami kardiomiocytów (lepsza wydajność i wyższa jakość)17. Ostatnio przekształciło się to w wykonywanie in vivo, perfuzji serca bez Langendorffa18,19,20,21,22. Rozwinęliśmy technikę izolacji kardiomiocytów bez Langendorffa w oparciu o technikę Ackers-Johnson et al.18 i dostosowaliśmy różne elementy z wielu poprzednich technik izolacji. Te kluczowe adaptacje obejmują wstrzyknięcie lodowatego bufora oczyszczającego i włączenie platformy nośnej w celu ustabilizowania igły, co pozwala na zmniejszenie manipulacji sercem. Szczegółowa w tej technice jest również kontrola temperatury wstrzykiwanych (37 °C), która skróciła czas między wstrzyknięciem in vivo a trawieniem ze względu na mniejszą perfuzję EDTA, jak wcześniej opublikowano18. Zmniejszając manipulację serca, a tym samym minimalizując rozmiar miejsca nakłucia, uzyskuje się dokładną i stałą perfuzję tętnic wieńcowych. Udoskonaliliśmy również technikę za pomocą wtórnej metody roztwarzania w kawałkach, ilości EDTA w wstrzykniętym buforze czyszczącym i zmieniliśmy pH. Opisana przez nas technika jest bardziej niezawodna, bardziej wydajna i nie wymaga intensywnego szkolenia/praktyki w porównaniu z użyciem aparatu Langendorffa (Tabela 1).

<table><tbody><tr><td>10 cc Bd Luer-Lok Strzykawka</td><td>Fisher Sci</td><td>14-827-52</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Pyrex Low-Form Beaker</td><td>Cole-Palmer</td><td>UX-34502-01</td><td></td></tr><tr><td>100 mL polipropylenowa nakrętka szklana butelka do przechowywania mediów</td><td>DWK Life Sciences</td><td>UX-34523-00</td><td></td></tr><tr><td>14 ml Probówki polipropylenowe z okrągłym dnem z nakrętką</td><td>Fisher Sci</td><td>14-959-11B</td><td></td></tr><tr><td>Monoksymus 2,3-butanodionu</td><td>Sigma</td><td>B0753</td><td>>98%</td></tr><tr><td>3 cc BD Luer-Lok Strzykawka</td><td>Fisher Sci</td><td>14-823-435</td><td></td></tr><tr><td>35 mm naczynia ze szklanym dnem</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-1.0-20-C</td><td></td></tr><tr><td>50 mL BD Strzykawka bez igły</td><td>Fisher Sci</td><td>13-689-8</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Stożkowe probówki</td> wirówkowe <td>Cole-Palmer</td><td>EW-22999-84</td><td></td></tr><tr><td>95% O2 5% CO2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AIMS Kosmiczna żelowa poduszka grzewcza</td><td>Fisher Sci</td><td>14-370-223</td><td></td></tr><tr><td>BD PrecisionGlide 27 G X 1/2" Igły podskórne</td><td>Becton Dickinson</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma</td><td>A3803 Frakcja</td><td>szoku cieplnego, liofilizowany proszek, zasadniczo bez kwasów tłuszczowych, >98%</td></tr> <tr><td>dwuwodny chlorek wapnia</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td>>99%</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td>Nadaje się do hodowli komórkowych, >99,5%</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Fisher Sci</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Sci</td><td>AAA1071336</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 100 mm Naczynie do hodowli komórkowych z powłoką TC</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>R& D Systems (Bio-techne)</td><td>S11195</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Isotemp Podgrzewane cyrkulatory zanurzeniowe</td><td>Fisher Sci</td><td>13-874-432</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze hemostatyczne Hartman Mosquito</td><td>World Precision Instruments</td><td>15921</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw studzienek liczeniowych Hausser Scientific Hy-Lite</td><td>Fisher Sci</td><td>02-671-11</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td>>99,5%</td></tr><tr><td>Taśma do etykietowania</td><td>Fisher Sci</td><td>15-901-10R</td><td></td></tr><tr><td>Legato 100 Pompa strzykawkowa</td><td>kdScientific</td><td>788100</td><td></td></tr><tr><td>L-glutation</td><td>Fisher Sci</td><td>ICN19467980</td><td></td></tr><tr><td>Liberase TH Research Grade</td><td>Sigma</td><td>5401135001</td><td>Wysokie stężenie termolizyny</td></tr><tr><td>M199</td><td>Fisher Sci</td><td>MT10060CV</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek</td> <td>magnezuInvitrogen</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Laminin</td><td>Corning</td><td>354232</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Fisher Sci</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td>>99%</td></tr> <tr><td>Precyzyjna cyfrowa kąpiel wodna posuwisto-zwrotna</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>TSCIR19</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>Nadaje się do komórek kultura</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td>>99%</td></tr> <tr><td>Fosforan sodu jednozasadowy</td><td>Sigma</td><td>S5011</td><td>>99%</td></tr> <tr><td>Sterylne sitko komórkowe 70 i mikro; m</td><td>Fisher Sci</td><td>22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>Cienkie nożyczki studenckie</td><td>Fine Science Tools</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>Podkłady chłonne VWR</td><td>Fisher Sci</td><td>NC9481815</td><td></td></tr></tbody></table>

prosta i skuteczna metoda konsekwentnego izolowania kardiomiocytów myszy

A Simple and Effective Method to Consistently Isolate Mouse Cardiomyocytes

Potrzeba powtarzalnych, ale technicznie prostych metod dających wysokiej jakości kardiomiocyty jest niezbędna do badań w biologii serca. Komórkowe i molekularne eksperymenty funkcjonalne (np. skurcze, elektrofizjologia, obieg wapnia itp.) na kardiomiocytach są złotym standardem w ustalaniu mechanizmów choroby. Mysz jest gatunkiem wybieranym do eksperymentów funkcjonalnych, a opisana technika służy w szczególności do izolacji kardiomiocytów myszy. Dotychczasowe metody wymagające aparatu Langendorffa wymagały wysokiego poziomu wyszkolenia i precyzji kaniulacji aorty, co często prowadziło do niedokrwienia. Dziedzina ta przesuwa się w kierunku metod izolacji wolnych od Langendorffa, które są proste, powtarzalne i dają żywotne miocyty do pozyskiwania danych fizjologicznych i hodowli. Metody te znacznie skracają czas niedokrwienia w porównaniu z kaniulacją aorty i skutkują wiarygodnym uzyskaniem kardiomiocytów. Nasza adaptacja do metody Langendorffa obejmuje wstępną perfuzję z lodowatym roztworem czyszczącym, zastosowanie platformy stabilizującej, która zapewnia stabilną igłę podczas perfuzji, oraz dodatkowe etapy trawienia w celu zapewnienia wiarygodnego uzyskania kardiomiocytów do wykorzystania w pomiarach funkcjonalnych i hodowli. Ta metoda jest prosta i szybka do wykonania i wymaga niewielkich umiejętności technicznych.

Podczas oceny powodzenia izolacji należy zwrócić uwagę na kilka elementów. Po pierwsze, kardiomiocyty muszą mieć kształt pręcikowy i nie mogą wykazywać pęcherzyków błonowych, podobnie jak komórki izolowane na Rysunku 1. Typowa izolacja pozwala uzyskać ~80% myocytów o kształcie pręcikowym. Jeśli izolacja daje mniej niż 50% komórek o kształcie pręcikowym, uznaje się ją za nieudaną, a kardiomiocyty nie są wykorzystywane. Wreszcie kardiomiocyty powinny być w stanie spoczynku. Myocyty wykazujące ...

Złotym standardem w kardiologii dla komórkowych i molekularnych eksperymentów funkcjonalnych są kardiomiocyty. W artykule opisano adaptacje techniki innej niż Langendorff do izolowania kardiomiocytów myszy.

Prosta i skuteczna metoda konsekwentnego izolowania kardiomiocytów myszy

The need for reproducible yet technically simple methods yielding high-quality cardiomyocytes is essential for research in cardiac biology. Cellular and ...

Technika ta jest bardziej niezawodna i wydajna i nie wymaga rozległej praktyki ani szkolenia w porównaniu z najczęściej stosowanymi technikami aparatu Langendorffa. Główną zaletą tej techniki jest to, że ogranicza ona czas niedokrwienia, ponieważ początkowa perfuzja zachodzi in vivo. Podczas wykonywania tej techniki ważne jest, aby unikać pęcherzyków w kolektorze i unikać nadmiernego ruchu serca podczas trawienia, ponieważ mogą one zmniejszyć wydajność.Technikę tę zademonstruje Sarah Sturgill, doktorantka w laboratorium dr Marka Ziolo. Rozpocząć od oczyszczenia kolektora o kontrolowanej temperaturze za pomocą świeżo przygotowanego buforu perfuzyjnego. W tym celu wkręć igłę o rozmiarze 27 i usuń pęcherzyki za pomocą złącza typu luer lock.Upewnij się, że nie pozostały żadne bąbelki. Aby wyizolować kardiomiocyt, odsłoń mostek w pełni znieczulonej myszy i bocznie do linii środkowej, przetnij proksymalnie przez żebra i do pachy. Następnie przetnij przeponę, zapewniając płytkie cięcia, aby uniknąć serca.Zaciśnij mostek hemostatem i złóż żebra do tyłu, aby odsłonić klatkę piersiową. Delikatnie usuń osierdzie z serca przed przecięciem żyły głównej dolnej bezpośrednio dystalnie do serca. Wstrzyknąć trzy mililitry lodowatego buforu oczyszczającego do prawej komory serca w ciągu jednej minuty za pomocą igły o rozmiarze 27.Następnie przytrzymaj serce za pomocą pęsety. Odciągnij go od ciała i odsłoń jak najwięcej aorty. Następnie zacisnąć aortę wstępującą za pomocą hemostatu i wyciąć serce.Szybko przenieś zaciśnięte serce na pokrywę polipropylenowej szalki Petriego zawierającej 10 mililitrów ciepłego buforu perfuzyjnego. Umieść zaciśnięte serce na platformie nośnej i wstrzyknij 10 mililitrów buforu perfuzyjnego o kontrolowanej temperaturze 37 stopni Celsjusza do lewej komory w ciągu pięciu minut za pomocą stabilizowanej igły o rozmiarze 27 przymocowanej do kolektora. Następnie przenieś zaciśnięte serce i platformę nośną na szalkę Petriego z około pięcioma mililitrami buforu wytrawiającego.Zamień strzykawki wejściowe na 50-mililitrową strzykawkę zawierającą 25 mililitrów buforu wytrawiającego. Przed wstrzyknięciem oczyścić kolektor z pęcherzyków i pozostałego buforu perfuzyjnego. Ostrożnie umieścić igłę w tym samym położeniu igły w wierzchołku lewej komory.Za pomocą pompy perfuzyjnej wstrzyknij bufor wytrawiający o temperaturze 37 stopni Celsjusza do lewej komory na 15 minut za pomocą 50-mililitrowej strzykawki. Kontroluj temperaturę roztworu za pomocą płaszcza wodnego skalibrowanego do wyrzucania roztworu o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Usuń komory z przedsionków przed przeniesieniem ich do 10-mililitrowej zlewki.Dodaj trzy mililitry buforu wytrawiającego do zlewki i pokrój komory na duże kawałki ostrymi nożyczkami. Przykryj zlewkę folią aluminiową i umieść ją w roztrząsającej łaźni wodnej podgrzanej do 37 stopni Celsjusza na pięć minut. Po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić kawałki tkanki w trzech mililitrach buforu wytrawiającego i rozcierać go przez około cztery minuty lub do uzyskania jednorodnej mieszaniny.Po zakończeniu przefiltruj komórki do 50-mililitrowej rurki polipropylenowej za pomocą nylonowego sitka do komórek o średnicy 70 mikrometrów. Umyj nylonowe sitko komórkowe trzema mililitrami buforu wytrawiającego. Umieść filtrat z powrotem w 14-mililitrowej probówce polipropylenowej z okrągłym dnem i odwiruj go.Wyrzucić supernatant przed ponownym zawieszeniem osadu w trzech mililitrach buforu zatrzymującego. Do zawiesiny komórkowej dodać 54 mikrolitry 100-milimolowego chlorku wapnia, aby końcowe stężenie chlorku wapnia wynosiło 1,8 milimola. Pozwól żywym komórkom osiąść przez 10 minut i usuń supernatant zawierający martwe komórki.Po ponownym zawieszeniu osadu w roztworze do przechowywania, komórki można wykorzystać do eksperymentów funkcjonalnych i hodowli. Obrazy mikroskopowe w jasnym polu izolowanych komórek wykazały, że izolacja kardiomiocytów myszy wytworzyła spokojne komórki w kształcie pręcików bez pęcherzyków błonowych lub zaokrąglonych krawędzi. Komórki wykazały około 80% wydajności i wysokie wskaźniki przeżycia, które decydują o powodzeniu techniki izolacji.Aby pomyślnie wyizolować się, najważniejsze jest usunięcie pęcherzyków z kolektora i włożenie igły do tego samego otworu w sercu. Po wyizolowaniu kardiomiocyty można wykorzystać do komórkowych i molekularnych eksperymentów funkcjonalnych.

a-simple-effective-method-to-consistently-isolate-mouse

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Pierwotne hodowle kardiomiocytów myszy są jednym z kluczowych narzędzi do badania organizacji i funkcji miofibrylarów. Poniższy protokół opisuje izolację i hodowlę pierwotnych kardiomiocytów z serca noworodków myszy. Uzyskane w ten sposób kultury kardiomiocytów mogą być następnie wykorzystane do różnych testów biomechanicznych, biochemicznych i biologicznych.

Izolacja i hodowla nowonarodzonych kardiomiocytów myszy

Tutaj opisujemy izolację dorosłych kardiomioktyesów myszy za pomocą systemu perfuzyjnego Langendorffa.  Powstałe komórki tolerują Ca2+, są elektrycznie uśpione i mogą być hodowane i transfekowane adeno- lub lentiwirusami w celu manipulowania ekspresją genów.  Ich funkcjonalność może być również analizowana za pomocą systemu MMSYS i technik zacisków krosowych.

Izolacja, hodowla i charakterystyka funkcjonalna kardiomioktaków dorosłych myszy

Pojedyncze kardiomiocyty od myszy typu dzikiego i zmutowanych mogą być izolowane z serca w celu zbadania ich kurczliwości i przejściowych stanów wapnia. Pozwala to na scharakteryzowanie udziału dysfunkcji komórkowej w dysfunkcji serca z dowolnej przyczyny.

Izolacja i analiza fizjologiczna kardiomiocytów myszy

Opisujemy niezawodną metodę izolacji kardiomiocytów dorosłych myszy. Protokół ten daje spójny wynik dla hodowli funkcjonalnych dorosłych kardiomiocytów od różnych genetycznie zmodyfikowanych myszy.

Izolacja i hodowla kardiomiocytów dorosłych myszy do sygnalizacji komórkowej i przerostu serca in vitro

Ten protokół opisuje krok po kroku metodę powtarzalnej izolacji i długoterminowej hodowli kardiomiocytów dorosłych myszy o wysokiej wydajności, czystości i żywotności.

Izolacja, hodowla i transdukcja kardiomiocytów dorosłych myszy

Ten protokół jest używany do izolowania pojedynczych kardiomiocytów przedsionkowych z serca dorosłej myszy za pomocą metody trawienia fragmentów. Podejście to stosuje się do izolacji miocytów prawego lub lewego przedsionka, które można wykorzystać do scharakteryzowania elektrofizjologii miocytów przedsionków w badaniach typu patch-clamp.

Izolacja miocytów przedsionkowych od dorosłych myszy

Tutaj prezentujemy protokół izolacji, transfekcji i długoterminowej hodowli kardiomiocytów dorosłych myszy i szczurów.

Izolacja, transfekcja i długotrwała hodowla dorosłych kardiomiocytów myszy i szczurów

Opisano metodę jednoczesnej izolacji miocytów i nie-miocytów zarówno z przedsionków, jak i komór serca pojedynczej dorosłej myszy. Protokół ten zapewnia stałą wydajność wysoce żywotnych miocytów serca i niemiocytów oraz szczegółowo opisuje optymalne warunki hodowli specyficzne dla komórek do fenotypowania i analizy in vitro.

Jednoczesna izolacja i hodowla miocytów przedsionkowych, miocytów komorowych i niemiocytów z serca dorosłej myszy

Opracowaliśmy prostąmetodę izolowania wysokiej jakości pojedynczych komórek serca myszy za pomocą techniki perfuzji antegrade. Metoda ta nie zawiera metody Langendorffa i jest przydatna do izolowania miocytów komorowych i przedsionkowych lub komórek śródmiąższowych, takich jak fibroblasty serca lub komórki progenitorowe.

Metoda perfuzji antegrade do izolacji kardiomiocytów od myszy

Modele mysie pozwalają badać kluczowe mechanizmy arytmogenezy. W tym celu niezbędne są wysokiej jakości kardiomiocyty do wykonywania pomiarów typu patch-clamp. W tym miejscu opisano metodę izolacji mysich miocytów przedsionków i komór za pomocą wstecznej perfuzji Langendorffa opartej na enzymach, która umożliwia jednoczesne pomiary stanów przejściowych wapnia i prądu wapniowego typu L.

Izolacja wysokiej jakości mysich miocytów przedsionkowych i komorowych do jednoczesnych pomiarów stanów nieustalonych Ca2+ i prądu wapniowego typu L

Ten protokół opisuje modyfikacje metody Langendorffa, w tym głębokość kaniulacji aorty do jednoczesnej izolacji miocytów przedsionkowych i komorowych od dorosłych myszy.

Modyfikacje metody Langendorffa do jednoczesnej izolacji miocytów przedsionkowych i komorowych od dorosłych myszy

Poznaj niezawodną metodę izolacji kardiomiocytów myszy bez aparatu Langendorffa. Technika ogranicza czas niedokrwienia dzięki perfuzji in vivo i zapewnia wysoką wydajność komórek.

Prosta i skuteczna metoda konsekwentnego izolowania kardiomiocytów myszy

Przeglądaj więcej filmów