Poprawa odtwarzalności w celu uzyskania minimalnych informacji do badań pęcherzyków zewnątrzkomórkowych Wytyczne z 2018 r. dotyczące analizy śledzenia nanocząstek

Protokół ten został opracowany dla początkujących operatorów NanoSight LM10. Postępując zgodnie z instrukcjami krok po kroku, można uzyskać dokładne i powtarzalne wyniki. Ta technika pomaga zapewnić spójne wyniki w wielu seriach próbnych, niezależnie od poziomu umiejętności użytkownika.

Charakterystyka nanocząstek, a zwłaszcza kwantyfikacja, nadal stanowi wyzwanie w dziedzinie badań nad pęcherzykami zewnątrzkomórkowymi. Protokół ten pozwala na analizę spójnej wielkości i stężenia nanocząstek w zawiesinie. Zacznij od wyczyszczenia szklanych powierzchni modułu laserowego za pomocą dobrej jakości środka do czyszczenia soczewek i papieru do soczewek.

Przed montażem modułu należy upewnić się, że uszczelka O-ring jest prawidłowo osadzona w rowku pokrywy komory przepływowej. Następnie umieść pokrywę kuwety przepływowej na module laserowym, upewniając się, że styki elektryczne są we właściwej orientacji. Następnie umieść cztery sprężynowe radełkowane przez płytkę komory przepływowej i zamocuj gwinty modułu laserowego bez indywidualnego dokręcania.

Wywierając równomierny nacisk na pokrywę komory przepływowej, równomiernie dokręcaj skrzydełkowe naprzemiennie po przekątnej, aż będą dobrze dopasowane. Przepłukać trzy razy dwie jednomililitrowe strzykawki tuberkulinowe z adapterami z blokadą ślizgową jednym mililitrem DPBS. Wyjąć i wyrzucić tłok z pierwszej strzykawki tuberkulinowej przed włożeniem strzykawki do pozostałego portu, który ma służyć jako opróżniony rozcieńczalnik lub zbiornik na próbkę.

Następnie napełnij drugą strzykawkę jednym mililitrem DPBS i przymocuj ją do portu wlotowego pokrywy komory przepływowej. Trzymaj moduł laserowy przechylony z wylotowym portem strzykawki podniesionym, aby umożliwić usunięcie powietrza z komory, gdy DPBS jest powoli wstrzykiwany do modułu laserowego. Przepłucz pozostały DPBS z modułu laserowego, wstrzykując jeden mililitr powietrza do portu wlotowego.

Powtórz płukanie dwukrotnie. Po ostatnim spłukiwaniu opróżnij moduł laserowy tak całkowicie, jak to możliwe i załaduj moduł do ustawiania ostrości i pozycjonowania. Otwórz oprogramowanie.

Na karcie przechwytywania w lewym górnym rogu kliknij uruchom kamerę. Jeśli kamera wyłączy się automatycznie po pięciu minutach, kliknij przycisk uruchom kamerę, aby ją ponownie uruchomić. W tej samej zakładce dostosuj poziom kamery od 14 do 16, aby rozjaśnić linię lasera i uprościć identyfikację cząstek oraz ostrość.

Przesuwając górny suwak po lewej stronie głowicy do środka lub na zewnątrz, przekieruj obraz z aparatu do okularów. W polu view znajdź obszar o zwiększonej gęstości, określany jako odcisk palca i środek, a następnie ustaw ostrość odcisk palca w pionie. W polu view wyśrodkuj linię lasera, a następnie przesuń górny suwak, aby skierować światło do kamery, jak zaobserwowano na ekranie komputera.

Obraz na ekranie komputera jest odbiciem lustrzanym z widoku w okularach mikroskopu. Dostosuj ostrość, aby wyostrzyć obraz pojedynczych poruszających się cząstek na ekranie za pomocą pokrętła ostrości. Aby załadować próbki, należy pobrać jeden mililitr próbki do wypłukanej strzykawki tuberkulinowej o pojemności jednego mililitra i przymocować strzykawkę do portu wlotowego pokrywy komory przepływowej.

Przesuwaj tłok, aż płyn stanie się widoczny w otwartej strzykawce podłączonej do portu wylotowego. Moduł powinien być przechylony, aby umożliwić usunięcie powietrza z modułu laserowego. W widoku kamery przesuń ostrość na prawo od linii lasera na obszar o jednolitej liczbie cząstek.

Dostosuj orientację pionową, aby wyśrodkować poziome pasma światła i ponownie ustawić ostrość, aż w polu widzenia znajdzie się największa liczba cząstek. Upewnij się, że pozycja ostrości jest spójna dla wszystkich kolejnych miar. Dostosuj poziom kamery do punktu, w którym ciemny symbol informacyjny z przerwami w prawym górnym rogu kamery view.

W przypadku analizy śledzenia nanocząstek (NTA) ustaw czas trwania na 30 lub 60 sekund, a liczbę filmów na pięć. Aby zmienić istniejącą podstawową nazwę pliku, kliknij kartę nowej lokacji magazynu dla wygenerowanych danych o nowej nazwie pliku. Następnie zaznacz pole temperatury docelowej, aby wprowadzić żądaną temperaturę i kliknij utwórz skrypt, aby ponownie użyć standardowego pomiaru.

Gdy przykład zostanie załadowany, a eksperyment będzie gotowy do uruchomienia, kliknij pozycję Utwórz i uruchom skrypt. Na wyskakującym ekranie ustawiania szczegółów raportu wypełnij pola niezbędnymi informacjami o operatorze, próbce i rozcieńczalniku. Po wypełnieniu wszystkich żądanych pól kliknij przycisk Ustawienia OK, aby zainicjować skrypt.

Przed każdym nagraniem wideo poszukaj monitu, aby ręcznie przesunąć tłok. Wstrzyknąć około 0,05 mililitra próbki do komory laserowej. Gdy cząstki zatrzymają się, kliknij przycisk OK. Po zakończeniu piątego przechwytywania wideo pojawi się okno potwierdzenia ustawień wraz z oknem procesu.

Ponieważ klatki są przesuwane ręcznie od dołu ekranu wideo, zwróć uwagę na liczbę niebieskich krzyżyków tworzących cząstki na ekranie i ustaw próg wykrywania dla przetwarzania próbki. Poczekaj, aż filmy zostaną automatycznie przetworzone w histogramie wyników, zanim zostanie wyświetlone powiadomienie o zakończeniu w oknie dialogowym, a następnie naciśnij OK. Po wyświetleniu okna ustawień eksportu zapisz wyniki, klikając przycisk eksportuj. Wyróżnij wszystkie pięć filmów z nagraniami wideo wymienionych w bieżącym eksperymencie.

Następnie kliknij Przetwarzaj wybrane pliki i poczekaj, aż w oknie procesu pojawi się okno potwierdzenia ustawienia, aby migać, aby zmienić próg wykrywania, a następnie dostosuj próg wykrywania do żądanego poziomu i przejdź do ustawień i kliknij OK. Filmy zostaną przetworzone automatycznie w postaci histogramu wyników i zostanie wyświetlone powiadomienie o zakończeniu w oknie dialogowym. Kliknij OK.In reprezentatywną analizę, wyświetlane są wyniki analizy nanośledzenia lub NTA dla próbek liposomów i reprezentatywnego rozcieńczalnika DPBS. Przefiltrowane próbki miały średnią średnicę cząstek 108 nanometrów i stężenie 7,4 razy 10 do ósmych cząstek na mililitr.

Natomiast niefiltrowane próbki miały średnią średnicę cząstek 159 nanometrów i stężenie 7,6 razy 10 do ósmych cząstek na mililitr. Na połączonych poziomach kamer, gdy próg wykrywania został zwiększony z dwóch do pięciu, średnia i modna wielkość cząstek wykazała znaczny spadek rozmiarów cząstek w przefiltrowanych próbkach. Stężenia cząstek na połączonych poziomach kamer zmniejszały się wraz ze wzrostem progu wykrywalności.

Nie stwierdzono istotnej różnicy w stężeniach cząstek między próbkami filtrowanymi i niefiltrowanymi. Przy łączonych progach wykrywania, wraz ze wzrostem poziomu kamery z 12 do 14, odnotowano spadek średniej i modowej wielkości cząstek w przefiltrowanych próbkach. Stężenie cząstek przy łącznych progach wykrywania wzrastało wraz ze wzrostem poziomu kamery z 12 do 14.

Nie zaobserwowano istotnych różnic między próbkami filtrowanymi i niefiltrowanymi. Kroki od 4.1 do 5.2 są ważne, aby znaleźć właściwy obszar wyświetlania. Osiągnięcie spójnych wyników w wielu seriach próbnych zależy od tej powtarzalnej umiejętności.

Dynamiczne rozpraszanie światła jest często stosowane jako uzupełnienie analizy śledzenia nanocząstek, przede wszystkim w celu uzyskania potencjału zeta, który jest ładunkiem powierzchniowym cząstek. W przypadku analizy nanocząstek, NTA nadal jest bardzo cenną metodą oznaczania ilościowego cząstek przydatną do badań pęcherzyków zewnątrzkomórkowych.