Zastosowanie fioletu krystalicznego w celu poprawy wizualnego odczytu opartego na efekcie cytopatycznym do miareczkowania wirusów przy użyciu testów TCID50
12 lutego 2022
Ten protokół pokazuje dokładne i obiektywne podejście do wizualizacji miareczkowania wirusa za pomocą fioletu krystalicznego, porównując go z mikroskopią optyczną i barwieniem immunocytochemicznym.
Celem tego protokołu jest uzyskanie miareczkowania zapasu wirusa i jego wizualizacja za pomocą barwienia fioletem krystalicznym. W tym celu zostanie zademonstrowane ogólne miareczkowanie wirusa, a następnie barwienie. Miareczkowanie to będzie przeprowadzane na 96-dołkowej płytce przez okres siedmiu dni w komorze bezpieczeństwa biologicznego w laboratorium o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2.
Aby to zrobić, 96-dołkowa płytka preferowanej linii komórkowej zostanie wysiana przy użyciu odpowiedniego podłoża i pozostawiona do wzrostu aż do zlewania się. Zapas wirusa zostanie rozcieńczony przy użyciu dziesięciokrotnych rozcieńczeń, przez zmieszanie 900 mikrolitrów pożywki i 100 mikrolitrów wirusa lub odpowiednie rozcieńczenie. Upewnij się, że każda probówka jest wirowana, aby zapewnić prawidłowe wymieszanie pożywki i wirusa oraz uniknąć błędów w rozcieńczeniach.
W leadzie napisz układ swojej płytki, a także każde rozcieńczenie, aby pomóc podczas procesu infekcji. Przed infekcją przemyć 200 mikrolitrami PBS. Dodaj 50 mikrolitrów swojego inokulum do odpowiednich studzienek.
Następnie inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 przez siedem dni. Po siedmiodniowej inkubacji przemyć 200 mikrolitrami PBS. Utrwal komórki, dodając 50 mikrolitrów PFA na studzienkę o stężeniu 4% w PBS i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
Po inkubacji ponownie umyć komórki dwukrotnie 200 mikrolitrami PBS przed dodaniem 50 mikrolitrów fioletu krystalicznego na studzienkę w wodzie i inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Na koniec odessać fiolet krystaliczny ze studzienek i opcjonalnie pozostawić płytki do wyschnięcia na powietrzu przez dwie do pięciu minut w temperaturze pokojowej lub umyć je 200 mikrolitrami wody, aby usunąć nadmierną plamę przed wizualizacją. W rezultacie, po ponownym zabarwieniu, ujemne komórki zostaną wybarwione.
Dodatnie studnie zostaną wyczyszczone. Informacje te zostaną wykorzystane w jednej z dwóch opisanych formuł do obliczenia ostatecznego miana wirusa. Kiedy porównano miano uzyskane za pomocą każdej metody, okazało się, że w monocytochemii barwienie może w niektórych przypadkach wykryć dodatkowe dołki dodatnie w porównaniu z fioletem krystalicznym, i że podobnie obie metody barwienia mogą wykryć więcej dodatnich dołków niż ocena wizualna za pomocą mikroskopii.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół przedstawia dokładną metodę wizualizacji mianowania wirusów z wykorzystaniem barwienia fioletem krystalicznym. Metoda ta została porównana z mikroskopią optyczną oraz barwieniem immunocytochemicznym.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Wirusologia
- Biologia komórki
- Techniki laboratoryjne
Wstęp
- Miareczkowanie wirusa jest niezbędne do ilościowego określenia zapasów wirusa.
- Barwienie fioletem krystalicznym zapewnia wizualną reprezentację obecności wirusa.
- Metody porównawcze obejmują mikroskopię optyczną oraz barwienie immunocytochemiczne.
- Prawidłowe techniki rozcieńczania są kluczowe dla uzyskania dokładnych wyników.
Cel badania
- W celu przygotowania miareczkowania zapasu wirusa.
- W celu wizualizacji miareczkowania przy użyciu barwienia fioletem krystalicznym.
- Aby zapewnić dokładność metod ilościowego oznaczania wirusów.
Zastosowane metody
- Wysiewanie wybranej linii komórkowej na płytkę 96-dołkową.
- Przygotowanie rozcieńczeń dziesięciokrotnych zapasu wirusa.
- Mieszanie każdego rozcieńczenia za pomocą wortexa w celu zapewnienia jednorodności.
- Barwienie fioletem krystalicznym po siedmiodniowym okresie inkubacji.
Główne wyniki
- Skuteczna wizualizacja miana wirusa przy użyciu fioletu krystalicznego.
- Porównanie z innymi metodami barwienia wykazało spójność wyników.
- Osiągnięto dokładną kwantyfikację zapasów wirusa.
- Protokół dostarcza wiarygodną metodę do przyszłych badań.
Wnioski
- Barwienie fioletem krystalicznym jest skuteczną metodą wizualizacji mian wirusów.
- Protokół ten zwiększa dokładność ilościowego oznaczania wirusów.
- Dalsze badania mogą opierać się na tej metodzie w różnych zastosowaniach.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Dokładne miareczkowanie wirusów jest kluczowe dla przesiewu leków przeciwwirusowych oraz opracowywania szczepionek, gdzie niespójne wykrywanie CPE może negatywnie wpłynąć na identyfikację związków wiodących i decyzje o kontynuacji lub przerwaniu badań. Barwienie fioletem krystalicznym stanowi kosztową i powtarzalną alternatywę dla barwienia immunocytochemicznego, co poprawia standaryzację testów i zmniejsza zmienność w początkowych etapach procesów odkrywania leków. Wspiera to pewność prognoz w ocenie skuteczności przeciwwirusowej i umożliwia skalowalny, wysokoprzepustowy przesiew oparty na TCID50 dla wirusów wywołujących CPE.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia obiektywną kwantyfikację zakaźności wirusa, zmniejszając zależność od subiektywnej mikroskopii i wspierając mechanistyczną weryfikację ryzyka celów przeciwwirusowych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia szybką i niskokosztową metodę barwienia, która zwiększa przepustowość i powtarzalność testów w procesie walidacji związków hit przeciwwirusowych.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Generuje jasne, mierzalne punkty końcowe dla testów TCID50, poprawiając stosunek sygnału do szumu w kampaniach przesiewowych związków.
- Wartość operacyjna: Eliminuje potrzebę stosowania kosztownych odczynników do ICC, obniżając koszt pojedynczego testu i umożliwiając szersze zastosowanie w platformach odkrywania leków przeciwwirusowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Zapewnia spójne pomiary miana wirusa w różnych badaniach, co wspiera wiarygodne modelowanie zależności dawka-odpowiedź w przedklinicznych badaniach skuteczności.
- Wartość operacyjna: Ułatwia standaryzację przygotowania zapasów wirusa między laboratoriami, redukując zmienność międzyeksperymentalną w badaniach umożliwiających złożenie wniosku o IND.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w proces odkrywania leków przeciwwirusowych, od wczesnego potwierdzenia trafień (hit confirmation) po optymalizację wiodących związków (lead optimization), gdzie dokładne miareczkowanie wirusa dostarcza informacji na temat zależności struktura-aktywność oraz profilowania oporności.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez zapewnienie powtarzalnych modeli zakażeń wirusowych do badań nad mechanizmami działania.
- Przesiewanie: Dostarcza ustandaryzowanych, mierzalnych wyników niezbędnych do przejścia z etapu identyfikacji hitów do optymalizacji leadów w kaskadach badań przesiewowych leków przeciwwirusowych.
- Analityka: Umożliwia precyzyjne obliczanie wartości TCID50, co pozwala na dokładne porównanie potencji związków w różnych warunkach eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość między przesiewaniem przeciwwirusowym in vitro a modelami zakażeń in vivo dzięki spójnej kwantyfikacji zapasów wirusa.
- Zastosowania w przedsiębiorstwie: Stanowi skalowalną, niskokosztową metodę możliwą do zastosowania w odniesieniu do wielu celów wirusowych i obszarów terapeutycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w ocenie skuteczności przeciwwirusniczej poprzez redukcję wyników fałszywie ujemnych wynikających z wizualnej oceny CPE.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i skalowalność testów TCID50 dzięki uproszczonemu, zestandaryzowanemu barwieniu.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową programów przeciwwirusniczych poprzez obniżenie kosztów analiz bez utraty jakości danych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera decyzje o dalszym rozwoju skorygowane o ryzyko, dostarczając wiarygodnych danych o mianie wirusa dla kryteriów go/no-go.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagane jest podstawowe przeszkolenie z zakresu wirusologii oraz stosowanie technik aseptycznych w celu bezpiecznego obchodzenia się z wirusami w środowiskach BSL-2.
- Metoda opiera się na standardowym wyposażeniu laboratoryjnym, w tym na inkubatorach, wirówkach i czytnikach płytek do opcjonalnej kwantyfikacji.
- Konieczne jest uzgodnienie w obrębie zespołów czasu trwania barwienia oraz protokołów płukania, aby zapewnić powtarzalność między laboratoriami.
- Metoda jest stosowalna w liniach komórkowych adherentnych wspierających powstawanie CPE; optymalizacja może być wymagana w przypadku wirusów nieindukujących CPE lub linii komórkowych nieadherentnych.
- Metoda jest ograniczona do wirusów indukujących wykrywalny efekt cytopatyczny; nie nadaje się do modeli infekcji trwałych lub niecytopatycznych bez wprowadzenia modyfikacji.
