Zastosowanie fioletu krystalicznego w celu poprawy wizualnego odczytu opartego na efekcie cytopatycznym do miareczkowania wirusów przy użyciu testów TCID50
12 lutego 2022
Ten protokół pokazuje dokładne i obiektywne podejście do wizualizacji miareczkowania wirusa za pomocą fioletu krystalicznego, porównując go z mikroskopią optyczną i barwieniem immunocytochemicznym.
Celem tego protokołu jest uzyskanie miareczkowania zapasu wirusa i jego wizualizacja za pomocą barwienia fioletem krystalicznym. W tym celu zostanie zademonstrowane ogólne miareczkowanie wirusa, a następnie barwienie. Miareczkowanie to będzie przeprowadzane na 96-dołkowej płytce przez okres siedmiu dni w komorze bezpieczeństwa biologicznego w laboratorium o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2.
Aby to zrobić, 96-dołkowa płytka preferowanej linii komórkowej zostanie wysiana przy użyciu odpowiedniego podłoża i pozostawiona do wzrostu aż do zlewania się. Zapas wirusa zostanie rozcieńczony przy użyciu dziesięciokrotnych rozcieńczeń, przez zmieszanie 900 mikrolitrów pożywki i 100 mikrolitrów wirusa lub odpowiednie rozcieńczenie. Upewnij się, że każda probówka jest wirowana, aby zapewnić prawidłowe wymieszanie pożywki i wirusa oraz uniknąć błędów w rozcieńczeniach.
W leadzie napisz układ swojej płytki, a także każde rozcieńczenie, aby pomóc podczas procesu infekcji. Przed infekcją przemyć 200 mikrolitrami PBS. Dodaj 50 mikrolitrów swojego inokulum do odpowiednich studzienek.
Następnie inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 przez siedem dni. Po siedmiodniowej inkubacji przemyć 200 mikrolitrami PBS. Utrwal komórki, dodając 50 mikrolitrów PFA na studzienkę o stężeniu 4% w PBS i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
Po inkubacji ponownie umyć komórki dwukrotnie 200 mikrolitrami PBS przed dodaniem 50 mikrolitrów fioletu krystalicznego na studzienkę w wodzie i inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Na koniec odessać fiolet krystaliczny ze studzienek i opcjonalnie pozostawić płytki do wyschnięcia na powietrzu przez dwie do pięciu minut w temperaturze pokojowej lub umyć je 200 mikrolitrami wody, aby usunąć nadmierną plamę przed wizualizacją. W rezultacie, po ponownym zabarwieniu, ujemne komórki zostaną wybarwione.
Dodatnie studnie zostaną wyczyszczone. Informacje te zostaną wykorzystane w jednej z dwóch opisanych formuł do obliczenia ostatecznego miana wirusa. Kiedy porównano miano uzyskane za pomocą każdej metody, okazało się, że w monocytochemii barwienie może w niektórych przypadkach wykryć dodatkowe dołki dodatnie w porównaniu z fioletem krystalicznym, i że podobnie obie metody barwienia mogą wykryć więcej dodatnich dołków niż ocena wizualna za pomocą mikroskopii.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten protokół demonstruje dokładną metodę wizualizowania titracji wirusów przy użyciu barwienia fioletem kryształowym. Porównuje tę metodę z mikroskopią optyczną i barwieniem immunocytochemicznym.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- Wirologia
- Biologia komórki
- Techniki laboratoryjne
Tło
- Titracja wirusów jest niezbędna do ilościowego określania zasobów wirusów.
- Barwienie fioletem kryształowym zapewnia wizualną reprezentację obecności wirusów.
- Porównywalne metody obejmują mikroskopię optyczną i barwienie immunocytochemiczne.
- Właściwe techniki rozcieńczania są kluczowe dla dokładnych wyników.
Cel badania
- Wykonanie titracji zasobu wirusa.
- Wizualizacja titracji za pomocą barwienia fioletem kryształowym.
- Zapewnienie dokładności w metodach ilościowego określania wirusów.
Stosowane metody
- Zasiew preferowanej linii komórkowej na płytce 96-dołkowej.
- Wykonanie dziesięciokrotnych rozcieńczeń zasobu wirusów.
- Wirtowanie każdego rozcieńczenia dla prawidłowego mieszania.
- Barwienie fioletem kryształowym po siedmiodniowym okresie inkubacji.
Główne wyniki
- Udane wizualizowanie titracji wirusów za pomocą fioletu kryształowego.
- Porównanie z innymi metodami barwienia wykazało spójność.
- Osiągnięto dokładne ilościowe określenie zasobu wirusów.
- Protokół zapewnia niezawodną metodę dla przyszłych badań.
Wnioski
- Barwienie fioletem kryształowym jest skuteczną metodą wizualizowania titracji wirusów.
- Protokół poprawia dokładność ilościowego określania wirusów.
- Kolejne badania mogą opierać się na tej metodzie dla różnych zastosowań.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Accurate viral titration is critical for antiviral screening and vaccine development, where inconsistent CPE detection can compromise lead identification and go/no-go decisions. Crystal violet staining offers a cost-effective, reproducible alternative to immunocytochemical staining, improving assay standardization and reducing variability in early discovery workflows. This supports predictive confidence in antiviral efficacy assessments and enables scalable, high-throughput TCID50-based screening for CPE-forming viruses.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables objective quantification of viral infectivity, reducing reliance on subjective microscopy and supporting mechanistic de-risking of antiviral targets.
- Operational Value: Provides a rapid, low-cost staining method that increases assay throughput and reproducibility in antiviral hit validation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates clear, quantifiable endpoints for TCID50 assays, improving signal-to-noise ratio in compound screening campaigns.
- Operational Value: Eliminates need for expensive ICC reagents, lowering cost per assay and enabling broader application across antiviral discovery platforms.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Delivers consistent viral titer measurements across studies, supporting reliable dose-response modeling in preclinical efficacy studies.
- Operational Value: Facilitates cross-lab standardization of viral stock preparation, reducing inter-experimental variability in IND-enabling studies.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the antiviral discovery continuum from early hit confirmation to lead optimization, where accurate viral titration informs structure-activity relationships and resistance profiling.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by providing reproducible viral challenge models for mechanism-of-action studies.
- Screening: Delivers standardized, quantifiable outputs essential for hit-to-lead progression in antiviral screening cascades.
- Analytics: Enables precise calculation of TCID50 values, allowing accurate comparison of compound potency across experimental conditions.
- Translational Research: Ensures continuity from in vitro antiviral screening to in vivo challenge models through consistent viral stock quantification.
- Enterprise Reuse: Represents a scalable, low-cost capability applicable across multiple viral targets and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in antiviral efficacy by reducing false negatives from visual CPE assessment.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability of TCID50 assays through simplified, standardized staining.
- Strategic Value: Improves capital efficiency in antiviral programs by lowering assay costs without sacrificing data quality.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement decisions by providing reliable viral titer data for go/no-go criteria.
Implementation Considerations
- Requires basic virology training and aseptic technique for safe virus handling in BSL-2 environments.
- Depends on standard laboratory equipment including incubators, centrifuges, and plate readers for optional quantification.
- Necessitates cross-team agreement on staining duration and wash protocols to ensure inter-lab reproducibility.
- Applicable to adherent cell lines supporting CPE formation; optimization may be needed for non-adherent or non-CPE-inducing viruses.
- Limited to viruses inducing detectable cytopathic effect; not suitable for non-cytopathic or persistent infection models without modification.
