Name: Zastosowanie fioletu krystalicznego w celu poprawy wizualnego odczytu opartego na efekcie cytopatycznym do miareczkowania wirusów przy użyciu testów TCID50 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-12T14:45:00.000+00:00
Duration: 4 min 6 s
Description: Poznaj metodę barwienia fioletem krystalicznym do wizualizacji miareczkowania wirusów w płytkach 96-dołkowych. Technika ta poprawia dokładność oznaczania wirusów w porównaniu z mikroskopią optyczną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują dr Frankowi Scholle za jego pomocne komentarze w manuskrypcie, Chloe Mariant za pomoc przy obrazach mikroskopowych oraz Teresie M. Tiedge za pomocną korektę języka angielskiego.

1. Protokół miareczkowania
UWAGA: Użyj cytopatycznego wirusa infekującego przylegające komórki. Do tej demonstracji wykorzystano wirusa grypy A (IAV) pochodzącego od świń (A/California/07/2009/(H1N1)) oraz wirusa zespołu rozrodczo-oddechowego świń (PRRSV) typu 2, szczep NC 1-7-4.
<ol>
	<li>Miareczkować te wirusy w 96-dołkowych płytkach przez 7 dni w komorze bezpieczeństwa biologicznego znajdującej się w laboratorium o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL-2).
	<ol>
		<li>Aby wykonać te miareczkowania, wysiewaj 96-dołkowe płytki wymaganą linią komórkową. W przypadku PRRSV użyj linii komórkowej MA-104, a w przypadku IAV użyj linii komórkowej MDCK. Do hodowli komórkowej użyj pożywki DMEM uzupełnionej 10% FBS, L-Glutaminą i Penicyliną-Streptomycyną i hoduj komórki do zbieżności.</li>
		<li>Przed infekcją należy przemyć komórki za pomocą 200 μl PBS.</li>
		<li>Rozcieńczyć zapasy wirusa za pomocą serii 10-krotnych rozcieńczeń, mieszając 900 μl pożywki i 100 μl wirusa. Upewnij się, że probówka jest prawidłowo wirowana, aby zapewnić prawidłowe wymieszanie pożywki i wirusa oraz uniknąć błędów rozcieńczenia.</li>
		<li>Zaznacz układ talerza na pokrywie. Umyj studzienki 1x buforem soli fosforanowej (PBS). Dodać 50 μl inokulum do odpowiednich studzienek zgodnie z wcześniej opisanymi metodami miareczkowania2,3.</li>
		<li>Inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 przez 7 dni.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Ocena efektu cytopatycznego (CPE) za pomocą mikroskopii
<ol>
	<li>Po 7-dniowej inkubacji przemyć wszystkie studzienki dwukrotnie 200 μl 1x PBS.</li>
	<li>Oceń wszystkie dołki płytki pod mikroskopem świetlnym, aby wizualnie wykryć CPE. Zarówno w przypadku PRRSV, jak i IAV, ich CPE polega na śmierci komórki, a następnie oderwaniu się od płytki, co prowadzi do rozerwania monowarstwy. Jednak inne wirusy mogą prezentować różne typy CPE.</li>
</ol>
3. Protokół barwienia
UWAGA: Efekt cytopatyczny (CPE) oceniano za pomocą barwienia fioletem krystalicznym.
<ol>
	<li>Po 7-dniowej inkubacji umyj wszystkie studzienki dwukrotnie 200 μl 1x PBS.</li>
	<li>Utrwal komórki, dodając 50 μl / studzienkę 4% paraformaldehydu (PFA) w 1x PBS i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	<li>Po inkubacji przemyć komórki dwukrotnie 200 μl 1x PBS. Następnie dodać 50 μl/studzienkę fioletu krystalicznego rozcieńczonego do 4% w wodzie i inkubować przez 5 minut w temperaturze RT. 
	UWAGA: Krystalicznie fioletowa substancja chemiczna barwi komórki, które pozostają przyczepione do płytki w momencie utrwalania, pozostawiając sekcje studzienki, w których komórki odłączyły się, jako niezabarwione.</li>
	<li>Na koniec odessać fiolet krystaliczny ze studzienek i opcjonalnie pozostawić płytki do wyschnięcia na powietrzu przez 2-5 minut w temperaturze pokojowej lub umyć płytkę 200 μl wody, aby usunąć nadmiar plamy przed wizualizacją.</li>
	<li>Użyj wcześniej opisanych metod, aby matematycznie obliczyć miano. W tym przypadku zastosowano formułę Karbera i formułę Muencha odpowiednio dla PRRSV i IAV2,3. Szczegóły tych równań przedstawiono w sekcji dotyczącej wyników reprezentatywnych.</li>
</ol>
4. Znakowanie immunocytochemiczne (ICC)
UWAGA: Znakowanie immunocytochemiczne dla obu wirusów zostało przeprowadzone zgodnie z wcześniej opisanymi metodami9,10,11.
<ol>
	<li>Po 7-dniowej inkubacji miareczkowania utrwalić komórki za pomocą PFA, jak opisano w kroku 3.2.</li>
	<li>Przemyć płytki roztworem złożonym ze 100 ml 1 M chlorowodorku Tris, 1 g saponiny i 8,5 g NaCl w 900 ml H2O. Następnie wykonaj dwa dodatkowe płukania mieszaniną 1x PBS i 5% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i inkubuj z tym roztworem Tris-Saponin-NaCl w temperaturze pokojowej (RT) przez 20 minut.</li>
	<li>Inkubować wszystkie studzienki z pierwotnym przeciwciałem przez 2 godziny w temperaturze RT. 
	UWAGA: Objętość przeciwciał pierwszorzędowych dla każdego wirusa wynosiła 100 μl i została przygotowana przy użyciu rozcieńczenia 1:300 2% FBS w 1x PBS.</li>
	<li>Umyj komórki dwukrotnie roztworem Tris, Saponiny i NaCl przygotowanym w kroku 4.2.</li>
	<li>Inkubować wszystkie studzienki z przeciwciałem drugorzędowym przez 1 godzinę w temperaturze RT. 
	UWAGA: Objętość przeciwciała drugorzędowego wynosiła 100 μl i została przygotowana przy użyciu rozcieńczenia 1:250 2% FBS w 1x PBS.</li>
	<li>Przemyj komórki rozcieńczeniem Tris, Saponiny i NaCl, jak opisano w kroku 4.2.</li>
	<li>Odessać poprzednie rozcieńczenie i inkubować płytki w roztworze aminoetylokarbazolu (AEC) o stężeniu 200 μl/basenik w końcowym rozcieńczeniu 1:50 w wodzie, postępując zgodnie ze wskazówkami producenta, przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Po inkubacji odrzucić roztwór AEC i dodać 100 μl/basenik 1x PBS do obrazowania za pomocą mikroskopii.</li>
	<li>Matematycznie wyznacz miano zgodnie z opisem w kroku 3.5.</li>
</ol>

<ol><li>Kärber, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+to+the+collective+treatment+of+pharmacological+series+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Naunyn-Schmiedeberg%27s+Archive+for+Experimental+Pathology+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Contribution to the collective treatment of pharmacological series experiments.</a> Naunyn-Schmiedeberg's Archive for Experimental Pathology and Pharmacology. 162 (4), 480-483 (1931).</li>
<li>Ramakrishnan, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+50%25+endpoint+titer+using+a+simple+formula%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Determination of 50% endpoint titer using a simple formula.</a> World Journal of Virology. 5 (2), 85-86 (2016).</li>
<li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+of+estimating+fifty+per+cent+endpoints%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Epidemiology%22%5BJournal%5D)">A simple method of estimating fifty per cent endpoints.</a> American Journal of Epidemiology. 27 (3), 493-497 (1938).</li>
<li>Spearman, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+method+of+right+and+wrong+cases+%28constant+stimuli%29+without+Gauss%27s+formulae%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Psychology%22%5BJournal%5D)">The method of right and wrong cases (constant stimuli) without Gauss's formulae.</a> British Journal of Psychology. 2 (3), 227(1908).</li>
<li>Darling, A. J., Boose, J. A., Spaltro, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus+assay+methods%3A+accuracy+and+validation%5BTitle%5D)+AND+%22Biologicals%22%5BJournal%5D)">Virus assay methods: accuracy and validation.</a> Biologicals. 26 (2), 105-110 (1998).</li>
<li>Kim, J., Chae, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+virus+isolation%2C+polymerase+chain+reaction%2C+immunohistochemistry%2C+and+in+situ+hybridization+for+the+detection+of+porcine+circovirus+2+and+porcine+parvovirus+in+experimentally+and+naturally+coinfected+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Veterinary+Diagnostic+Investigation%22%5BJournal%5D)">A comparison of virus isolation, polymerase chain reaction, immunohistochemistry, and in situ hybridization for the detection of porcine circovirus 2 and porcine parvovirus in experimentally and naturally coinfected pigs.</a> Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 16 (1), 45-50 (2004).</li>
<li>Suchman, E., Blair, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytopathic+effects+of+viruses+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22American+Society+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Cytopathic effects of viruses protocols.</a> American Society of Microbiology. , (2007).</li>
<li>Karakus, U., Crameri, M., Lanz, C., Yángüez, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKarakus%2C+U+%22Influenza+Virus%22">Influenza Virus</a>. , Springer. 59-88 (2018).</li>
<li>Tingstedt, J. -E., Nielsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+immune+responses+in+the+lungs+of+pigs+infected+in+utero+with+PRRSV%3A+an+immunohistochemical+study%5BTitle%5D)+AND+%22Viral+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cellular immune responses in the lungs of pigs infected in utero with PRRSV: an immunohistochemical study.</a> Viral Immunology. 17 (4), 558-564 (2004).</li>
<li>Guarner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+and+in+situ+hybridization+studies+of+influenza+A+virus+infection+in+human+lungs%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical and in situ hybridization studies of influenza A virus infection in human lungs.</a> American Journal of Clinical Pathology. 114 (2), 227-233 (2000).</li>
<li>Nicholls, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+highly+pathogenic+influenza+and+pandemic+influenza+virus+in+formalin+fixed+tissues+by+immunohistochemical+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Detection of highly pathogenic influenza and pandemic influenza virus in formalin fixed tissues by immunohistochemical methods.</a> Journal of Virological Methods. 179 (2), 409-413 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Miareczkowanie wirusów jest rutynowo stosowane w badaniach wirusologicznych, przy czym najczęściej stosuje się wykrywanie PFU i testy TCID50 1,2,3,4. Obie metody polegają na wykrywaniu CPE w zakażonych komórkach i chociaż można je wizualnie ocenić za pomocą mikroskopii, zwykle stosuje się barwienie w celu uzyskania bardziej obiektywnego wyniku lub nawet skrócenia czasu inkubacji. W prz...

Miareczkowanie wirusa za pomocą testu TCID50 jest powszechnie stosowaną techniką w badaniach nad chorobami zakaźnymi1. Chociaż z biegiem czasu zaproponowano różne wersje matematyki stojącej za tą metodą1,2,3,4, obecnie stosowane metody wykrywania infekcji opierają się na wizualnym potwierdzeniu poprzez obecność efektu cytopatycznego (CPE) za pomocą mikroskopii5. Aby bardziej obiektywnie potwierdzić wizualizację CPE w testach TCID50, barwienie wewnątrzkomórkowe immunocytochemiczne (ICC) ukierunkowane na białka wirusa jest jedną z najczęściej stosowanych metod6, ponieważ różne wirusy mogą wytwarzać różne formy CPE. W naszym przypadku zmiany morfologiczne komórek są podobne po zakażeniu zarówno wirusem grypy A (IAV), jak i wirusem zespołu rozrodczo-oddechowego świń (PRRSV), w którym zakażone komórki zaokrąglają się i odrywają od płytki. W przypadku PRRSV powoduje CPE znane jako "całkowite zniszczenie", w którym wszystkie komórki odłączają się od studni. Z drugiej strony, IAV może prezentować zarówno całkowite zniszczenie, jak i dodatkowe CPE znane jako "subtotalne zniszczenie", w którym niewielka liczba komórek nie odłącza się po infekcji7. Technika ta jest jednak czasochłonna w wykonaniu i wymaga użycia stosunkowo kosztownych odczynników. Ważne jest, aby pamiętać, że ICC nie oznacza CPE, ale raczej liczbę komórek, które zostały pomyślnie zainfekowane wirusem. Oznacza to, że komórki, które zostały pomyślnie zakażone pod koniec inkubacji, będą postrzegane jako pozytywne, nawet jeśli infekcja nie spowodowała jeszcze CPE, a zatem oczekuje się wyższego odsetka komórek ICC dodatnich w porównaniu z CPE. Z tego powodu w niniejszym badaniu opisano komplementarną metodę wizualnego wykrywania CPE w teście TCID50 opartym na fiolecie krystalicznym, substancji chemicznej o ładunku dodatnim, która przyczepia się do błon komórkowych i służy do barwienia przylegających komórek. Fiolet krystaliczny jest często wykorzystywany w badaniach wirusologicznych do pomiaru jednostek tworzących płytki nazębne, między innymi8.
W tym badaniu porównujemy czułość wykrywania CPE za pomocą mikroskopii niebarwionej z barwieniem fioletem krystalicznym i barwieniem immunocytochemicznym w oparciu o rozpoznawanie białek wirusowych, które są znane jako bardziej obiektywne ze względu na swoją wysoką czułość. Badanie to pokazuje, że zarówno barwienie fioletem krystalicznym, jak i immunocytochemiczne jest dokładniejsze niż wykrywanie CPE oparte na mikroskopii wzrokowej i może być wykorzystane do obiektywnej identyfikacji zakażonych studzienek w miareczkowaniu TCID50. Biorąc pod uwagę ich zdolność do osiągnięcia prawie identycznego poziomu dokładności w przypadku wirusów cytopatycznych testowanych w liniach komórkowych, fiolet krystaliczny jest przedstawiany jako szybszy i tańszy sposób określania miareczkowania wirusa w teście TCID50. Proponowana metoda wykorzystująca barwienie fioletem krystalicznym zajmuje łącznie 40 minut, z czego 15 minut na inkubację paraformaldehydu (PFA), 5 minut na inkubację fioletu krystalicznego i maksymalnie 15 minut na przygotowanie materiału, płukanie buforem i suszenie. Protokół immunocytochemiczny zastosowany do porównania trwa średnio 4 h 30 min i został przeprowadzony zgodnie z wcześniejszym opisem9,10. Proponowana metoda ma na celu pomoc w wizualizacji zakończonego miareczkowania wirusa. Czas infekcji i inkubacji może być przeprowadzany w różnym układzie w zależności od wirusa. Tutaj przetestowaliśmy dwa wirusy RNA o działaniu cytopatycznym na linie komórkowe.

<table><tbody><tr><td>96-dołkowe płytki do hodowli komórkowych</td><td>Genesee</td><td>25-221</td><td>Przezroczysty, płaskodenny</td></tr><tr><td>roztwór AEC</td><td>Thermo Fisher</td><td>1122</td><td></td></tr><tr><td>Crystal violet</td><td>Thermo Fisher</td><td>C581-25; C581-100</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>BioWest</td><td>S1480</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehide</td><td>Thermo Fisher</td><td>J19943</td><td></td></tr><tr><td>Pierwotne przeciwciało przeciw grypie</td><td>Bioss</td><td>BS-0344R</td><td></td></tr><tr><td>Pierwotne przeciwciało PRRSV</td><td>Bioss</td><td>BS-10043R</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td>AAA1882014</tr><tr><td>Przeciwciało wtórne</td><td>Invitrogen</td><td>31460</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek Tris</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM9856</td><td></td></tr></tbody></table>

zastosowanie fioletu krystalicznego w celu poprawy wizualnego odczytu opartego na efekcie cytopatycznym do miareczkowania wirusów przy użyciu testów tcid50

Use of Crystal Violet to Improve Visual Cytopathic Effect-based Reading for Viral Titration using TCID50 Assays

Miareczkowanie wirusa jest kluczowym testem w badaniach wirusologicznych. Wykrywanie efektu cytopatycznego (CPE) za pomocą testów TCID50 i testów jednostek tworzących blaszki (PFU) to dwie główne metody obliczania miana wirusa i często opierają się na wykrywaniu mikroskopowym lub barwieniu komórek w celu wizualizacji. W przypadku testu TCID50 obiektywna wizualizacja jest zwykle oparta na immunocytochemicznym (ICC) barwieniu wewnątrzkomórkowego wirusa w celu obliczenia mian w połączeniu z wizualnym wykrywaniem CPE za pomocą mikroskopii. Jednak barwienie ICC jest kosztowne i czasochłonne. W tym badaniu porównaliśmy wizualną obserwację CPE za pomocą mikroskopii, barwienia ICC i barwienia fioletem krystalicznym w celu określenia mian dwóch wirusów tworzących CPE, wirusa grypy A (IAV) pochodzącego od świń i wirusa zespołu rozrodczo-oddechowego świń (PRRSV). Wykazaliśmy, że zarówno barwienie fioletem krystalicznym, jak i ICC są dokładniejsze niż wizualne wykrywanie CPE, prezentując prawie identyczne poziomy precyzji zarówno w przypadku IAV, jak i PRRSV. Z tego powodu przedstawiamy tutaj barwienie fioletem krystalicznym jako szybszy i tańszy sposób określania miareczkowania wirusa w teście TCID50 dla wirusów tworzących CPE miareczkowanych w liniach komórkowych.

Równania wykorzystywane do matematycznego obliczania miana zostały opisane wcześniej2,3.
Krótko mówiąc, w przypadku PRRSV stosujemy metodę Karbera:
Miano (TCID50) = 10 T + 1,3 gdzie:
<img alt="Równanie matematyczne, T=d+(r/N)×(n+(N/2)), ilustrujące obliczenia w badaniach fizycznych." src="/files/ftp_upload/63063/63063eq01.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt=...

Ten protokół pokazuje dokładne i obiektywne podejście do wizualizacji miareczkowania wirusa za pomocą fioletu krystalicznego, porównując go z mikroskopią optyczną i barwieniem immunocytochemicznym.

Zastosowanie fioletu krystalicznego w celu poprawy wizualnego odczytu opartego na efekcie cytopatycznym do miareczkowania wirusów przy użyciu testów TCID50

Viral titration is a key assay for virology research. The detection of cytopathic effect (CPE) via TCID50 assays and plaque-forming units (PFU) assays are ...

Celem tego protokołu jest uzyskanie miareczkowania zapasu wirusa i jego wizualizacja za pomocą barwienia fioletem krystalicznym. W tym celu zostanie zademonstrowane ogólne miareczkowanie wirusa, a następnie barwienie. Miareczkowanie to będzie przeprowadzane na 96-dołkowej płytce przez okres siedmiu dni w komorze bezpieczeństwa biologicznego w laboratorium o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2.Aby to zrobić, 96-dołkowa płytka preferowanej linii komórkowej zostanie wysiana przy użyciu odpowiedniego podłoża i pozostawiona do wzrostu aż do zlewania się. Zapas wirusa zostanie rozcieńczony przy użyciu dziesięciokrotnych rozcieńczeń, przez zmieszanie 900 mikrolitrów pożywki i 100 mikrolitrów wirusa lub odpowiednie rozcieńczenie. Upewnij się, że każda probówka jest wirowana, aby zapewnić prawidłowe wymieszanie pożywki i wirusa oraz uniknąć błędów w rozcieńczeniach.W leadzie napisz układ swojej płytki, a także każde rozcieńczenie, aby pomóc podczas procesu infekcji. Przed infekcją przemyć 200 mikrolitrami PBS. Dodaj 50 mikrolitrów swojego inokulum do odpowiednich studzienek.Następnie inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 przez siedem dni. Po siedmiodniowej inkubacji przemyć 200 mikrolitrami PBS. Utrwal komórki, dodając 50 mikrolitrów PFA na studzienkę o stężeniu 4% w PBS i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej.Po inkubacji ponownie umyć komórki dwukrotnie 200 mikrolitrami PBS przed dodaniem 50 mikrolitrów fioletu krystalicznego na studzienkę w wodzie i inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Na koniec odessać fiolet krystaliczny ze studzienek i opcjonalnie pozostawić płytki do wyschnięcia na powietrzu przez dwie do pięciu minut w temperaturze pokojowej lub umyć je 200 mikrolitrami wody, aby usunąć nadmierną plamę przed wizualizacją. W rezultacie, po ponownym zabarwieniu, ujemne komórki zostaną wybarwione.Dodatnie studnie zostaną wyczyszczone. Informacje te zostaną wykorzystane w jednej z dwóch opisanych formuł do obliczenia ostatecznego miana wirusa. Kiedy porównano miano uzyskane za pomocą każdej metody, okazało się, że w monocytochemii barwienie może w niektórych przypadkach wykryć dodatkowe dołki dodatnie w porównaniu z fioletem krystalicznym, i że podobnie obie metody barwienia mogą wykryć więcej dodatnich dołków niż ocena wizualna za pomocą mikroskopii.

use-crystal-violet-to-improve-visual-cytopathic-effect-based-reading

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

W celu wytworzenia lentiwirusów wektory DNA są transfekowane do ludzkich komórek 293. Po zbiorze i skoncentrowaniu naddatku miano wirusa jest określane na podstawie ekspresji fluorescencji przy użyciu cytometru przepływowego.

Produkcja lentiwirusa

Analiza opisuje szybką metodę pomiaru wczesnego tworzenia się biofilmu przez bakterie i grzyby. Metoda ta wykorzystuje płytkę mikrotitracyjną jako podłoże do tworzenia biofilmu mikrobiologicznego, a sam biofilm jest wizualizowany przy użyciu fioletu krystalicznego. Analiza ta pozwala na jakościowe lub ilościowe oznaczenie wczesnego etapu tworzenia biofilmu.

Analiza tworzenia biofilmu w płytkach mikrotitrowych

W tym filmie demonstrujemy test żywotności komórek za pomocą procedury barwienia fioletem krystalicznym dla chemoterapeutycznie opornych na leki komórek nowotworowych.

Barwienie fioletem krystalicznym: technika wizualizacji lekoopornych komórek nowotworowych za pomocą testów tworzenia kolonii

Ta metoda opisuje użycie chemii kliknięć do pomiaru zmian w transkrypcji komórek gospodarza po zakażeniu wirusem gorączki doliny Rift (RVFV) szczepem MP-12. Wyniki można wizualizować jakościowo za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej lub uzyskiwać ilościowo za pomocą cytometrii przepływowej. Ta metoda można dostosować do użytku z innymi wirusami.

Wykorzystanie chemii kliknięć do pomiaru wpływu infekcji wirusowej na syntezę RNA komórki gospodarza

Trzy testy, w tym test oparty na działaniu cytopatycznym (CPE), test dawka-odpowiedź i test czasu dodania (ToA) zostały opracowane, zoptymalizowane, zatwierdzone i wykorzystane do identyfikacji nowych leków przeciwwirusowych przeciwko wirusowi choroby niebieskiego języka (BTV), a także do określenia możliwego mechanizmu działania (MoA) dla nowo zidentyfikowanych leków przeciwwirusowych.

Testy do identyfikacji nowych leków przeciwwirusowych przeciwko wirusowi choroby niebieskiego języka

Testy płytki nazębnej są złotym standardem w kwantyfikacji wirusa, wykorzystując nakładki pułapkowe na monowarstwy komórkowe gospodarza do określenia miana wirusa. Podczas gdy tradycyjnie stosuje się różne półstałe nakładki, tutaj demonstrujemy techniki płytki nazębnej, porównując półstałe nakładki z nową ciekłą celulozą mikrokrystaliczną wśród kilku rodzin wirusów.

Oznaczanie stężenia wirusa za pomocą testów płytki nazębnej: przy użyciu tradycyjnych i nowatorskich systemów nakładek

Opisujemy metodę generowania i amplifikacji genetycznie modyfikowanych syncytialnych wirusów oddechowych (RSV) oraz zoptymalizowany test płytki nazębnej dla RSV. Ilustrujemy ten protokół, tworząc dwa rekombinowane wirusy, które odpowiednio umożliwiają ilościowe określenie replikacji RSV i analizę na żywo ciał inkluzyjnych RSV i dynamiki granulek związanych z ciałami inkluzyjnymi.

Wytwarzanie, amplifikacja i miareczkowanie rekombinowanych syncytialnych wirusów oddechowych

Celem protokołu jest zilustrowanie różnych testów związanych z wnikaniem wirusa, które mogą być użyte do identyfikacji potencjalnych inhibitorów wnikania wirusa.

Wykorzystanie testów wnikania wirusa i molekularnej analizy dokowania do identyfikacji kandydatów na leki przeciwwirusowe przeciwko wirusowi Coxsackie A16

Obecny protokół opisuje rozprzestrzenianie się wirusa Zika (ZIKV) w komórkach nerkowych afrykańskiej zielonej małpy Vero oraz kwantyfikację ZIKV za pomocą komórkowych metod immunodetekcji kolorymetrycznej w formatach 24-dołkowych i 96-dołkowych (o wysokiej przepustowości).

Namnażanie wirusa i kwantyfikacja kolorymetryczna na podstawie komórek

Opisany tutaj test TCID50 wykorzystuje bezoznakowe pomiary impedancji w czasie rzeczywistym oraz moduł Virology systemu, aby obiektywnie monitorować efekty cytopatyczne (CPE) wywołane wirusem w czasie rzeczywistym. Ten uprościony test znacznie skraca czas pracy praktycznej, jednocześnie wspierając wysokoprzepustowe, ilościowe pomiary kinetyczne CPE oraz umożliwiając zautomatyzowane, w czasie rzeczywistym obliczenia TCID50.

Uproszczony, bezoznakowy, w czasie rzeczywistym 50% testu zakaźnego hodowli tkanek (TCID50) z impedancją do automatycznego ilościowania miana wirusowego

Przedstawiamy tutaj protokół do identyfikacji potencjalnych kandydatów do leków przeciwgruźliczych poprzez badanie fenotypową, obejmujące syntezę chemiczną związku 4-aminochinolinowego, określenie jego minimalnego stężenia hamującego wobec Mycobacterium tuberculosis i ocenę jego cytotoksyczności w liniach komórek ssaczych.

Identyfikacja potencjalnych kandydatów przeciwgruźliczych: Krok po kroku przewodnik po syntezie, oznaczaniu MIC i ocenie cytotoksyczności w komórkach ssaczy

Poznaj metodę barwienia fioletem krystalicznym do wizualizacji miareczkowania wirusów w płytkach 96-dołkowych. Technika ta poprawia dokładność oznaczania wirusów w porównaniu z mikroskopią optyczną.

Zastosowanie fioletu krystalicznego w celu poprawy wizualnego odczytu opartego na efekcie cytopatycznym do miareczkowania wirusów przy użyciu testów TCID50 (Wideo) | JoVE Journal

Zastosowanie fioletu krystalicznego w celu poprawy wizualnego odczytu opartego na efekcie cytopatycznym do miareczkowania wirusów przy użyciu testów TCID50

Przeglądaj więcej filmów