Name: Poprawa odtwarzalności w celu uzyskania minimalnych informacji do badań pęcherzyków zewnątrzkomórkowych Wytyczne z 2018 r. dotyczące analizy śledzenia nanocząstek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Poznaj protokół analizy śledzenia nanocząstek NTA do charakteryzacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. Metoda zapewnia powtarzalne wyniki niezależnie od umiejętności operatora.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca była wspierana przez stan Kansas do Midwest Institute for Comparative Stem Cell Biology (MICSCB), Johnson Cancer Research Center do MLW i NIH R21AG066488 do LKC. OLS otrzymał wsparcie GRA od MICSCB. Autorzy dziękują dr Santoshowi Aryalowi za dostarczenie liposomów użytych w tym projekcie oraz członkom laboratoriów Weiss i Christenson za pomocne rozmowy i informacje zwrotne. Dziękuję doktorowi Hong He za wsparcie techniczne. MLW dziękuje Betti Goren Weiss za jej wsparcie i rady.

<ol><li>Lotvall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+experimental+requirements+for+definition+of+extracellular+vesicles+and+their+functions%3A+a+position+statement+from+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).</li>
<li>Thery, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+%28MISEV2018%29%3A+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).</li>
<li>Consortium, E. -T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EV-TRACK%3A+transparent+reporting+and+centralizing+knowledge+in+extracellular+vesicle+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">EV-TRACK: transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research.</a> Nature Methods. 14 (3), 228-232 (2017).</li>
<li>Gardiner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+used+for+the+isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicles%3A+results+of+a+worldwide+survey%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 5, 32945(2016).</li>
<li>Maas, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Possibilities+and+limitations+of+current+technologies+for+quantification+of+biological+extracellular+vesicles+and+synthetic+mimics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Possibilities and limitations of current technologies for quantification of biological extracellular vesicles and synthetic mimics.</a> Journal of Controlled Release. 200, 87-96 (2015).</li>
<li>Danaei, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+particle+size+and+polydispersity+index+on+the+clinical+applications+of+lipidic+nanocarrier+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Impact of particle size and polydispersity index on the clinical applications of lipidic nanocarrier systems.</a> Pharmaceutics. 10 (2), 57(2018).</li>
<li>Kestens, V., Bozatzidis, V., De Temmerman, P. J., Ramaye, Y., Roebben, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+a+particle+tracking+analysis+method+for+the+size+determination+of+nano-+and+microparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nanoparticle+Research%22%5BJournal%5D)">Validation of a particle tracking analysis method for the size determination of nano- and microparticles.</a> Journal of Nanoparticle Research. 19 (8), 271(2017).</li>
<li>Filipe, V., Hawe, A., Jiskoot, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+evaluation+of+nanoparticle+tracking+analysis+%28NTA%29+by+NanoSight+for+the+measurement+of+nanoparticles+and+protein+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">Critical evaluation of nanoparticle tracking analysis (NTA) by NanoSight for the measurement of nanoparticles and protein aggregates.</a> Pharmaceutical Research. 27 (5), 796-810 (2010).</li>
<li>Hole, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interlaboratory+comparison+of+size+measurements+on+nanoparticles+using+nanoparticle+tracking+analysis+%28NTA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nanoparticle+Research%22%5BJournal%5D)">Interlaboratory comparison of size measurements on nanoparticles using nanoparticle tracking analysis (NTA).</a> Journal of Nanoparticle Research. 15 (12), 2101(2013).</li>
<li>Malvern analytical Ltd. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22NanoSight+LM10+Operating+Manual-P550H%22">NanoSight LM10 Operating Manual-P550H</a>. , (2013).</li>
<li>Kim, A., Ng, W. B., Bernt, W., Cho, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+size+estimation+of+nanoparticle+tracking+analysis+on+polydisperse+macromolecule+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Validation of size estimation of nanoparticle tracking analysis on polydisperse macromolecule assembly.</a> Scientific Reports. 9 (1), 2639(2019).</li>
<li>Gollwitzer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+techniques+for+size+measurement+of+nanoparticles+in+cell+culture+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Methods%22%5BJournal%5D)">A comparison of techniques for size measurement of nanoparticles in cell culture medium.</a> Analytical Methods. 8 (26), 5272-5282 (2016).</li>
<li>vander Pol, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+size+distribution+of+exosomes+and+microvesicles+determined+by+transmission+electron+microscopy%2C+flow+cytometry%2C+nanoparticle+tracking+analysis%2C+and+resistive+pulse+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">Particle size distribution of exosomes and microvesicles determined by transmission electron microscopy, flow cytometry, nanoparticle tracking analysis, and resistive pulse sensing.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12 (7), 1182-1192 (2014).</li>
</ol>

Żaden z autorów nie pozostaje w konflikcie interesów.

Dostępnych jest kilka metod szacowania wielkości i stężenia nanocząstek11. Należą do nich metody zespołowe, które generują oszacowanie wielkości populacji, w tym dynamiczne rozpraszanie światła (DLS), sedymentacja odśrodkowa i analiza na poziomie pojedynczej cząstki - mikroskopia elektronowa, NTA, mikroskopia sił atomowych i przestrajalne wykrywanie impulsów rezystancyjnych. Spośród nich DLS i NTA są szeroko stosowanymi, nieniszczącymi metodami pomiaru wielkości i stężenia, opartymi na ruchu Brown...

Dokładna i powtarzalna analiza EV oraz innych cząstek w skali nanometrycznej stanowi liczne wyzwanie zarówno w badaniach naukowych, jak i w przemyśle. Replikacja badań nad EV była utrudniona, częściowo ze względu na brak jednolitości w raportowaniu niezbędnych parametrów związanych z gromadzeniem danych. Aby zaradzić tym brakom, ISEV zaproponowało wytyczne branżowe jako minimalny zestaw standardów biochemicznych, biofizycznych i funkcjonalnych dla badaczy EV, publikując je w formie oświadczenia stanowiskowego, powszechnie znanego jako MISEV20141. Przyspieszające tempo badań nad EV wymagało zaktualizowania wytycznych, w związku z czym „MISEV2018: a position statement of the ISEV” rozszerzyło wytyczne MISEV20142. Publikacja MISEV2018 zawierała tabele, zarysy sugerowanych protokołów oraz kroki, które należy podjąć w celu udokumentowania specyficznej charakterystyki związanej z EV. Jako kolejny środek mający na celu ułatwienie interpretacji i replikacji eksperymentów, opracowano EV-TRACK jako bazę wiedzy opartą na crowdsourcingu (http://evtrack.org), aby umożliwić bardziej przejrzyste raportowanie biologii EV oraz metodologii stosowanej w publikowanych wynikach3. Pomimo tych zaleceń dotyczących standaryzowanego raportowania metod, dziedzina ta nadal boryka się z problemami w zakresie replikacji i potwierdzania opublikowanych wyników.
W zgodzie z dążeniami National Institutes of Health oraz National Science Foundation do opracowania narzędzi oceny jakości, niniejsza praca sugeruje, że ISEV wymaga standaryzowanego raportowania metod i szczegółów, aby możliwe było zastosowanie narzędzi oceny danych w celu replikacji wyników między laboratoriami. Raportowanie źródeł komórek, procedur hodowli komórkowych oraz metod izolacji EV są istotnymi czynnikami określającymi cechy populacji EV. W przypadku instrumentów NTA czynniki takie jak ustawienia detekcji, współczynnik załamania światła cieczy nośnej, heterogeniczne populacje cząstek przyczyniające się do polidyspersyjności, brak ujednoliconych wymagań dotyczących raportowania oraz brak wyników pomiarów wewnątrz- i międzyobserwatorami sprawiają, że porównanie NTA między laboratoriami jest trudne lub niemożliwe.
NTA, stosowana od 2006 roku, jest popularną metodą określania wielkości i stężenia nanocząstek, z której korzysta obecnie około 80% badaczy EV4. Wytyczne MISEV2018 wymagają zastosowania dwóch form analizy pojedynczych pęcherzyków, z których NTA jest jedną z popularnych opcji. NTA pozostaje w powszechnym użyciu w charakterystyce EV ze względu na szeroką dostępność, niski koszt analizy pojedynczej próbki oraz prostą teorię podstawową (równanie Stokesa-Einsteina). Ocena EV za pomocą NTA generuje rozkład wielkości cząstek i szacunkowe stężenie z wykorzystaniem rozpraszania światła laserowego oraz analizy ruchu Browna, przy czym dolna granica detekcji jest określona przez współczynnik załamania światła EV. Przy użyciu próbki płynnej o znanej lepkości i temperaturze śledzone są trajektorie EV w celu określenia ich średniokwadratowego przesunięcia w dwóch wymiarach. Pozwala to na obliczenie współczynnika dyfuzji cząstek i przeliczenie go na hydrodynamiczną średnicę ekwiwalentu sferycznego za pomocą zmodyfikowanego równania Stokesa-Einsteina5,6,7. Analiza cząstka po cząstce w NTA wykazuje mniejsze zakłócenia spowodowane przez aglomeraty lub większe cząstki w heterogennej populacji EV niż inne metody charakterystyki7. Choć kilka większych cząstek ma minimalny wpływ na dokładność pomiaru wielkości, obecność nawet śladowych ilości dużych cząstek o wysokim rozpraszaniu światła prowadzi do zauważalnego zmniejszenia detekcji mniejszych cząstek ze względu na utrudnione wykrywanie i śledzenie EV przez oprogramowanie8. Jako technika pomiarowa NTA jest ogólnie uznawana za nieobciążoną w stronę większych cząstek lub agregatów cząstek i może rozdzielać populacje o różnych rozmiarach poprzez analizę pojedynczych cząstek9. Ze względu na wykorzystanie rozpraszania światła przez cząstki, jednym z ograniczeń analizy NTA jest fakt, że wszelkie zanieczyszczenia cząsteczkowe, takie jak kurz, plastik lub proszek o podobnych właściwościach załamania i rozmiaru w porównaniu do EV, nie mogą zostać odróżnione od rzeczywistych EV za pomocą tej metody charakterystyki.
Urządzenia NanoSight LM10 (analizator wielkości nanocząstek) i LM14 (moduł laserowy) są sprzedawane od 2006 roku i choć opracowano nowsze modele tego instrumentu, ten konkretny model znajduje się w wielu placówkach badawczych i jest uważany za niezawodny sprzęt roboczy. Szkolenie jest niezbędne, aby prawidłowo zoptymalizować ustawienia NTA dla pomiarów wielkości i stężenia o wysokiej rozdzielczości. Dwiema ważnymi ustawieniami niezbędnymi do optymalnych nagrań wideo są (1) poziom kamery oraz (2) próg detekcji. Muszą one zostać ustawione przez operatora na podstawie charakterystyki próbki. Jednym z głównych ograniczeń analizy NTA jest zalecenie stosowania stężeń próbek od 107 do 109 cząstek/mL; aby to osiągnąć, może być wymagane rozcieńczenie próbki10. Roztwory stosowane do rozcieńczania, takie jak solanka fosforanowa (PBS), solanka 0,15 M lub woda ultrapure, rzadko są całkowicie wolne od cząstek o wielkości mniejszej niż 220 µm, co może wpływać na pomiary NTA. Charakterystyka NTA roztworów stosowanych do rozcieńczania powinna być przeprowadzona przy tym samym poziomie kamery i progu detekcji, co w przypadku analizowanych próbek nanocząstek. Wielkość i stężenie nanocząstek obecnych w rozcieńczalnikach stosowanych do rozcieńczania próbek EV rzadko są uwzględniane w publikacjach dotyczących analizy NTA w odniesieniu do EV.
Niniejszy protokół wykorzystuje analizę NTA syntetycznych liposomów przypominających EV, ocenianych przy użyciu wybranych poziomów czułości kamery, progów detekcji oraz mechanicznego filtrowania próbek, w celu analizy systematycznego wpływu poziomu kamery, progu detekcji lub filtracji próbki na zestaw danych NTA. Liposomy zsyntezowano zgodnie z opisem w Pliku uzupełniającymS1. W tym eksperymencie wykorzystano syntetyczne liposomy ze względu na ich jednolitość rozmiaru, właściwości fizyczne oraz stabilność podczas przechowywania w temperaturze 4 °C. Choć można było użyć rzeczywistych próbek EV, heterogenność i stabilność EV podczas przechowywania mogłyby skomplikować to badanie i jego interpretację. Podobieństwa w raportach NTA dla (A) liposomów i (B) EV wskazują, że efekty systematyczne ujawnione dla liposomów w niniejszej pracy prawdopodobnie będą miały zastosowanie również do charakterystyki EV (Rycina 1). Wspólnie znaleziska te potwierdzają tezę, że pełne raportowanie krytycznych ustawień oprogramowania oraz opis przygotowania próbki, taki jak rodzaj rozcieńczalnika, stopień rozcieńczenia i filtracja, wpływają na powtarzalność danych NTA.
Celem niniejszej pracy jest wykazanie, że zmiana ustawień NTA (temperatury, poziomu kamery oraz progu detekcji) i przygotowania próbki wpływa na zbierane wyniki: uzyskano systematyczne, istotne różnice w wielkości i stężeniu. Ponieważ NTA jest jedną z popularnych metod spełnienia specyfikacji charakterystyki MISEV2018, wyniki te wskazują na znaczenie raportowania przygotowania próbek oraz ustawień NTA w celu zapewnienia powtarzalności.
<img alt="Raporty z analizy śledzenia nanocząstek; rozkład wielkości i wykresy stężenia próbek liposomów/EV." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63059/63059fig01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Reprezentatywne raporty NTA służące do porównania liposomów z EV. (A) Liposomy: nieprzefiltrowana próbka scharakteryzowana za pomocą NTA w dniu 12 marca 2020 r. (B) EV: nieprzefiltrowana próbka scharakteryzowana za pomocą NTA w dniu 26 sierpnia 2021 r. Skróty: NTA = analiza śledzenia nanocząstek; EV = pęcherzyki zewnątrzkomórkowe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63059/63059fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

<table><tbody>Automatyczne probówki wirówkowe <tr><td>pipeterowe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>, stożkowe, Nunc 15 mL</td><td>Thermo Sci.</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Papier</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>do czyszczenia<td>soczewek</td></tr><tr><td>NanoSight LM-10</td><td>Malvern Panalytical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Moduł laserowy NanoSight LM-14</td><td>Malvern Panalytical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanosight NTA Software Ver. 3.2</td><td>Malvern Panalytical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ręczniki</td><td></td><td></td><td></td>papierowe</tr><tr><td>Końcówki do pipet, 1-200 i mikro; L, Filtrowane, Sterylne, Niskowiążące</td><td>końcówki</td> do pipet BioExpress <td>P -3243-200X</td><td></td></tr><tr><td>, 50-1,000 &mikro; L, Filtrowany, Sterylny</td><td>BioExpress</td><td>P-3243-1250</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna, Dulbecco's Phosphate Buffered (No Ca lub Mg)</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Standardy, Transfer lateksowy - 100 nm (3 mL)</td><td>Malvern</td><td>NTA4088</td><td></td></tr><tr><td>Standardy, Transfer lateksowy - 50 nm&nbsp; (3 ml)</td><td></td> Filtr strzykawkowy <td>Malvern</td> NTA4087<td></td></tr><tr><td>, 33 mm, .22 i mikro; m, MCE, sterylna</td><td>marka Fisher</td><td>09-720-004</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka, TB, 1 mL, końcówka poślizgowa</td><td>Becton Dickinson</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Pojemnik</td><td></td><td></td><td></td> na zużyty płyn</tr></tbody></table>

poprawa odtwarzalności w celu uzyskania minimalnych informacji do badań pęcherzyków zewnątrzkomórkowych wytyczne z 2018 r. dotyczące analizy śledzenia nanocząstek

Improving Reproducibility to Meet Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 Guidelines in Nanoparticle Tracking Analysis

Analiza śledzenia nanocząstek (NTA) jest jedną z kilku metod charakteryzacji używanych do badań nad pęcherzykami zewnątrzkomórkowymi (EV) od 2006 roku. Wiele osób uważa, że przyrządy NTA i ich pakiety oprogramowania mogą być łatwo wykorzystywane po minimalnym szkoleniu, a kalibracja rozmiaru jest możliwa we własnym zakresie. Ponieważ zarówno akwizycja NTA, jak i analiza oprogramowania stanowią charakterystykę EV, zostały one omówione w Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 (MISEV2018). Ponadto były one monitorowane w ramach Przejrzystego Raportowania i Centralizacji Wiedzy w Badaniach nad Pęcherzykami Zewnątrzkomórkowymi (EV-TRACK) w celu poprawy niezawodności eksperymentów EV (np. zminimalizowania zmienności eksperymentalnej spowodowanej niekontrolowanymi czynnikami).
Pomimo wysiłków mających na celu zachęcenie do raportowania metod i kontroli, wiele opublikowanych prac badawczych nie informuje o krytycznych ustawieniach potrzebnych do odtworzenia oryginalnych obserwacji NTA. Niewiele prac opisuje charakterystykę NTA kontroli ujemnych lub rozcieńczalników, najwyraźniej zakładając, że dostępne na rynku produkty, takie jak sól fizjologiczna buforowana fosforanami lub ultraczysta woda destylowana, są wolne od cząstek stałych. Podobnie, kontrole pozytywne lub normy wielkości są rzadko zgłaszane przez badaczy w celu weryfikacji wielkości cząstek. Równanie Stokesa-Einsteina obejmuje zmienne lepkości i temperatury próbki w celu określenia przemieszczenia cząstek. Raportowanie stabilnej temperatury w komorze laserowej podczas całego pobierania próbek wideo jest zatem niezbędnym środkiem kontrolnym dla dokładnej replikacji. Filtracja próbek lub rozcieńczalników również nie jest rutynowo raportowana, a jeśli tak, rzadko podaje się specyfikę filtra (producent, materiał membrany, wielkość porów) i warunki przechowywania. Minimalne standardy Międzynarodowego Towarzystwa Pęcherzyków Zewnątrzkomórkowych (ISEV) dotyczące akceptowalnych szczegółów eksperymentalnych powinny obejmować dobrze udokumentowany protokół NTA dotyczący charakterystyki EV. Poniższy eksperyment dostarcza dowodów na to, że protokół analizy NTA musi zostać ustalony przez indywidualnego badacza i włączony do metod publikacji, które wykorzystują charakterystykę NTA jako jedną z opcji spełnienia MISEV2018 wymagań dotyczących charakterystyki pojedynczego pęcherzyka.

Tabela 1 zawiera wyniki analizy wideo NTA dla próbek liposomów (18 filtrowanych i 18 niefiltrowanych) oraz reprezentatywnego rozcieńczalnika DPBS. W niniejszej pracy porównania między dwiema grupami przeprowadzono niezależnie od poziomu kamery lub progu detekcji. Próbki filtrowane charakteryzowały się średnią średnicą cząstek 108,5 nm, modą średnicy cząstek 86,2 nm oraz stężeniem 7,4 × 108 cząstek/mL. W przeciwieństwie do nich, próbki niefiltrowane miały średnią średnicę cząstek 159,1 nm, modę...

Analiza śledzenia nanocząstek (NTA) jest powszechnie stosowaną metodą do charakteryzowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. W artykule przedstawiono parametry eksperymentalne i kontrolne NTA oraz jednolitą metodę analizy i charakterystyki próbek i rozcieńczalników niezbędną do uzupełnienia wytycznych zaproponowanych przez MISEV2018 i EV-TRACK w zakresie odtwarzalności między laboratoriami.

Poprawa odtwarzalności w celu uzyskania minimalnych informacji do badań pęcherzyków zewnątrzkomórkowych Wytyczne z 2018 r. dotyczące analizy śledzenia nanocząstek

Nanoparticle tracking analysis (NTA) has been one of several characterization methods used for extracellular vesicle (EV) research since 2006. Many ...

Protokół ten został opracowany dla początkujących operatorów NanoSight LM10. Postępując zgodnie z instrukcjami krok po kroku, można uzyskać dokładne i powtarzalne wyniki. Ta technika pomaga zapewnić spójne wyniki w wielu seriach próbnych, niezależnie od poziomu umiejętności użytkownika.Charakterystyka nanocząstek, a zwłaszcza kwantyfikacja, nadal stanowi wyzwanie w dziedzinie badań nad pęcherzykami zewnątrzkomórkowymi. Protokół ten pozwala na analizę spójnej wielkości i stężenia nanocząstek w zawiesinie. Zacznij od wyczyszczenia szklanych powierzchni modułu laserowego za pomocą dobrej jakości środka do czyszczenia soczewek i papieru do soczewek.Przed montażem modułu należy upewnić się, że uszczelka O-ring jest prawidłowo osadzona w rowku pokrywy komory przepływowej. Następnie umieść pokrywę kuwety przepływowej na module laserowym, upewniając się, że styki elektryczne są we właściwej orientacji. Następnie umieść cztery sprężynowe radełkowane przez płytkę komory przepływowej i zamocuj gwinty modułu laserowego bez indywidualnego dokręcania.Wywierając równomierny nacisk na pokrywę komory przepływowej, równomiernie dokręcaj skrzydełkowe naprzemiennie po przekątnej, aż będą dobrze dopasowane. Przepłukać trzy razy dwie jednomililitrowe strzykawki tuberkulinowe z adapterami z blokadą ślizgową jednym mililitrem DPBS. Wyjąć i wyrzucić tłok z pierwszej strzykawki tuberkulinowej przed włożeniem strzykawki do pozostałego portu, który ma służyć jako opróżniony rozcieńczalnik lub zbiornik na próbkę.Następnie napełnij drugą strzykawkę jednym mililitrem DPBS i przymocuj ją do portu wlotowego pokrywy komory przepływowej. Trzymaj moduł laserowy przechylony z wylotowym portem strzykawki podniesionym, aby umożliwić usunięcie powietrza z komory, gdy DPBS jest powoli wstrzykiwany do modułu laserowego. Przepłucz pozostały DPBS z modułu laserowego, wstrzykując jeden mililitr powietrza do portu wlotowego.Powtórz płukanie dwukrotnie. Po ostatnim spłukiwaniu opróżnij moduł laserowy tak całkowicie, jak to możliwe i załaduj moduł do ustawiania ostrości i pozycjonowania. Otwórz oprogramowanie.Na karcie przechwytywania w lewym górnym rogu kliknij uruchom kamerę. Jeśli kamera wyłączy się automatycznie po pięciu minutach, kliknij przycisk uruchom kamerę, aby ją ponownie uruchomić. W tej samej zakładce dostosuj poziom kamery od 14 do 16, aby rozjaśnić linię lasera i uprościć identyfikację cząstek oraz ostrość.Przesuwając górny suwak po lewej stronie głowicy do środka lub na zewnątrz, przekieruj obraz z aparatu do okularów. W polu view znajdź obszar o zwiększonej gęstości, określany jako odcisk palca i środek, a następnie ustaw ostrość odcisk palca w pionie. W polu view wyśrodkuj linię lasera, a następnie przesuń górny suwak, aby skierować światło do kamery, jak zaobserwowano na ekranie komputera.Obraz na ekranie komputera jest odbiciem lustrzanym z widoku w okularach mikroskopu. Dostosuj ostrość, aby wyostrzyć obraz pojedynczych poruszających się cząstek na ekranie za pomocą pokrętła ostrości. Aby załadować próbki, należy pobrać jeden mililitr próbki do wypłukanej strzykawki tuberkulinowej o pojemności jednego mililitra i przymocować strzykawkę do portu wlotowego pokrywy komory przepływowej.Przesuwaj tłok, aż płyn stanie się widoczny w otwartej strzykawce podłączonej do portu wylotowego. Moduł powinien być przechylony, aby umożliwić usunięcie powietrza z modułu laserowego. W widoku kamery przesuń ostrość na prawo od linii lasera na obszar o jednolitej liczbie cząstek.Dostosuj orientację pionową, aby wyśrodkować poziome pasma światła i ponownie ustawić ostrość, aż w polu widzenia znajdzie się największa liczba cząstek. Upewnij się, że pozycja ostrości jest spójna dla wszystkich kolejnych miar. Dostosuj poziom kamery do punktu, w którym ciemny symbol informacyjny z przerwami w prawym górnym rogu kamery view.W przypadku analizy śledzenia nanocząstek (NTA) ustaw czas trwania na 30 lub 60 sekund, a liczbę filmów na pięć. Aby zmienić istniejącą podstawową nazwę pliku, kliknij kartę nowej lokacji magazynu dla wygenerowanych danych o nowej nazwie pliku. Następnie zaznacz pole temperatury docelowej, aby wprowadzić żądaną temperaturę i kliknij utwórz skrypt, aby ponownie użyć standardowego pomiaru.Gdy przykład zostanie załadowany, a eksperyment będzie gotowy do uruchomienia, kliknij pozycję Utwórz i uruchom skrypt. Na wyskakującym ekranie ustawiania szczegółów raportu wypełnij pola niezbędnymi informacjami o operatorze, próbce i rozcieńczalniku. Po wypełnieniu wszystkich żądanych pól kliknij przycisk Ustawienia OK, aby zainicjować skrypt.Przed każdym nagraniem wideo poszukaj monitu, aby ręcznie przesunąć tłok. Wstrzyknąć około 0,05 mililitra próbki do komory laserowej. Gdy cząstki zatrzymają się, kliknij przycisk OK. Po zakończeniu piątego przechwytywania wideo pojawi się okno potwierdzenia ustawień wraz z oknem procesu.Ponieważ klatki są przesuwane ręcznie od dołu ekranu wideo, zwróć uwagę na liczbę niebieskich krzyżyków tworzących cząstki na ekranie i ustaw próg wykrywania dla przetwarzania próbki. Poczekaj, aż filmy zostaną automatycznie przetworzone w histogramie wyników, zanim zostanie wyświetlone powiadomienie o zakończeniu w oknie dialogowym, a następnie naciśnij OK. Po wyświetleniu okna ustawień eksportu zapisz wyniki, klikając przycisk eksportuj. Wyróżnij wszystkie pięć filmów z nagraniami wideo wymienionych w bieżącym eksperymencie.Następnie kliknij Przetwarzaj wybrane pliki i poczekaj, aż w oknie procesu pojawi się okno potwierdzenia ustawienia, aby migać, aby zmienić próg wykrywania, a następnie dostosuj próg wykrywania do żądanego poziomu i przejdź do ustawień i kliknij OK. Filmy zostaną przetworzone automatycznie w postaci histogramu wyników i zostanie wyświetlone powiadomienie o zakończeniu w oknie dialogowym. Kliknij OK.In reprezentatywną analizę, wyświetlane są wyniki analizy nanośledzenia lub NTA dla próbek liposomów i reprezentatywnego rozcieńczalnika DPBS. Przefiltrowane próbki miały średnią średnicę cząstek 108 nanometrów i stężenie 7,4 razy 10 do ósmych cząstek na mililitr.Natomiast niefiltrowane próbki miały średnią średnicę cząstek 159 nanometrów i stężenie 7,6 razy 10 do ósmych cząstek na mililitr. Na połączonych poziomach kamer, gdy próg wykrywania został zwiększony z dwóch do pięciu, średnia i modna wielkość cząstek wykazała znaczny spadek rozmiarów cząstek w przefiltrowanych próbkach. Stężenia cząstek na połączonych poziomach kamer zmniejszały się wraz ze wzrostem progu wykrywalności.Nie stwierdzono istotnej różnicy w stężeniach cząstek między próbkami filtrowanymi i niefiltrowanymi. Przy łączonych progach wykrywania, wraz ze wzrostem poziomu kamery z 12 do 14, odnotowano spadek średniej i modowej wielkości cząstek w przefiltrowanych próbkach. Stężenie cząstek przy łącznych progach wykrywania wzrastało wraz ze wzrostem poziomu kamery z 12 do 14.Nie zaobserwowano istotnych różnic między próbkami filtrowanymi i niefiltrowanymi. Kroki od 4.1 do 5.2 są ważne, aby znaleźć właściwy obszar wyświetlania. Osiągnięcie spójnych wyników w wielu seriach próbnych zależy od tej powtarzalnej umiejętności.Dynamiczne rozpraszanie światła jest często stosowane jako uzupełnienie analizy śledzenia nanocząstek, przede wszystkim w celu uzyskania potencjału zeta, który jest ładunkiem powierzchniowym cząstek. W przypadku analizy nanocząstek, NTA nadal jest bardzo cenną metodą oznaczania ilościowego cząstek przydatną do badań pęcherzyków zewnątrzkomórkowych.

improving-reproducibility-to-meet-minimal-information-for-studies

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opisano protokół analizy śledzenia nanocząstek (NTA) i wysokoprzepustowej cytometrii przepływowej do oceny nanocząstek dostarczających geny polimerowe. NTA wykorzystuje się do scharakteryzowania rozkładu wielkości cząstek nanocząstek i rozkładu plazmidu na cząstkę. Wysokoprzepustowa cytometria przepływowa umożliwia ilościową ocenę skuteczności transfekcji dla biblioteki biomateriałów dostarczających geny.

Ocena nanocząstek dostarczających geny polimerowe za pomocą analizy śledzenia nanocząstek i wysokoprzepustowej cytometrii przepływowej

W tym artykule przedstawiono metodę izolacji egzosomów z krwi pełnej i dalszej analizy za pomocą śledzenia nanocząstek za pomocą półautomatycznego instrumentu. Prezentowana technologia zapewnia niezwykle czułą metodę wizualizacji i analizy cząstek w ciekłej zawiesinie.

Innowacyjna metoda kwantyfikacji egzosomów i pomiaru wielkości

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe odgrywają ważną rolę w procesach fizjologicznych i patologicznych, w tym w krzepnięciu, reakcjach immunologicznych i raku, lub jako potencjalne środki terapeutyczne w dostarczaniu leków lub medycynie regeneracyjnej. Protokół ten przedstawia metody kwantyfikacji i charakterystyki wielkości izolowanych i nieizolowanych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w różnych płynach przy użyciu przestrajalnego rezystancyjnego wykrywania impulsów.

Kwantyfikacja i profilowanie wielkości pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą przestrajalnego rezystancyjnego wykrywania impulsów

W tym protokole opisujemy kompletny proces szybkiej izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych od ludzkiej krwi pełnej i charakteryzacji specyficznych markerów za pomocą analizy nanocząstek opartej na fluorescencji. Przedstawione wyniki wykazują wysoki poziom odtwarzalności i mogą być dostosowane do supernatantów z hodowli komórkowych.

Szybka charakterystyka oparta na fluorescencji pojedynczych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w ludzkiej krwi z analizą śledzenia nanocząstek

Egzosom to nowa generacja nośników leków. Opracowaliśmy protokół izolacji egzosomów o wysokiej wydajności i czystości dostarczania siRNA. Otorbiliśmy również znakowane fluorescencyjnie niespecyficzne siRNA do egzosomów i zbadaliśmy wychwyt komórkowy egzosomów obciążonych siRNA w komórkach nowotworowych.

Przygotowanie egzosomów do dostarczania siRNA do komórek nowotworowych

Kliniczne tłumaczenie biomarkerów pochodzących z egzosomów dla chorych i złośliwych komórek jest utrudnione przez brak szybkich i dokładnych metod kwantyfikacji. W niniejszym raporcie opisano wykorzystanie obrazów mikroskopowych ciemnego pola o małym powiększeniu do ilościowego oznaczania określonych podtypów egzosomów w próbkach surowicy lub osocza o małej objętości.

Wykorzystanie rozpraszania wzmocnionego nanoplazmonem i obrazowania mikroskopowego w małym powiększeniu do ilościowego określenia egzosomów pochodzących z guza

Opisany tutaj protokół ma na celu zmierzenie hydrodynamicznej średnicy sferycznych nanocząstek, a dokładniej nanocząstek złota, w środowisku wodnym za pomocą analizy śledzenia nanocząstek (NTA). Ta ostatnia polega na śledzeniu ruchu cząstek spowodowanym ruchami Browna i implementacji równania Stokesa-Einsteina w celu uzyskania średnicy hydrodynamicznej.

Analiza nanocząstek nanocząstek złota w środowisku wodnym poprzez porównanie międzylaboratoryjne

Pokazujemy, jak używać nowatorskiego instrumentu do analizy śledzenia nanocząstek, aby oszacować rozkład wielkości i całkowite stężenie cząstek pęcherzyków zewnątrzkomórkowych wyizolowanych z mysiej tkanki tłuszczowej okołokomórkowej i ludzkiego osocza.

Analiza śledzenia nanocząstek w celu ilościowego określenia i określenia wielkości pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Obecny protokół opisuje metodę ekstrakcji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z krwi obwodowej i tkanek stałych z późniejszym profilowaniem antygenów powierzchniowych i ładunków białkowych.

Izolacja i analiza identyfikowalnych i funkcjonalizowanych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z osocza i tkanek stałych

Najnowsza generacja narzędzi do charakteryzacji EV jest w stanie przeprowadzić pojedynczą analizę EV dla wielu parametrów jednocześnie. Cytometria nanoprzepływowa mierzy wszystkie cząstki biologiczne większe niż 45 nm bez znakowania i identyfikuje specyficzne cechy subpopulacji za pomocą różnych technik znakowania fluorescencyjnego.

Charakterystyka białka transbłonowego pojedynczego pęcherzyka zewnątrzkomórkowego za pomocą cytometrii nanoprzepływowej

Ten artykuł proponuje nową generację wieloparametrycznych platform analitycznych o zwiększonej przepustowości do charakterystyki podzbiorów pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. Metoda opiera się na połączeniu multipleksowanych metod biodetekcji z analizami metrologicznymi i morfomechanicznymi za pomocą mikroskopii sił atomowych, w połączeniu ze spektroskopią Ramana, w celu kwalifikacji celów pęcherzykowych uwięzionych na biochipie mikromacierzy.

Multimodalna platforma analityczna na multipleksowanym chipie do obrazowania powierzchniowego rezonansu plazmonowego do analizy podzbiorów pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Poznaj protokół analizy śledzenia nanocząstek NTA do charakteryzacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. Metoda zapewnia powtarzalne wyniki niezależnie od umiejętności operatora.

Poprawa odtwarzalności w celu uzyskania minimalnych informacji do badań pęcherzyków zewnątrzkomórkowych Wytyczne z 2018 r. dotyczące analizy śledzenia nanocząstek (Wideo) | JoVE Journal

Poprawa odtwarzalności w celu uzyskania minimalnych informacji do badań pęcherzyków zewnątrzkomórkowych Wytyczne z 2018 r. dotyczące analizy śledzenia nanocząstek

Przeglądaj więcej filmów